DK170714B1 - Rekombinant DNA-vektor, fremgangsmåde til fremstilling deraf, værter transformeret dermed, fremgangsmåde til fremstilling af transformeret vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et lymfoblastoidtalfa-interferon - Google Patents

Description

i DK 170714 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt rekombinant DNA-vektor, som indeholder en DNA-sekvens, der koder for et lymfoblastoidt «-interferon, en 5 fremgangsmåde til fremstilling af den rekombinante DNA-vektor, en E. coli-værtsstamme transformeret med den rekombinante DNA-vektor og en fremgangsmåde til fremstilling af en sådan transformeret E. coli-værtsstamme. Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til 10 fremstilling af et hidtil ukendt lymfoblastoidt «-interferon.

Interferoner (IFN) er en gruppe overvejende glycosyle-rede polypeptider med molekylvægt i området fra 10.000 til 40.000. De dannes af hvirveldyrsceller ved 15 indvirkning af en IFN-inducer, såsom et virus, et dobbeltkædet RNA, intrace11ulære mikroorganismer, mikroorganismeprodukter eller forskellige kemiske midler (1). Interferoner findes sædvanligvis ikke i normale sunde celler. De hjælper de sunde celler i hvirveldyrene 20 med at forsvare sig mod virusinfektioner og andre angreb. Interferoner har vist sig at have immunomodulator-virk-ninger.

Hidtil er der identificeret tre klasser interferoner af human oprindelse (HuIFN), nemlig HuIFN-α, HuIFN-0 og 25 HulFN-γ. HuIFN-a dannes af humane leucocyter og af lymfoblastoide celler efter induktion, f.eks. med et virus (E.A. Haveil et al. (2) og A.D. Sager et al. (3)).

Det er stabilt ved pH-værdien 2 og indeholder en blanding af individuelle interferon-polypeptider, som hovedsagelig 30 er forskellige med hensyn til glycosyleringsgraden (jfr. f.eks. M. Rubinstein et al., (4)), og aminosyresam-mensætningen (se nedenfor). Af de to komponenter, som hidtil er blevet isoleret og renset, er komponenten med en molekylvægt på 15.000 til 18.000 ikke glycosyleret, 35 hvorimod komponenten med en molekylvægt på 21.000 til 22.000 er glycosyleret. Det er anført af W.E. Stewart, Il 2 DK 170714 B1 et al. (5), at det ikke-glycosylerede interferon har bibeholdt størsteparten eller hele dets HulFN-α-akti-vitet. Dele af aminosyresekvensen i HuIFN-α fra lymfo-5 blastoide celler er også blevet beskrevet, jfr. K.C. Zoon et al., (6). Forskellige former for HuIFN-α, som er * forskellige i strukturelle og fysiologiske henseender, kendes allerede. Enkelte mennesker kan danne alleliske variationer af HuIFN-a.

10 HuIFN-0 dannes af humane fibroblaster ved induktion med et ds RNA og, i mindre udstrækning, sammen med HuIFN-a, af humane lymfoblastoide celler ved induktion med et virus. Hul FN-/S er ligeledes stabilt ved pH-værdien 2.

Hidtil er mindst to typer HuIFN-/3 blevet beskrevet (7, 15 8). Molekylvægtene er omkring 20.000 og 22.000. Amino syresekvensen er delvis kendt.

HuIFN-γ dannes af T-lymfocyter som respons på antigener eller mitogener. Det er syrelabilt ved pH-værdien 2 og serologisk forskelligt fra HuIFN-α og HuIFN-Ø.

20 HuIFN kan anvendes som antivirale midler, antitumormidler og anticancermidler.

Som antivirale midler kan de anvendes til at behandle f.eks. virusinfektioner i åndedrætsvejene, herpes simplex keratitis, akut hemorrhagic conjuctivitis, varicella 25 zoster, hepatitis B, cytomegalic inclusion disease og andre.

*

Som antitumormidler og anticancermidler kan HulFN anvendes 3 DK 170714 B1 til behandling af f.eks. osteosarcoma, akut myeloid leukemi, multiple myeloma, Hodgkins sygdom, melanoma, bryst-carcino-ma, lymfosarcoma og papilloma og andre.

HuIFN kan anvendes i form af farmaceutisk præparater til 5 oral eller parenteral indgift, f.eks. farmaceutisk præparater til topisk, intravenøs, intramuskulær, intranasal, intradermal eller subkutan indgift, f.eks. tabletter, hætteglas, siruper, opløsninger eller suspensioner til oral indgift, pulvere, injektions- eller infusionsopløsninger el-10 ler suspensioner, øjedråber, salver, spraymidler og lignende.

Præparaterne indgives sædvanligvis f.eks. intramuskulært, 6 7 én til tre gange dagligt i doser på fra ca. 10 til ca. 10 enheder, idet behandlingen afhænger af sygdommen, indgiftsmåden og af patientens tilstand. Virusinfektioner behandles 15 sædvanligvis dagligt eller op til tre gange dagligt i et tidsrum på fra flere dage til flere uger, hvorimod tumorer og cancere behandles i flere måneder eller år, enten én eller flere gange dagligt eller to eller flere gange om ugen.

Hidtil er HuIFN-α kun blevet fremstillet i utilstrækkelige 20 mængder ved hjælp af inducerede menneskeceller, f.eks. humane lymfoblastoide celler (f.eks. fra Burkitts lymfoma "Na-malwa"-celler) eller humane leucocyter udvundet fra frisk blod fra donorer. HuIFN-β udvindes hovedsagelig fra humane q fibroblaster. Det er beskrevet, at der kun opnås 2,6 x 10 25 internationale enheder (IE) af råt HuIFN-α fra 800 liter dyrkede Namalwa-celler, og at der kun kan opnås ca. 10^ IE råt HuIFN-α om året ved meget store blodcentre, f.eks. det finske Røde Kors Center i Helsingfors. Den specifikke akti-

O

vitet for HuIFN-α er af størrelsesordenen ca. 4 x 10 til 9 30 10 IE/mg. Den mængde HuIFN-a, som ville være påkrævet til udbredt og kommerciel anvendelse, ville være meget lille sammenlignet med andre farmaceutiske forbindelser.

100 g rent HuIFN-α ville give mellem 10 og 30 millioner do- 4 DK 170714 B1 ser. Imidlertid kan sådanne mængder ikke fremstilles industrielt til en rimelig pris ved anvendelse af teknologien med humane vævskulturer og humane leucocyter.

En anden ulempe ved disse stordrifts-produktionsmetoder er, 5 at der kun opnås blandinger af interferoner, og det er besværligt og kostbart at adskille disse i de enkelte undertyper. Det har derfor været utilfredsstillende at bestemme de terapeutiske anvendelser af rene individuelle interferonarter.

10 Den industrielle udnyttelse af disse fremgangsmåder er endvidere begrænset til HuIFN dannet af humane celler, som kan dyrkes, såsom humane tumorceller og visse fibroblast-celler, eller til humane celler, som er tilgængelige i relativt store mængder, såsom leucocyter og lymfocyter. Imid-15 lertid er alle disse fremgangsmåder kostbare og indviklede.

Det blev erkendt, at løsningen på problemet med den industrielle syntese af store mængder individuelle interferonarter kunne komme fra fremskridt indenfor molekylærbiologien, hvorved det blev muligt at udbrede et specifikt ikke-bakte-20 rielt eukaryotisk gen i bakterieceller. S.N.Cohen og H.W.

Boyer (9) har for nylig beskrevet en generel fremgangsmåde til gendannelse af biologisk funktionelle DNA-sekvenser.

Ved denne fremgangsmåde foretages spaltning af et cirkulært plasmid-DNA til dannelse af et første lineært DNA-segment, 25 hvorefter der i dette første segment indsættes et andet lineært DNA-segment med et gen for et phenotypisk træk til dannelse af et rekombinant DNA-molekyle (et modificeret cirkulært plasmid), hvorefter en éncellet mikroorganisme transformeres med dette rekombinant DNA-molekyle, den transforme-30 rede mikroorganisme dyrkes sammen med den ikke-transformere- » de mikroorganisme under passende ernæringsbetingelser, og de transformerede mikroorganismeceller isoleres fra de éncellede stam-mikroorganismer. De transformerede celler kan „ da danne det ønskede protein.

5 DK 170714 B1

Problemet med at danne en lineær DNA-sekvens, som koder for interferoner og derfra et rekombinant DNA, er ikke løst af Cohen og Boyer.

5 DNA-sekvenser afledt af humane leucocyter og fibroblas-ter, som koder for polypeptider med HuIFN-a-lignende aktivitet, rekombinant DNA-molekyler indeholdende disse DNA-sekvenser, værter transformeret med de rekombinerede DNA-molekyler, polypeptider eller dyrkningsvæsker inde-10 holdende disse polypeptider samt fremgangsmåder til fremstillingen af disse sammensætninger er beskrevet i beskrivelserne til forskellige patentansøgninger og andre publikationer.

Under anvendelse af humane leucocyter induceret med 15 Sendaivirus som udgangsmateriale fremstilles flere polypeptider med HuIFN-a-lignende aktivitet, DNA-sekven-serne, rekombinant DNA-molekylerne og værterne for deres fremstilling, jfr. C. Weissmann (10), se endvidere S.

Nagata et al. (11), N. Mantai et al. (12) og M. Streuli 20 et al. (13).

Et delvis renset HuIFN-a-lignende polypeptid med en molekylvægt på 21.000, som også er afledt fra leucocyter, især fra den humane myeloblastoide cellelinie KG-1 induceret med Sendai virus, og det tilsvarende DNA er 25 beskrevet af D.V. Goeddel et al. (14).

Goeddel et al. (15) har vist, at humant leucocytinter-feron udgør en familie af homologe, men strukturelt forskellige proteiner, og der beskrives otte specifikke leucocytinterferon-cDNA-kloner samt interferoner (LeIF 30 A-H), som disse koder for.

Endvidere er en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med HuIFN-a-lignende aktivitet ud fra humane lymfoblastoide Namalwa-celler eller humane blodleuco- 6 DK 170714 B1 cyter, begge induceret med Newcastle disease virus, beskrevet alment i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 34.307 (16), men der anføres ingen kon- ? 5 krete data eller detaljer.

Humant lymfoblastoidt interferon "HuIFN(Ly)" kan fremstilles i varierende mængder ved hjælp af Namalwa-celler ved stimulering med forskellige inducere, jfr. M.D.

Johnston et al. (17). Det er påvist, at HuIFN(Ly) 10 produceret af Namalwa-celler induceret ved hjælp af Sendai-virus indeholder HuIFN-a(Ly) (70-90%) og HuIFN-|3(Ly) (10-30%). Det består af i det mindste syv komponenter. (K.C. Zoon et al. (6), se også E.A. Haveil et al. (2) og A.D. Sagar et al. (3)). Selv om de lymfo-15 blastoide interferonpolypeptiders totale struktur endnu ikke er klarlagt, er det fastslået, at HuIFN-a(Ly) er forskelligt fra HuIFN-a(Le). Der synes at være ringe eller slet ingen glycosylering af gruppebestanddelene i lymfoblastoidt interferon. De forskellige komponenter er 20 endnu ikke blevet adskilt og renset.

Da der gennemføres kliniske forsøg med blandinger af lymfoblastoide HuIFN, er det ønskeligt at adskille de forskellige komponenter og danne dem hver for sig for at kunne være i stand til at fastlægge deres terapeutiske 25 potentiel. Ingen af de tidligere beskrevne rekombinant DNA-fremgangsmåder er rettet på fremstillingen af lymfoblastoide humane interferoner. Det er formålet med opfindelsen at løse dette problem ved hjælp af rekombinant DNA-teknologien. Endvidere skal strukturen 30 (aminosyresekvensen) af de forskellige undertyper af HuLyIFN klarlægges, og der skal tilvejebringes fremgangsmåder, som tillader fremstilling af de enkelte interferoner i tilstrækkelige mængder til at sikre forsyningen til behandlingen af et stort antal mulige 35 patienter.

7 DK 170714 B1

Ifølge den foreliggende opfindelsen kan der fremstilles et individuelt polypeptid med samme biologiske aktivitet som lymfoblastoide interferoner.

5 Rekombinant DNA-vektoren ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at den indeholder en DNA-sekvens, der koder for et lymfoblastoidt α-interferon, valgt blandt den for HLycIFN-5i kodende DNA-sekvens

ATGGCCTTGACTTTTTATTTACTGGTGGCCC

TAGTGGTGCTCAGCTACAAGTCATTCAGCTCICTGGGCTGTGATCrGCCTCAGACTCACAGCCTGGG

TAACAGGAGGGCCTTGATACTCCTGGCACAAATGCGAAGAATCTCTCCTTTCTCCrGCCTGAAGGAC

AGACATGACTTTGAATTCCCCCAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCT

CTGTCCTCCATCAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTCnCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCrTT

GGATGAGACCCTTCTAGATGAATTCTACATCGAACTTGACCAGCAGCTGAATGACCrGGAG

TCCTGTGTGATGCAGGAAGTGGGGGTGATAGAGTCTCCCCTGATGTACGAGGACTCCATCCTGGCTG

TGAGGAAATAdTCCAAAGAATCACrCTATATCTGACAGAGAAGAAATACAGCTCTTGTGCCTGGGA

GGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCTTCTCTTTATCAATCAACTTGCAAAAAAGATTGAAGAGT

AAGGAA

10 og den for LyIFN-a-2 kodende DNA-sekvens.

ATGTGTGATCTGCCTC

AGACTCACAGCCTGGGTAACAGGAGGGCCTTGATACTCCTGGCACAAATGCGAAGAATCTCTCCTT

TCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACnTGAATTCCCCCAGGAGGACTTTGATGATAAACACTTCC

AGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTCTTCAGCACAA

AGGACrCATCTGCTGCnTGGATGAGACCCrrCTAGATGAATTCTACATCGAACTTGACCAGCAGC

TGAATGACCTGGAGTCCTGTGTGATGCAGGAAGTGGGGGTGATAGAGTCTCCCCTGATGTACGAGG

actccatcctggctgtgaggaaatacitccaaagaatcactctatatctgacagagaagaaataca gctcttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatccttctctttatcaatcaacttgc aaaaaagattgaagagt aaggaa,

Det har vist sig, at interferonet LyIFN-a-2, som den rekombinante DNA-vektor ifølge opfindelsen kodes for, har overraskende bedre antivirale og antiproliferative 15 virkninger end de kendte nært beslægtede interferoner LeIF-D (svarer til IFN-α-Ι) og LeIF-A (handelsprodukt 8 DK 170714 B1

Roferon A), hvilket fremgår af det efterfølgende eksempel 11.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af en 5 rekombinant DNA-vektor ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man i en kloningsvektor indfører en DNA-sekvens valgt blandt de DNA-sekvenser, som koder for HLycIFN-5i og LyIFN-a-2.

Den transformerede E. coli-værtsstamme ifølge opfindel-10 sen er ejendommelig ved, at den er transformeret med mindst én rekombinant DNA-vektor ifølge opfindelsen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af en transformeret E. coli-værtsstamme ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man indfører en rekombinant DNA-vek-15 tor ifølge opfindelsen i E. coli-værtsstammen.

Det lymfoblastoide α-interferon HLycIFN-5i har formlen MET ALA LEU TUR PHETYR LEU LEU VAL ALA LEU VAL VAL LEU SER TYR LYS SER PHE SER SER LEU GLY CYS ASP LEU PRO GLNTHR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG Π-E SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU CLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS CLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG AlA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU.

Det lymfoblastoide α-interferon LyIFN-a-2 er fremstillet ud fra en transformeret E. coli-værtsstamme, som inde-20 holder en rekombinant DNA-vektor, der bærer DNA-sekvensen 9 DK 170714 B1

ATGTGTGATCTGCCTC

AGACTCACAGCCTGGGTAACAGGAGGGCCTTGATACrCCTGGCACAAATGCGAAGAATCTCTCCTT

TCrCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGAATTCCCCCAGGAGGAGinTGATGATAAACAGTTCC

AGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCrCCATGAGATGATCCAGCAGACCrrCAACCTCTTCAGCACAA

AGGACTCATCrGCTGCTTTGGATGAGACCCTTCTAGATGAATTCrACATCGAACTTGACCAGCAGC

tgaatgacctggagtcctgtgtgatccaggaagtgggggtgatagagtctcccctgatgtacgagg

ACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTATATCTGACAGAGAAGAAATaCA

GCTCTTGTGCCTGGGAGGTTCTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCTTCTCTrTATCAATCAACTTGC

AAAAAAGATTGAAGAGTAAGGAA

Endelig er fremgangsmåden til fremstilling af et lymfo-blastoidt α-interferon ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at man dyrker en transformeret E. coli-værtsstamme 5 ifølge opfindelsen og isolerer interferonet.

Lymfoblastoid-interferonerne er strukturelt forskellige fra de i litteraturen beskrevne α-interferoner, specielt fra de af Goeddel et al. (15) beskrevne otte a-inter-feroner, og er derfor nye.

10 Fremgangsmåden til fremstilling af en transformeret E. coli-værtsstamme omfatter følgende trin:

Isolering af humant lymfoblastoidt poly(A) RNA fra inducerede humane lymfoblastoide celler og opkoncentrering af HuLyIFN-mRNA.

15 Fremstilling af et enkeltstrenget komplementært DNA ud fra denne kopi og deraf et dobbeltstrenget cDNA.

10 DK 170714 B1

Indføring af det dobbeltstrengede cDNA i et passende vektor-DNA.

Transformering af en passende E. coli-værtsstamme med det 5 dannede rekombinant DNA.

¥

Dyrkning af værtsstammen og udvælgelse af de kloner, som er transformerede med rekombinant DNA, der indeholder en DNA-sekvens, som koder for HLycIFN-5i eller LyIFN-a-2.

1. Induktion af humane lymfoblastoide celler og isolering 10 af humant lymfoblastoidt poly(A) RNA beriget med HuLyIFN mRNA.

Isoleringen af humant lymfoblastoidt poly(A) RNA beriget for HuLyIFN mRNA kan opnås ved anvendelse af forskellige kendte metoder. Metoden, som anvendes ved den forelig-15 gende opfindelse, omfatter følgende trin:

Induktion af humane lymfoblastoide celler til LylFN-syn-tese, sønderdeling af de inducerede celler, isolering af lymfoblastoidt poly(A) RNA fra kontamineren-20 de proteiner, lipoproteiner, DNA'er og RNA*er af en anden type, koncentration af LyIFN-specifikt mRNA.

Som følge af påvirkningen af en IFN-induktor danner humane lymfoblastoide celler LyIFN mRNA og derefter 25 humant LyIFN.

Egnede IFN-induktorer er f.eks. forskellige kemiske midler, et dobbeltkædet RNA, f.eks. poly(I):poly(C), eller især visse vira, først og fremmest medlemmerne af paramyxovirus-, pseudomyxovirus- og reoviridialfamili-30 erne.

11 DK 170714 B1

Humane lymfoblastoide celler er fordelagtigt sådanne, som er udvundet fra patienter med Burkitt's lymfoma. Det er påvist, at én sådan cellelinie, Namalwa, producerer 5 høje koncentrationer af IFN ved viral stimulering (18).

Induktionen af de lymfoblastoide celler gennemføres som beskrevet i litteraturen for analoge fremgangsmåder. De lymfoblastoide celler dyrket i et egnet dyrkningsmedium induceres ved tilsætning af et egnet virus i et passende 10 tidsrum.

IFN-Titeren kan bestemmes ved måling af IFN-aktiviteten under anvendelse af farvestofoptagelsesmetoden udviklet af Armstrong (19).

Til isolering af nukleinsyrerne nedbrydes de inducerede 15 celler ved hjælp af mekaniske kræfter, f.eks. homogenisering, osmotisk chok eller ultralyd, eller ved anvendelse af lytiske kemiske midler, f.eks. anioniske detergenter. Den frigjorte nukleinsyreblanding deprotoniseres ved tilsætning af proteaser, f.eks. pronase eller pro-20 tease P, og gentagen ekstraktion med phenol og chloroform.

Til rensning af RNA’et kan det kontaminerende DNA nedbrydes ved hjælp af RNAse-fri desoxyribonuklease, eller nukleinsyreblandingen kan til adskillelse af RNA og DNA 25 underkastes en ligevægtscentrifugering i CsCl-gradienter.

På grund af tilstedeværelse af poly(A)-kæder ved 3'-enden kan mRNA-molekylet isoleres specifikt fra de andre RNA-molekyler ved adsorption til oligo(dT)-cellulose eller poly(U)-sepharose.

30 På dette trin kan poly(A) RNA afprøves for dets evne til syntesen af polypeptider, som udviser HulFN-aktivitet i et in vitro translationssystem (f.eks. retlculocyt-trans- 12 DK 170714 B1 lations-system, Xenopus laevis oocyster). De IFN-speci-fikke polypeptider kan identificeres ved anvendelse af en strålingsimmun test eller især en cytopatisk biotest 5 ifølge Stewart et al. (20).

c-

Berigelsen af poly(A) RNA-fraktionen med lymfoblastoidt HuIFN mRNA kan opnås under anvendelse af forskellige fremgangsmåder kendt fra litteraturen. Den er i det væsentlige baseret på forskellen i molekylstørrelse hos 10 de enkelte mRNA-arter.

Fraktioneringen af poly(A) RNA med hensyn til størrelse kan opnås f.eks. ved gelfiltrering på søjler med dextran-derivater eller polyacrylamid. Endvidere kan en blanding af poly(A) RNA-arter fraktioneres ved zoneelektroforese i 15 polyacrylamidgeler, stivelsesgeler eller agarosegeler eller efter de enkelte RNA-arters sedimentationshastighed ved zonecentrifugering i saccharosedensitet-gradienter.

De enkelte fraktioner opsamles og kan analyseres for IFN mRNA-aktivitet. Fraktionerne med den højeste IFN mRNA-20 aktivitet hældes sammen og sættes til en oligo(dT)-cellulosesøj le eller en poly(U)-sepharosesøjle. Det bundne poly(A) RNA, som er beriget i betydelig grad med HuLyIFN mRNA, elueres med vand og fældes med ethanol.

2. Fremstilling af lymfoblastoidt dobbeltkædet cDNA inde-25 holdende HuLyIFN ds cDNA

Poly(A) RNA'et beriget med HuLyIFN mRNA og fremstillet som beskrevet ovenfor kan anvendes som skabeloner til fremstilling af et dobbeltkædet cDNA. Denne omdannelse omfatter fremstillingen af et enkeltkædet cDNA, syntesen 30 af den anden DNA-kæde og nedbrydningen af den terminale "hårnåle"-struktur, som er dannet primært.

13 DK 170714 B1

a. Fremstilling af det enkeltkædede cDNA

Et enkeltkædet DNA, som er komplementært med poly(A) RNA'et, kan fremstilles ved revers eller omvendt trans-5 skription af RNA'et. Syntesen er katalyseret af en RNA-afhængig DNA-polymerase (omvendt transskriptase). Som primer for startpunktet for den reverse transkriptase på RNA-templaten kan man anvende oligodeoxythymidylat (oligo(dT)) eller poly(U), hvorved der dannes et dobbelt-10 strenget RNA i området med 3'-poly(A)-enden. Syntesen af det enkeltkædede cDNA gennemføres i en konventionel pufferbiånding, idet deoxynukleosidtriphosphaterne (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) anvendes i overskud for at fremme syntesen af kopier i fuld størrelse. Efter afslutning af 15 syntesereaktionen ved tilsætning af en inhiberings- blanding indeholdende f.eks. EDTA og SDS deproteiniseres cDNA'et, de frie desoxynukleosid-triphosphater fjernes over en "Sephadex"-søjle, og det forurenende skabelon-RNA fjernes ved spaltning med en ribonuklease eller hydrolyse 20 med base. Længden af det tilbageblevne cDNA kan bestemmes f.eks. ud fra dets elektroforetiske mobilitet i en basis agarosegel eller i en polyacrylamidgel i forhold til markør-DNA'er af kendt læængde (jvf. 35).

Det enkeltkædede cDNA har en 3'-terminal "hårnåle"-25 struktur. Denne "hårnåle"-struktur udgør et kort dob-beltkædet område, som gør cDNA'et selvpriming for den efterfølgende syntese af en anden DNA-kæde. Der kræves derfor ingen yderligere primer.

Det dobbeltkædede cDNA kan syntetiseres ved hjælp af en 30 RNA-afhængig DNA-polymerase, f.eks. revers transskriptase, på samme måde som beskrevet ovenfor ved syntesen af det enkeltkædede cDNA, bortset fra at poly(A) RNA er erstattet af enkeltkædet cDNA, og primeren er udeladt. Alternativt kan andre enzymer, som katalyserer syntesen 35 af DNA ud fra dets deoxyribonukleotid-precursorer, lige så godt anvendes, f.eks. T4 DNA-polymerase, E. coli-DNA- polymerase (Klenow-fragment) eller fortrinsvis E. coli- DNA-polymerase I.

14 DK 170714 B1 5 Det fremkomne ds DNA indeholder en såkaldt "hårnåle"-sløjfe, som forbinder de to DNA-kæder. Sløjfen kan overskæres ved hjælp af Sl-nuklease, hvorved der fås et ds cDNA med base-parrede ender. Derefter deproteiniseres ds cDNA'et, renses på en "Sephadex"-søjle og opkoncentre-10 res ved hjælp af gelfiltrering, elektroforese på poly-acrylamidgel eller på en agarosegel eller zonecentrifugering i en saccharosegradient. Ved parallel coelek-troforese og cocentrifugering af DNA-molekyler med kendt molekylstørrelse er det muligt at lokalisere de ds cDNA-15 molekyler, som har den forventede molekylstørrelse for IFN ds cDNA'er (700-1200 base-par ifølge tidligere publicerede data: 15, 21, 22, 7).

3. Kloning af ds cDNA'et beriget med HuLyIFN ds cDNA

Kloningen af ds cDNA'et, fremstillet som beskrevet oven-20 for kan gennemføres under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder. Fremgangsmåden indbefatter - knytning af ds cDNA*et til et passende vektor-DNA og - overføring af det dannede rekombinant DNA til en passende værtscelle (transformation), hvori det er i stand 25 til at danne kopier.

Et vektor-DNA indeholder foruden genetiske funktioner, der sikrer dets egen mangfoldiggørelse, når det overføres til en værtscelle, såkaldte "markørgener", som f.eks. antibiotika-resistensgener, der gør det muligt at udvælge 30 de transformerede værtceller fra en stor population af ikke-transformerede vildtypeceller. Indenfor genteknologien er almindeligt anvendte vektorer f.eks. cirkulært plasmid-DNA (især plasmidet col El eller dets derivater, f.eks. pMB 9, pSF 2124, pBR 317 og især pBR 322) og 15 DK 170714 B1 DNA'et fra visse bakteriofager, hvortil ds cDNA'et kan knyttes eksperimentelt, f.eks. derivater af bakteriofagen λ.

5 Til fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle spaltes f.eks. et egnet plasmid, såsom pBR 322 ved hjælp af et egnet restriktionssystem, ds cDNA'et indsættes i det lineære plasmid, og ringen gendannes under dannelse af et større rekombinantplasmidmolekyle indeholdende det ind-10 satte ds cDNA-segment.

DNA-segmenterne sammenknyttes sædvanligvis gennem de enkeltkædede cohæsive ender og lukkes covalent ved hjælp af en DNA-ligase, f.eks. T4 DNA-ligase. Komplementære ender kan dannes på to forskellige måder: enten ved 15 spaltning med restriktionsenzymer, hvorved der fremkommer forskudte spaltningssteder og dannes cohæsive ender, eller ved addition af definerede enkeltkædede sekvenser (f.eks. homopolymere ender). Alternativt kan fuldstændigt baseparrede DNA-dobbeltkæder med såkaldte korte ender 20 forbindes ved hjælp af T4-ligase.

Anvendelige værter indbefatter f.eks. gær og især bakterier, som kan undergå transformation og mangler restriktionsenzymer og modifikationsenzymer, f.eks. stammer af Escherichia coli, f.eks. Escherichia coli X 1776 eller 25 Escherichia coli HB 101, eller stammer af Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre bakterier og mutanter deraf.

Rekombinant-DNA-molekylet fremstillet som beskrevet 30 ovenfor kan overføres til den egnede værtscelle ved anvendelse af en almindelig transformationsprocedure, som indbefatter f.eks. Ca2+-forbehandling af værtscellerne.

Celler indeholdende et rekombinantplasmid-DNA, som medfører en fenotypisk egenskab, f.eks. tetracyclinre- sistens i værtscellen, udvælges ved udspredning af kulturer på et selektivt, f.eks. tetracyclinholdigt, næringssubstrat på agarplader. s 16 DK 170714 B1 5 Ved den foreliggende opfindelse er det foretrukne vektor-DNA plasmidet pBR 322, som efter spaltning med en passende restriktionsendonuklease, især Pst I, bindes til ds cDNA'et via komplementære homopolymere ender, især dG:dC-ender. Det dannede rekombinant-DNA overføres til 10 Escherichia coli HB 101.

I stedet for IFN-gener fremstillet ved hjælp af den ds cDNA-syntetiske metode som beskrevet ovenfor kan tilsvarende kromosomalt DNA på samme måde anvendes til fremstillingen af kloner, som er i stand til at danne poly-15 peptider med iFN-aktivitet.

Den foretrukne vektor ved den foreliggende opfindelse er plasmidet pBR 322. Det indeholder to resistensgener (ampr, tetr) og nogle enkelte (unikke) restriktionssteder. Et enkelt Pst I-sted ligger i ampr-genet, medens 20 de eneste BamHI, Hindlll og Sall-steder er i tetr-genet.

Et enkelt EcoRI-sted findes et andet sted (23). Ved anvendelse af en af de nedenfor nævnte restriktionsendo-nukleaser forbliver enten ampr-genet eller tetr-genet eller begge gener intakte. Begge de nævnte enzymer er 25 derfor egnede til spaltning og linearisering af pBR 322.

Efter linearisering af plasmidet pBR 322 kan der indføres deoxynukleotidkæder i begge 3'-enderne i nærværelse af terminal deoxynukleotidinyltransferase. Der indføres fortrinsvis ca. 20 til ca. 50 deoxynukleotidrester for at 30 sikre en stabil forbindelse til ds cDNA'et forlænget med kæder af de komplementære deoxynukleotider. Eksempelvis behandles plasmidet pBR 322 i et passende pufret vandigt medium desuden med en restriktionsendonuklease, f.eks.

Pst I. Når nedbrydningen er afsluttet, deproteiniseres 17 DK 170714 B1 opløsningen med f.eks. phenol. Den terminale addition af deoxynukleotidylrester gennemføres i et konventionelt puffersystem med en tilstrækkelig mængde deoxynukieosid-5 triphosphater, f.eks. dGTP, og terminal deoxynukleotidyl-transferase.

Forlængelsen af ds cDNA’et fremstillet som beskrevet ovenfor (afsnit 2) kan gennemføres på samme måde som syntesen af det lineariserede, deoxynukleotid-forlængede 10 plasmid pBR 322 under anvendelse af det komplementære deoxynukleosidtriphosphat (f.eks. dCTP i stedet for dGTP).

Det lineariserede, kædeforlængede plasid pBR 322 og det kædeforlængede ds cDNA kan anneleres og atter ringsluttes på konventionel måde, dvs. ved baseparring af de komple-15 mentære deoxynukleotidkæder.

Eksempelvis inkuberes en blanding af deoxynukleotidfor-længet (f.eks. dCMP-forlænget) ds cDNA og lineariseret deoxynukleotidforlænget (f.eks. dGMP-forlænget) pBR 322 i fire på hinanden følgende trin af en varighed på en time 20 med forskellige temperaturer (f.eks. 65°C, 46°c, 37°C og 20°C). Det annelerede DNA kan anvendes direkte til transformering til en forenelig bakterie, f.eks Escherichia coli HB 101.

De dannede annelerede hybridplasmider kan anvendes til 25 transformering af Escherichia coli HB 101. Transformeringen af Escherichia coli HB 101 med de annelerede hybridplasmider kan gennemføres under anvendelse af fremgangsmåder kendt fra litteraturen. Fremgangsmåden indbefatter Ca2+-forbehandling af cellerne, således at de 30 tillader DNA-optagelse (f.eks. (24)) og inkubering med hybridplasmidet. Derefter kan cellerne overføres til et selektivt dyrkningsmedium, som tillader adskillelse af de transformerede celler fra modercellerne. Da hybridplas-midet stadig indeholder et tetr-gen, vælges med fordel 18 DK 170714 B1 et agarmedium indeholdende tetracyclin som et vækstinhi-berende stof.

4. Identificering af kloner indeholdende lymfoblastoidt 5 IFN cDNA

Kolonier indeholdende specifikke gener kan identificeres ved anvendelse af forskellige fremgangsmåder, f.eks. RNA-selektionshybridisering, differentielhybridisering eller hybridisering med en syntetisk sporingsdel, medens 10 kloner dannende et særligt genprodukt kan identificeres ved immunologiske eller biologiske analyser.

Medens de immunologiske og biologiske metoder er baseret på dannelsen af det immunologisk og biologisk påviselige genprodukt, er det første sæt fremgangsmåder principielt 15 baseret på tilgængeligheden af en passende sporingsdel, som er i tilstrækkelig ren tilstand til at forhindre uspecifik hybriddannelse. Egnede sporingsstoffer er mRNA'et komplementært til det ønskede gen eller det tilsvarende cDNA.

20 Den ved den foreliggende opfindelse anvendte screeningsmetode omfatter syntese af et 5’-terminalt mærket oligodeoxynukleotid, som er komplementært til både IFN-a-og IFN-Ø-nRNA'er, omvendt transskription af poly(A)RNA med koncentreret indhold af LylFN mRNA under anvendelse 25 af nævnte oligodeoxynukleotid som primer, og in situ kolonihybridiseringen (25) af de filterbundne plasmid-DNA'er med den mærkede cDNA-sporingsdel.

En sammenligning af de kodende stræk (coding stretches) i cDNA'erne fra klonet humant IFN-α og IFN-0 har vist et 30 stræk på tretten nukleotider, som de to cDNA'er har tilfælles (og selvfølgelig også de tilsvarende mRNA'er) (26).

19 DK 170714 B1

Et tilsvarende syntetisk 13-mer oligodeoxynukleotid med formlen 5 *-CCTTCTGGAACTG-3' 5 kan derfor anvendes til at starte cDNA-syntesen fra humant lymfoblastoidt IFN-a- og -/3-mRNA. Oligodeoxy-nukleotidet kan fremstilles på kendt måde, jvf. f.eks.

(27).

Markeringen med 32p gennemføres ligeledes på kendt måde.

10 Poly(A)RNA'et beriget med LyIFN mRNA (jf. trin 1) anvendes som skabelon for syntesen af en IFN-a- og -/3-specifik cDNA-sporingsdel på følgende måde: cDNA-syn-tesen gennemføres i alt væsentligt på samme måde som beskrevet ovenfor (trin 2), idet dog det 5'-mærkede 15 syntetiske oligodeoxynukleotid anvendes som en primer i stedet for oligo(dT). Det mærkede cDNA-produkt depro-teiniseres med f.eks. phenol og isoleres ved udfældning med ethanol. Yderligere rensning kan eksempelvis foretages ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese af cDNA-20 produktet. Produktet kan iagttages ved autoradiografi.

Et enkelt DNA-bånd, som er specifikt for poly(A)RNA fra inducerede celler, og som ikke findes i det produkt, der fremkommer ved anvendelse af poly(A)RNA fra ikke-induce-rede celler, ekstraheres fra gelen. Dets størrelse kan 25 eksempelvis bestemmes ud fra dets relative bevægelighed i relation til mærkede markør-DNA'er med kendt længde.

Produktet repræsenterer en human Ly IFN-a- og -/S-specifik cDNA-sporingsdel.

Kolonier, som overlever og vokser på et agarmedium tilsat 30 tetracyclin (jf. afsnit 3), testes ved hjælp af in situ-kolonihybridiseringsmetoden for kloner indeholdende lymfoblastoidt IFN cDNA. De transformerede kolonier over- 20 DK 170714 B1 føres til nitrocellulosefiltre, og et referencesæt af disse kolonier fremstilles herpå ved duplikeringsafsætning på yderligere agarplader. Kolonierne på filtrene 5 lyseres, deres DNA denatureres og fikseres til filtrene in situ (25).

Inden hybridiseringsproceduren præhybridiseres fordelagtigt det denaturerede DNA på filtrene med en blanding indeholdende blandt andet et DNA af fremmed oprindelse 10 for at opnå lavere baggrund og for at mætte ikke-speci-fikke hybridlseringssteder. Derefter hybridiseres den ovenfor beskrevne radioaktivt mærkede cDNA-prøve med det filterbundne DNA. Efter vaskning af filtrene kan resultatet af hybridiseringsproceduren følges ved hjælp af 15 autoradiografisk analyse på en røntgenfilm. Kolonier, som udviser et positivt respons på røntgenfilmen, kan udtages fra referencesættet og anvendes til yderligere undersøgelse.

Fortrinsvis overføres kun én del af de transformerede 20 kolonier ti nitrocellulosefiltrene. De resterende kolonier anvendes til yderligere testningsprocedurer, som beskrives nærmere i det følgende.

De identificerede kolonier indeholder rekombinant-DNA'er med indsatte dele, som er komplementære til delene i 25 cDNA-sporingsdelen, dvs. DNA-segmenter, som svarer til humane lymfoblastoide gener eller fragmenter deraf. Da de primære kloner af transformerede celler lejlighedsvis indeholder mere end én art rekombinant-DNA-molekyler, isoleres hybridpiasmid-DNA*erne fra de positivt hybridi-30 serede kloner og anvendes til retransformering af

Escherichia coli HB 101 som beskrevet ovenfor (afsnit 3). Hybridpiasmid-DNA’erne kn isoleres på i og for sig kendt måde. Hybridplasmid-DNA'erne underkastes restriktionsanalyse, og en fuldstændig eller delvis nukleotidsekvens-35 analyse af de indsatte cDNA-dele foretages på i og for 21 DK 170714 B1 sig kendt måde for at udvælge hybrid-DNA'er, som er egnede til videre anvendelse. Endvidere kan den partielle sekvensanalyse klargøre, hvorvidt de indsatte IFN cDNA-5 segmenter svarer til de humane lymfoblastoide IFN-a-eller -Ø-gener.

Som anført ovenfor overføres én del af de transformerede kolonier til nitrocellulosefiltrene, og de fikserede DNA'er underkastes in situ kolonihybridisering under 10 anvendelse af et radioaktivt mærket cDNA som sporingsdel, f.eks. en IFN-specifik cDNA-sporingsdel. Rekombi-nant-DNA'erne fra positivt hybridiserende kolonier kan anvendes til testning for yderligere kloner indeholdende rekombinant-DNA-molekyler med samme eller beslægtet 15 indsatte DNA-del (f.eks. IFN-beslægtede sekvenser).

5. Syntese af polypeptider med HuLylFN-lignende aktivitet ved hjælp af Escherichia coli indeholdende HuLylFN-speci-fikke rekombinant-DNA'er

De HuLyIFN cDNA indsatte dele ifølge opfindelsen indsæt-20 tes ved hybridisering på Pst I-stedet i pBR 322 (se ovenfor). Da Pst I-stedet i pBR 322 ligger inden i (S-lactamasegenet, kan der dannes et kondenseret protein, når den indsatte cDNA-del knyttes til denne position i den rigtige orientering med hensyn til transskription og 25 i det rigtige aflæsningsmønster med hensyn til translation. Klonernes IFN-aktlvitet kan bestemmes under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder. I øvrigt er selv de kloner, som ikke udviser nogen IFN-aktivitet, selv om der er et HuLyIFN cDNA til stede, 30 værdifulde. I det tilfælde kan den indsatte cDNA-del isoleres og bindes til ekspressionskontrolområdet på passende måde (jf. afsnit 7) for at opnå høje ekspressionskoncentrationer for det ønskede polypeptid.

Kloner, som syntetiserer polypeptider med HuLylFN-akti- 22 DK 170714 B1 vitet i tilfredsstillende grad, er egnede til produktion i stor målestok. Klonerne kan dyrkes, og polypeptiderne kan udvindes som beskrevet i kapitel 7 og 8.

5 6. Konstruktion af rekombinantplasmider, som er i stand til at udtrykke høje koncentrationer af polypeptider med HuLylFN-aktivitet

For at opnå tilstrækkelig ekspression skal et gen være rigtigt anbragt med hensyn til kontrolområdet, herunder 10 initiatoren for transskription (promotor) og translation (ribosomalt bindingssted).

Som beskrevet i afsnit 3 kan det rekombinante plasmid-DNA indeholde et HuLy cDNA, som eksempelvis er integreret i Pstl-skæringsstedet og dermed i (3-lactamasegenet i pBR 15 322. Hvis bindingen er blevet opnået med den rigtige orientering og det rigtige aflæsningsskema, kan der dannes et fusioneret protein bestående af en del af Ø-lacta-masekæden efterfulgt af HuLyIFN-aminosyresekvensen.

For at forøge effektiviteten af ekspressionen af den 20 indsatte HuLyIFN cDNA-del er det nødvendigt at anbringe den indsatte HuLyIFN cDNA-del i nærheden af ekspressionskontrolsekvensen anført ovenfor, således at der ikke findes ekstra nukleotider (og derfor aminosyrer) foran genet (og derfor polypeptidet med HuLylFN-aktivitet). I 25 tilfælde af HuLyIFN!er er de primære translationsprodukter endvidere præ-interferoner bestående af signal-peptider knyttet til N-enderne af færdige interferoner. Signalpeptidsekvenserne fjernes post-translationelt i den oprindelige progenitorcelle. Imidlertid vil Escherichia 30 coli ikke være i stand til at fjerne præsekvenserne proteolytisk. Derfor fjernes præsekvenserne fordelagtigt fra de indsatte cDNA-dele ved anvendelse af passende fremgangsmåder (se nedenfor), således at det primære translationsprodukt vil være et færdigt IFN-, lignende 23 DK 170714 B1 polypeptid. Til dette formål rekonstitueres genet, som koder for færdigt HuLylFN, in vitro, og det genindsættes i et plasmid tæt ved (operabelt bundet) en ekspressions-5 kontrolsekvens, f.eks. ekspressionskontrolsekvensen i β-1actamasegenet.

Det færdige HuLylFN cDNA kan eksempelvis anbringes under kontrol af /3-1 actamaseekspressionskontrolsekvensen. Da den "modne" indsatte cDNA-del, som koder for et "modent" 10 HuLylFN-lignende polypeptid, ikke starter med kodonet ATG, som er nødvendigt for initieringen af translation, må ATG-tripletten indføres syntetisk. Når man kender nukleotidbasesekvenserne og dermed restriktionsendo-nukleasemønsteret hos både pBR 322 og HuLylFN cDNA, kan 15 eksempelvis følgende fremgangsmåde anvendes. Plasmidet pBR 322 spaltes med Pst I i β-laetamasegenet og nedbrydes med en exonuklease, f.eks. Bal 31, til afkortning af /3-lactamasekodningssekvensen. Det forkortede plasmid bindes til en ds DNA-binder. Binderen indeholder 20 genkendelsessekvensen i en passende restriktionsendo-nuklease, f.eks. Bell (Sau 3A). Det dannede plasmidfrag-ment spaltes med restriktionsendonukleasen, som er karakteristisk for den tilknyttede binder (f.eks. Bell) og derefter med EcoRI (der findes et EcoRI-sted i pBR 25 322, som er anbragt i nærheden af /S-lactamaseekspres- sionskontrolsekvensen). Det dannede DNA-fragment, f.eks.

EcoRI - Bell DNA-fragment, består i det væsentlige af ekspressionskontrolsekvensen fra /3-lactamase (ApPr) og den tilknyttede binder og kan isoleres ved polyacrylamid-30 elektroforese.

På den anden side fraspaltes den indsatte HuLylFN cDNA-del fra et rekombinant DNA-molekyle indeholdende denne, f.eks. ved nedbrydning med restriktionsendonukleasen Pst I. Den isolerede indsatte HuLylFN cDNA-del 35 spaltes endvidere med en anden restriktionsendonuklease (eller om nødvendigt med to andre restriktionsendo- 24 DK 170714 B1 nukleaser eller delvis genbindes) til fjernelse af DNA-sekvensen, som koder for signalpeptidet. Det dannede færdige HuLylFN cDNA har en såkaldt klæbrig ende, som er 5 komplementær til enden i ApPr DNA-fragmentet anført ovenfor (f.eks. en Sau 3A klæbrig ende). Det modne HuLylFN cDNA og ApPr DNA-fragmenterne sammenbindes med ligase på sædvanlig måde (jf. afsnit 3). Sammenbindingen skal resultere i dannelsen af et ATG-kodon. som kommer 10 før det første kodon i det færdige cDNA for at tilvejebringe et rigtigt aflæsningsskema. Det dannede hybrid DNA indeholder Ø-lactamaseekspressionskontrolområdet, et ATG-translationsstartkodon, en DNA-sekvens, som koder for det komplette HuLylFN, og to restriktionsendoukleaseender 15 (f.eks. EcoRI- og Pst I-ender), som er egnede til indføring af hybrid-DNA1 et i plasmidet pBR 322, som er spaltet i overensstemmelse hermed.

Det fremkomne hybridplasmid kan anvendes til transformering af Escherichia coli HB 101 og til styring af synte-20 sen af et omhandlet polypeptld med HuLylFN-aktivitet med høj koncentration.

7. Dyrkning af kloner indeholdende HuLyIFN-specifik re-kombinant-DNA'er

De omhandlede transformerede værter, som i morfologisk 25 henseende ike adskiller sig fra de til transformationen anvendte udgangsstammer, kan anvendes til fremstillingen af polypeptider ifølge opfindelsen med HuLylFN-aktivitet. Fremgangsmåden til fremstilling af disse polypeptider er karakteriseret ved, at den transformerede Escherichia 30 coli-stamme dyrkes i et flydende næringssubstrat indeholdende assimilerbare kilder af carbon og nitrogen og uorganiske salte.

Der kan anvendes forskellige carbonkilder. Som eksempler på foretrukne carbonkilder kan nævnes assimilerbare 25 DK 170714 B1 kulhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et acetat, som kan anvendes enten alene eller i passende blandinger. Egnede nitrogenkilder 5 indbefatter f.eks. aminosyrer, såsom casaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbrydningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrakter, endvidere gærekstrakt, maltekstrakt, majsstøbevand samt ammoniumsalte, såsom ammoniumchlorid, ammoniumsulfat eller 10 ammoniumnitrat, som kan anvendes alene eller i passende blandinger. Anvendelige uorganiske salte indbefatter f.eks. sulfater, chlorider phosphater og carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium.

Dyrkningssubstratet kan endvidere indeholde vækstfrem-15 mende stoffer, f.eks. sporelementer eller individuelle aminosyrer, og/eller stoffer, som udøver et selektionstryk, f.eks. antibiotika, for at forhindre tabet af det HuLylFN-speci fikke rekombinant-DNA.

Dyrkningen gennemføres under anvendelse af konventionel 20 dyrkningsteknik. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, mediets pH-værdi og fermenteringstiden, vælges på en sådan måde, at der opnås maksimale koncentrationer af IFN-lignende polypeptider. I en udvalgt Escherichia coli-stamme dyrkes fortrinsvis under aerobe betingelser 25 ved submers dyrkning med rystning eller omrøring ved en temperatur på fra ca. 20 til ca. 40, fortrinsvis ved ca.

30°C, ved en pH-værdi på fra 4 til 9, fortrinsvis ved pH-værdien 7, og i fra ca. 4 til ca. 20 timer, fortrinsvis i 8-12 timer. Som følge af dyrkningen sker der en 30 intracellulær akkumulering af IFN-lignende polypeptider.

8. Isolering og rensning af polypeptider med IFN-aktivitet

De omhandlede humane lymfoblastoide interferoner kan udvindes fra dyrkningsvæsken ved frigørelse af polypep-tiderne fra cellerne af den transformerede vært og rens- 26 DK 170714 B1 ning af polypeptiderne.

Efter dyrkning af de transformerede Escherichia coli-celler til en tilstrækkelig celletæthed gennemføres det 5 første trin til udvinding af det kopierede polypeptid, ved hvilket det frigøres fra cellens indre. Til dette formål lyseres cellerne ved behandling med et detergent, såsom SDS eller triton. Eventuelt kan der anvendes mekaniske kræfter til oplukning af cellerne, såsom 10 forskydningskræfter (f.eks. X-press, French press) eller rystning med glasperler eller aluminiumoxid. I den dannede polypeptidblanding kan humant LylFN koncentreres på sædvanlig måde, f.eks. ved fældning med ammoniumsulfat eller trichloreddikesyre, gelelektroforese, dialyse, 15 kromatografi, f.eks. ionbytterkromatografi, kromatografi med udelukkelse efter størrelse eller HPLC med omvendt fase og lignende. Den endelige rensning af det forrensede produkt kan eksempelvis opnås ved hjælp af antistofaffinitetkromatografi. Rensningstrinnene kan principielt 20 gennemføres i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Staehelin et al. (28), som er udviklet til rensning af humant leucocytinterferon.

For at opnå et tilstrækkeligt rent produkt kan det være nødvendigt at anvende yderligere rensningstrin, f.eks.

25 kation- eller anionbytterkromatografi, adsorption på hydroxylapatit og HPLC med omvendt fase.

Opfindelsen omfatter især de rekombinante DNA-vektorer i praktisk taget ren form.

De omhandlede polypeptider anvendes på samme måde som de 30 kendte interferoner til behandling af virusinfektioner, tumorer og cancere i det menneskelige legeme, eventuelt i kombination med andre antivirale midler, antitumormidler eller anticancermidler, fortrinsvis i form af farmaceutiske præparater, som indeholder en effektiv mængde af 27 DK 170714 B1 den aktive bestanddel sammen med eller i blanding med uorganiske eller organiske, faste eller flydende, farmaceutisk acceptable bærestoffer, som fortrinsvis er egne-5 de til parenteral indgift.

De omhandlede farmakologisk aktive forbindelser anvendes fortrinsvis i form af præparater eller infusionsopløsninger til parenteral indgift, f.eks. intramuskulær eller intravenøs indgift. Sådanne opløsninger er for- trinsvis 10 isotoniske vandige opløsninger eller suspen- sioner, som kan fremstilles inden anvendelse, f.eks. ud fra lyofiliserede præparater, som indeholder den aktive bestanddel alene eller sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof. De farmaceutiske præparater kan 15 være steriliserede og/eller indeholde hjælpestoffer, f.eks. konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, fugte-midler og/eller emulgeringsmidler, opløseliggørende stoffer, salte til regulering af det osmotiske tryk og/eller puffere. De farmaceutiske præparater, der om 20 ønsket kan indeholde andre farmakologisk værdifulde stoffer, fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. ved hjælp af konventionelle opløsnings- eller lyofilise-ringsfremgangsmåder, og de indeholder fra ca. 0,1 til 100%, især fra ca. 1% til ca. 50%, og i tilfælde af 25 lyofilisater op til 100%, af den aktive bestanddel.

Afhængigt af sygdommens natur og patientens tilstand indgives præparaterne f.eks. intramuskulært, sædvanligvis en til tre gange dagligt i doser på fra ca. 10® til ca. 107 enheder.

30 Opfindelsen forklares nærmere med henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser namalwa ds cDNA-syntese og fremstilling af rekombinante DNA-molekyler, 28 DK 170714 B1 fig. 2 viser fremstillingen af DNA-primer (13-mer) komplementær til αχ- og Ø-IFN mRNA, fig. 3 viser fremstillingen af HuIFN-/3- og HuIFN-a-spe-5 cifik sporingsdel og anvendelse til identifikation af humane lymfoblastoide IFN-holdige kloner, fig. 4 viser nukleotidsekvensen af cDNA-indsætningsdelen fra rekombinantplasmid-DNA'et CG-pBR 322/HlycIFN-l'b, fig. 5 viser nukleotidsekvensen af cDNA-indsætningsdelen 10 fra rekombinantplasmid-DNA'et CG-pBR 322/HlycIFN-Øi, fig. 6 viser nukleotidsekvensen af cDNA-indsætningsdelen fra rekombinantplasmid-DNA'et CG-pBR 322/HlycIFN-4i, fig. 7 viser nukleotidsekvensen af cDNA-indsætningsdelen fra rekombinantplasmid-DNA'et CG-pBR 322/HlycIFN-8'i, 15 fig. 8 viser nukleotidsekvensen af cDNA-insætningsdelen fra rekombinantplasmid-DNA'et CG-pBR 322/HlycIFN-5i, fig. 9 viser fremstillingen af CG-pBR(AP)/LyIFN-a-l-re-kombinant-DNA, fig. 10 viser nukleotidsekvensen af cDNA-indsætningsdelen 20 og det β-lactamaseregulerende område fra klonen CG-pBR (AP ) /LyIFN-a-1, fig. 11 viser fremstillingen af rekombinant-DNA-plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3, fig. 12 viser nukleotidsekvensen af cDNA-indsætningsdelen 25 og det |5-lactamaseregulerende område fra klonen CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3, og 29 DK 170714 B1 fig. 13 viser nukleotidsekvensen af cDNA-indsætnings de len og det Ø-lactamaseregulerende område i plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2.

5 Symboler anvendt i fig. 4-8 har følgende betydninger: aminosyreoinbytning • og ± nukleotidombytning _ sekvens ikke til stede i kendt teknik polyadenyleringssteder i kendt teknik I fjernelse af et nukleotid I indføring af et nukleotid I de pågældende figurer refererer de angivne symboler til den nærmestliggende kendte teknik som anført i eksemplerne.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende 10 eksempler.

30 DK 170714 B1

Eksempler 1 eksemplerne anvendes følgende forkortelser:

EtBr: ethidiumbromid BSA: okseserumalbumin 5 DTT: 1,4-dihtiothreitol (l,4-dimercapto-2,3-butandiol) EDTA: ethylendiamintetraeddikesyre SDS: natriumdodecylsulfat TNE: opløsning indeholdende 100 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl

(pH 7,5) og 5 mM EDTA

10 Tris (Trizma): tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

Tris.HCl: monohydrochloridet af Tris 1. Isolering af poly(A) RNA beriget med HuIFN mRNA (fig. 1) a) Induktion af Namalwaceller

Namalwaceller dyrkes i et dyrkningsmedium RPMI 1640 indehol-15 dende 10% fetal kalveserum ved 37°C. Når celletætheden er 3.106 celler/ml, centrifugeres suspensionen ved 800 G i 10 minutter ved stuetemperatur. De isolerede celler resus-penderes i 200 ml dyrkningsmedium indeholdende glutamin (0,027 rumfangsprocent), penicillin (200 enheder/ml) og 20 streptomycin (50 yg/ml). Cellerne inkuberes i 90 minutter ved 37°C med Newcastle diseasevirus (NDV 110) i et forhold på 190 HAU/10^ celler (HAU: hæmaglutinationsenheder). Ved tilsætning af frisk dyrkningsmedium indstilles celletætheden på 1,3.10^ celler/ml, og cellesuspensionen rystes ved 34°C

Q

25 med 100 omdr./min. Efter 12 timers forløb isoleres 6.10 celler, som resuspenderes i 50 ml phosphatpufret natrium-chloridopløsning ("PBS", 1 liter PBS indeholder 80 g NaCl, 2 g KC1, 14,4 g Na2HP04 og 2 g Itf^PO^). Inden isolering af cellerne udtages en prøve, og interferonaktiviteten be-30 stemmes ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Armstrong (19) under anvendelse af humane CCL-23-celler og vesicular stana-titisvirus (VSV) som challengervirus. Resultatet af bestemmelsen er 4.300 IFN-enheder/ml.

b) Nedbrydning af cellerne og deproteinisering o 35 Cellesuspensionen (6.10 celler i 50 ml PBS) sættes ved 31 DK 170714 B1 stuetemperatur til 800 ml lyseringspuffer bestående af 0,05 M tris.HCl (pH-værdi 7,5), 0,1 M NaCl, 5 mMEDTA og 2% SDS (krystallinsk, researchkvalitetv Serva). Lysatet nedbrydes ved behandling med 0,2 mg/ml præinkuberet (2 timer ved 5 37°C) protease (Protease P, type VI, Sigma) ved stuetempe ratur i 1 time, hvorunder opløsningen omrøres. Opløsningen deproteiniseres ved ekstraktion med 3 gange 500 ml phenol mættet med TNE og 5 gange 500 ml chloroform. Der fås 500 mg nukleinsyre, bestemt ved absorbanten ved 260 nm.

10 c) Fjernelse af kontaminerende DNA og RNA

Den svagt viskose vandige opløsning fremstillet som beskrevet ovenfor under trin lb indstilles til 0,3 M NaCl, og der tilsættes 1 g oligo(dT)-cellulose (type 7, P-L Biochemicals). Efter omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur centrifuge-15 res suspensionen i 1 liters Sorvall-flasker i en Sorvall RC-3 centrifuge ved 4000 omdr./min. i 10 minutter ved stuetemperatur, og oligo(dT)-celluloseopslæmningen vaskes 2 gange med 40 ml 2 x TNE indeholdende 0,5% SDS. Det bundne poly(A) RNA fortyndes derpå med fem på hinanden følgende vaskninger 20 med 2,5 ml E^O. Udbyttet er 720 yg poly(A) RNA bestemt ved måling af den optiske tæthed. Den ovenstående RNA-opløsning fra den første adsorption adsorberes endnu en gang på 1 g oligo(dT)-cellulose og elueres som beskrevet ovenfor, hvorved der fås 320 yg poly(A) RNA. Eluaterne hældes sam-25 men, indstilles til TNE; og poly(A) RNA fældes med 67%'s ethanol ved -20°C i løbet af 10 timer. RNA isoleres ved centrifugering ved 10.000 omdr./min. i en Sorwall RC-5B-centrifuge i 10 minutter ved 0°C. Bundfaldet (1 mg) genopløses i 1 ml 1 mM EDTÅ.

30 RNA'et afprøves for HuIFN mRNA-aktivitet ved injektion til oocyter af Xenopus leavis på følgende måde: 50 ni af RNA-opløsningen injiceres i hver af 20 oocyter. Oocyterne inkuberes i Barth-medium (2 mM Tris, 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 0,33 mM Ca(N03)2.H20, 0,41 mM CaCl2.2H20, 0,82 mM 35 MgS04.7H20, 2,4 mM NaHCOg, 0,01 mg/ml penicillin og 0,01 mg/ml streptomycin, opløsningen er indstillet på pH-værdien 7,6 med HC1) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge DK 170714 B1 32

Gurdon (29)/ Barth (30) og Colman et al. (31). De injicerede oocyter inkuberes i 42-48 timer, og inkuberingsmediet udtages, centrifugeres i 5 minutter i en Eppendorf-centri-fuge, hvorefter den ovenstående væske opbevares ved -20 5 eller -80°C, indtil den anvendes til analyse. IFN-aktiviteten bestemmes i alt væsentligt under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Armstrong (19) , idet dog VSV anvendes som challengervirus på Hep-2-celler (Flow Laboratories).

Oocytekstrakten har en specifik aktivitet på 600 IE-inter-10 feron pr. ug RNA injiceret.

d) Berigelse af poly(A) RNA*et med HuIFN mRNA Poly(A) RNA'et ledes gennem en Chelex-100-søjle (200-400 mesh, Bio-Rad) med lejerumfang på 0,5 ml. Søjlen skylles med 1 ml 1 mM EDTA.

15 Eluatet (1 mg poly(A) RNA i 2 ml EDTA) opvarmes i 2 minutter til 100°C og underkastes centrifugering gennem en saccha-rose-densitetsgradient (6 portioner 14 ml saccharose-opløs-ning med en saccharosekoncentration, der stiger fra 5 til 23% (m/v) og indeholder 50 mM Tris.HCl [pH-værdi 7,5], 20 0,2 M NaCl og 1 mM EDTA). Centrifugeringen gennemføres i en TST 41-rotor (Kontron AG) med 35.000 omdr./min. i 16 timer ved 5°C. Der opsamles 0,3 ml fraktioner med en ISCO gradient opsamler. Til hver fraktion sættes 2 rumfang ethanol, og opløsningen henstår i 10 timer ved -20°C. Det 25 udfældede mRNA fracentrifugeres (Sorvall, HB-4 rotor ved 0°C, 10.000 omdr./min. i 10 minutter). Bundfaldet fra hver fraktion genopløses i 25 μΐ 1 mM EDTA, og hver fraktion testes for human IFN mRNA-aktivitet som beskrevet ovenfor (trin lc), idet der dog kun injiceres 10 oocyter pr. RNA-30 prøve i stedet for 20. Resultaterne er anført i den efter- - følgende tabel 1.

33 DK 170714 B1

Tabel 1

HuIFN mRNA-aktivitet fra fraktioner af saccharose-densi-tetsgradient.

Fraktion nr. IFN-aktivitet (enheder/ml) 5 1-18 19 162 20 162 21 162 22 162 10 23 ikke testet 24 729 25 ikke testet 26 405 27 ikke testet 15 28 486 29 ikke testet 30 162 31 ikke testet 32 162 20 33 ikke testet 34 54 35-40 ikke testet

Fraktionerne 23-29 hældes sammen/ og poly(A) RNA'et renses yderligere på følgende måde: 25 Poly(A) RNA-opløsningen indstilles til 2 x TNE i 0,5% SDS og sættes til en 200 yl oligo(dT)-cellulosesøjle. Søjlen vaskes med 2 ml 2 x TNE i 0,5% SDS, og poly(A) RNA'et elueres ved vaskning med 5 gange 0,5 ml H20. Eluatet indstilles til TNE, og opløsningen ekstraheres 2 gange med 30 et lige så stort rumfang phenol (mættet i TNE) og to gange med et lige så stort rumfang chloroform. Poly(A) RNA'et fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer og isoleres ved centrifugering i en HB-4-rotor som beskrevet ovenfor.

34 DK 170714 B1

Poly(A) RNA'et opløses i 100 yl 0,5 mM EDTA. Udbyttet er 40 yg bestemt ved måling af den optiske tæthed.

En prøve af poly(A) RNA'et analyseres for human IFN-akti-vitet som beskrevet ovenfor under anvendelse af 20 oocyter 5 pr. analyse. Poly(A) RNA-præparatet har en specifik aktivitet på 8.100 IE interferon pr. yg RNA.

2. Fremstilling af dobbeltkædet cDNA (fig. 1)

Poly(A) RNA beriget med HuIFN mRNA (jfr. trin ld) anvendes som skabelon til fremstilling af dobbeltkædet cDNA i alt 10 væsentligt som beskrevet af Efstratiadis et al. (32), Mania-tis et al. (33) og Hoeijmakers et al. (34).

a) Syntese af første kæde 250 yl reaktionsblanding indeholdende 40 mM Tris.HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT (Calbiochem.),

15 1 mM dGTP, dCTP, dTTP (P-L Biochemicals) og 1 mM 22P-dATP

(Amersham, specifik aktivitet 50.000 cpm/nmol), 20 yg/ml oligo(dT)12-18 ^P_L Bi°chemicals), 40 yg/ml poly(A) RNA og 100 enheder aviært myeloblastosis virus (AMV) revers-transskriptase (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida) 20 inkuberes i 80 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved at indstille opløsningen på 10 mM EDTA og 0,1% SDS. Blandingen ekstraheres en gang med 1 rumfang phenol. Den vandige fase reekstraheres med 1 rumfang chloroform og sættes til en kolonne med 3 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, fine).

25 Der udtages fraktioner på 0,1 ml. Radioaktiviteten af hver fraktion bestemmes ved måling af Cerenkov-strålingen. Radioaktive fraktioner hældes sammen, og nukleinsyrerne fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer. Prøven centrifugeres i en HB-4-rotor i 20 minutter ved 10.000 omdr./min.

30 ved 0°C. Bundfaldet opløses i 95 yl H20. 5 yl lONNaOH

tilsættes, og blandingen inkuberes ved 25°C i 40 minutter. Efter neutralisering med 5 M eddikesyre tilsættes 50 yl vand og 2 rumfang ethanol, og prøven henstår ved -20°c i 10 timer. Bundfaldet isoleres ved centrifugering som be-35 skrevet ovenfor og genopløses i 200 yl 0,1 mM EDTA. Udbyttet af enkeltkædet cDNA er 3,7 yg. Størrelsen af cDNA'et 35 DK 170714 B1 er 700-1.500 nukleotider i længden, bestemt ud fra dets elektroforetiske mobilitet i en 6%’s polyacrylamidgel i Tris-borat-EDTA (108 g Tris, 9,3 g dinatrium EDTA og 55 g borsyre pr. liter opløsning med pH-værdi 8,3) indeholdende 5 7 M urinstof, i forhold til markør DNA'er af kendt længde (35) .

b) Syntese af anden kæde og S^-endonukleasenedbrydning

Den dannede cDNA-opløsning opvarmes til 100°C i 90 sekunder, lynafkøles og inkuberes i en 400 yl reaktionsblan-10 ding indeholdende 0,1 M kaliumphosphatpuffer (pH-værdi 6,9), 10 mM MgCl,, 10 mM DTT (Calbiochem), 1 mM dATP, 1 mM dCTP, z 3 1 mM dTTP (P-L, Biochemicals), 1 mM H-dGTP (Amersham, specifik aktivitet 94.000 cpm/nmol) og 165 enheder/ml E.coli DNA polymerase I (Biolabs, New England) i 8 timer 15 ved 15°C. Reaktionen afsluttes ved tilsætning af EDTA og SDS til slutkoncentrationer på henholdsvis 10 mM og 0,1%. Blandingen ekstraheres med phenol og chloroform, kromatograf eres over Sephadex G-50 (Pharmacia, fine, 2 ml lejerumfang) og fældes med ethanol som beskrevet ovenfor (trin 20 2a).

Det dannede DNA behandles i en 50 yl inkuberingsblanding indeholdende 0,25 M NaCl, 50 mM natriumacetat (pH-værdi 4,5) og 1 mM ZnS04 med 6 enheder S-^-endonuklease (P-L Biochemi-cals) ved 37°C i 30 minutter. Reaktionen afbrydes med 25 0,1% SDS og 10 mM EDTA. Reaktionsblandingen deproteinise- res med 1 rumfang phenol (mættet i 50 mM natriumacetat, pH-værdi 4,5) og chloroform. Den vandige fase kromatogra-feres på en søjle med 2 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, fine) i TNE. Der opsamles fraktioner på 100 yl, og Cerenkov-strå-30 lingen bestemmes for hver enkelt fraktion. De udelukkede fraktioner hældes sammen, og DNA'et fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer som beskrevet ovenfor. Bundfaldet centrifugeres i en HB-4-rotor (se ovenfor), og det isolerede bundfald opløses i 100 yl opløsning indeholdende 35 10 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5) og 0,5 mM EDTA. Der fås 4 yg DNA.

36 DK 170714 B1 DNA'et fraktioneres gennem en saccharose-densitetsgradient (5-23%) i 50 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5) og 1 mM EDTA i en TST-6O-rotor (Kontron AG). Centrifugeringen gennemføres ved 55.000 omdr./min. i 5 timer ved 15°C. Den DNA-fraktion, 5 som aflejres hurtigere end et 800 basepar markør DNA, som kører i en parallelgradient, hældes sammen, indstilles til TNE og fældes med 67%'s ethanol ved-20°C i 10 timer.

Der fås 0,4 yg dobbeltkædet cDNA.

3. Fremstilling af pBR 322-bundet cDNA (fig. 1) 10 a) Fremstilling af dCMP-forlænget OPNÅ 3'-enderne i 0,1 yg af det fremstillede ds cDNA forsynes med poly(dC)-haler i et reaktionsmedium på 10 yl indeholdende 100 mM natriumcacodylat (pH-værdi 7,2), 2,5 mM CoCl2, 50 yg BSA (Calbiochem.) pr. ml, 1 mM dCTP og 10 enheder 15 terminal-deoxynukleotidyltransferase (P-L Biochemicals) pr. yg ds cDNA. Efter inkubering (20 minutter ved 27°C), tilsættes EDTA til 10 mM, og prøven henstår ved -20°C til senere anvendelse.

b) Fremstilling af Pst I-spaltet, dGMP-forlænget pBR 322 20 10 yg pBR 322 plasmid-DNA spaltes med 10 enheder Pst I

endonuklease (Biolabs) i en 10.0 yl opløsning indeholdende 50 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 6 mM 2-mercaptoethanol og 100 yg/ml gelatine i 1 time ved 37°C.

Opløsningen ekstraheres med 1 rumfang phenol og chloroform.

25 Opløsningen indstilles til TNE, og det lineariserede DNA fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 5 timer.

Det lineariserede plasmid-DNA forlænges med dGMP i en 200 yl reaktionsblanding indeholdende 100 mM natriumcacodylat (pH 7,2), 5 mM MgCl2, 20 mM NaH2PO^, 50 yg BSA pr. ml, 1 mM ? 30 dGTP og 100 enheder terminal-deoxynukleotidyltranferase (P-L Biochemicals). Efter inkubering i 20 minutter ved 37°C tilsættes EDTA til 10 mM, og reaktionsblandingen fryses ved -20°C til senere anvendelse.

37 DK 170714 B1 c) Annelering af dGMP-forlænget pBR 322 til dCMP-forlæn- get ds cDNA_

En blanding af dCMP-forlænget dobbeltkædet cDNA (0,1 yg) og lineariseret pBR 322 med dGMP-haler (0,5 yg) i 500 yl 5 TNE-puffer inkuberes ved 65°C i 1 time, ved 46°C i 1 time, ved 37°C i 1 time og ved 20°C i 1 time. Opløsningen indeholdende pBR 322-bundet cDNA sættes på is og anvendes straks til transformeringen.

4. Transformering af Escherichia coli HB 101 med det anne- 10 lerede hybrldplasmid_

Calciumbehandlet Escherichia coli HB 101 forberedes til transformeringen ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Mandel et al. (24) .

10 yl reaktionsblanding indeholdende de annelerede pBR 322 15 hybridplasmid DNA'er fremstillet som beskrevet ovenfor (trin 3c) sættes til en blanding indeholdende 150 yl calciumbehandlet Escherichia coli HB 101 i 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 og 10 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5) i et samlet rumfang på 200 yl.

20 Blandingen afkøles i is i 20 minutter, opvarmes til 42°C i 1 minut og inkuberes ved 20°C i 10 minutter. Der tilsættes 1 ml tryptonmedium (tryptonmediet indeholder 10 g Bacto-Trypton (Difco), 1 g gærekstrakt (Difco), 1 g glucose, 8 g NaCl og 294 mg CaCl2·2__H20 i 1 liter destilleret vand), 25 og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C ved rystning med 300 omdr./min. Blandingen udhældes på to agarplader (McConkey agar, Difco, 0,6 ml/plade) tilsat 10 yg/ml tetracyclin (Sigma). Pladerne inkuberes ved 37°C i 12-17 timer. Der fås ca. 5.600 tetracyclinresistente kolonier 30 af transformeret Escherichia coli HB 101.

5. Identificering af kloner indeholdende HuIFN cDNA

a) Syntese af en 13-mer oligodeoxynukleotidprimer (fig. 2)

Et oligodeoxynukleotid, som er komplementært til et stræk (stretch) på 13 nukleotider, som er fælles for både HuIFN-35 a^- og HuIFN-β-mRNA, fremstilles kemisk ved anvendelse af 38 DK 170714 B1 phosphotriestermetoden (jfr. Itakura et al. (36)# de Rooij et al. (37)). De enkelte trin i syntesemetoden er vist i fig. 2. Udgangsmaterialerne angivet i linie 1 i fig. 2 (mono- og dideoxynukleotider med beskyttelsesgrupper) er 5 kendt fra litteraturen. Beskyttelsesgrupperne fraspaltes ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet af Itakura et al.: Deblokeringen af 5'-monomethoxytrityl (M)- eller -dime-thoxytrityl (D)-substituerede hydroxylgrupper gennemføres med eddikesyre (80%'s) ved stuetemperatur, og (3-cyano-10 ethylphosphatgrupperne spaltes med 0,1 N natriumhydroxid i en blanding af dioxan og vand (4:1) ved stuetemperatur. Kondensationen af byggestenene gennemføres ved anvendelse af triisopropylbenzensulfonylchlorid som aktiveringsmiddel til dannelse af oligodeoxynukleotider op til den helt 15 beskyttede 13-mere primer anført i linie 7 i fig. 2. Det sidste trin (fuldstændig fjernelse af alle beskyttelsesgrupper) gennemføres på følgende måde:

En opløsning indeholdende 64,6 mg af det helt beskyttede 13-mere oligodeoxynukleotid i 3 ml dioxan og 1 ml acetoni-20 tril behandles med 200 mg syn-p-nitrobenzaldoxim og 124 mg N ,Ν ,N , N -tetramethylguanidirv og blandingen henstår i 27 timer. Der tilsættes 10 ml ammoniak (25%'s), og opløsningen henstår i 24 timer ved 50°C. Efter fordampning af opløsningsmidlet i vakuum opløses remanensen i vand, indstilles 25 på pH-værdien 4 med eddikesyre, og opløsningen ekstra-heres 20 gange med chloroform. Den vandige opløsning inddampes i vakuum, og remanensen opløses i 1 ml eddikesyre i80%’rs). Opløsningen henstår i 1 time, fortyndes med 6 ml vand, ekstraheres 3 gange med chloroform og lyofiliseres.

30 Den tredje del af det dannede råprodukt renses ved kromatografi på DEAE-Sephadex A 25 (søjlestørrelse: 10x1,3 cm) gennem en 200 ml 0,2-1,2 M triethylammoniumhydrogencarbonatgradient. Eluering af hovedfraktionen forløber ved en gradientkoncentration på 0,87 M. Hovedfraktionen, der består 35 af det rene produkt, hvilket konstateres ved en HPLC-ana-lyse, fordampes tre gange med vand, filtreres gennem 10 ml Dowex 50 W (NH^-salt) og lyofiliseres. HPLC (permafase AAX, 39 DK 170714 B1 søjlestørrelse 90χ0,3 cm, 60°C, 2 ml/min., gradient: A = 0,005 M KH2P04, B = 0,5 M KH2P04, 0,5 M KC1, pH 4,5, 20% A -^ 100% B på 30 min.): tR 11,8 min.

32 b) Fremstilling af en P-mærket human IFN-α- og IFN-β- 5 specifik cDNA-sporingsdel (fig. 3)_ 40 pmol af den syntetiske 13-mere oligodeoxynukleotidprimer (jfr. trin 5a) og 40 pmol [γ-^Ρ]-ΑΤΡ (5.700 Ci.mmol Amersham) kombineres i 100 yl 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2 og 5 mM DTT. Der tilsættes 50 enheder T4-poly-10 nukleotidkinase (P-L Biochemicals), og efter 30 minutters forløb ved 37°C tilsættes yderligere 20 enheder af enzymet, hvorefter inkuberingen fortsættes i yderligere 15 minutter ved 37°C. Den vandige opløsning indeholdende den ^P-mærke-de primer renses ved ekstraktion med phenol. Yderligere 15 rensning opnås ved kromatografi på en 4 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, fine)-søjle i 1 mM Tris.HCl (pH 8,0). Der opsamles fraktioner på 0,1 ml. Radioaktiviteten for hver fraktion bestemmes ved måling af Cerenkov-strålingen. Der

C

opnås en specifik aktivitet på 4.10 Cerenkov cpm pr. pmol 3 2 20 oligodeoxynukleotid. Den P-mærkede primer (40 pmol) lyo-filiseres, resuspenderes i 91 yl H20 indeholdende 14 yg poly(A) RNA (fra inducerede Namalwaceller, fremstillet som beskrevet i trin 1) og opvarmes i 60 sekunder til 100°C.

Der tilsættes 9 yl 4 M KC1, og blandingen inkuberes ved 25 25°C i 60 minutter. Der tilsættes 450 yl reverstransSkripta- seblanding, således at reaktionsrumfanget indeholder 40 mM Tris.HCl (pH 8), 4 mM MgCl2, 1 mM DTT (Calbiochem, Inc.), 74 mM KC1, 1 mM af dATP, dGTP, dCTP og dTTP (P-L Biochemicals) og 90 enheder aviært myeloblastosisvirus (AMVj-30 reverstransskriptasa Inkubationen fortsættes i 1 time ved 37°C. Opløsningen ekstraheres med 1 rumfang phenol (mættet med hensyn til TNE), og nukleinsyrerne fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer. Bundfaldet isoleres ved centrifugering (HB-4-rotor, 20 min., 10.000 omdr./ 35 min., 0°C), hvorpå det genopløses i 20 yl farveblanding indeholdende 90% (rumfang/rumfang) formamid (Merck, pro analysis), 1 mM EDTA, 0,05% bromphenolblåt og 0,05% xylencvanolblåt. Prøven opvarmes til 90°C i 2 minutter og 40 DK 170714 B1 sættes til en 5%'s pol^acrylamidgel i Tris-borat-EDTA (jfr. Peacock et al. (35)). I autodiagrammet ses et enkelt bånd, som migrerer mellem 267 bp- og 435 bp- P-mærkede markør DNA-fragmenter dannet ved Hae IH-nedbrydningen af 5 plasmidet pBR 322. Det P-mærkede cDNA-fragment ekstra-heres fra gelen og renses som beskrevet af Mueller et al.

(38). Der fås 20.000 Cerenkov cpm af den P-mærkede humane IFN-α- og IFN-Ø-specifikke cDNA-sporingsdel.

c) Testning for kolonier indeholdende HuIFN cDNA (fig. 3) 10 1650 af de transformante kolonier fremstillet som beskrevet ovenfor (trin 4) overføres til nitrocellulosefiltre BA 85 (Schleicher & Schuell, diameter 8 cm). Cellerne lyseres, og DNA'et denatureres og fikseres til filtrene in situ under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Grunstein og Hog-15 ness (25). Filtrene med kolonierne præhybridiseres i 4 x SET (en opløsning indeholdende 0,15 M NaCl, 30 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA), 0,1% (vægt/rumfang) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,1% (vægt/rumfang) polyvinylpyrrolidon (PVP-360, Sigma), 0,1% (rumfang/rumfang) BSA, 0,5% SDS, 50 yg/ml 20 denatureret kalvethymus DNA (fremstillet som følger: 5 mg kalve-thymus DNA (type I, Sigma) koges i 10 minutter i 0,5 M NaOH til forskydning af DNA'et,'neutrliseres med 5 M eddikesyre og fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C. Bundfaldet isoleres ved centrifugering i en HB-4-rotor i 10 25 minutter ved 0°C og genopløses i 500 μΐ 0,5 mM EDTA) ved 65°C i 4 timer under anvendelse af 20 ml blandinger pr.

3 32 filter og hybridiseres med 10 Cerenkov cpm af den P-mærkede sporingsdel pr. nitrocellulosefilter i 5 x SET, 0,02% (vægt/rumfang) Ficoll, 0,01% polyvinylpyrrolidon, 30 0,02% (rumfang/rumfang) BSA, 0,2% SDS og 50 yg/ml dena tureret kalve-thymus DNA. Hybridiseringen gennemføres ved 65°C i 36 timer.

Filtrene skylles en gang i chloroform, to gange i SET, 0,5% SDS ved stuetemperatur og to gange i SET, 0,5% SDS 35 il time ved 60°C og en gang med 3 mM Trizma-base ved stuetemperatur i 1 time. Filtrene tørres ved aftrykning på 3 MM-papir (Whatman), og en røntgenfilm eksponeres med 41 DK 170714 B1 filtrene under anvendelse af en skærm (Ilford intensifying screen) ved -80°C i 72 timer.

Ni positive kolonier identificeres på autoradiogrammet, og de anvendes til fortsat undersøgelse.

5 Da de primære kloner af transformerede celler lejlighedsvis indeholder mere end én art rekombinant DNA-molekyler, isoleres hybridplasmid DNAerne fra de ni positivt hybridiserede kloner og anvendes til retransformering af Escherichia coli HB-101 som beskrevet ovenfor.

10 Hybridplasmid DNA'et isoleres på følgende måde: 1 koloni anvendes til inokulering af 10 ml tryptonmedium tilsat 10 yg/ml tetracyclin som ovenfor i en 25 ml Erlenmeyer-kolbe. Kulturen rystes i 15-18 timer ved 37°C med 300 omdr./min. Cellerne isoleres ved centrifugering (Sorvall, 15 HS-4-rotor, 10 min. med 4000 omdr./min., 4°C). Der fås ca. 0,1 g celler, som resuspenderes i 1 ml 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). 0,25 ml lysozymopløsning (10 mg/ml i 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), lysozym fås fra Sigma) tilsættes, og efter inkubering ved 0°C i 10 min. tilsættes 0,15 ml 0,5 M 20 EDTA (pH 7,5). Efter yderligere 10 minutter ved 0°C.tilsættes 60 yl 2% Triton X-100 (Merck). Efter 30 minutters forløb ved 0°C centrifugeres prøven i 30 minutter ved 15.000 omdr./min. og 4°C i en Sorvall SA-600-rotor.

Den ovenstående væske deproteiniseres med 1 rumfangsdel 25 phenol (mættet med TNE). Påserne adskilles ved centrifugering (Sorvall HB-4-rotor) i 10 minutter ved 5.000 omdr./ min. ved 4°C. Den øvre fase ekstraheres to gange med 1 rumfangsdel chloroform. RNAse A fra pancreas (Sigma, 10 mg/ml i TNE, forvarmet i 10 minutter ved 85°C) tilsæt-30 tes til en slutkoncentration på 25 yg/ml, og blandingen inkuberes i 40 minutter ved 37°C. Opløsningen indstilles derefter på 1 M NaCl og 10% polyethylenglycol 6000 (Fluka, autoklaveret i 20 minutter ved 120°C) og inkuberes ved -10°C i 2 timer. Bundfaldet isoleres i en Sorvall 35 HB-4-rotor (20 minutter ved 10.000 omdr./min., 0°C) og genopløses i 100 yl TNE. DNA-opløsningen ekstraheres med 1 rumfang phenol/ og DNA'et fældes med 2 rumfang ethanol ved -80°C i 10 minutter.

42 DK 170714 B1

Bundfaldet fracentrifugeres i en Eppendorf centrifuge, og DNA'et genopløses i 20 yl 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) 5 og 0,5 mM EDTA. Fra 10 ml kultur fås 8-10 yg hybrid-plas-mid DNA.

Escherichia coli HB-101 transformeres med hvert enkelt af de ni isolerede hybrid DNA'er, og de transformerede celler overføres til agarplader indeholdende tetracyclin, som 10 beskrevet ovenfor (trin 4). Fra hver transformering udtages tre tetracyclinresistente kloner, 10 ml kulturer fremstilles, og hybrid DNA'erne isoleres fra kulturerne som beskrevet ovenfor. Alle DNA-prøverne analyseres før og efter retransformeringen ved spaltning med Pst I endonu-15 klease og elektroforese gennem en 1% agarosegel i 50 mM Tris-acetat (pH 7,8) og 1 mM EDTA. Alle prøverne udviser identiske spaltningsmønstre før og efter retrans-formationen.

Et af de reklonede rekombinant DNA-molekyler giver 2 bånd, 20 et med mobiliteten af Pst I-spaltet pBR 322, det andet med en mobilitet svarende til ca. 1000 bp. Det betegnes CG-pBR 322/HLycIFN-l'b.

Et andet rekombinant DNA giver 3 bånd, et med mobiliteten for Pst I-spaltet pBR 322, et med en mobilitet på ca. 600 bp 25 og et med en mobilitet på ca. 150 bp. Rekombinant DNA-mo-lekylet i denne klon betegnes CG-pBR 322/HLycIFN-31· d. Karakterisering af klonerne CG-pBR 322/HLycIFN-l'b og CG-pBR 322/HLycIFN-81

Rekombinantplasmid DNA'erne fra klonerne CG-pBR 322/HLyc-30 IFN-l'b og CG-pBR 322/HLycIFN-31 isoleres fra kulturerne som beskrevet ovenfor (trin 5c) og karakteriseres ved bestemmelse af nukleotidsekvensen af den indsatte cDNA-del under anvendelse af fremgangsmåden som beskrevet af Maxam og Gilbert (41). I princippet anvendes følgende 43 DK 170714 B1 metode:

Det isolerede rekombinantplasmid DNA nedbrydes med forskellige restriktionsendonukleaser. Enzymerne anvendes i alt væsentligt som beskrevet af leverandøren (New England 5 Biolabs), idet dog BSA erstattes med gelatine i enzympufferne. Opløsningen indeholdende det spaltede DNA de-proteiniseres med phenol (mættet med TNE). DNA'et fældes med ethanol, genopløses i 50 mM Tris.HCl (pH 8,0)ved en DNA-koncentration på 50 yg/ml og inkuberes med 0,1 enhe-10 der alkalisk kalvetarmphosphatase (calf intestinal alkaline phosphatase) (Boehringer) pr. pmol DNA 5'-ender i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved opvarmning af opløsningen i 60 minutter til 65°C. DNA'et renses ved DEAE-cellulosekromatografi som beskrevet af Mueller et 15 al. (38) og fældes med ethanol. DNA'et mærkes derpå 5'- 32 terminalt med [γ- P]-ATP (>5000 Ci/mmol, Amersham) og T4-polynukleotidkinase (P-L Biochemicals) i alt væsentligt som beskrevet af Maxam og Gilbert (39), idet dog DNA1et ikke denatureres inden kinasereaktionen. Sædvan-20 ligvis er de specifikke aktiviteter 1-3.106 cpm/pmol 5’-ender.

De mærkede DNA-fragmenter spaltes med en anden restrik-tionsendonuklease, og produkterne adskilles ved elektro-forese gennem en 6%, 8% eller 10% polyacrylamidgel i Tris-25 borat-EDTA-puffer. DNA-fragmenterne ekstraheres fra gelen og renses som beskrevet af Mueller et al. (38). Til bestemmelsen af nukleotidsekvenserne nedbrydes DNA-fragmen-terne kemisk, og produkterne adskilles ved polyacrylamid-gelelektroforese som beskrevet af Maxam og Gilbert (39).

30 Specielt behandles de isolerede plasmid DNA'er fra klonen CG-pBR 322/HLycIFN-l'b på følgende måde. 5 yg af plas-midet DNA nedbrydes med Bgl II, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Pvu II. Pvu II-Bgl II*- og Bgl Il-Pvu II*-DNA-fragmenterne isoleres på en 6% polyacrylamidgel. (* angiver 35 mærkningsstedet). Separat nedbrydes 5 yg af plasmidet med Alu I, markeres 5'-terminalt og spaltes med Pst I. Pst I-Alu I*-DNA-fragmentet isoleres på en 8% polyacrylamidgel.

DK 170714 Bl 44

De enkelte fragmenter nedbrydes og sekvenseres derpå i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert. Den fremkomne nukleotidsekvens er angivet i fig. 4.

Et stræk på ca. 25-35 deoxyguanosinrester er i 5'-enden 5 foran den indsatte cDNA-del. Den viste nukleotidsekvens ligner en del sekvensen af IFN-α (type F) cDNA beskrevet af Go eddel et al. [(15), jfr. også Weissmann GLO)], men den udviser ikke desto mindre en hel del tydelige afvigelser (punktmutationer), hvoraf nogle påvirker de resulte-10 rende aminosyrer (jfr. fig. 4).

Det isolerede plasmid DNA fra klonen CG-pBR 322/HLycIFN-f^ behandles på tilsvarende måde. 5 yg af plasmidet nedbrydes med Pvu II og mærkes 5'-terminalt. Halvdelen af blandingen spaltes med Pst I, og resten spaltes med Bgl II. Pst I-15 Pvu II*- og Bgl II-Pvu II*-fragmenterne isoleres ved elektrofor ese på en 6% polyacrylamidgel og nedbrydes som beskrevet ovenfor. Nukleotidsekvensen (N-terminalsekvens) er anført i fig. 5 og viser, at den indsatte cDNA-del begynder ved nukleotid nr. 102 i IFN-β^ cDNA'et som beskre-20 vet af Taniguchi et al. (40). Den indsatte cDNA-del er derfor i stand til at kode for human IFN-β^, som mangler 11 aminosyrer ved N-afslutningen. Den indsatte cDNA-del er flankeret ved 5'-enden af et stræk på ca. 20-25 deoxyguanosinrester og udviser en punktmutation ved stilling 25 153, hvori en C-rest omdannes til en T-rest uden påvirkning af den resulterende aminosyre.

e. Identificering af kloner indeholdende rekombinant DNA-molekyler, som kryds-hybridiserer til indsatte dele af CG-pBR 32 2/HLycIFN-1'b og CG-pBR 322/HLycIFN-^ 30 Rekombinantplasmid DNA'erne fra klonerne CG-pBR 322/HLyc-IFN-l'b og CG-pBR 322/HLycIFN-32 isoleres fra kulturerne som beskrevet ovenfor (trin 5c). CG-pBR 322/HLycIFN-l'b plasmid-DNA'et (5 yg) nedbrydes med Bgl II, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Pvu II. Separat nedbrydes det iso-35 lerede CG-pBR 322/HLyclFN-£^ plasmid-DNA (5 yg) med Pvu II, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Bgl II. Pvu II- 45 DK 170714 B1

Bgl II* (351 bp) DNA-fragmentet (prøve A) og Pvu II*-Bgl II (368 bp) DNA-fragmentet (prøve B) isoleres fra en 8% polyacrylamidgel som beskrevet ovenfor (trin 5d) og anvendes til in situ kolonihybridisering (se nedenfor).

5 Spaltningen af plasmid DNA'erne, mærkningen og rensningen af DNA-fragmenterne gennemføres på samme måde som beskrevet ovenfor (trin 5d).

4000 af de transformante kolonier fremstillet som beskrevet ovenfor (trin 4) overføres til nitrocellulosefiltre 10 BA 85 (Schleicher & Schuell, diameter 8 cm). Cellerne lyseres, og deres DNA denatureres og fikseres til filtrene in situ ved fremgangsmåden ifølge Grunstein og Hog-ness (25). Hybridiseringer til prøverne A og B (begge prøver er blandede) foretages som beskrevet ovenfor (trin 15 5c). Ved autoradiografi identificeres 6 positive kolonier, hvoraf 3 betegnes E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-Sj^ og E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8.[ 20 og anvendes til yderligere undersøgelser. Plasmid DNA'erne fra disse kloner isoleres, retransformeres og reisoleres som beskrevet ovenfor (trin 5c, 5d).

For at bestemme naturen af de indsatte dele i rekombinant-DNA'erne foretages bestemmelse af nukleotidsekvenserne i 25 de indsatte cDNA-dele (delvis eller fuldstændigt) ved anvendelse af den ovenfor beskrevne almindelige fremgangsmåde (trin 5d).

Nærmere betegnet nedbrydes 5 yg af hver af de isolerede plasmid-DNA'er CG-pBR 322/HLycIFN-41 og CG-pBR 322/HLycIFN-30 8£ med Pvu II, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Pst I.

DNA-fragmenterne fraktioneres på en 8% polyacrylamidgel, og Pst Ι-Pvu II* (~120 bp) fra 8|-DNA og Pst Ι-Pvu II* (82 bp) fra 4^-DNA isoleres som sædvanligt.

46 DK 170714 B1

Det isolerede plasmid-DNA CG-pBR 322/HLycIFN-52 behandles på følgende måde. 5 ug af plasmid-DNA'et nedbrydes med Hae III, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Pst I.

Pst I-Hae III* (57 bp) DNA-fragmentet isoleres på en 10%'s 5 polyacrylamidgel. Separat nedbrydes 5 ug af plasmidet med Ecor I, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Pst I.

Pst I-EcoR I* (235 bp) og EcoR I*-Pst I (-700 bp) DNA-fragmenterne isoleres på en 8%'s polyacrylamidgel. De forskellige DNA-fragmenter underkastes sekvensanalyse 10 under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert (39).

Nukleotidsekvenserne i de indsatte cDNA-dele er vist i fig. 6-8. I fig. 6 er nukleotidsekvensen i den indsatte cDNA-del af CG-pBR 322/HLycIFN-4^ vist. Den indsatte del 15 støder ved 5'-enden op til et stræk på 23 deoxyguanosin-rester og omfatter en del af IFN-c^ (Le) cDNA'et beskrevet af Streuli et al. (13). I det 3'-extracistroniske område er der nogle mindre afvigelser (punktmutationer) og et stræk på yderligere 318 nukleotider. Nukleotidse-20 kvensen for den indsatte cDNA-del af CG-pBR 322/HLycIFN-8^ er vist i fig. 7. Den indsatte del støder ved 5'-enden op til et stræk på 20-23 deoxyguanosinrester og ligner, men er ikke identisk med det IFN-α (type D) cDNA, som er beskrevet af Goeddel et al. [(15), jfr. også Mantei et 25 al. (12)]· Bortset fra forskelle i cDNA-områderne før og efter IFN-kodningssekvensen indeholder IFN-genet i stillingerne 28-30 en GCC-triplet og i stillingerne 409-411 en GCG-triplet, som koder for alanin i stedet for henholdsvis GTC og GTG, der koder for valin. Nukleotidsekvensen 30 for den indsatte cDNA-del af CG-pBR 322/HLycIFN-5^ (se fig. 8) viser et stræk på 17 deoxyguanosinrester ved 5'-enden. Nukleotidsekvensen er beslægtet med nukleotidsekvensen i IFN-α (type B) cDNA beskrevet af Goeddel et al. (15). Der er imidlertid yderligere nukleotider ved 35 5'-enden i den indsatte cDNA-del i HLycIFN-5^, og der findes ligeledes punktmutationer, udskæringer og indsætninger i det extracistroniske område og i IFN-kodningse-kvensen, især i stillingerne 22 og 361-372.

47 DK 170714 B1 6. Syntese af humane interferoner ved hjælp af Escherichia coli indeholdende humane IFN-specifikke rekombinant- DNA-molekyler_

De 5 kloner, som indeholder humane IFN-specifikke rekom-5 binant DNA-molekyler, nemlig E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8.[ og 10 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-^ afprøves for IFN-aktivitet, hvilket i hvert enkelt tilfælde gennemføres på følgende måde:

Kulturer af den tilsvarende Escherichia coli-klon (30 ml suspensioner) dyrkes i tryptonmedium til en optisk tæthed 15 (°D65ø) ca. 1· Cellerne isoleres og resuspenderes i 0,5 ml af en vandig opløsning indeholdende 30 mM NaCl og 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lysozym (Sigma) tilsættes til 1 mg/ml. Efter 30 minutter ved 0°C fryses suspensionerne (flydende nitrogen) og optøes (ved 37°C) 5 gange og cen-20 trifugeres i 20 minutter ved 20.000 omdr./min. i en SS Sorvall-rotor ved 4°C. De ovenstående væsker afprøves for IFN-aktivitet under anvendelse af den cytopatiske bioanalyse ifølge Armstrong (19) som beskrevet i trin 1c.

Der findes følgende aktiviteter: 25 Ekstraktkilde IFN-aktivitet E. coli HB 101 indeholdende rekombinant-DNA (IE ml) CG-pBR 322/HLycIFN-l'b 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-41 0;0 30 CG-pBR 322/HLycIFN-51 10.000;10.000 CG-pBR 322/HLycIFN-8£ 100;100 CG-pBR 322/HLycIFN-&1 0;0

Muligvis indeholder kloner, som ikke udviser målelige IFN-aktiviteter, rekombinant-DNA'er, hvori den indsatte 48 DK 170714 B1

HuLyIFN-cDNA-del har en forkert orientering med hensyn til transskriptionsretningen. Rekombinant-DNA'et fra en sådan klon (CG-pBR 322/HLycIFN-*l’b) indeholdende en indsat cDNA-del i fuld længde reorienteres derfor på 5 følgende måde:

Plasmid-DNA'et fra klonen Escherichia coli (HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b isoleres som beskrevet ovenfor (trin 5c) og spaltes med Pst I. 0,5 ug af det spaltede DNA i 20 μΐ af en pufferblanding indeholdende 20 mM Tris.HCl 10 (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 25 mM NaCl og 50 yg/ml gelatine behandles med 0,2 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) og 0,5 mM ATP i 2 timer ved 15°C. Escherichia coli HB 101 transformeres med cDNA-blandingen som beskrevet ovenfor (trin 4). Transformerede kolonier udvælges på McConkey-15 agarplader tilsat tetracyclin, hvorefter de genanbringes på nitrocellulosefiltre. 4 bakteriekolonier, som hybridi- 32 serer til det P-mærkede Pvu II-Bgl II*-fragment (351 bp) fra rekombinant-DNA'et CG-pBR 322/HLycIFN-l'b (jfr. trin 5e) betegnes Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-20 l'b^ til l'b^. Ekstrakter af de fire kloner fremstilles og afprøves for IFN-aktivitet som beskrevet ovenfor. Der opnås følgende aktiviteter:

Ekstraktkilde IFN-aktivitet E. coli HB 101 indeholdende 25 rekombinant-DNA (IE ml) CG-pBR 322/HLycIFN-l'bj, 0*0 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b2 0*0 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b3 0*0 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b4 30*30 30 Plasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-l'b^ indeholder derfor en indsat cDNA-del, som er i stand til at styre syntesen af et polypeptid med IFN-aktivtet.

49 DK 170714 B1 7. Dannelse af rekombinantplasmider, som kan producere polypeptider med IFN-aktivitet i høj koncentration, og transformering af Escherichia coli HB 101 med disse plasmider_ 5 A. Dannelse af CG-pBR (ÅP)/LyIFN-a-1 rekombinantplasmid For at forøge udbyttet af det IFN-specifikke protein fra klonen Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b gennemføres nedenstående synteserække som vist skematisk i fig. 9.

10 a. Fremstilling af cDNA-indsætningsdelen

Rekombinantplasmid-DNA'et (150 yg) fra klonen Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b spaltes med Pst I (Biolabs) under anvendelse af standardfremgangsmåder (jfr. trin 5d). Efter ekstraktion med phenol og fæld-15 ning med ethanol isoleres den afskårne indsitningsdel ved hjælp af saccharosegradientcentrifugering (5-23%) i 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Centrifugeringen gennemføres ved 35.000 omdr./min. i en TST-41-rotor (Kon-tron AG) ved 15°C i 16 timer. Der opsamles fraktioner 20 på 0,3 ml med en ISCO-gradientkollektor med 1 ml/min. Fraktionerne indeholdende det lille fragment (dvs. indsætningsdelen) hældes sammen. DNA'et fældes med ethanol som sædvanlig, og bundfaldet isoleres ved centrifugering i en HB-4-rotor (Sorvall) ved 10.000 omdr./min. ved 0°C 25 i 10 minutter. Bundfaldet genopløses i 60 yl 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA. Der udvindes 30 yg DNA bestemt ved måling af den optiske tæthed.

DNA-indsætningsdelen (10 yg) nedbrydes med Hae III (Biolabs), og fragmenterne fraktioneres på en 2% agarose-30 gel i en opløsning indeholdende 50 mM Tris, 50 mM borsyre, 1 mM EDTA og 0,5 yg/ml ethidiumbromid. De største DNA-fragmenter, Hae III-Pst I (869 bp) og Hae III-Hae III (82 bp, jfr. fig. 9, henholdsvis fragmenterne 3 og 4), udskæres hver for sig fra gelen, overføres ved hjælp af en injek-35 tionssprøjte til 5 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA og elueres natten over ved rystning. Eluatet 56 DK 170714 B1 ledes gennem en 100 yl DE-52 (Whatman) Pasteur-pipette-søjle til absorption af DNA'et. Søjlen vaskes med 2 ml af den samme puffer, og DNA'et elueres med 400 μΐ af en opløsning indeholdende 1,5 M NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0) 5 og 1 mM EDTA. DNA'et fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C natten over. Bundfaldet fracentrifugeres i en Eppendorf-centrifuge.

Hae III-Hae III-DNA-fragmentet (82 bp) genopløses og nedbrydes med Sau 3A (Biolabs). Enzymet inaktiveres ved 10 opvarmning til 65°C i 30 minutter. Der tilsættes 1 μg af Hae III-Pst I DNA-fragmentet (869 bp), opløsningen indstilles til 10 mM MgC^r 10 mM DTT og 0,5 mM ATP, og der tilsættes T4 DNA-ligase (Biolabs) til 30 enheder/μΐ reaktionsrumfang. Opløsningen inkuberes i 10 timer ved 15 15°C. Efter ekstraktion med phenol og chloroform fraktio neres blandingen på en 2% agarosegel i Tris-borat-EDTA i nærværelse af ethidiumbromid. Sau 3A-Pst I DNA-fragmentet (jfr. fig. 9, fragment 5) ekstraheres som beskrevet ovenfor, fældes med ethanol og genopløses i 10 μΐ af en 20 opløsning indeholdende 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA.

b. Fremstilling af DNA-fragmentet indeholdende det β- lactamaseregulerende område (ApPr) af pBR 322_

Plasmidet pBR 322 spaltes med Pst I (jfr. trin 3b) og 25 behandles med 4 enheder/ml af exonukleasen Bal 31 (Bethes-da Research Lab.) ved 30°C i 4-10 minutter til fjernelse af segmentet, som koder for β-lactamasen.

En kemisk DNA-binder med formlen 5'-ATGTGTGATCACACAT-3' 30 syntetiseres under anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde (trin 5a). Binderen adderes til det Bal 31-behandlede pBR 322 DNA ved anvendelse af en konventionel additionsproces (ligatering). Det dannede hybridmolekyle spaltes med restriktionsendonukleaser Bel I (Biolabs) og 35 EcoR I. Nedbrydningsprodukterne fraktioneres på en 8% 51 DK 170714 B1 polyacrylamidgel i Tris-borat-EDTA som beskrevet ovenfor (trin 2a). DNA-fragmenter (ApPr DNA-fragmenter), som mi-grerer mellem 184 bp- og 234 bp-markerings DNA'er isoleres som beskrevet ovenfor (trin 7a) og fældes med etha-5 nol på sædvanlig måde. Bundfaldet genopløses i en opløsning indeholdende 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA.

c. Ligatering af ApPr DNA-fragmentet til cDNA-indsæt-ningsdelen og fremstilling af plasmidet CG-pBR(AP)/

LyIFN-a-1_ 10 Opløsningerne indeholdende ApPr DNA-fragmenterne og cDNA-indsætningsdelen hældes sammen. Blandingen indstilles til 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,5 mM ATP og inkuberes med 30 enheder/yl T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 12 timer. Efter ekstraktion med phenol og chloroform 15 fraktioneres blandingen på en 1% lavtsmeltende saccha-rosegel (Biorad). Det dannede ApPr-cDNA-fragment bindes til det store fragment fra pBR 322 spaltet med både Pst I (Biolabs) og EcoR I (Biolabs) på følgende måde. Gelstykket indeholdende ApPr cDNA-fragmentet (ca. 20 yl) blandes med 20 Pst I-EcoR I-fragmentet fra pBR 322, smeltes ved 65°C i 2 minutter, afkøles til 37°C, indstilles til 0,5 mM ATP, 10 mM DTT og 10 mM MgCl2 og inkuberes med 30 enheder/yl T4 DNA-ligase (Biolabs) i 12 timer ved 15°C til dannelse af en opløsning indeholdende rekombinantplasmi-25 det med betegnelsen CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1.

d. Transformering af Escherichia coli HB 101 med plas- midet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1_

En tiendedel af rumfanget af en opløsning indeholdende 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 og 100 mM MgCl2 30 sættes til opløsningen indeholdende plasmidet CG-pBR(AP)/ LyIFN-α-Ι. De kombinerede opløsninger opvarmes i 10 minutter til 65°C til inaktivering af ligasen, hvorefter de afkøles til 37°C. Opløsningen anvendes derpå til trans- 2+ formeringen af Ca -behandlet Escherichia coli HB 101 som 35 beskrevet ovenfor (trin 4), og der fremstilles plader på McConkey-agar tilsat 10 yg/ml tetracyclin. De transformerede kolonier testes for IFN-aktivitet (jfr. trin 6).

52 DK 170714 B1

Klonen, som danner den største IFN-aktivitet, udvælges og betegnes Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1.

Der findes en aktivitet på 40.000 (IE/ml), som repræsenterer en 1300 gange stimulering sammenlignet med den 5 oprindelige klon Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLyc-IFN-l'b.

Rekombinantplasmid DNA'et fra klonen CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1 isoleres fra kulturen som beskrevet ovenfor (trin 3c) og karakteriseres ved bestemmelse af nukleotidsekvensen af 10 cDNA-indsætningsdelen (IFN-gen) og det β-lactamaseregule-rende område. Resultaterne fremgår af fig. 10.

53 DK 170714 B1 B. Fremstilling af højkombinantplasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-g-3

Ubytterne af det IFN-specifikke protein fra klonen Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^ forbedres på 5 følgende måde (jf. fig. 11) - a. Fremstilling af DNA-fragmentet indeholdende det β-lactamaseregulerende område fra CG-pBR(AP)/LvIFN-g-1 CG-pBR (AP)/LyIFN-g-1 DNA (100 y g) spaltes med Hind III (Biolabs) og Bgl II (Biolabs). Efter ekstrahering med phenol 10 og fældning med ethanol isoleres det fraspaltede DNA-frag-ment ved anvendelse af saccharosedensitetsgradientcentri-fugering (5-23%) i 50 mM Tris*HCl (pH-værdi 8,0) og 1 mM EDTA. Centrifugeringen gennemføres ved 58000 rpm i en TST 60 rotor (Kontron AG) ved 15°C i 4 timer. Der opsam-15 les fraktioner på 0,2 ml som beskrevet ovenfor. Fraktionerne indeholdende det lille fragment (Hind III-Bgl II) hældes sammen, og DNA'et udfældes med ethanol som sædvanligt. Bundfaldet genopløses i 80 yl 10 mM Tris*HCl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA. Der udvindes 16 yg DNA be-20 stemt ved måling af den optiske tæthed.

DNA-fragmentet (Hind III-Bgl II) (4 yg) spaltes med Sau 3A (Biolabs), og nedbrydningsprodukterne fraktioneres på en 6%'s polyacrylamidgel i tris-borat-EDTA som beskrevet ovenfor, DNA-fragmenterne farves i EtBr (0,5 yg/ml), 25 Hind III-Sau 3A DNA-fragmentet (239 bp) ekstraheres og isoleres på den ovenfor beskrevne måde. DNA'et udfældes med ethanol på sædvanlig måde. Bundfaldet genopløses i 20 yl 10 mM Tris*HCl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA.

b. Fældning af den indsatte cDNA-del 30 Den indsatte cDNA-del spaltes fra rekombinantplasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-8£ med Pst I på samme måde som beskrevet ovenfor (afsnit 7a).

54 DK 170714 B1 cDNA-indsætningsdelen (2 yg) spaltes med 2,5 enheder Sau 3A (Biolabs) i 10 yg/ml EtBr og inkuberes ved 37°C i 60 minutter. Spaltningsprodukterne ekstraheres med phenol, * og DNA'et fældes i ethanol på den ovenfor beskrevne må-5 de. DNA-fragmenterne fraktioneres på en 1,2%'s agarosegel i en opløsning indeholdende 50 mM Tris, 50 mM borsyre, 1 mM EDTA og 0,5 yg/ml ethidiumbromid.

Det næststørste DNA (Sau 3A-Pst I: 693 bp) ekstraheres fra gelen og renses under anvendelse af den i afsnit 7a) 10 beskrevne fremgangsmåde. DNA'et genopløses i 20 yl 10 mM TriS‘HCl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA.

c. Ligatering af Hind III-Sau 3A DNA-fragmentet til cDNA-indsætningsdelen (Sau 3A-Pst I)

Lige store mængder af de to DNA-fragmenter (- 50 ng) in-15 kuberes i en opløsning indeholdende 10 mM MgC^/ 10 mM DTT, 0,5 mM ATP og 30 enheder/yl T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 3 timer. Blandingen inkuberes i 15 minutter ved 80°C og indstilles på 50 mM NaCl. DNA-blandingen spaltes med 0,5 enheder Pst I (Biolabs) og en enhed Hind 20 III (Biolabs) i 20 minutter ved 37°C. DNA'et ekstraheres med phenol, der fældes med ethanol, og produktet genopløses i 20 yl 10 mM Tris*HCl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA.

Halvdelen af den fremkomne blanding ligateres til det 25 store Hind III-Pst I DNA-fragment fra plasmidet pBR 322 (~ 100 ng) i 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,5 mM ATP indeholdende 30 enheder/yl T4 DNA-ligase (Biolabs) i 2 timer ved 15°C til dannelse af en opløsning indeholdende rekom-binantplasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3.

30 d. Transformering af Escherichia coli HB 101 med plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-g-3

En tiendedel af rumfanget af den ovenfor fremstillede op- 55 DK 170714 B1 løsning anvendes til transformering af Escherichia coli HB 101 som beskrevet ovenfor under trin 4. De transformerede kolonier anvendes til afprøvning for IFN-aktivi-tet som beskrevet ovenfor (jf. trin 6) .

5 Klonen, som syntetiserer IFN-aktivitet i højeste koncentration, udvælges og betegnes Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3.

IFN-aktiviteten bestemmes som beskrevet ovenfor (trin 6).

Der konstateres en aktivitet på 70.000 (IE/ml), hvilket 10 repræsenterer en 700 gange stimulering sammenlignet med den oprindelige klon Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/ HLycIFN-8^.

Rekombinantplasmidet DNA'et fra klonen CG-pBR(AP)/LyIFN-ct-3 isoleres fra kulturen som beskrevet ovenfor (trin 3c) 15 og karakteriseres ved bestemmelse af nukleotidsekvensen i cDNA-indsætningsdelen (IFN-gen) og i det β-lactamase-regulerende område. Resultaterne er vist i fig. 12.

Fremstillingsfremgangsmåden for plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 kan generelt anvendes til alle α-IFN cDNA-gener eller 20 hensigtsmæssigt spaltede kromosomale a-IFN-gener.

Eksempelvis fremstilles plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 ud fra plasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-51 på samme måde som beskrevet for plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3. Dette nye plasmid indeholder DNA-indsætningsdelen fra CG-pBR 322/ 25 HLycIFN-5^ og det (3-lactamaseregulerende område fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1. En klon med betegnelsen Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 udvælges som beskrevet ovenfor. Der konstateres en IFN-aktivitet på 50.000 (IE/ml), hvilket repræsenterer en femdobbelt stimulering sammenlig-30 net med den oprindelige Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-5^. Nukleotidsekvensen i cDNA-indsætnings-delen og det β-lactamaseregulerende område i plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 bestemmes som beskrevet ovenfor og er angivet i fig. 13.

56 DK 170714 B1 8. Dyrkning af stammen Escherichia coli HB 101 CG-pBR (AP)/LyIFN-a-3 i fermenteringsskala

Stammen Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 dyrkes i medium nr. X, som pr. liter opløsning indeholder 5 følgende bestanddele:

Na2HP04‘7H20 13,25 g KH2P04 3,0

NaCl 0,5 nh4ci 1,0 10 CaCl2-2H20 0,015

MgS04*7H20 0,25

Fe-(III)-citrat 0,006

Casaminosyrer 18,0 Gærekstrakt 2,0 15 Cerelose 8,0

Tetracyclin 0,01

Separat steriliseres cerelosen og tetracyclinet ved henholdsvis varmesterilisering og sterilfiltrering. Tre 2 liter rystekolber indeholdende 500 ml af mediet nr. X inoku-20 leres med cellerne fra en veldyrket agarkultur. Rystekolberne er forsynet med fire prelplader, og der foretages inkubering på et roterende rystebord med 120 omdr./minut ved 30°C i 11 timer. 1,5 liter af denne forkultur overføres til en 500 liter fermenteringsbeholder indeholden-25 de 300 liter medium nr. X og dyrkes under følgende betingelser: omrøring ved 350-500 omdr./minut med en flad skovl-turbine, beluftningshastighed 0,3-1,0 liter/liter«minut, fermenteringsbeholderhovedtryk 0,3 bar, temperatur 30°C. Koncentrationen af opløst oxygen holdes på mindst 50%'s 30 mætning ved at forøge beluftningshastigheden og, om nødvendigt, tillige omrøringshastigheden til de maksimale værdier. pH-Værdien holdes over 6,8 ved reguleret til- - sætning af NaOH. Efter dyrkning i ca. 10 timer har kulturen nået den maksimale interferon-koncentration [be-35 stemt ifølge Armstrong (19)], og kulturen høstes.

57 DK 170714 B1 9. Isolering og rensning af HLyIFN-a-3 a. Fremstilling af polypeptidopløsningen til den mono-klonale antistofsøjle 280 liter dyrkningsvæske med pH-værdi 7,2 afkøles til 10°C, 5 og cellerne isoleres ved hjælp af et slamfjernelsesapparat (Alfa-Laval BRPX-207). Den klare ovenstående væske indeholder ingen IFN-aktivitet. Inden isolering af cellemassen, som er samlet inden i den faste skål i slamfjer-nelsesapparatet, erstattes den ovenstående væske med 20 10 liter lyseringspuffer A [50 mM Tris*HCl, 50 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 10 mM PMSF (phenylmethylsulfonyIfluorid), 1 mM L-cystein, indstillet med HC1 til pH-værdien 8,2], og centrifugeskålens indhold (7 liter) udtømmes under fuldstændig slamfjernelse. Slamfjernelsesapparatet vaskes tre 15 gange med 2 liter lyseringspuffer A. Den fremkomne cellemasse indstilles med puffer A på 20 liter, hvorved der opnås en pH-værdi på 6,9. Efter afkøling til 5-10°C le-des suspensionen gennem en Dyno -mølle (type KDL-Pilot, 1,41) forsynet med polyurethanomrøringsplader og 1170 ml 20 glasperler med en diameter på 0,5-0,75 mm ved en omrøringshastighed på 3350 omdr./minut og en fødehastighed på 5 liter pr. time, hvorved cellerne åbnes. 800 ml lyseringspuffer A (indeholdende desuden 100 g polyethylen-imin indstillet på pH-værdien 8,2 med HC1) sættes til 25 den fremkomne suspension af de åbnede celler ved 2°C under forsigtig omrøring. Suspensionen, som har en pH-værdi på ca. 7,6, afkøles i 3 timer til -2°C og centrifugeres. Til den ovenstående væske (17,2 liter) sættes 3028 g ammoniumsulfat. Den svagt uklare blanding cen-30 trifugeres efter 1 times henstand ved 6°C. Den ovenstående væske behandles med 4324 g ammoniumsulfat og henstår natten over, hvorefter den centrifugeres ved 3000 omdr./ minut. Den våde centrifugemasse (ca. 1224 g) opløses i puffer B (25 mM Tris’HCl, 10 ]jM PMSF, indstillet på pH-35 værdien 8,5 med HC1), hvorved der fås 2800 ml af en op- 58 DK 170714 B1 løsning indeholdende det ønskede polypeptid.

700 ml af denne polypeptidopløsning diafiltreres ved stuetemperatur gennem en H1P10 hulfilterpatron ved hjælp af et Amicon DC-2 hulfiltersystem under anvendelse af 5 7 liter af puffersystemet B. Filterpatronen vaskes med puffer Bf den diafiltrerede opløsning og vaskevæskerne hældes sammen (1440 ml) og føres med en strømningsha-

A

stighed på 200 ml pr. time til en DEAE-søjle (Trisacryl M DEAE, LKB 2205-300) med et lejerumfang på 450 ml, som 10 er blevet præækvilibreret med puffer B. Den første poly-peptidfraktion med en UV-absorption med en bølgelængde på 280 nm kastes bort. Søjlen vaskes yderligeie med puffer B, indtil mindst 5 lejerumfang for vaskevæsker har basisabsorptionslinien ved 280 nm. De absorberede polypepti-15 der elueres derpå med 2,8 liter puffer C (0,2 M NaCl, 25 mM Tris*HCl, pH-værdi 8,5). Søjlekromatograferingen gennemføres ved 4°C. Ved analyse ifølge Armstrong (19) 5 viser eluatet en IFN-aktivitet på 1,4 x 10 IE/mg polypeptid. Eluatet indstilles med 2 M HC1 på pH-værdien 20 7,4, og portioner på 100 ml deraf fryses ved -20°C, ind til de skal anvendes på den monoklonale antistofsøjle.

b. Rensning af humant LyIFN-g-3 på en monoklonal antistof-søjle

Den monoklonale antistofsøjle 1K2-20 (lejerumfang 0,8 ml, 25 se nedenfor) ækvilibreres med PBS [phosphatpufret na- triumchloridopløsning: 0,137 M NaCl, 0,0027 M KC1, 0,0077 M Na2HP04-12H20, 0,0015 M KH2P04 (pH = 7,4)] og 10 ml portioner af den ovenfor beskrevne polypeptidopløsning sættes til søjlen ved stuetemperatur med en strømningshastig-30 hed på 10 ml pr. time. De første fraktioner indeholdende de ikke-adsorberede polypeptider og 3 ml PBS-vaskevæske * kastes bort. Andre uspecifikke bundne polypeptider elueres med 3 ml PBS indeholdende yderligere 0,5 M NaCl og 0,2% Triton X 100. Søjlen vaskes med 3 ml PBS, hvorefter 35 de specifikt adsorberede polypeptider elueres med 3 ml 59 DK 170714 B1 puffer D (0,1 M citronsyre, 0,3 M NaCl, pH-værdi = 2).

Denne fraktion og 4 ml af en efterfølgende PBS-vaskevæ-ske hældes sammen, indstilles på pH-værdien 6,3 med 2 N

natriumhydroxidopløsning og koncentreres til dettidobbel-

O TM

5 te ved 4 C ved hjælp af en nedsænkelig CX molekylsepa- ΰ rator (Millipore ). Koncentratet sættes til en søjle med Sephadex G-25 (fine) (2,6 x 34 cm, lejerumfang 200 ml) ækvilibreret med 0,025 M histidin*HCl med pH-værdi 6,3.

Søjlen elueres ved 4°c og med en strømningshastighed 10 på 42 ml/time med den samme histidin’HCl-opløsning med pH-værdien 6,3, hvorved der opsamles 20 fraktioner på hver 10,5 ml. Polypeptidholdige fraktioner påvises ved hjælp af deres optiske absorption ved 280 nm. Fraktionerne 7 og 8 indeholder polypeptidet med IFN-aktivitet, 15 som lokaliseres ved anvendelse af analysen ifølge Armstrong (19). De aktive fraktioner indeholdende LyIFN-a-3 opbevares ved -20°C eller i et isbad til senere anven-

O

delse. Fraktionernes IFN-aktivitet er 1,8 x 10 IE/mg polypeptid (19).

20 Ved lyofilisering af ovenstående fraktioner fra 1 ml opløs-inger fås 20-40 yg polypeptid.

SDS-polyacrylamidgelelektroforese (jf. (41)) giver en molekylvægt for det fremstillede LyIFN-a-3 på ca. 18 kDalton.

25 Ultratyndtlagsisoelektrisk fokusering på polyacrylamidgel (100 yM), foretaget under anvendelse af fremgangsmåden ifølge B.J. Radola (42), i et pH-område fra 4,5 til 6,5 giver det rene aktive humane LyIFN-a-3 ved det isoelek-triske punkt på 5,3-5,4 pH-enheder.

30 c. Fremstilling af den monoklonale antistofsøjle 1K2-20 (A) Immunisering af mus

Balb/c-mus (8 uger gamle, leveret fra dyrefarmen Sisseln, 5 60 DK 170714 B1

Schweiz) injiceres med 3 x 10 enheder af humant leucocyt IFN-α (renhed 1%) i komplet Freund's adjuvans (Difco) fordelt i fire trædepuder. På den 30. dag injiceres den samme mængde IFN i ufuldstændig Freund's adjuvans på samme 5 måde. En tredie injektion foretages den 85. dag, hvor 5 der intraperitonealt indgives 4 x 10 enheder humant leucocyt IFN i natriumchloridopløsning. Fire dage senere udtages milten til fusionen.

(B) Fremstilling af hybridomer 10 Alle fusionsforsøgene under anvendelse af X63-Ag8-653 myeloma-linie (43) gennemføres i alt væsentligt under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Kohier og Milstein 8 7 (44) ved blanding af 10 miltceller med 10 myeloma-celler under anvendelse af 1 ml 50%'S polyethylenglycol 15 (PEG 1500, Serva) (45j. Efter vaskning resuspenderes cellerne i 48 ml standard Dulbecco's minimale essential-medium (Gibco). Der tilsættes 15% fetalt kalveserum og g 3 x 10 peritoneale exodatceller fra normale mus pr. fusion, som feeder-celler. Cellerne fordeles i 48 x 1 ml 20 Costar-huller (wells). Kulturerne fodres' to gange om ugen med standard selektivt medium (44) i 3-6 uger. Når hybriderne er vokset, fryses de, og de ovenstående væsker testes for anti-IFN-aktivitet som beskrevet i det følgende. Kloningen af hybridomacellerne gennemføres 25 ved begrænset fortynding i mikrotiterplader.

(C) Antistofanalyser

Til afprøvning af anti-IFN-aktiviteten af den ovenstående væske inkuberes 50 yl IFN-α (slut-10-20 enheder IFN/ml) 30 med 50 Pi af den ovenstående dyrkningsvæske ved stuetemperatur, og 30-60 minutter senere foretages analyse for rest-IFN-aktivitet under anvendelse af en standard-IFN-analysemetode. Denne metode, der virker med konventionelle antistoffer, svigter eller giver ikke-reproducer- 61 DK 170714 B1 bare resultater for analysen af ovenstående hybridoma-væsker. Den følgende kombinerede immunofældnings-bio-analyse er derfor udviklet til dette formål. 50 yl råt 4 IFN-a (10 E/ml) blandes (i mikrorør 3810, Eppendorf) 5 med en lige så stor mængde ovenstående dyrkningsvæske, og blandingen inkuberes ved 37°C i 2-4 timer. Derefter tilsættes 50 yl forud titreret kaninantimuse-Ig-anti-stof (Nordic), og blandingen inkuberes først ved 37°C i 1 time og derefter ved 4°C i 16 timer til dannelse 10 af immunkomplekser. Derefter centrifugeres rørene ved 12.000 omdr./minut i 5 minutter i et koldt rum. Den ovenstående væske stilles til side, og bundfaldet vaskes én gang med 1 ml pufret natriumchloridopløsning med pH-værdi 7,2. Efter vaskningen opløses bundfaldet 15 i 200 yl natriumchloridopløsning med pH-værdi 2,2. IFN-aktiviteten bestemmes ved fremgangsmåden ifølge Armstrong (19) .

(D) Rensning af anti-IFN-antistof isoleret fra ascitisk væske_ 20 Balb/c-mus forbehandles ved intraperitoneal indgift med 0,4 ml Pristan (Carl Roth). En uge senere foretages intra-

C

peritoneal injektion med 2-5x10 hybridomaceller. Aski-tisk væske udtages flere gange fra hver mus. Væskerne hældes sammen og fryses ved -80°C. Efter optøning centri-25 fugeres blandingen ved 16.000 omdr./min. i 30 minutter.

Fedtet i toppen suges fra, og den ovenstående væske uden indhold af rester stilles til side. Om nødvendigt kan centrifugeringen gentages. Der fås en rå immunoglobulin-fraktion fra den ascitiske væske ved fældning med 18%'s 30 Na2S04 ved stuetemperatur. Derefter ledes denne fraktion gennem Sephacryl G 200 (Pharmacia) under anvendelse af producentens anvisninger og under anvendelse af 0,1 M Tris.HCl-puffer med pH-værdi 8,2. Aktive fraktioner hældes sammen og koncentreres ved anvendelse af Amicon XM 35 50-filtre (Amicon). Der foretages proteinbestemmelse ved OD2go“måling under den forudsætning, at 1 mg protein 62 DK 170714 B1 fremkalder en absorbans på 1,2 ved 280 nm i en 1 cm cuvette.

(E) Immunoadsorbentsøjle 1K2-20 1 ml aflejret Affi-Gel 10 (Bio-Rad) kobles til 15 mg 5 immunoglobulin fra monoklonalt anti-IFN-antistof i henhold til producentens instruktion: Affi-Gel 10 vaskes på en centret glasfiltertragt først med koldt destilleret vand og derpå med en 0,1 M NaHCO^-opløsning med pH-værdi 8,0 (koblingspuffer). 50% gel i koblingspuf-10 fer overføres til et plastrør, blandes med en tilsvarende mængde renset antistofopløsning og roteres i 4 timer ved stuetemperatur. Efter kobling vaskes gelen med koblingspuffer, og til blokering af uomsatte steder behandles den med 0,1 ml 1 M ethanolamin-HCl (pH-værdi 8,0) 15 pr. ml gel i 1-2 timer ved stuetemperatur. Gelen vaskes med phosphatpufret natriumchloridopløsning i nærværelse af 10 mM NaNg og holdes deri ved 4°C. 0,8 ml af den dannede gel anvendes til fremstilling af den monoklonale antistofsøjle (betegnet 1K2-20) anvendt til fremstil-20 lingen af humant LylFN (jfr. ovenfor).

10. Farmaceutiske præparater (parenteral indgift) 2 mg lymfoblastoidt interferon, f.eks. LyIFN-a-3 isoleret fra klonen Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LylFN-

O

a-3 (se eksempel 9), med en specifik aktivitet på 1,8x10 25 enheder/mg, opløses i 30 ml 5 N humant serumalbumin.

Den fremkomne opløsning ledes gennem et bakteriologisk filter, og den filtrerede opløsning overføres under aseptiske betingelser til 100 hætteglas, som hver inde- g holder 3,6x10 enheder rent lymfoblastoidt interferon.

30 Hætteglassene, som er velegnede til parenteral indgift, opbevares fortrinsvis i kulden, f.eks. ved -20°C.

På samme måde kan der fremstilles hætteglas indeholdende g *7 7,2x10 eller 1,08x10 enheder ved anvendelse af henholdsvis 4 eller 6 mg af ovennævnte lymfoblastoide 35 interferon.

4 63 DK 170714 B1 11. Sammenligningsforsøg I nedenstående forsøg anvendes følgende interferoner:

LeIF-οΑ (Roferon A) 5 LeIF-aD (svarer til LyIFN-a-l)

LyIFN-a-2

Alle interferonerne er praktisk taget rene bestemt ved HPLC-analyse.

1. Forstærkning af human NK-aktivitet 10 Naturlige dræberceller (NK-celler) er en heterogen subpopulation af lymfocyter, som kan lysere målceller uden forudgående sensibilisering. Interferonpræparater forøger basal NK-celleaktivitet (Rager-Zisman og Bloom (1985), British Med. Bull. 41, 22-27).

15 Effektorceller præpareres ud fra heparinbehandlet blod fra normale voksne humane donorer på en diskontinuert Percoll-gradient efterfulgt af gennemledning på "Nylon”®-søjler. Effektorceller inkuberes med interferon i 2 timer ved 37°C og vaskes derefter inden afprøvning.

20 NK-celleaktiviteten bestemmes med en direkte 51cr-frigørelsesanalyse [Timonen og Saksela (1980) J.

Immunol. Methods 36, 285-291]. Resultaterne angives i lytiske enheder (LEj/lO^-celler. I disse forsøg repræsenterer 1 LE det antal celler, som er nødvendige 25 for at opnå en cytotoksisitet på 30%. Resultaterne er gennemsnitsværdien af 10 forskellige forsøg.

64 DK 170714 B1

Koncentration af IFN Aktivitet af NK-celler i pg/ml i lytiske enheder 0 129 5 LyIFN-a-2 1,5 139 15 182 150 250 1500 270

LeIF-aD 1,5 122 10 15 141 150 161 1500 213 2. Specifik antiviral virkning

LelF-aA koncentration: 22,5 jig/ml 15 LyIFN-a-2 koncentration: 11 /ig/ml

International Interferonreference: GA023-902-530

Bioanalyse

Reduktion af cytopatisk virkning under anvendelse af humane Wish- eller Hep-2-celler behandlet med mengovirus 20 [Rubinstein et al., J. Virology 37, 755 (1981)].

Specifik virkning på humane celler (geometrisk middelværdi af to uafhængige forsøg).

WISH-celler Hep-2-celler

LelF-aA 9,2 x 107 IE/mg 5,8 x 107 IE/mg 25 LyIFN-a-2 2,51 x 108 IE/mg 2,44 x 108 IE/mg 3. Antiproliferative virkninger in vitro a. Materialer og metoder

Tumorceller BT-20: østrogenreceptornegativ brystcancerlinie 30 ME 180: cervix carcinoma-linie 65 DK 170714 B1

Cellerne dyrkes i Eagles medium ved 37°C, 5% CO 2 i luft.

Væksthæmning 5 Tumorceller (1000-5000) podes i 96-hullers mikrotiter-plader og inkuberes natten over. Forsøgsforbindelser fortyndet med dyrkningsmedium tilsættes i rækkefortyndinger. Pladerne inkuberes i 6 dage, hvorved kontrolkulturerne undergår mindst fire celledelinger. Efter 10 inkubering fikseres cellerne med 20% glutaraldehyd, vaskes med vand og farves med 0,05% methylenblåt. Efter vaskning elueres farvestoffet med 3% saltsyre, og den optiske tæthed pr. hul bestemmes ved hjælp af et Titertek multiskan-apparat -ved ¢20 nm. IC5£)“værdierne beregnes ved 15 hjælp af et computersystem under anvendelse af formlen OD620 Test " OD620 Start - x 100 OD620 Kontr°l ” OI>620 Start IC50 defineres som den koncentration af forsøgsforbindelse, som fører til 50% celler pr. hul sammenlignet med kontrolkulturer ved afslutning af inkubationsperioden.

_ , . . IC$o (antiproliferative enh.)

20 Cellelinie a_2 eA «D

HE 180 292 2108 > 10* 44 520 > 10* BT-20 <20 <20 838 40 108 2569 66 DK 170714 B1

Deponering af de fremstillede mikroorganismer Mikroorganisker og rekombinant DNA-molekyler fremstillet ved de heri beskrevne fremgangsmåder er eksemplificeret 5 ved kulturer deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktatens bestemmelser i kultursamlingen i Agricultural Research Culture Collection (NRRL) den 14. september 1981 og er tildelt følgende deponeringsnumre.

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-31: NRRL B-12528

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41: NRRL B-12529

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b: NRRL B-12530 Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51: NRRL B-12531

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^: NRRL B-12532 67 DK 170714 B1

Litteratursteder.

1. W.E. Stewart, II, The Interferon System, Springer Verlag, Vienna (1979).

5 2. E.A. Haveil et al., "Characteristics of Human

Lymphoblastoid (Namalva) Interferon", J. Gen. Virol. 38, 51-59 (1977).

3. A.D. Sagar et al., "Heterogeneity of interferon mRNA species from Sendai virus-induced human lymphobla- 10 stoid (Namalva) cells and Newcastle disease virus-induced murin fibroblastoid (L) cells", Nucl. Acids Res. 9, 149-160 (1981).

4. M. Rubinstein et al., "Human Leukocyte Interferon: Production, Purification to Homogeneity and 15 Initial Characterization", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 640-644 (1979).

5. W.E. Stewart, II et al., "Effect of Glycosylation Inhibitors on the Production and Properties of Human Leukocyte Interferon"; Virology 97, 473-476 (1979).

20 6. K.C. Zoon et al., "Amino Terminal Sequence of the

Major Component of Human Lymphoblastoid Interferon",

Science 207, 527-528 (1980).

7. P.B. Sehgal et al., "Heterogeneity of poly(I)-poly(C)-induced human fibroblast interferon in RNA

25 species", Nature 288, 95-97 (1980).

8. J. Weissenbach et al., "Two interferon mRNAs in human fibroblasts: In vitro translation and Escherichia coli cloning studies", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7152-7156 (1980).

30 9. S.N. Cohen and H.W. Boyer, "Process for Producing

Biologically Functional Molecular Chimeras", U.S. patent No. 4.237.224 (Leland Stanford Jr. University).

10. C. Weissmann, "DNA Sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon- 35 like polypeptides", European patent application No. 32134 (Biogen N.V.).

68 DK 170714 B1 11. S. Nagata et al., "Synthesis in E. coli of a polypeptide with human leukocyte interferon Activity".

Nature 284, 316-320 (1980).

5 12. N. Mantei et al., "The nucleotide sequence of a cloned human leukocyte interferon cDNA", Gene 10, 1-10 (1980).

13. M. Streuli et al., "At least Three Human Type a Interferons: Structure of a2", Science 209, 1343-1347 10 (1980).

14. D.V. Goeddel et al, "Human leukocyte interferon produced by E. coli is biologically active", Nature 287, 411-416 (1980).

15. D.V. Goeddel et al., "The structure of eight 15 distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs", Nature 290, 20-26 (1981).

16. J. Groneberg et al., "Mikrobiologisch herge-stelltes Polypeptid mit der Aminosåuresequenz des menschlichen Interferons, DNA und Plasmide, die filr diese 20 Sequenz codieren, Mikroorganismen, die diese genetische Interformation enthalten, und Verfahren zu deren Herstellung", European patent application No. 34307 (Hoechst Aktiengesellschaft).

17. M.D. Johnston et al., "Factors influencing pro- 25 duction of interferon by human lymphoblastoid cells",

Adv.Exp.Med. Biol. 110, 61-74 (1978).

18. H. Strander et al., "Production of human lymphoblastoid interferon", J. Clin. Microbiol. 1, 116-117 (1975).

30 19. J.A. Armstrong, "Semi-Micro Dye-Binding Assay for

Rabbit Interferon", Appl. Microbiol, 21, 723-725 (1971).

20. W.E. Stewart, II et al., "Interferon Production in Hamsters Experimentally Infected With Rabies Virus",

Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 123, 650-653 (1966).

35 21. H. Sugano et al., "Novel DNA, cloned DNA, recom binant plasmid containing the DNA, microorganism containing the recombinant plasmid and process for their production", European patent application No. 28033 (Japanese 69 DK 170714 B1

Foundation of Cancer Research).

22. R. Derynck et al., "Isolation and structure of a human fibroblast interferon gene", Nature 285, 542-547 5 (1980).

23. J. G. Sutcliffe, "pBR 322 restriction map derived from the DNA sequence: accurate DNA size markers up to 4361 nucleotide pairs long", Nucl. Acids Res. 5, 2721-2728 (1978).

10 24. M. Mandel et al., "Calcium-dependent Bacterio phage DNA Infection", J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970).

25. M. Grunstein and D.S. Hogness, "Colony hybridization: A Method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene", Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 15 3961-3965 (1979).

26. T. Taniguchi et al., "Human leukocyte and fibroblast interferons are structurally related", Nature 285, 547-549 (1980).

27. K. Itakura et al., "Chemical DNA Synthesis and 20 Recombinant DNA studies", Science 209, 1401-1405 (1980).

28. T. Staehelin et al., J. Biol. Chem. 256, 9750-9754 (1981).

29. J. B. Gurdon. J. Embryol. Exp. Morph. 20, 401-414 (1968).

25 30. Barth. J. Embryol. Exp. Morph. 7, 210-222 (1959).

31. A. Colman et al., "Export of Proteins from Oocytes of Xenopus laevis", Cell 17, 517-526 (1979).

32. A. Efstratiadis et al., Full Length and Discrete Partial Reverse Transcripts of Globin and Chorion mRNAs, 30 Cell 4, 367-378 (1975).

33. T. Maniatis et al., "Amplification and Characterization of a 0-Globin Gene Synthesized in Vitro", Cell 8, 163-182 (1976).

34. J. H. J. Hoeijmakers et al., "The isolation of

35 plasmids containing DNA complementary to messenger RNA

for variant surface glycoproteins of Trypanosoma brucei",

Gene 8, 391-417 (1980).

70 DK 170714 B1 35. A.C. Peacock et al., "Resolution of Multiple Ribonucleic Acid Species by Polyacrylamid Gel Electrophoresis", Biochemistry 6, 1818-1827 (1967).

5 36. K. Itakura et al., "Improved Triester Approach for the Synthesis of Pentadecathymidylic Acid", J. Am.

Chem. Soc. 97, 7327-7332 (1975).

37. J.F.M. De Rooij et al., "Synthesis of complementary DNA fragments via phosphotriester intermediates", 10 Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537-548 (1979).

38. W. Mueller et al., "Site-directed Mutagenesis in DNA: Generation of Point Mutations in Cloned β Globin Complementary DNA at the Positions Corresponding to Amino Acids 121 to 123", J. Mol. Biol. 124, 343-358 (1978).

15 39. A. M. Maxam and H. Gilbert, "A new method for sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977); see also Meth. Enzym. 65, 499-559 (1980).

40. T. Taniguchi et al., "The nucleotide sequence of human fibroblast interferon cDNA", Gene 10, 11-15 (1980).

20 41. U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970).

42. B.J. Radola, "Electrophoresis”, p. 79-94, Walter de Gruyter, Berlin-New York 1980.

43. J.F. Kearney et al., J. Immunolog. 123, 1548 (1979).

25 44. G. Kliler and C. Milstein, Nature 256, 459 (1975).

45. G. Galfre et al., Nature 266, 550 (1977).

Claims (10)

1. 71 DK 170714 B1
2. 1. Rekombinant DNA-vektor, som indeholder en DNA- sekvens, der koder for et lymfoblastoidt a-interferon, 5 valgt blandt den for HLycIFN-5i kodende DNA-sekvens ATGGCCTTGACn ITT ATTTACTGGTGGCCC TAGTGGTGCTCAGCTACAAGTCAT7CAGCTCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACTCACAGCCTGGG TAACAGGAGGGCCITGATACTCCTGGCACAAATGCGAAGAATCTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGAC AGACATGACTTTGAATTCCCCCAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCT CTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCrCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTT GGATGAGACCCITCTAGATGAATTCTACATCGAACTTGACCAGCAGCTGAATGACCTGGAG TCCTGTGTGATGCAGGAAGTGGGGGTGATAGAGTCrCCCCTGATGTACGAGGACTCCATCCTGGCTG TGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTATATCTGACAGAGAAGAAATACAGCTCTTGTGCCrGGGA GGTTGTCAGAGCACAAATCATGAGATCCTTCTCrTTATCAATCAACTTGCAAAAAAGATTGAAGAGT AAGGAA og den for LyIFN-a-2 kodende DNA-sekvens. atgtgtgatctgcctc agactcacagcctgggtaacaggagggccttgatactcctggcacaaatgcgaagaatctctcctt tctcctgcctgaaggacagacatgactttgaattcccccaggaggagtttgatgataaacagttcc agaaggctcaagccatctctgtcctccatgagatgatccagcagaccttcaacctcitcagcacaa AGGACTCATCTGCrGCTTTGGATGAGACCCrTCTAGATGAATTCTACATCGAACTrCACCAGCAGC tgaatgacctggagtcctgtgtgatgcaggaagtgggggtgatagagtctcccctgatctacgagg ACTCCATCCTGGCrCTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTATATCTGACAGAGAACAAATACA GCTCTTGTGCCrGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCTTCTCTTTATCAATCAACTTGC AAAAAAGATTGAAGAGTAAGGAA,
3. 2. Rekombinant DNA-vektor ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det indeholder den DNA-sekvens, som koder for HLycIFN-5i.
4. 3. Rekombinant DNA-vektor ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det indeholder den DNA-sekvens, som koder for LyIFN-a-2. 72 DK 170714 B1
5. 4. Rekombinant DNA-vektor ifølge krav 1, kendeteg net ved, at DNA-sekvensen er bundet operativt til /3-lactamasegenets ekspressionskontrolsekvens.
6. 5. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant DNA-vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man i en kloningsvektor indfører en DNA-sekvens valgt blandt de i krav 1 angivne DNA-sekvenser, som koder for HLycIFN-5i og LyIFN-a-2. 10 6. E. coli-værtsstamme transformeret med mindst en rekombinant DNA-vektor ifølge krav 1.
7. 7. Værtsstamme ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er en transformeret E. coli HB 101-værtsstamme.
8. 8. Værtsstamme ifølge krav 6, kendetegnet ved, at 15 det er den transformerede værtsstamme E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51 (NRRL B-12531).
9. 9. Fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret E. coli-værtsstamme ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man indfører en rekombinant DNA-vektor ifølge 20 krav 1 i E. coli-værtsstammen.
10. 10. Fremgangsmåde til fremstilling af et lymfo-blastoidt a-interferon, kendetegnet ved, at man dyrker en transformeret E. coli-værtsstamme ifølge krav 6 og isolerer inteferonet.