JPH0822230B2 - アルファ―インターフェロンｇｘ―１ - Google Patents
アルファ―インターフェロンｇｘ―１Info
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- JPH0822230B2 JPH0822230B2 JP58047349A JP4734983A JPH0822230B2 JP H0822230 B2 JPH0822230 B2 JP H0822230B2 JP 58047349 A JP58047349 A JP 58047349A JP 4734983 A JP4734983 A JP 4734983A JP H0822230 B2 JPH0822230 B2 JP H0822230B2
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- JP
- Japan
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- interferon
- gene
- plasmid
- microorganism
- dna
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はインターフエロンの生物学的合成の特性のあ
るクローンのヒト遺伝子に関する。更に詳しくは本発明
はα−インターフエロンGx−１の生物学的合成の特性の
あるクローンのヒト遺伝子、このような遺伝子を含むプ
ラスミド、このようなプラスミドにより形質転換させた
微生物、およびα−インターフエロンGx−１と命名され
るポリペプチドに関する。
るクローンのヒト遺伝子に関する。更に詳しくは本発明
はα−インターフエロンGx−１の生物学的合成の特性の
あるクローンのヒト遺伝子、このような遺伝子を含むプ
ラスミド、このようなプラスミドにより形質転換させた
微生物、およびα−インターフエロンGx−１と命名され
るポリペプチドに関する。
“インターフエロン”なる用語は抗ウイルス活性およ
び他の潜在的に有用な活性をもつ動物蛋白類をいう。イ
ンターフエロンはウイルス感染に応答して生体内でわづ
かな量が作られる。研究および臨床試験のための比較的
少量のヒト・インターフエロンが、ウイルスまたは他の
誘発剤によってインターフエロンを作るように誘発され
たヒト細胞の組織培養物から回収された。これらの技術
は全く高価であり、製造しうるインターフエロンの量も
限られていた。それ故、有効にインターフエロンを製造
しうる遺伝学的に工学化された微生物を開発することに
かなりな関心が払われた。ある種のヒト・インターフエ
ロン遺伝子の複製およびインターフエロンの細菌での発
現が報告された。Nagata.S.らのNature284、316−320
（1980）;Goeddel,D.らのNature287、411−416（198
0）;Streuli,M.,Nagata,S.,およびWeissmann,G.のScien
ce,209、1343−1347（1980）;Derynck,R.らのNucleic A
cid Research,８、4057−4074（1980）；およびTanigui
chi,T.らのProc.Natl.Acad.Sci.USA、77、5230−5233
（1980）参照。
び他の潜在的に有用な活性をもつ動物蛋白類をいう。イ
ンターフエロンはウイルス感染に応答して生体内でわづ
かな量が作られる。研究および臨床試験のための比較的
少量のヒト・インターフエロンが、ウイルスまたは他の
誘発剤によってインターフエロンを作るように誘発され
たヒト細胞の組織培養物から回収された。これらの技術
は全く高価であり、製造しうるインターフエロンの量も
限られていた。それ故、有効にインターフエロンを製造
しうる遺伝学的に工学化された微生物を開発することに
かなりな関心が払われた。ある種のヒト・インターフエ
ロン遺伝子の複製およびインターフエロンの細菌での発
現が報告された。Nagata.S.らのNature284、316−320
（1980）;Goeddel,D.らのNature287、411−416（198
0）;Streuli,M.,Nagata,S.,およびWeissmann,G.のScien
ce,209、1343−1347（1980）;Derynck,R.らのNucleic A
cid Research,８、4057−4074（1980）；およびTanigui
chi,T.らのProc.Natl.Acad.Sci.USA、77、5230−5233
（1980）参照。
インターフエロンは現在次の３つのカテゴリー、すな
わち白血球またはα−インターフエロン、腺維芽細胞ま
たはβ−インターフエロン、および免疫またはγ−イン
ターフエロン、に分類されている。現在の科学的証拠は
恐らく10〜15種の異なったα−インターフエロンおよび
わづか１種のβ−インターフエロンが存在することを示
唆している。Goeddel,D.V.らのNature290、20−26（198
1）およびBrack,C.らのGene15、379−394（1981）参
照。α−インターフエロン遺伝子のいくつかは複製さ
れ、それらのヌクレオチド配列が発表された。Goedell
らのNature290（前記）参照。先行の研究者によりα−
インターフエロンと命名された十分な長さのα−インタ
ーフエロンの分離または複製はこれまでに報告されてお
らず、そのヌクレオチド配列の一部分のみが開示された
にすぎなかった。完全なヒト・α−インターフエロンＧ
蛋白の細菌的製造は報告されなかった。
わち白血球またはα−インターフエロン、腺維芽細胞ま
たはβ−インターフエロン、および免疫またはγ−イン
ターフエロン、に分類されている。現在の科学的証拠は
恐らく10〜15種の異なったα−インターフエロンおよび
わづか１種のβ−インターフエロンが存在することを示
唆している。Goeddel,D.V.らのNature290、20−26（198
1）およびBrack,C.らのGene15、379−394（1981）参
照。α−インターフエロン遺伝子のいくつかは複製さ
れ、それらのヌクレオチド配列が発表された。Goedell
らのNature290（前記）参照。先行の研究者によりα−
インターフエロンと命名された十分な長さのα−インタ
ーフエロンの分離または複製はこれまでに報告されてお
らず、そのヌクレオチド配列の一部分のみが開示された
にすぎなかった。完全なヒト・α−インターフエロンＧ
蛋白の細菌的製造は報告されなかった。
本発明によれば、ここにα−インターフエロンGx−１
と命名する新規なヒト・α−インターフエロン遺伝子が
複製され且つ特徴づけられ、そしてこの遺伝子の細菌で
の発現が記述される。十分な長さのα−インターフエロ
ンGx−１遺伝子およびこの遺伝子によって特定されるポ
リペプチドのアミノ酸配列もここに報告される。ここに
報告するヌクレオチド配列の一部分はα−インターフエ
ロンＧについて従来報告された部分のヌクレオチド配列
に対応し、それ故に、従来えられて配列決定された遺伝
子部分はここにα−インターフエロンGx−１と命名する
遺伝子の断片であった可能性がある。
と命名する新規なヒト・α−インターフエロン遺伝子が
複製され且つ特徴づけられ、そしてこの遺伝子の細菌で
の発現が記述される。十分な長さのα−インターフエロ
ンGx−１遺伝子およびこの遺伝子によって特定されるポ
リペプチドのアミノ酸配列もここに報告される。ここに
報告するヌクレオチド配列の一部分はα−インターフエ
ロンＧについて従来報告された部分のヌクレオチド配列
に対応し、それ故に、従来えられて配列決定された遺伝
子部分はここにα−インターフエロンGx−１と命名する
遺伝子の断片であった可能性がある。
α−インターフエロンGx−１遺伝子の取得、その生体
内での増殖、およびその細菌を培養することによる発現
は、他に特に示すものを除いて、分子生物学の通常の技
術を利用して達成された。たとえば、Ullrich,A.らのSc
ience196、1313（1977）およびSeeburg,P.H.らのNature
270、486（1977）参照。
内での増殖、およびその細菌を培養することによる発現
は、他に特に示すものを除いて、分子生物学の通常の技
術を利用して達成された。たとえば、Ullrich,A.らのSc
ience196、1313（1977）およびSeeburg,P.H.らのNature
270、486（1977）参照。
α−インターフエロンGx−１生産微生物を導く方法は
次の６つの主要段階に分けることができ、それらの各段
階は詳しく後述する。（１）α−インターフエロンGx−
１のメツセンジヤーRNA（mRNA）を製造するためのヒト
白血球の生体内誘発；（２）α−インターフエロンGx−
1mRNAの回収および分離；（３）鋳型としてα−インタ
ーフエロンGx−1mRNAを使用する相補DNA（cDNA）の生体
内合成；（４）好適な複製用ベクター中へのcDNAの挿入
およびこの複製用ベクターによる細菌細胞の形質転換；
（５）α−インターフエロンGx−１遺伝子を含む細菌ク
ローンの選択；ならびに（６）好適な発現ベクター中へ
の複製遺伝子の挿入およびこの発現ベクターによる好適
な宿主微生物の形質転換。
次の６つの主要段階に分けることができ、それらの各段
階は詳しく後述する。（１）α−インターフエロンGx−
１のメツセンジヤーRNA（mRNA）を製造するためのヒト
白血球の生体内誘発；（２）α−インターフエロンGx−
1mRNAの回収および分離；（３）鋳型としてα−インタ
ーフエロンGx−1mRNAを使用する相補DNA（cDNA）の生体
内合成；（４）好適な複製用ベクター中へのcDNAの挿入
およびこの複製用ベクターによる細菌細胞の形質転換；
（５）α−インターフエロンGx−１遺伝子を含む細菌ク
ローンの選択；ならびに（６）好適な発現ベクター中へ
の複製遺伝子の挿入およびこの発現ベクターによる好適
な宿主微生物の形質転換。
α−インターフエロン類はウイルス処理白血球によっ
て製造され、そしてα−インターフエロン類を特定する
遺伝子は人体すべての細胞の染色体中に存在するけれど
も、α−インターフエロン類に付随する遺伝子がこのよ
うなウイルス処理白血球から最も容易にえられる。
て製造され、そしてα−インターフエロン類を特定する
遺伝子は人体すべての細胞の染色体中に存在するけれど
も、α−インターフエロン類に付随する遺伝子がこのよ
うなウイルス処理白血球から最も容易にえられる。
ユーカリオテイツク遺伝子は細胞核の染色体のDNA中
に含まれる。この染色体のDNAはクロマチンと呼ぶ密な
核蛋白複合体中に存在する。ユーカリオテイツク染色体
のDNAから特定の遺伝子を分離することは煩雑であって
多くの場合不可能な場合のある試みである。他方、関心
のある遺伝子に対応するリボヌクレオチド配列をもつメ
ツセンジヤーRNA（mRNA）はこの遺伝子によって特定さ
れる蛋白を製造するユーカリオテイツク細胞から好都合
に回収することができる。それ故、このmRNAはその最も
入手し易い形体で所望の遺伝学的情報を通常提供する。
に含まれる。この染色体のDNAはクロマチンと呼ぶ密な
核蛋白複合体中に存在する。ユーカリオテイツク染色体
のDNAから特定の遺伝子を分離することは煩雑であって
多くの場合不可能な場合のある試みである。他方、関心
のある遺伝子に対応するリボヌクレオチド配列をもつメ
ツセンジヤーRNA（mRNA）はこの遺伝子によって特定さ
れる蛋白を製造するユーカリオテイツク細胞から好都合
に回収することができる。それ故、このmRNAはその最も
入手し易い形体で所望の遺伝学的情報を通常提供する。
α−インターフエロンmRNAはウイルスまたは他の誘発
剤で処理した白血球から有用な量で回収することができ
る。一般に、Contell,K.らのIn Vitro,Waymouth Ed.,pp
35−38、The Tissue Culture Association,Rockville,M
D（1974）に記載の方法を使用して白血球を誘発させて
α−インターフエロンmRNAを製造する。この方法は赤血
球細胞を含まない白血球（たとえばヒトの血液を分別す
ることによってえられる）を適当な媒地に懸濁させ、適
当な誘発剤好ましくはウイルス、たとえばニユーカツス
ル病ウイルスに感染させ、十分なインターフエロン活性
がえられるまで培養することを包含する。インターフエ
ロン活性はウイルス抑制試験たとえばRubinstein,Famil
etti,Pestka,J.Virol,37、755−758（1981）に記載の試
験によって測定することができる。誘発白血球はmRNAの
回収前に洗浄して凍結させるのが有利である。
剤で処理した白血球から有用な量で回収することができ
る。一般に、Contell,K.らのIn Vitro,Waymouth Ed.,pp
35−38、The Tissue Culture Association,Rockville,M
D（1974）に記載の方法を使用して白血球を誘発させて
α−インターフエロンmRNAを製造する。この方法は赤血
球細胞を含まない白血球（たとえばヒトの血液を分別す
ることによってえられる）を適当な媒地に懸濁させ、適
当な誘発剤好ましくはウイルス、たとえばニユーカツス
ル病ウイルスに感染させ、十分なインターフエロン活性
がえられるまで培養することを包含する。インターフエ
ロン活性はウイルス抑制試験たとえばRubinstein,Famil
etti,Pestka,J.Virol,37、755−758（1981）に記載の試
験によって測定することができる。誘発白血球はmRNAの
回収前に洗浄して凍結させるのが有利である。
誘発細胞によって作られたα−インターフエロンGx−
1mRNAはα−インターフエロンGx−１遺伝子の２つのス
トランドのうちの１つに対して相補性であり、以下に述
べるように相補DNA（cDNA）の合成用の鋳型として使用
することができる。cDNA合成用mRNAを有効に利用するた
めに、mRNAを比較的純粋な形体の誘発細胞から回収する
のが有利である。この回収は該mRNAを細胞の膜、蛋白、
脂質、炭水化物、塩類および細胞中に存在するこのよう
なものからのみならず、所望のα−インターフエロン以
外の蛋白質合成に付随するmRNA分子からも分離すること
を含む。Chirgwin,J,M.らのBiochemstry,18、5294−529
9（1979）ならびにMC Candliss,R.,Sloma,R.,およびRes
tka,S.のMethods of Enzymology,Vol.70（1981）に記載
の方法もα−インターフエロンGx−1mRNAの回収のため
に有効に使用することができる。RNAは固有の性質とし
てDNAより安定性が低く、ヒトの白血球中に比較的高濃
度で存在するリボヌクレアーゼによる分解を特に受け易
い。それ故、このmRNA回収法では存在するリボヌクレア
ーゼを迅速に不活性化する手段を使用する。
1mRNAはα−インターフエロンGx−１遺伝子の２つのス
トランドのうちの１つに対して相補性であり、以下に述
べるように相補DNA（cDNA）の合成用の鋳型として使用
することができる。cDNA合成用mRNAを有効に利用するた
めに、mRNAを比較的純粋な形体の誘発細胞から回収する
のが有利である。この回収は該mRNAを細胞の膜、蛋白、
脂質、炭水化物、塩類および細胞中に存在するこのよう
なものからのみならず、所望のα−インターフエロン以
外の蛋白質合成に付随するmRNA分子からも分離すること
を含む。Chirgwin,J,M.らのBiochemstry,18、5294−529
9（1979）ならびにMC Candliss,R.,Sloma,R.,およびRes
tka,S.のMethods of Enzymology,Vol.70（1981）に記載
の方法もα−インターフエロンGx−1mRNAの回収のため
に有効に使用することができる。RNAは固有の性質とし
てDNAより安定性が低く、ヒトの白血球中に比較的高濃
度で存在するリボヌクレアーゼによる分解を特に受け易
い。それ故、このmRNA回収法では存在するリボヌクレア
ーゼを迅速に不活性化する手段を使用する。
一般に、全RNAの回収はリボヌクレアーゼ不活性化用
物質の存在下で細胞を破壊することによって開始され
る。細胞の破壊は分解剤、凍結／解凍または機械的破
壊、好ましくはその組合せにかけることによって達成さ
れる。グアニジンチオシアネートと還元試剤たとえばメ
ルカプトエタノールとの混合物は分解剤およびリボヌク
レアーゼ不活性剤として有効な機能を果すことが見出さ
れた。
物質の存在下で細胞を破壊することによって開始され
る。細胞の破壊は分解剤、凍結／解凍または機械的破
壊、好ましくはその組合せにかけることによって達成さ
れる。グアニジンチオシアネートと還元試剤たとえばメ
ルカプトエタノールとの混合物は分解剤およびリボヌク
レアーゼ不活性剤として有効な機能を果すことが見出さ
れた。
細胞の破壊の後に、固体の細胞断片をたとえば遠心分
離によって除き、えられた清澄液からRNAを沈殿させ
る。沈殿は周知の技術たとえば水混和性アルコール（た
とえばエタノール）をこの溶液に沈殿量加えることによ
って行なう。この溶液はこれらの方法を行なう期間中低
温たとえば約0.℃以下に保ってRNAの沈殿を促進させる
のが有利である。
離によって除き、えられた清澄液からRNAを沈殿させ
る。沈殿は周知の技術たとえば水混和性アルコール（た
とえばエタノール）をこの溶液に沈殿量加えることによ
って行なう。この溶液はこれらの方法を行なう期間中低
温たとえば約0.℃以下に保ってRNAの沈殿を促進させる
のが有利である。
α−インターフエロンGx−1mRNAは周知の技術の任意
のものまたはそれらの組合せによって沈殿RNAから分離
することができる。たとえばAdams,R.L.PらのDavidson'
s The Biochmistry of the Nucleic Acids,8th Ed.,pp.
52−58、Academic Press,Inc.,N.Y.（1976）参照。塩化
セシウムグラジエントを使用する密度勾配遠心分離とそ
の後のフエノール抽出とを予備分離技術として使用する
ことができる。GlisinらのBiochemistry,13、2633（197
4）参照。
のものまたはそれらの組合せによって沈殿RNAから分離
することができる。たとえばAdams,R.L.PらのDavidson'
s The Biochmistry of the Nucleic Acids,8th Ed.,pp.
52−58、Academic Press,Inc.,N.Y.（1976）参照。塩化
セシウムグラジエントを使用する密度勾配遠心分離とそ
の後のフエノール抽出とを予備分離技術として使用する
ことができる。GlisinらのBiochemistry,13、2633（197
4）参照。
親和クロマトグラフを使用してα−インターフエロン
mRNAを更に精製することができる。それ故、該mRNAはオ
リゴ（dT）−セルロースのカラム上のクロマトグラフに
よって非アデニル化RNAから容易に分離することができ
る。Green,M.らのArch.Biochem.Biophbs.,172、74（197
6）参照。
mRNAを更に精製することができる。それ故、該mRNAはオ
リゴ（dT）−セルロースのカラム上のクロマトグラフに
よって非アデニル化RNAから容易に分離することができ
る。Green,M.らのArch.Biochem.Biophbs.,172、74（197
6）参照。
最終の精製工程として、mRNAはサクロースグラジエン
トによる遠心分離によって分別することができる。約12
S種として移動するα−インターフエロンmRNAはこの方
法によって分離することができる。
トによる遠心分離によって分別することができる。約12
S種として移動するα−インターフエロンmRNAはこの方
法によって分離することができる。
最終の精製mRNA（および所望ならば中間分画）の無細
胞系での翻訳はα−インターフエロンmRNAがえられたこ
とを確認するために使用することができる。多数の無細
胞翻訳系が考案された。たとえば小麦胚芽エキス〔Mart
ial,J.らのPro,Nat,Acad.Sci.USA、74、1816（197
7）〕、mRNA依存レテイキユロサイト分解物〔Pelham,H.
R.B.らのEur.J.Biochem.,67、247（1976）〕、およびキ
シノパスラエビスの卵母細胞〔Sloma,A.,Mc Candliss,
R.およびPeska,S.のMethods in Enzymology,Vol.70（19
81）〕である。
胞系での翻訳はα−インターフエロンmRNAがえられたこ
とを確認するために使用することができる。多数の無細
胞翻訳系が考案された。たとえば小麦胚芽エキス〔Mart
ial,J.らのPro,Nat,Acad.Sci.USA、74、1816（197
7）〕、mRNA依存レテイキユロサイト分解物〔Pelham,H.
R.B.らのEur.J.Biochem.,67、247（1976）〕、およびキ
シノパスラエビスの卵母細胞〔Sloma,A.,Mc Candliss,
R.およびPeska,S.のMethods in Enzymology,Vol.70（19
81）〕である。
回収し分離したα−インターフエロンGmRNAの翻訳は
好ましくはX.ラエビス卵母細胞系中で行なう。
好ましくはX.ラエビス卵母細胞系中で行なう。
この系の翻訳は健康なカエルからえた卵母細胞を適当
な培養媒地中に懸濁させることによって達成される。た
とえばCavalieriらのProc.Natl.Acad,Sci.USA、74、328
7（1977）参照。mRNAの無菌水溶液をミクロ操作装置を
使用して約10個の卵母細胞に注射する。注射を行なった
卵母細胞を培養してからインターフエロン活性を分析す
る。卵母細胞はこれらをその培養媒地中でホモジユネー
ト処理してから遠心分離して不活性の膜、蛋白などを除
くことによって分析する。上澄液の分別量を次いで、ベ
ンキユラ口内炎ウイルスによって生ずる細胞破壊効果か
らヒトの線維芽細胞を保護する能力によって、インター
フエロンを分析する。前記のRubinstenらの刊行物参
照。上記の方法によってえられたmRNAはX.ラエビス卵母
細胞翻訳系中で１ミリ１当り約2000〜5000単位（約2000
〜5000μ/ml）のインターフエロン滴定数を生ずること
が見出された。
な培養媒地中に懸濁させることによって達成される。た
とえばCavalieriらのProc.Natl.Acad,Sci.USA、74、328
7（1977）参照。mRNAの無菌水溶液をミクロ操作装置を
使用して約10個の卵母細胞に注射する。注射を行なった
卵母細胞を培養してからインターフエロン活性を分析す
る。卵母細胞はこれらをその培養媒地中でホモジユネー
ト処理してから遠心分離して不活性の膜、蛋白などを除
くことによって分析する。上澄液の分別量を次いで、ベ
ンキユラ口内炎ウイルスによって生ずる細胞破壊効果か
らヒトの線維芽細胞を保護する能力によって、インター
フエロンを分析する。前記のRubinstenらの刊行物参
照。上記の方法によってえられたmRNAはX.ラエビス卵母
細胞翻訳系中で１ミリ１当り約2000〜5000単位（約2000
〜5000μ/ml）のインターフエロン滴定数を生ずること
が見出された。
X.ラエビス卵母細胞試験により最高の活性をもつ、mR
NA画分はcDNA合成用の鋳型を与えるために組合せること
ができる。この方法はもとの染色体遺伝子の機能配列と
同じヌクレチオドベース対の配列をもつところの２重ス
トランドDNAを酵素的に構築することを包含する。このc
DNAはユーカリオテイツク遺伝子上に存在しうる非情報
セグメント（イントロン）を含まず、従って究極的にプ
ロカリオテイツク系中で転写し翻訳することができる。
NA画分はcDNA合成用の鋳型を与えるために組合せること
ができる。この方法はもとの染色体遺伝子の機能配列と
同じヌクレチオドベース対の配列をもつところの２重ス
トランドDNAを酵素的に構築することを包含する。このc
DNAはユーカリオテイツク遺伝子上に存在しうる非情報
セグメント（イントロン）を含まず、従って究極的にプ
ロカリオテイツク系中で転写し翻訳することができる。
cDNAの合成は鳥類の骨髄腫細胞ウイルスのリバースト
ランスクリプターゼを使用する。この酵素はmRNAを鋳型
としてデオキシヌクレオキドトリホスフエートからDNA
の単一ストランドを合成するという触媒作用をもつ。Ka
cian,D.L.らのProc.Nat'l Acad,Sci.USA、73、2191（19
76）参照。mRNAのポリγ（Ａ）の尾部はオリゴ（dT）
（約12〜18個のヌクレオチドの）オリゴ（dT）がcDNA合
成用のプライマーとして使用されることを可能にする。
放射活性標識の付いたデオキシヌクレオシドトリホスフ
エートの使用は合成反応の監視を容易にする。一般に32
P−含有デオキシヌクレオシドトリホスフエートたとえ
ば〔α−32P〕dCTPがこの目的のために有利に使用され
る。cDNA合成は一般にmRNA、デオキシヌクレオシドトリ
ホスフエート、オリゴ（dT）およびリバーストラスクリ
プターゼを適切な緩衝溶液中で一緒にすることによって
行なわれる。この溶液は好ましくは十分な長さの合成を
促進するために少量のアクチノマイシンＤおよびジチオ
スレイトールを含む。Kacicn,D.L.らの前述の報文参
照。この溶液は昇温たとえば約40〜50℃で、cDNAのコピ
ーの生成を可能にするに十分な時間、たとえば約５〜20
分間、培養する。反応条件はKacian,D.L.らの前述の報
文に記載されているのと実質的に同じである。培養後、
エチレンジアミン四酢酸をこの溶液に加え、溶液をフエ
ノール：クロロホルム（1:1容量）で抽出する。水相は
ゲル濾過クロマトグラフによって有利に精製され、抽出
液中のcDNA−mRNA錯体はアルコールで沈殿せしめられ
る。
ランスクリプターゼを使用する。この酵素はmRNAを鋳型
としてデオキシヌクレオキドトリホスフエートからDNA
の単一ストランドを合成するという触媒作用をもつ。Ka
cian,D.L.らのProc.Nat'l Acad,Sci.USA、73、2191（19
76）参照。mRNAのポリγ（Ａ）の尾部はオリゴ（dT）
（約12〜18個のヌクレオチドの）オリゴ（dT）がcDNA合
成用のプライマーとして使用されることを可能にする。
放射活性標識の付いたデオキシヌクレオシドトリホスフ
エートの使用は合成反応の監視を容易にする。一般に32
P−含有デオキシヌクレオシドトリホスフエートたとえ
ば〔α−32P〕dCTPがこの目的のために有利に使用され
る。cDNA合成は一般にmRNA、デオキシヌクレオシドトリ
ホスフエート、オリゴ（dT）およびリバーストラスクリ
プターゼを適切な緩衝溶液中で一緒にすることによって
行なわれる。この溶液は好ましくは十分な長さの合成を
促進するために少量のアクチノマイシンＤおよびジチオ
スレイトールを含む。Kacicn,D.L.らの前述の報文参
照。この溶液は昇温たとえば約40〜50℃で、cDNAのコピ
ーの生成を可能にするに十分な時間、たとえば約５〜20
分間、培養する。反応条件はKacian,D.L.らの前述の報
文に記載されているのと実質的に同じである。培養後、
エチレンジアミン四酢酸をこの溶液に加え、溶液をフエ
ノール：クロロホルム（1:1容量）で抽出する。水相は
ゲル濾過クロマトグラフによって有利に精製され、抽出
液中のcDNA−mRNA錯体はアルコールで沈殿せしめられ
る。
mRNAはcDNAの存在下で希薄水酸化ナトリウム（約1.0
M）により昇温たとえば約60〜80℃において10〜30分間
で選択的に加水分解させることができる。アルカリ溶液
の中和およびアルコールによる沈殿は単一ストランドの
cDNAコピーを生ぜしめる。
M）により昇温たとえば約60〜80℃において10〜30分間
で選択的に加水分解させることができる。アルカリ溶液
の中和およびアルコールによる沈殿は単一ストランドの
cDNAコピーを生ぜしめる。
単一ストランドのcDNAコピーは５′−ポリ（dT）尾部
をもつこと、および二重鎖DNAの短いセグメントを与え
る３″末端ヘアピン構造をもつことが示された。Efstra
tiadis,A.らのCell ７、279（1976）参照。この３″−
ヘアピン構造は相補DNAストランド合成用のプライマー
として作用しうる。この相補ストランドの合成はcDNAの
合成と実質的に同じ条件下で行なわれる。ただし、DNA
ポリメラーゼＩのクレノウ断片〔Klenow,H.らのEur.J.B
iochem.,22、371（1971）〕をリバーストランスクリプ
ターゼの代りに使用する。この方法によって回収される
二重鎖cDNAは単一ストランドcDNAコピーの３′−ヘアピ
ン構造から生ずる３′−ループをもっている。この３′
−ループはUllrich,A.らの前述の報文に記載の方法を実
質的に使用して酵素S1ヌクレアーゼを用いる消化によっ
て開裂させることができる。このS1ヌクレアーゼ消化物
はフエノール・クロロホルムで抽出することができ、え
られたcDNAはアルコールで水性相から沈殿せしめられ
る。
をもつこと、および二重鎖DNAの短いセグメントを与え
る３″末端ヘアピン構造をもつことが示された。Efstra
tiadis,A.らのCell ７、279（1976）参照。この３″−
ヘアピン構造は相補DNAストランド合成用のプライマー
として作用しうる。この相補ストランドの合成はcDNAの
合成と実質的に同じ条件下で行なわれる。ただし、DNA
ポリメラーゼＩのクレノウ断片〔Klenow,H.らのEur.J.B
iochem.,22、371（1971）〕をリバーストランスクリプ
ターゼの代りに使用する。この方法によって回収される
二重鎖cDNAは単一ストランドcDNAコピーの３′−ヘアピ
ン構造から生ずる３′−ループをもっている。この３′
−ループはUllrich,A.らの前述の報文に記載の方法を実
質的に使用して酵素S1ヌクレアーゼを用いる消化によっ
て開裂させることができる。このS1ヌクレアーゼ消化物
はフエノール・クロロホルムで抽出することができ、え
られたcDNAはアルコールで水性相から沈殿せしめられ
る。
α−インターフエロン遺伝子に相当する完全な二重ス
トランドDNAはManiatisらのBiockemistry,14、3787（19
75）の方法を実質的に使用してポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分離することができる。ゲルをたとえ
ばエチジウムブロマイドで染色して、分子量マーカーと
して入れた制限酵素消化物を肉眼でみえるようにした後
に、写真フイルムをこのゲルで露光して放射性標識二重
鎖ストランドcDNA遺伝子をさがす。500〜1300ベース対
の長さのDNA分子を含むゲルの領域を除き、このDNAをSm
ith,H.O.のMethod of Enzymology,65、371（1980）の方
法によって実質的に、電気泳動的に溶出させる。α−イ
ンターフエロンGx−１遺伝子（約900ベース対）に相当
する大きさのDNAを電気泳動溶出液のフエノール−クロ
ロホルム抽出およびその後の水相相からのcDNAのアルコ
ール沈殿によって回収する。
トランドDNAはManiatisらのBiockemistry,14、3787（19
75）の方法を実質的に使用してポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分離することができる。ゲルをたとえ
ばエチジウムブロマイドで染色して、分子量マーカーと
して入れた制限酵素消化物を肉眼でみえるようにした後
に、写真フイルムをこのゲルで露光して放射性標識二重
鎖ストランドcDNA遺伝子をさがす。500〜1300ベース対
の長さのDNA分子を含むゲルの領域を除き、このDNAをSm
ith,H.O.のMethod of Enzymology,65、371（1980）の方
法によって実質的に、電気泳動的に溶出させる。α−イ
ンターフエロンGx−１遺伝子（約900ベース対）に相当
する大きさのDNAを電気泳動溶出液のフエノール−クロ
ロホルム抽出およびその後の水相相からのcDNAのアルコ
ール沈殿によって回収する。
増殖および選択のために、上述のようにして製造した
二重ストランドcDNA遺伝子を適当なクローン用ベクター
中に挿入し、これを適切な宿主細胞の形質転換のために
使用する。好適なクローン用ベクターには種々のプラス
ミドおよびフエージが含まれるが、プラスミドが一般に
好ましい。クローン用ベクターの選択基準にはその大き
さ、宿主細胞中でのその複製能力、選択可能な遺伝子の
存在、および遺伝子の挿入場所の存在が含まれる。その
大きさに関しては、ベクターは大きな遺伝子の挿入を可
能にするために、そして欲せざる巨大分子の製造へ大量
の細胞栄養およびエネルギーをそらすことのないように
するために、比較的小さいのが有利である。ベクターは
また遺伝子の挿入後に機能を保持する完全なレプリコン
を含む。このレプリコンはプラスミドの所望の形式の複
製、すなわち細胞当り多数のコピーまたは単一のコピ
ー、あるいは細胞当り制御された数のコピー、を好まし
くは指示する。一種またはそれ以上の表示型の性質好ま
しくは抗生物質耐性は形質転換体の選択を容易にする。
挿入部位は有利には制限エンドヌクレアーゼに独特の制
限酵素部位である。これらの基準のすべにて合致するク
ローン用ベクターはプラスミドpBR322である。Bolivar,
F.らのGene,２、95（1977）参照。このプラスミドは小
さく（約2.8×106ダルトン）、アンピシリン（amp）お
よびテトラサイクリン（tet）の耐性のための遺伝子を
保持し、そしてE.コリイ中でリラツクス複製を受ける。
このプラスミドはまた、amp遺伝子内に生ずるエンドヌ
クレアーゼpst Ｉの制限酵素部位をもつ。cDNAはホモ
重合テーリング技術によってこのプラスミド中に好都合
に挿入される。Nelson,T.らのMethods of Enzymology,6
8、41（1980）参照。ホモポリマー尾部たとえばpoly−d
Cは末端デオキシヌクレオチジルトランスフアラーゼ〔C
hang.L.S.M.らのJ.Biol.Chem.,246、909（1971）〕の存
在下で適当なデオキシヌクレオシドトリホスフエートた
とえばdCTPとの反応によりインターフエロン二重ストラ
ンドcDNA遺伝子の３′−ヒドロキシに加えられるプラス
ミドは適当なエンドヌクレアーゼを用いる消化によって
開裂され、相補ホモポリマー尾部たとえばポリdGが同じ
ホモポリマーテーリング技術を使用してたとえばdGTPを
使用して、開例プラスミドの３′−ヒドロキシに加えら
れる。所望ならば、放射活性標識デオキシヌクレオチド
トリホスフエートたとえば〔3H〕dCTPおよび〔3H〕dGTP
を反応中に使用することによって、テーリング反応を監
視することができる。一般にこの反応は約10〜20個のヌ
クレオチドの長さの尾部を与えるように行なわれる。尾
部のついたcDNAとプラスミドはたとえばフエノール抽出
とその後のアルコール沈殿によって回収される。２つの
尾部のついたDNA種はこれら両種の等モル濃度の緩衝溶
液をインキユベーシヨンすることによってアンニーリン
グしてα−インターフエロンGx−１遺伝子を含む組み換
え体プラスミドを得る。
二重ストランドcDNA遺伝子を適当なクローン用ベクター
中に挿入し、これを適切な宿主細胞の形質転換のために
使用する。好適なクローン用ベクターには種々のプラス
ミドおよびフエージが含まれるが、プラスミドが一般に
好ましい。クローン用ベクターの選択基準にはその大き
さ、宿主細胞中でのその複製能力、選択可能な遺伝子の
存在、および遺伝子の挿入場所の存在が含まれる。その
大きさに関しては、ベクターは大きな遺伝子の挿入を可
能にするために、そして欲せざる巨大分子の製造へ大量
の細胞栄養およびエネルギーをそらすことのないように
するために、比較的小さいのが有利である。ベクターは
また遺伝子の挿入後に機能を保持する完全なレプリコン
を含む。このレプリコンはプラスミドの所望の形式の複
製、すなわち細胞当り多数のコピーまたは単一のコピ
ー、あるいは細胞当り制御された数のコピー、を好まし
くは指示する。一種またはそれ以上の表示型の性質好ま
しくは抗生物質耐性は形質転換体の選択を容易にする。
挿入部位は有利には制限エンドヌクレアーゼに独特の制
限酵素部位である。これらの基準のすべにて合致するク
ローン用ベクターはプラスミドpBR322である。Bolivar,
F.らのGene,２、95（1977）参照。このプラスミドは小
さく（約2.8×106ダルトン）、アンピシリン（amp）お
よびテトラサイクリン（tet）の耐性のための遺伝子を
保持し、そしてE.コリイ中でリラツクス複製を受ける。
このプラスミドはまた、amp遺伝子内に生ずるエンドヌ
クレアーゼpst Ｉの制限酵素部位をもつ。cDNAはホモ
重合テーリング技術によってこのプラスミド中に好都合
に挿入される。Nelson,T.らのMethods of Enzymology,6
8、41（1980）参照。ホモポリマー尾部たとえばpoly−d
Cは末端デオキシヌクレオチジルトランスフアラーゼ〔C
hang.L.S.M.らのJ.Biol.Chem.,246、909（1971）〕の存
在下で適当なデオキシヌクレオシドトリホスフエートた
とえばdCTPとの反応によりインターフエロン二重ストラ
ンドcDNA遺伝子の３′−ヒドロキシに加えられるプラス
ミドは適当なエンドヌクレアーゼを用いる消化によって
開裂され、相補ホモポリマー尾部たとえばポリdGが同じ
ホモポリマーテーリング技術を使用してたとえばdGTPを
使用して、開例プラスミドの３′−ヒドロキシに加えら
れる。所望ならば、放射活性標識デオキシヌクレオチド
トリホスフエートたとえば〔3H〕dCTPおよび〔3H〕dGTP
を反応中に使用することによって、テーリング反応を監
視することができる。一般にこの反応は約10〜20個のヌ
クレオチドの長さの尾部を与えるように行なわれる。尾
部のついたcDNAとプラスミドはたとえばフエノール抽出
とその後のアルコール沈殿によって回収される。２つの
尾部のついたDNA種はこれら両種の等モル濃度の緩衝溶
液をインキユベーシヨンすることによってアンニーリン
グしてα−インターフエロンGx−１遺伝子を含む組み換
え体プラスミドを得る。
E.コリイの好適なampS、tetSはLederbergのJ.Baterio
logy、119,1077（1974）の方法を実質的に使用して、組
み換え体プラスミドを用いて形質転換させることができ
る。形質転換体はテトラサイクリン約50μg/mlを含む標
準Ｌ−培養液上で代表的に生育する。テトラサイクリン
含有培地上で生育するコロニイのサンプルを次いでアイ
ピシリン約50μg/mlを含む第２倍地に移す。pBR322プラ
スミドは細胞にテトラサイクリン耐性を与えるために、
テトラサイクリン含有培地はこのプラスミドを含まなけ
ればならない。他方、pBR322プラスミドのアンピシリン
耐性は遺伝子の挿入によって破壊され、従ってtetR、am
pSのコロニイのみが更なる試験のためにえらばれる。
logy、119,1077（1974）の方法を実質的に使用して、組
み換え体プラスミドを用いて形質転換させることができ
る。形質転換体はテトラサイクリン約50μg/mlを含む標
準Ｌ−培養液上で代表的に生育する。テトラサイクリン
含有培地上で生育するコロニイのサンプルを次いでアイ
ピシリン約50μg/mlを含む第２倍地に移す。pBR322プラ
スミドは細胞にテトラサイクリン耐性を与えるために、
テトラサイクリン含有培地はこのプラスミドを含まなけ
ればならない。他方、pBR322プラスミドのアンピシリン
耐性は遺伝子の挿入によって破壊され、従ってtetR、am
pSのコロニイのみが更なる試験のためにえらばれる。
一般に、数百〜数千の有力なα−インターフエロンGx
−１コロニイがこれらの方法によって製造される。α−
インターフエロンGx−１を含むこれらのコロニイを同定
するために、放射性標識DNAプローブを有利に使用する
ことができる。Grunstein,M.らのProc.Nat'l.Acad.Sci.
USA、72、3961−3965（1975）参照。特に好ましいDNAプ
ローブは米国特許継続出願番号第286,351号に記載され
ており、引用によってここにくみ入れる。このプローブ
は、周知のヒト白血球の及びヒト線維芽細胞のインター
フエロン遺伝子に共通の配列に対して相補的な13個のヌ
クレオチド配列を含む。このプローブを使用するため
に、それぞれのコロニイからの（またはコロニー群から
の）DNAをニトロセルロースフイルタの分離帯域に固定
させ、そして変性する。プローブの溶液をハイブリダイ
ズする条件下でこれに適用する。ハイブリダイズしてい
ないプローブをフイルタから洗い、プローブがハイブリ
ダイズしているDNAを含むコロニイをオートラジオグラ
ムによって同定する。
−１コロニイがこれらの方法によって製造される。α−
インターフエロンGx−１を含むこれらのコロニイを同定
するために、放射性標識DNAプローブを有利に使用する
ことができる。Grunstein,M.らのProc.Nat'l.Acad.Sci.
USA、72、3961−3965（1975）参照。特に好ましいDNAプ
ローブは米国特許継続出願番号第286,351号に記載され
ており、引用によってここにくみ入れる。このプローブ
は、周知のヒト白血球の及びヒト線維芽細胞のインター
フエロン遺伝子に共通の配列に対して相補的な13個のヌ
クレオチド配列を含む。このプローブを使用するため
に、それぞれのコロニイからの（またはコロニー群から
の）DNAをニトロセルロースフイルタの分離帯域に固定
させ、そして変性する。プローブの溶液をハイブリダイ
ズする条件下でこれに適用する。ハイブリダイズしてい
ないプローブをフイルタから洗い、プローブがハイブリ
ダイズしているDNAを含むコロニイをオートラジオグラ
ムによって同定する。
陽性コロニイを適当な生育培地上で培養して豊富な量
の細胞を取得し、これらの細胞からプラスミドDNAを抽
出することができる。プラスミドDNAは通常の技術、た
とえば細胞の破砕、その後のフエノール抽出およびアル
コール沈殿を使用して抽出される。このDNAは電気泳動
またはサクロース勾配沈降によって分離することができ
る。約900個のベース対の挿入体を含むプラスミドDNAを
えらんで更に特性をしらべる。
の細胞を取得し、これらの細胞からプラスミドDNAを抽
出することができる。プラスミドDNAは通常の技術、た
とえば細胞の破砕、その後のフエノール抽出およびアル
コール沈殿を使用して抽出される。このDNAは電気泳動
またはサクロース勾配沈降によって分離することができ
る。約900個のベース対の挿入体を含むプラスミドDNAを
えらんで更に特性をしらべる。
クローン用ベクター中にcDNAを挿入するために使用さ
れた技術はもとのベクトルの挿入部位に対応する２つの
制限エンドヌクレアーゼ部位を再形成するので、クーロ
ンの遺伝子は適当なエンドヌクレアーゼを用いる消化に
よってプラスミドDNAから好都合に切り出される。切り
出された遺伝子は次いで制限マツピングおよびシークエ
ンシング分析によって特徴づけられる。本発明の切り出
されたα−インターフエロンGx−１遺伝子の制限酵素地
図を添付の第１図に示す。分離した遺伝子は1032個のベ
ース対をもつ。この遺伝子は５′末端（ベース対１〜8
5）および３′末端（ベース対632〜1032）に非コード領
域をもつ。コード領域の５′末端（ベース対86〜133）
は先導配列を含み、成熟したα−インターフエロンGx−
１蛋白はベース対No.134からベース対No.631までの領域
によって特定される。
れた技術はもとのベクトルの挿入部位に対応する２つの
制限エンドヌクレアーゼ部位を再形成するので、クーロ
ンの遺伝子は適当なエンドヌクレアーゼを用いる消化に
よってプラスミドDNAから好都合に切り出される。切り
出された遺伝子は次いで制限マツピングおよびシークエ
ンシング分析によって特徴づけられる。本発明の切り出
されたα−インターフエロンGx−１遺伝子の制限酵素地
図を添付の第１図に示す。分離した遺伝子は1032個のベ
ース対をもつ。この遺伝子は５′末端（ベース対１〜8
5）および３′末端（ベース対632〜1032）に非コード領
域をもつ。コード領域の５′末端（ベース対86〜133）
は先導配列を含み、成熟したα−インターフエロンGx−
１蛋白はベース対No.134からベース対No.631までの領域
によって特定される。
この遺伝子のヌクレオチド配列をSangerらのProc.Na
t′l Acad.Sci.USA、74、5463−5467に記載の方法によ
って測定し、このヌクレオチド配列を第１表に示した。
この表は遺伝子によって特定されるアミノ酸配列と共
に、非コード領域およびコード領域の５′−−＞３のス
トランドを示すものである。第１表およびその他に使用
した略号は次の標準的な意味をもつ。
t′l Acad.Sci.USA、74、5463−5467に記載の方法によ
って測定し、このヌクレオチド配列を第１表に示した。
この表は遺伝子によって特定されるアミノ酸配列と共
に、非コード領域およびコード領域の５′−−＞３のス
トランドを示すものである。第１表およびその他に使用
した略号は次の標準的な意味をもつ。
Ａ＝デオキシアデニル Ｔ＝チミジル Ｇ＝デオキシグアニル Ｃ＝デオキシシトシル GLY＝グリシン ALA＝アラニン VAL＝バリン LEU＝ロイシン ILE＝イソロイシン SER＝セリン THR＝スレオニン PHE＝フエニルアラニン TYR＝チロシン TRP＝トリプトフアン CYS＝システイン MET＝メチオニン ASP＝アスパラギン酸 GLU＝グルタミン酸 LYS＝リジン ARG＝アルギニン HIS＝ヒスチジン PRO＝プロリン GLN＝グルタミン ASN＝アスパラギン 遺伝コードの縮重のために、遺伝子のヌクレオチド配
列は実質的に変化しうることが理解される。たとえば、
遺伝子の一部分または全部を化学的に合成して第１表に
示すものとは異なったヌクレオチド配列をもつDNAを得
ることができ、然も適切なコード・アミノ酸指定が観察
される限りアミノ酸配列は保存される。α−インターフ
エロンGx−１遺伝子のヌクレオチド配列およびその蛋白
質のアミノ酸配列が確立されたので、本発明の遺伝子は
特定のヌクレオチド配列に制限されるものではなくて、
遺伝コードによって許されるそのすべての変形を含むも
のである。
列は実質的に変化しうることが理解される。たとえば、
遺伝子の一部分または全部を化学的に合成して第１表に
示すものとは異なったヌクレオチド配列をもつDNAを得
ることができ、然も適切なコード・アミノ酸指定が観察
される限りアミノ酸配列は保存される。α−インターフ
エロンGx−１遺伝子のヌクレオチド配列およびその蛋白
質のアミノ酸配列が確立されたので、本発明の遺伝子は
特定のヌクレオチド配列に制限されるものではなくて、
遺伝コードによって許されるそのすべての変形を含むも
のである。
クローンのα−インターフエロンGx−１遺伝子を含む
E.コリイ細胞の培養物をRubinsteinらの前述の報文に記
載のウイルス抑制法によって分析してインターフエロン
活性を求め、これらの細胞が少量のインターフエロン活
性を生産することを見出した。この細胞培養物はA3−26
と命名され、アメリカンタイプカルチユアーコレクシヨ
ン（アメリカ合衆国メアリーランドロツクビル）にATCC
No.39063として寄託された。
E.コリイ細胞の培養物をRubinsteinらの前述の報文に記
載のウイルス抑制法によって分析してインターフエロン
活性を求め、これらの細胞が少量のインターフエロン活
性を生産することを見出した。この細胞培養物はA3−26
と命名され、アメリカンタイプカルチユアーコレクシヨ
ン（アメリカ合衆国メアリーランドロツクビル）にATCC
No.39063として寄託された。
クローンのα−インターフエロンGx−１遺伝子がえら
れたので、この遺伝子を次いで高水準の蛋白発現を達成
するために設計された条件下で微生物中に導入すること
ができる。この目標達成のために、この遺伝子を発現ベ
クター中に有利に挿入することができる。クローン用ベ
クターと同様に、発現ベクターはプラスミドまたはフア
ージでありうるが、プラスミドが好ましい。良好なクロ
ーン用ベクターの基準に加えて、発現ベクターはクロー
ン遺伝子の直接の転写および翻訳を指示する適切に配置
された制御信号をも含む。Guarante,L.らのCell,20、54
3−553（1980）参照。代表的には１つの遺伝子がプラス
ミドの完全なオペロン中に挿入されて、この遺伝子の発
現がこのオペロンによって制御される。E.コリイのラク
トース（lac）オペロンおよびトリプトフアン（trp）オ
ペロンをこの目的に使用した。Roberts,T.M.らのProc.N
at'l Acad.USA、76、760−764（1979）参照。
れたので、この遺伝子を次いで高水準の蛋白発現を達成
するために設計された条件下で微生物中に導入すること
ができる。この目標達成のために、この遺伝子を発現ベ
クター中に有利に挿入することができる。クローン用ベ
クターと同様に、発現ベクターはプラスミドまたはフア
ージでありうるが、プラスミドが好ましい。良好なクロ
ーン用ベクターの基準に加えて、発現ベクターはクロー
ン遺伝子の直接の転写および翻訳を指示する適切に配置
された制御信号をも含む。Guarante,L.らのCell,20、54
3−553（1980）参照。代表的には１つの遺伝子がプラス
ミドの完全なオペロン中に挿入されて、この遺伝子の発
現がこのオペロンによって制御される。E.コリイのラク
トース（lac）オペロンおよびトリプトフアン（trp）オ
ペロンをこの目的に使用した。Roberts,T.M.らのProc.N
at'l Acad.USA、76、760−764（1979）参照。
本発明をα−インターフエロンGx−１遺伝子を含む組
み換え体DNA用のバクテリア宿主としてE.コリイを使用
することに関連して述べたが、習熟した分子生物学者は
他のグラム陰性バクテリアたとえばシユードモナス；グ
ラム陽性バクテリアたとえばバシラス；および高等な単
細胞微生物たとえばイーストおよび菌類；などもα−イ
ンターフエロンGx−１遺伝子のクローニングおよび／ま
たは発現のために使用しうることを理解するであろう。
み換え体DNA用のバクテリア宿主としてE.コリイを使用
することに関連して述べたが、習熟した分子生物学者は
他のグラム陰性バクテリアたとえばシユードモナス；グ
ラム陽性バクテリアたとえばバシラス；および高等な単
細胞微生物たとえばイーストおよび菌類；などもα−イ
ンターフエロンGx−１遺伝子のクローニングおよび／ま
たは発現のために使用しうることを理解するであろう。
本発明を次の実施例によって更に説明するが、これら
の実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきでは
ない。
の実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきでは
ない。
実施例 1. 白血球の誘発 誘発法の出発物質は血小板泳動（plateletpheresis）
調製物からの残渣であった。それぞれの残渣は夾雑赤血
球細胞とまざったヒトの血液の６〜20単位の白血球細胞
を含んでいた。２つの残渣をプールしてボトル中で1600
×ｇで７分間遠心分離した。赤血球細胞の大部分をピペ
ツトでボトルの底部から除いた。残存容積を測定し、残
存赤血球細胞を0.83％の塩化アンモニウムの10倍容量の
迅速添加によって分解した。４℃で10分後に、白血球細
胞を遠心分離によって集め、10％の加熱−不活性化仔牛
血清、3mg/mlのトリシンおよび25μg/mlネオマイシンを
補ぎなってある500mlのイーグル最小必須培地（リン酸
塩緩衝液なし）中に懸濁させた。これは約107細胞/mlの
細胞濃度を与えた。ニユーカツスル病ウイルス（ND
V）、菌株B1を100ヘマグルチニン単位/mlの最終濃度で
細胞懸濁液に加え、この細胞をかくはんしながら37℃で
培養した。５時間後に、40mlの培養物を小さなかくはん
容器に写し、これを37℃で更に18時間培養した。この分
別量の細胞を次いで遠心分離によって除き、上澄液を小
胞口内炎ウイルスによって生ずる食細胞効果からヒトの
線維芽細胞を保護する能力によってインターフエロンに
ついて分析した。滴定値は25,000IU/mlであった。培養
物（NDV添加後５時間のもの）の残りの450mlを遠心分離
した。上澄液をインターフエロンについて分析した。滴
定値は6400IU/mlであった。この細胞ペレツトをPBS（8.
2g/lの塩化ナトリウム、0.22g/lの塩化カリウム、0.20g
/lの一塩基性リン酸カリウム、1.14g/lの二塩基性リン
酸ナトリウム）で洗浄し、4.9gの重量の洗浄ペレツトを
−70℃で凍結させた。
調製物からの残渣であった。それぞれの残渣は夾雑赤血
球細胞とまざったヒトの血液の６〜20単位の白血球細胞
を含んでいた。２つの残渣をプールしてボトル中で1600
×ｇで７分間遠心分離した。赤血球細胞の大部分をピペ
ツトでボトルの底部から除いた。残存容積を測定し、残
存赤血球細胞を0.83％の塩化アンモニウムの10倍容量の
迅速添加によって分解した。４℃で10分後に、白血球細
胞を遠心分離によって集め、10％の加熱−不活性化仔牛
血清、3mg/mlのトリシンおよび25μg/mlネオマイシンを
補ぎなってある500mlのイーグル最小必須培地（リン酸
塩緩衝液なし）中に懸濁させた。これは約107細胞/mlの
細胞濃度を与えた。ニユーカツスル病ウイルス（ND
V）、菌株B1を100ヘマグルチニン単位/mlの最終濃度で
細胞懸濁液に加え、この細胞をかくはんしながら37℃で
培養した。５時間後に、40mlの培養物を小さなかくはん
容器に写し、これを37℃で更に18時間培養した。この分
別量の細胞を次いで遠心分離によって除き、上澄液を小
胞口内炎ウイルスによって生ずる食細胞効果からヒトの
線維芽細胞を保護する能力によってインターフエロンに
ついて分析した。滴定値は25,000IU/mlであった。培養
物（NDV添加後５時間のもの）の残りの450mlを遠心分離
した。上澄液をインターフエロンについて分析した。滴
定値は6400IU/mlであった。この細胞ペレツトをPBS（8.
2g/lの塩化ナトリウム、0.22g/lの塩化カリウム、0.20g
/lの一塩基性リン酸カリウム、1.14g/lの二塩基性リン
酸ナトリウム）で洗浄し、4.9gの重量の洗浄ペレツトを
−70℃で凍結させた。
実施例 2. 誘発白血球からのmRNAの抽出 次の溶液を調製した。
溶液A:4Mの試薬級グアニジンチオシアネート、0.1Mのト
リス−HCl（pH7.5）および0.1Mの２−メルカプトエタノ
ールを含む分解溶液。グアニジンチオシアネート（472.
6g）を500mlの水および200mlのトリス緩衝ストツク溶液
（0.5Mトリス−HCl、pH7.5）中で加熱してとかした。こ
の溶液を室温に冷却し、その後に7.15mlの２−メルカプ
トエタノールを加え、この溶液を滅菌水で1000mlに希釈
した。グアニジンチオシアネートからの粒状物質ナルジ
の使い捨てフイルタユニツトを通す濾過によって除い
た。この溶液は室温で少なくとも１ケ月間安定であっ
た。この試薬が皮膚にふれるのを避けるための強い注意
が払われるべきである。
リス−HCl（pH7.5）および0.1Mの２−メルカプトエタノ
ールを含む分解溶液。グアニジンチオシアネート（472.
6g）を500mlの水および200mlのトリス緩衝ストツク溶液
（0.5Mトリス−HCl、pH7.5）中で加熱してとかした。こ
の溶液を室温に冷却し、その後に7.15mlの２−メルカプ
トエタノールを加え、この溶液を滅菌水で1000mlに希釈
した。グアニジンチオシアネートからの粒状物質ナルジ
の使い捨てフイルタユニツトを通す濾過によって除い
た。この溶液は室温で少なくとも１ケ月間安定であっ
た。この試薬が皮膚にふれるのを避けるための強い注意
が払われるべきである。
誘発細胞の破壊を煙フード中で行なった。実施例１か
らの細胞を凍結状態を保ちながら部分的に破砕した。
らの細胞を凍結状態を保ちながら部分的に破砕した。
溶液B:6Mの超高純度グアニジン塩酸塩中に10mMのNa2EDT
A（pH7.0）および10mMのジチオスレイトールを含む洗浄
溶液。グアニジン塩酸塩の高純度のために、この溶液の
濾過は必要ではなく、そしてこの溶液は室温で貯蔵する
とき安定であった。ここでもこの溶液が皮膚にふれるの
を避けるために注意が払われるべきである。
A（pH7.0）および10mMのジチオスレイトールを含む洗浄
溶液。グアニジン塩酸塩の高純度のために、この溶液の
濾過は必要ではなく、そしてこの溶液は室温で貯蔵する
とき安定であった。ここでもこの溶液が皮膚にふれるの
を避けるために注意が払われるべきである。
誘発細胞の破壊を煙フード中で行なった。実施例１か
らの細胞を凍結状態に保ちながら部分的に破砕して、高
速ホモジナイザーの室中で細胞1g（湿潤重量）当り20ml
の溶液Ａに入れた。ホモジナイザーを十分な速度で２分
間操作して細胞を破壊した。溶菌生成物を次いでソルバ
ルGSAロータ中で12,000rpmで10分間遠心分離して存在す
る破片を除いた。
らの細胞を凍結状態に保ちながら部分的に破砕して、高
速ホモジナイザーの室中で細胞1g（湿潤重量）当り20ml
の溶液Ａに入れた。ホモジナイザーを十分な速度で２分
間操作して細胞を破壊した。溶菌生成物を次いでソルバ
ルGSAロータ中で12,000rpmで10分間遠心分離して存在す
る破片を除いた。
RNAおよび他の細胞成分を含む上澄液を0.1N酢酸0.04
容量の添加によってpH5に酸性化し、そして0.5容量の無
水エタノールの添加によってRNAを沈殿させた。この溶
液を−20℃に少なくとも２時間保持した。混合物を−20
℃にこれ以上長くおいてもRNAの収率が目立って増大す
ることはなく、大量の蛋白質の共沈殿が生じて、次の工
程での再溶解を困難にする。沈殿したRNAを、ソルバルG
SAロータ中で8,000rpmで10分間遠心分離することによっ
て集めた。上澄液を除き、ペレツトを（溶菌生成物のも
との容量に対して）約0.5容量の溶液に70℃でとかし
た。このRNAを0.04容量の1N酢酸の添加によって再びpH5
に酸性化した。この溶液を氷浴中で冷却し、0.5容量の
冷エタノールでRNAを沈殿させた。沈殿はほとんど瞬間
的に生じ、定量的であった。ソルバルGSAロータ中での
6,000rpm、10分間の遠心分離によってRNAを集めた。容
量を更に減らして溶液Ｂによる方法を次いで１回くりか
えした。最終ペレツトを滅菌した0.24M酢酸ナトリウム
液（pH5.5）にとかし、2.5容量のエタノールの添加によ
って沈殿させた。全RNAを次に使用するまでエタノール
沈殿物として−20℃で貯蔵した。この段階でのRNAは劣
化しておらず蛋白質およびDNAを含んでいなかつた。
容量の添加によってpH5に酸性化し、そして0.5容量の無
水エタノールの添加によってRNAを沈殿させた。この溶
液を−20℃に少なくとも２時間保持した。混合物を−20
℃にこれ以上長くおいてもRNAの収率が目立って増大す
ることはなく、大量の蛋白質の共沈殿が生じて、次の工
程での再溶解を困難にする。沈殿したRNAを、ソルバルG
SAロータ中で8,000rpmで10分間遠心分離することによっ
て集めた。上澄液を除き、ペレツトを（溶菌生成物のも
との容量に対して）約0.5容量の溶液に70℃でとかし
た。このRNAを0.04容量の1N酢酸の添加によって再びpH5
に酸性化した。この溶液を氷浴中で冷却し、0.5容量の
冷エタノールでRNAを沈殿させた。沈殿はほとんど瞬間
的に生じ、定量的であった。ソルバルGSAロータ中での
6,000rpm、10分間の遠心分離によってRNAを集めた。容
量を更に減らして溶液Ｂによる方法を次いで１回くりか
えした。最終ペレツトを滅菌した0.24M酢酸ナトリウム
液（pH5.5）にとかし、2.5容量のエタノールの添加によ
って沈殿させた。全RNAを次に使用するまでエタノール
沈殿物として−20℃で貯蔵した。この段階でのRNAは劣
化しておらず蛋白質およびDNAを含んでいなかつた。
インターフエロンmRNAを精製する際の第１工程はGree
n.M.らのArch.Biochem.Biophys.172、74（1976）に記載
の方法を使用するオリゴ（dT）−セルロースカラム上で
の親和クロマトグラフを含んでいた。このRNA溶液（30
〜50A260単位/ml）を0.11容量の5M−NaClの添加によつ
て0.5M−NaClに調整し、次いで10mMのトリス−HCl（pH
7.4）および0.5MのNaClで平衡化したオリゴ（dT）−セ
ルロース〔Ｔ−３、Collaborative Rerearch〕の5gを含
むカラムに約20ml/hrの流量で適用した。光学密度が0.0
8A260単位/ml以下になるまで同じ緩衝液で洗浄すること
によつてカラムから非結合RNAを除いた。次いでポリ
（Ａ）RNAを10mMのトリス−HCl（pH7.4）で溶出した。
ポリ（Ａ）RNAをもう一度カラム上をリサイクルさせて
リボゾームおよび他の非ポリ（Ａ）RNA類による汚染を
減少させた。第１のオリゴ（dT）−セルロースカラムの
クロマトグラフの後に、後述のゼノパスラエビス卵母細
胞中への注入によつて、このRNA調製物を分析してイン
ターフエロンmRNA活性を求めた。
n.M.らのArch.Biochem.Biophys.172、74（1976）に記載
の方法を使用するオリゴ（dT）−セルロースカラム上で
の親和クロマトグラフを含んでいた。このRNA溶液（30
〜50A260単位/ml）を0.11容量の5M−NaClの添加によつ
て0.5M−NaClに調整し、次いで10mMのトリス−HCl（pH
7.4）および0.5MのNaClで平衡化したオリゴ（dT）−セ
ルロース〔Ｔ−３、Collaborative Rerearch〕の5gを含
むカラムに約20ml/hrの流量で適用した。光学密度が0.0
8A260単位/ml以下になるまで同じ緩衝液で洗浄すること
によつてカラムから非結合RNAを除いた。次いでポリ
（Ａ）RNAを10mMのトリス−HCl（pH7.4）で溶出した。
ポリ（Ａ）RNAをもう一度カラム上をリサイクルさせて
リボゾームおよび他の非ポリ（Ａ）RNA類による汚染を
減少させた。第１のオリゴ（dT）−セルロースカラムの
クロマトグラフの後に、後述のゼノパスラエビス卵母細
胞中への注入によつて、このRNA調製物を分析してイン
ターフエロンmRNA活性を求めた。
このようにしてえられたインターフエロンmRNAをサク
ロース傾斜遠心分離によつて富化した。Buchler傾斜メ
ーカーの室中で、0.02Mの酢酸ナトリウム中の等容量の
５％（w/v）および20％（w/v）サクロースを混合するこ
とによつて線状の勾配を作つた。形成後、これらの傾斜
を４℃で少なくとも４時間平衡化した。荷重の前に、RN
Aサンプルを80℃に２分間加熱し、そして氷浴中で急速
に冷却して集塊を減少させた。このサンプルを勾配上に
層として置き、SW40ロータ（Beckman）を使用して４℃
で30,000γpm、20分間の遠心分離を行なつた。遠心分離
の後に、流れている細胞がGilford分光計に付着するよ
うにされたIsco Gradient Pumpの使用によって、グラジ
エント成分を集めた。チユーブの底部に50％サクロース
をポンプ給送することによってグラジエントを分析し
た。分画を集め、エタノールで沈殿させ、滅菌水にとか
し、そして後述のゼノパスラエビス卵母細胞中への注射
によって分析した。白血球インターフエロンmRNAS類は1
2Sの種としてほぼ移動した。
ロース傾斜遠心分離によつて富化した。Buchler傾斜メ
ーカーの室中で、0.02Mの酢酸ナトリウム中の等容量の
５％（w/v）および20％（w/v）サクロースを混合するこ
とによつて線状の勾配を作つた。形成後、これらの傾斜
を４℃で少なくとも４時間平衡化した。荷重の前に、RN
Aサンプルを80℃に２分間加熱し、そして氷浴中で急速
に冷却して集塊を減少させた。このサンプルを勾配上に
層として置き、SW40ロータ（Beckman）を使用して４℃
で30,000γpm、20分間の遠心分離を行なつた。遠心分離
の後に、流れている細胞がGilford分光計に付着するよ
うにされたIsco Gradient Pumpの使用によって、グラジ
エント成分を集めた。チユーブの底部に50％サクロース
をポンプ給送することによってグラジエントを分析し
た。分画を集め、エタノールで沈殿させ、滅菌水にとか
し、そして後述のゼノパスラエビス卵母細胞中への注射
によって分析した。白血球インターフエロンmRNAS類は1
2Sの種としてほぼ移動した。
実施例 3. ゼノパス ラエビス卵細胞中のインターフエロンmRNAの
翻訳 ゼノパスラエビス卵母細胞はNasco,Ft.Atkinson（ア
メリカ合衆国ウイスコンシン州）から（＃LM531LQ）の
商品名で入手した。これらのカエルからえられた卵母細
胞は再現性のある高いインターフエロン滴定濃度を生じ
ることが見出された。この動物を氷水に30分間入れた
後、これを殺して卵母細胞を除き、直ちに次の卵母細胞
培養培地150ml中に入れた。
翻訳 ゼノパスラエビス卵母細胞はNasco,Ft.Atkinson（ア
メリカ合衆国ウイスコンシン州）から（＃LM531LQ）の
商品名で入手した。これらのカエルからえられた卵母細
胞は再現性のある高いインターフエロン滴定濃度を生じ
ることが見出された。この動物を氷水に30分間入れた
後、これを殺して卵母細胞を除き、直ちに次の卵母細胞
培養培地150ml中に入れた。
卵母細胞培養培地 NaCl 88 mM KCl 1 mM NaHCO3 2.4 mM MgSO4・7H2O 0.82mM Ca（NO3）２・4H2O 0.33mM CaCl2・2H2O 0.41mM トリス塩基 7.5 mM ペニシリンG 18単位/ml カルシウム （11μg/ml） ストレプトマイシン 18μg/ml HClで最終pHをpH7.6に調製し、この溶液を濾過によっ
て滅菌した。
て滅菌した。
卵母細胞嚢を鈍い針でおだやかにけば立ててはがすこ
とによつて個々の卵母細胞をえた。これらの卵母細胞は
明瞭な動物性および植物性の極をもつている。植物性の
極の卵黄は淡灰白色であり、動物性の極は黒色である。
これらは大きさを異にするが、大部分の卵母細胞は直径
約1mmであつた。直径約1.2〜1.5mmの最大の卵母細胞を
注射後に洩れる傾向があるので使用しなかつた。分離後
に、卵母細胞を５℃で貯蔵した。卵母細胞は５℃で４〜
５日間貯蔵後に最大のインターフエロン滴定濃度を与え
る能力がある。
とによつて個々の卵母細胞をえた。これらの卵母細胞は
明瞭な動物性および植物性の極をもつている。植物性の
極の卵黄は淡灰白色であり、動物性の極は黒色である。
これらは大きさを異にするが、大部分の卵母細胞は直径
約1mmであつた。直径約1.2〜1.5mmの最大の卵母細胞を
注射後に洩れる傾向があるので使用しなかつた。分離後
に、卵母細胞を５℃で貯蔵した。卵母細胞は５℃で４〜
５日間貯蔵後に最大のインターフエロン滴定濃度を与え
る能力がある。
実施例２からのmRNAを0.5〜1mg/mlの濃度で滅菌水に
とかし、この溶液を注射するまで氷上に保持した。
とかし、この溶液を注射するまで氷上に保持した。
注射針は５μのマイクロ分配管（＃105G、Drummond
Scientific）を垂直ピペツトプラー（モデル700B.Davi
d Kopf Instruments;アメリカ合衆国カリフオルニア州
ツジユンガ）を用いて引つ張ることによって製造した。
引っ張った針を先端でシールした。この先端を解剖用顕
微鏡下で微小ハサミで破って直径0.005〜0.01mmの先端
をもつ針を作った。マイクロ分配毛管は50nlの等価の0.
27mmの均一な孔のチューブから成っていた（5.4mmが１
μｌに相当）。
Scientific）を垂直ピペツトプラー（モデル700B.Davi
d Kopf Instruments;アメリカ合衆国カリフオルニア州
ツジユンガ）を用いて引つ張ることによって製造した。
引っ張った針を先端でシールした。この先端を解剖用顕
微鏡下で微小ハサミで破って直径0.005〜0.01mmの先端
をもつ針を作った。マイクロ分配毛管は50nlの等価の0.
27mmの均一な孔のチューブから成っていた（5.4mmが１
μｌに相当）。
RNAを卵母細胞に注射するために、２μｌのインター
フエロンmRNAを、滅菌鉱油をみたした60×15mmの丸いペ
トリ皿の底部においた。ペトリ皿の壁に対して底部にお
いて小さい水性泡が残った。次いで注射針をBrinkmanマ
イクロマニピユレータ（＃06−15−00）の端部にクラン
プし、油圧系に接続するチューブに取り付けた。開いて
いる先端から2mmまで、正圧を針にかけてみたした。次
いでこの針を鉱油を通してmRNA溶液中に入れた。溶液は
系に適用された負圧の助けと共に、毛管作用によって管
中に引き込まれた。サンプルは注射針の1/2〜3/4をみた
した。RNA溶液と油圧流体（滅菌H2O）との間に小量の気
泡が残った。1mm目盛りのグラフ用紙の数枚を針の上に
おきメニスカスで整列させた。
フエロンmRNAを、滅菌鉱油をみたした60×15mmの丸いペ
トリ皿の底部においた。ペトリ皿の壁に対して底部にお
いて小さい水性泡が残った。次いで注射針をBrinkmanマ
イクロマニピユレータ（＃06−15−00）の端部にクラン
プし、油圧系に接続するチューブに取り付けた。開いて
いる先端から2mmまで、正圧を針にかけてみたした。次
いでこの針を鉱油を通してmRNA溶液中に入れた。溶液は
系に適用された負圧の助けと共に、毛管作用によって管
中に引き込まれた。サンプルは注射針の1/2〜3/4をみた
した。RNA溶液と油圧流体（滅菌H2O）との間に小量の気
泡が残った。1mm目盛りのグラフ用紙の数枚を針の上に
おきメニスカスで整列させた。
注射にために、10個の卵母細胞を正方形（100×100m
m）のペトリ皿にテープ止めしたスライドのヘリに対し
て整列させた。動物性または植物性の極は最終のインタ
ーフエロン滴定濃度に影響を及ぼくことなく注射するこ
とができる。注射針は60゜の角度で卵母細胞に入るの
で、系に正圧を加えた。メニスカスの移動は注射したそ
れぞれの卵母細胞について約0.3mmであった。これは卵
母細胞１個につき約50nlに相当する。針を卵母細胞から
除き、残りの９個を続けて注射した。卵母細胞１個当り
約40〜50ngのインターフエロンmRNAを注射した。この濃
度が飽和であることがあらかじめ示された。注射直後
に、10個の卵母細胞を0.1mlの新鮮な卵母細胞培養培地
に入れて1.5mlの滅菌プリプロピレンらせんチューブ中
で23℃において18時間培養した。
m）のペトリ皿にテープ止めしたスライドのヘリに対し
て整列させた。動物性または植物性の極は最終のインタ
ーフエロン滴定濃度に影響を及ぼくことなく注射するこ
とができる。注射針は60゜の角度で卵母細胞に入るの
で、系に正圧を加えた。メニスカスの移動は注射したそ
れぞれの卵母細胞について約0.3mmであった。これは卵
母細胞１個につき約50nlに相当する。針を卵母細胞から
除き、残りの９個を続けて注射した。卵母細胞１個当り
約40〜50ngのインターフエロンmRNAを注射した。この濃
度が飽和であることがあらかじめ示された。注射直後
に、10個の卵母細胞を0.1mlの新鮮な卵母細胞培養培地
に入れて1.5mlの滅菌プリプロピレンらせんチューブ中
で23℃において18時間培養した。
培養後に、卵母細胞をそれらを培養したのと同じチュ
ーブ中で手動によりホモジネートした。これは若干の卵
母細胞が培養培地中にかくされているために重要なこと
である。次いで抽出物をEppendorf遠心分離器中で５分
間遠心分離した。90μｌの上澄液を注意深く除いた。脂
質層が頂部に生成したが、このものはインターフエロン
分析の際に細胞に対して毒性がある。それ故、できるだ
け小量の脂質を除いた。90μｌの上澄液を次いで再び５
分間遠心分離した。次いでこの上澄液をRubinsteinらの
方法によって分析してインターフエロン活性を求めた。
この溶液のインターフエロン滴定濃度は1260U/mlであっ
た。
ーブ中で手動によりホモジネートした。これは若干の卵
母細胞が培養培地中にかくされているために重要なこと
である。次いで抽出物をEppendorf遠心分離器中で５分
間遠心分離した。90μｌの上澄液を注意深く除いた。脂
質層が頂部に生成したが、このものはインターフエロン
分析の際に細胞に対して毒性がある。それ故、できるだ
け小量の脂質を除いた。90μｌの上澄液を次いで再び５
分間遠心分離した。次いでこの上澄液をRubinsteinらの
方法によって分析してインターフエロン活性を求めた。
この溶液のインターフエロン滴定濃度は1260U/mlであっ
た。
実施例 ４ mRNAからcDNAの製造 次のストック溶液および物質を調製した。
0.5 M トリス−HCl、pH8.3 1.4 M KCl 0.25M MgCl2 0.05M dATP、 pH7.0 0.05M dCTP、 pH7.0 0.05M TTP、 pH7.0 〔32P〕dCTP、400Ci/mモル、1mCi/ml（Amersham） 0.01M ジチオスレイトール（DTT） オリゴ（dT）12-18、250μg/ml（Collaborative Resear
ch） アクチノマイシンＤ、500μg/ml（Calibiochem） 鳥類骨髄腫細胞ウイルスリバーストランスクプターゼ 約10,000単位/ml（Research Resources Branch,Viral O
ncology Program,National Cancer Research,から入
手） すべての緩衝液および塩溶液をオートクレーブ処理し
た。他の溶液は滅菌ガラス蒸留水で調製して滅菌容器中
で貯蔵した。すべてのストツク溶液を凍結して貯蔵し
た。
ch） アクチノマイシンＤ、500μg/ml（Calibiochem） 鳥類骨髄腫細胞ウイルスリバーストランスクプターゼ 約10,000単位/ml（Research Resources Branch,Viral O
ncology Program,National Cancer Research,から入
手） すべての緩衝液および塩溶液をオートクレーブ処理し
た。他の溶液は滅菌ガラス蒸留水で調製して滅菌容器中
で貯蔵した。すべてのストツク溶液を凍結して貯蔵し
た。
操 作 法 cDAN合成の鋳型として、実施例２からの12Sのインタ
ーフエロンmRNAを使用した。この合成を行なうために、
〔α−32P〕dCTPを使用してcDNAがポリアクリルアミド
ゲル上に配置されうるようにした。放射性化合物は凍結
乾燥によって乾燥した。mRNA各１μｇにつき400Ci/mモ
ルの比活性の〔α−32P〕dCTPの５μCiを使用した。0.1
MトリスHCl（pH8.3）、140mMのKCl、20mMのMgCl2、1mM
のdATP、1mMのdCTP、1mMのdGTP、1mMのTTP、および0.4m
MのDDTから成る2X反応混合物中に上記の乾燥物質をとか
した。この溶液を氷上に保った。この溶液にmRNA（50μ
g/ml、最終濃度）、オリゴ（dT）12-18（25μg/ml）、
アクチノマイシンＤ（40μg/ml）、AMVリバーストラン
スクリプターゼ（80単位/ml）、および上記2X混合物を1
Xに希釈するに十分な水を加えた。氷上で５分後、この
反応混合物を46℃で10分間インキュベーシヨンした。培
養後にEDTAを加えて25mMの最終濃度とした。この溶液を
等容量のフエノール：クロロホルム（1/1;v/v）で１回
抽出し、水性相を10mMのトリス−HCl（pH8.0）、1mMのE
DTA、0.1MのNaClで平衡化したセフアデツクスＧ−100
（0.7×20cm）のカラム上でクロマトグラフ処理した。
排除された容積中のcDNAを2.4Mの酢酸ナトリウム（pH
5）および2.5容量のエタノールの添加によって沈殿させ
た。mRNAの型を除くために、cDNAを遠心分離によって沈
降させ、0.1MのNaOHの0.3ml中にとかし、そして70℃に
おいて20分間培養した。この溶液を3.0mlの1.0M−HClで
中和し、上述のようにエタノールで沈殿させた。cDNAの
収率は使用したmRNAの10〜20％であった。
ーフエロンmRNAを使用した。この合成を行なうために、
〔α−32P〕dCTPを使用してcDNAがポリアクリルアミド
ゲル上に配置されうるようにした。放射性化合物は凍結
乾燥によって乾燥した。mRNA各１μｇにつき400Ci/mモ
ルの比活性の〔α−32P〕dCTPの５μCiを使用した。0.1
MトリスHCl（pH8.3）、140mMのKCl、20mMのMgCl2、1mM
のdATP、1mMのdCTP、1mMのdGTP、1mMのTTP、および0.4m
MのDDTから成る2X反応混合物中に上記の乾燥物質をとか
した。この溶液を氷上に保った。この溶液にmRNA（50μ
g/ml、最終濃度）、オリゴ（dT）12-18（25μg/ml）、
アクチノマイシンＤ（40μg/ml）、AMVリバーストラン
スクリプターゼ（80単位/ml）、および上記2X混合物を1
Xに希釈するに十分な水を加えた。氷上で５分後、この
反応混合物を46℃で10分間インキュベーシヨンした。培
養後にEDTAを加えて25mMの最終濃度とした。この溶液を
等容量のフエノール：クロロホルム（1/1;v/v）で１回
抽出し、水性相を10mMのトリス−HCl（pH8.0）、1mMのE
DTA、0.1MのNaClで平衡化したセフアデツクスＧ−100
（0.7×20cm）のカラム上でクロマトグラフ処理した。
排除された容積中のcDNAを2.4Mの酢酸ナトリウム（pH
5）および2.5容量のエタノールの添加によって沈殿させ
た。mRNAの型を除くために、cDNAを遠心分離によって沈
降させ、0.1MのNaOHの0.3ml中にとかし、そして70℃に
おいて20分間培養した。この溶液を3.0mlの1.0M−HClで
中和し、上述のようにエタノールで沈殿させた。cDNAの
収率は使用したmRNAの10〜20％であった。
cDNAから二重ストランドcDNAの合成は、５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼＩ（クレ
ノウ断片）の使用により行なった。追加プライマーは必
要としない。それは大部分のcDNA分子上の３′−ループ
がAMVリバーストランスクリプラーゼを用いて作られて
いるためである。ds cDNAを作るために、この３′−ル
ープをアスペルギルスオリザエS1ヌクレアーゼによって
開裂させた。
キソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼＩ（クレ
ノウ断片）の使用により行なった。追加プライマーは必
要としない。それは大部分のcDNA分子上の３′−ループ
がAMVリバーストランスクリプラーゼを用いて作られて
いるためである。ds cDNAを作るために、この３′−ル
ープをアスペルギルスオリザエS1ヌクレアーゼによって
開裂させた。
次のストツク溶液および物質を調製した。
0.5Mのリン酸カリウム（pH7.4） 0.25MのMgCl2 0.1MのDTT 0.05MのdATP（pH7.0） 0.05MのdGTP（pH7.0） 0.05MのdCTP（pH7.0） 0.05MのTTP（pH7.0） 〔α−3H〕dCTP、22Ci/mモル、1mCi/mモル（Amersham） E.コリイDNAポリマラーゼＩ（クレノウ断片） 約1000単位/ml（Boehringer−Mannheim） ５×S1ヌクレアーゼ緩衝液:0.167Mの酢酸ナトリウム（p
H4.5）;5mMのZnCl2 操 作 法 第２のストランドの合成を行なうために、cDNA合成に
使用したmRNAの１μｇ当り10μCiの〔3H〕dCTP（比活性
22Ci/mモル）を使用した。0.Mのリン酸カリウム（pH7.
4）、20mMのMgCl2、2mMのDTT、それぞれ0.4mMのdATP、d
GTP、dCTPおよびTTPから成る2X反応混合物に乾燥〔3H〕
dCTをとかした。この混合物を氷上に保持し、水中cDNA
を加え、E.コリイDNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）
を100単位/mlまで加え、そして水を加えて反応混合物を
1Xにした。この溶液を一夜15℃で培養した。培養後、ED
TAを25mMまで加え、溶液を等容量のフエノール：クロロ
ホルム（1/1;v/v）で１回抽出し、そして水性相を、10m
Mのトリス−HCl（pH8.0）、1mMのEDTAおよび0.1MのNaCl
で平衡化したセフアデツクスＧ−100の0.7×20cmカラム
上でクロマトグラフ処理した。溶出された分画中のDNA
を上述のようにエタノールで沈殿させた。ds DNAの収
率は鋳型として使用した。cDNAの量の50〜100％であっ
た。
H4.5）;5mMのZnCl2 操 作 法 第２のストランドの合成を行なうために、cDNA合成に
使用したmRNAの１μｇ当り10μCiの〔3H〕dCTP（比活性
22Ci/mモル）を使用した。0.Mのリン酸カリウム（pH7.
4）、20mMのMgCl2、2mMのDTT、それぞれ0.4mMのdATP、d
GTP、dCTPおよびTTPから成る2X反応混合物に乾燥〔3H〕
dCTをとかした。この混合物を氷上に保持し、水中cDNA
を加え、E.コリイDNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）
を100単位/mlまで加え、そして水を加えて反応混合物を
1Xにした。この溶液を一夜15℃で培養した。培養後、ED
TAを25mMまで加え、溶液を等容量のフエノール：クロロ
ホルム（1/1;v/v）で１回抽出し、そして水性相を、10m
Mのトリス−HCl（pH8.0）、1mMのEDTAおよび0.1MのNaCl
で平衡化したセフアデツクスＧ−100の0.7×20cmカラム
上でクロマトグラフ処理した。溶出された分画中のDNA
を上述のようにエタノールで沈殿させた。ds DNAの収
率は鋳型として使用した。cDNAの量の50〜100％であっ
た。
この点でds cDNAはヘアピンループを含んでいた。Vo
gtのEur.J.Biochem,33、192（1973）に記載の方法によ
って製造したアスペルギルスオリザエS1ヌクレアーゼを
用いる消化によって、単一ストランドのループを除い
た。このds cDNAを水にとかし、0.25容量の５×S1緩衝
液を加えた。適当量のS1ヌクレアーゼを加えて、この溶
液を37℃で20分間培養した。（添加すべき酵素の量はそ
れぞれの酵素による製造について実験的に測定しなけれ
ばならない。それは活性が製造ごとに変わるためであ
る。これはds cDNAからのTCA沈殿性カウントの増加を
測定することによって行なわれる。通常、50〜75％のds
cDNAがS1ヌクレアーゼに耐性がある。然し、S1ヌクレ
アーゼによる製造中の低水準の夾雑ヌクレアーゼによる
過消化を避けるために注意を払わねばならない。）S1消
化ds cDNAはフエノール：クロロホルムで１回抽出し、
水性相は上述のようにエタノールで沈殿させる。
gtのEur.J.Biochem,33、192（1973）に記載の方法によ
って製造したアスペルギルスオリザエS1ヌクレアーゼを
用いる消化によって、単一ストランドのループを除い
た。このds cDNAを水にとかし、0.25容量の５×S1緩衝
液を加えた。適当量のS1ヌクレアーゼを加えて、この溶
液を37℃で20分間培養した。（添加すべき酵素の量はそ
れぞれの酵素による製造について実験的に測定しなけれ
ばならない。それは活性が製造ごとに変わるためであ
る。これはds cDNAからのTCA沈殿性カウントの増加を
測定することによって行なわれる。通常、50〜75％のds
cDNAがS1ヌクレアーゼに耐性がある。然し、S1ヌクレ
アーゼによる製造中の低水準の夾雑ヌクレアーゼによる
過消化を避けるために注意を払わねばならない。）S1消
化ds cDNAはフエノール：クロロホルムで１回抽出し、
水性相は上述のようにエタノールで沈殿させる。
二重ストランドcDNAを12mlの５〜25％中性シユクロー
スのリニアーグラジエント上に層状におき、ベツクマン
SW40ロータ中で38,000γpm（５℃）で17時間遠心分離し
た。1mlの画分を集め、画分５−９（頂部から数えて）
をプールした。〔NorgardらのJ.Biol.Chem.,255、7665
−7672（1980）参照〕。
スのリニアーグラジエント上に層状におき、ベツクマン
SW40ロータ中で38,000γpm（５℃）で17時間遠心分離し
た。1mlの画分を集め、画分５−９（頂部から数えて）
をプールした。〔NorgardらのJ.Biol.Chem.,255、7665
−7672（1980）参照〕。
二重ストランドcDNAのホモポリマーテーリングのため
に、次のストツク溶液および物質を調製した。
に、次のストツク溶液および物質を調製した。
1.Mのカリウム・カコジレート 0.3Mのトリス、pH7.6 （pHは1:10に希釈したとき7.2になる） 15mMのCoCl2 10mMのジチオスレイトール（DTT） 4mMのdCTP（pH7.0） 操 作 法 ３′−末端へのdCMP残基の付加は、〔3H〕dCTPを酸沈
殿物質へ取り込ませることによって行なった。25μCiの
〔3H〕dCTPをもとのcDNA合成に使用したmRNAの１μｇ毎
に使用した。放射性物質を乾燥して反応混合物中に再び
とかした。二重ストランドcDNAを適当量のストツク溶液
にとかして次の最終濃度を与えた:0.14Mのカリウム・カ
コジレート、0.03Mのトリス、pH7.2;1mMのDTT;0.1mMの
〔3H〕dCTP（1Ci/mml）;1.5mMのCoCl2;および２×10-8M
の３′−末端。CoCl2なしの上記溶液を37℃に加温し、
次いでCoCl2を加えた。精製末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼを100単位/mlの最終濃度になるよ
うに加えた。この反応を37℃で５時間進行させた。この
時点においてサンプルをとって酸沈殿物質中への〔3H〕
dCMPの取り込み量を測定した。十分な長さの尾部が追加
されなかった場合、溶液を所望の長さの時間再び37℃に
おくことによって反応を続けた。約10〜20のdCMP残基の
尾部が生成したとき、EDTAを加えた（110mM、最終濃
度）。この溶液をフエノール：クロロホルム（1/1;v/
v）で一回抽出し、そして水性相をエタノールで沈殿さ
せた。この方法で製造したdC尾部付きds cDNAは後述の
dG尾部付きpBR322ベクター中に挿入する準備のできたも
のであった。
殿物質へ取り込ませることによって行なった。25μCiの
〔3H〕dCTPをもとのcDNA合成に使用したmRNAの１μｇ毎
に使用した。放射性物質を乾燥して反応混合物中に再び
とかした。二重ストランドcDNAを適当量のストツク溶液
にとかして次の最終濃度を与えた:0.14Mのカリウム・カ
コジレート、0.03Mのトリス、pH7.2;1mMのDTT;0.1mMの
〔3H〕dCTP（1Ci/mml）;1.5mMのCoCl2;および２×10-8M
の３′−末端。CoCl2なしの上記溶液を37℃に加温し、
次いでCoCl2を加えた。精製末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼを100単位/mlの最終濃度になるよ
うに加えた。この反応を37℃で５時間進行させた。この
時点においてサンプルをとって酸沈殿物質中への〔3H〕
dCMPの取り込み量を測定した。十分な長さの尾部が追加
されなかった場合、溶液を所望の長さの時間再び37℃に
おくことによって反応を続けた。約10〜20のdCMP残基の
尾部が生成したとき、EDTAを加えた（110mM、最終濃
度）。この溶液をフエノール：クロロホルム（1/1;v/
v）で一回抽出し、そして水性相をエタノールで沈殿さ
せた。この方法で製造したdC尾部付きds cDNAは後述の
dG尾部付きpBR322ベクター中に挿入する準備のできたも
のであった。
実施例 ５ 交配プラスミドの組立て プラスミドpBR322〔Bolival,F.らのGene,２、95（197
7）〕（20μｇ）をPst １酵素で切断して、約20個のdG
残基を、Roychoudhury,R.らのNucl,Acids Res.,３、101
（1976）に記載の方法に従い、３′−末端に付加した。
この反応は、0.14Mのカリウム・カコジレート;0.03Mの
トリス−HCl、pH7.0;1mMのCoCl2;および0.01mMのジチオ
スレイトールから成る緩衝液中で行なった。プラスミド
DNAの３′−ヒドロキシ基の濃度は40nMであり、3000モ
ルの過剰の3H−dGTPを使用した。反応は末端トランスフ
エラーゼの21単位によって触媒作用を受けさせた。
7）〕（20μｇ）をPst １酵素で切断して、約20個のdG
残基を、Roychoudhury,R.らのNucl,Acids Res.,３、101
（1976）に記載の方法に従い、３′−末端に付加した。
この反応は、0.14Mのカリウム・カコジレート;0.03Mの
トリス−HCl、pH7.0;1mMのCoCl2;および0.01mMのジチオ
スレイトールから成る緩衝液中で行なった。プラスミド
DNAの３′−ヒドロキシ基の濃度は40nMであり、3000モ
ルの過剰の3H−dGTPを使用した。反応は末端トランスフ
エラーゼの21単位によって触媒作用を受けさせた。
実施例４からのdC−尾部付き二重ストランドcDNAを、
10mMのトリス−HCl、pH7.5;100mMのNaClおよび2.5mMのN
a2EDTAから成るアニーリング緩衝液の0.9ml中で等モル
（470nモル）の該２種の分子を混合することによって、
dG−尾部付きpBR322にアニーリングさせた。この混合物
を水浴中で70℃において10分間培養した。次いでこの浴
を37℃の室に移し、一夜徐々に冷却した。次の日にこの
浴を室温に冷却させた。えられた組み換え体プラスミド
を使用してE.コリイ細胞を形質転換させた。
10mMのトリス−HCl、pH7.5;100mMのNaClおよび2.5mMのN
a2EDTAから成るアニーリング緩衝液の0.9ml中で等モル
（470nモル）の該２種の分子を混合することによって、
dG−尾部付きpBR322にアニーリングさせた。この混合物
を水浴中で70℃において10分間培養した。次いでこの浴
を37℃の室に移し、一夜徐々に冷却した。次の日にこの
浴を室温に冷却させた。えられた組み換え体プラスミド
を使用してE.コリイ細胞を形質転換させた。
実施例 ６ 形質転換 E.コリイ菌株HB101の培養物を0.2％グルコース含有LB
培地10ml中で一夜生育した。次の日に50mlのLB＋0.2％
グルコースの培地にこの培養物0.5mlを接種してこの培
養物を、それが595nmにおいて0.3の吸収値をもつまで、
37℃で生育した。この培養物をソルバルSS34ロータ中で
5000γpmで10分間遠心分離し、えられたペレツトを0.1M
の冷MgCl2溶液2ml中に再び懸濁させた。この懸濁液を0.
1Mの冷MgCl2溶液で25mlに希釈し、3000γpmで10分間遠
心分離した。次いでこれらの細胞を0.1MのCaCl2溶液25m
lに再び懸濁させ、氷上で１時間培養した。この懸濁液3
000γpmで10分間再び遠心分離して、細胞を同じ緩衝液
2.2ml中に再び懸濁させた。この時点で実施例５のアニ
ーリング混合物20μｌと細胞懸濁液とを混合して氷上で
20分間培養した。次いで細胞を42.5℃で２分間熱シヨツ
クを受けさせ、2.8mlのLB＋0.2％グルコース培地を加
え、混合物を37℃で培養して発現を行なった。この混合
物の100μｌを0.2％グルコース・0.8％カンテン含有LB
培地2.5mlに加え、これを45℃に保った。この“頂部カ
ンテン”を次いでLB−0.2％グルコース培地＋50μg/ml
のテトラサイクリンを含むプレートに注入した。これら
のプレートをコロニイが現れるまで37℃で１〜２日間培
養した。〔参考文献:Lederberg,E.らのJ.Bact.,119、10
72（1974）〕。
培地10ml中で一夜生育した。次の日に50mlのLB＋0.2％
グルコースの培地にこの培養物0.5mlを接種してこの培
養物を、それが595nmにおいて0.3の吸収値をもつまで、
37℃で生育した。この培養物をソルバルSS34ロータ中で
5000γpmで10分間遠心分離し、えられたペレツトを0.1M
の冷MgCl2溶液2ml中に再び懸濁させた。この懸濁液を0.
1Mの冷MgCl2溶液で25mlに希釈し、3000γpmで10分間遠
心分離した。次いでこれらの細胞を0.1MのCaCl2溶液25m
lに再び懸濁させ、氷上で１時間培養した。この懸濁液3
000γpmで10分間再び遠心分離して、細胞を同じ緩衝液
2.2ml中に再び懸濁させた。この時点で実施例５のアニ
ーリング混合物20μｌと細胞懸濁液とを混合して氷上で
20分間培養した。次いで細胞を42.5℃で２分間熱シヨツ
クを受けさせ、2.8mlのLB＋0.2％グルコース培地を加
え、混合物を37℃で培養して発現を行なった。この混合
物の100μｌを0.2％グルコース・0.8％カンテン含有LB
培地2.5mlに加え、これを45℃に保った。この“頂部カ
ンテン”を次いでLB−0.2％グルコース培地＋50μg/ml
のテトラサイクリンを含むプレートに注入した。これら
のプレートをコロニイが現れるまで37℃で１〜２日間培
養した。〔参考文献:Lederberg,E.らのJ.Bact.,119、10
72（1974）〕。
実施例 ７ コロニイの選択 次のヌクレオチド配列をもつ合成放射性標識トリデカ
デオキシリボヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼ
ーシヨンによるα−インターフエロン遺伝子の存在につ
いて、コロニイを選抜した。なお下記のヌクレオチド配
列はヒト−β−インターフエロン遺伝子および数種の周
知のα−インターフエロン遺伝子の蛋白質と一致するこ
とが知られている。
デオキシリボヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼ
ーシヨンによるα−インターフエロン遺伝子の存在につ
いて、コロニイを選抜した。なお下記のヌクレオチド配
列はヒト−β−インターフエロン遺伝子および数種の周
知のα−インターフエロン遺伝子の蛋白質と一致するこ
とが知られている。
Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−
Ｇ このプローブの合成および使用は米国特許継続出願番
号第286,351号に記載されている。
Ｇ このプローブの合成および使用は米国特許継続出願番
号第286,351号に記載されている。
プローブとのハイブリダイゼーシヨン 実施例６からの1mlの培養物のコロニイを標準Ｌ−培
養液プラス50μg/mlのテトラサイクリン中で一夜生育し
た。10個のクローン中の群プールし、DNAを次の連続沸
とう法によって調製した。細胞をソルバルSS−34ロータ
中で10,000γpmで10分間遠心分離した。これらを700μ
ｌのSTET緩衝液（８％シユクロース、５％トリトンＸ−
100、50mMのEDTA、50mMのトリスpH8.0）中に再び懸濁さ
せた。リゾチームの10mg/ml溶液の50μｌを加えた後
に、この溶液を直ちに40秒沸とうさせた。溶菌生成物を
次にで室温において10分間12,000γpmで遠心分離した。
上澄液を注意深く除き、これに150μｌのイソプロパノ
ールを加えた。DNAを−20℃で30分間沈殿させ、10,000
γpmで10分間遠心分離し、次いで0.3NのNaOH、10mMのト
リス（pH8）の100μｌ中に再び懸濁させた。この溶液を
70℃で30分間培養してRNAを加水分解し、次いで3NのHCl
10μｌの添加によって中和してから、エタノールによ
りDNAを沈殿させた。沈殿したDNAを次いでEppendorf Mi
crofuge中で10分間遠心分離し、ペレツトを真空下で乾
燥した。このDNA含有ペレツトを20μｌのH2O中にとかし
た。培養物当りの収率は約100〜200ngのDNAであった。
養液プラス50μg/mlのテトラサイクリン中で一夜生育し
た。10個のクローン中の群プールし、DNAを次の連続沸
とう法によって調製した。細胞をソルバルSS−34ロータ
中で10,000γpmで10分間遠心分離した。これらを700μ
ｌのSTET緩衝液（８％シユクロース、５％トリトンＸ−
100、50mMのEDTA、50mMのトリスpH8.0）中に再び懸濁さ
せた。リゾチームの10mg/ml溶液の50μｌを加えた後
に、この溶液を直ちに40秒沸とうさせた。溶菌生成物を
次にで室温において10分間12,000γpmで遠心分離した。
上澄液を注意深く除き、これに150μｌのイソプロパノ
ールを加えた。DNAを−20℃で30分間沈殿させ、10,000
γpmで10分間遠心分離し、次いで0.3NのNaOH、10mMのト
リス（pH8）の100μｌ中に再び懸濁させた。この溶液を
70℃で30分間培養してRNAを加水分解し、次いで3NのHCl
10μｌの添加によって中和してから、エタノールによ
りDNAを沈殿させた。沈殿したDNAを次いでEppendorf Mi
crofuge中で10分間遠心分離し、ペレツトを真空下で乾
燥した。このDNA含有ペレツトを20μｌのH2O中にとかし
た。培養物当りの収率は約100〜200ngのDNAであった。
次いで10μｌのDNAをＳ＆Ｓミリポア・ニトロセルロ
ースフイルタ（BA85/20）上に直接スポツトした。ま
た、1.5μｇのSV40DNA（このものはプローブと10/13ベ
ースのホモロジーをもつ）および1.5μｇのプラスミドp
BR322をそれぞれ正および負の対照標準としてスポツト
した。乾燥後に、0.5NのNaOH、1.0MのトリスpH7.4（１
回くりかえす）、２×SSC緩衝液（0.3MのNaCl、0.03Mの
Na−シトレート、pH7）、90％エタノール（１回くりか
えす）に浸漬した3mmのWhatmanペーパー片にフイルタ７
分間隔で配置することによってフイルタを処理した。こ
れらのフイルタを再び乾燥して真空オーブン中で75℃に
おいて２時間ベーキングした。
ースフイルタ（BA85/20）上に直接スポツトした。ま
た、1.5μｇのSV40DNA（このものはプローブと10/13ベ
ースのホモロジーをもつ）および1.5μｇのプラスミドp
BR322をそれぞれ正および負の対照標準としてスポツト
した。乾燥後に、0.5NのNaOH、1.0MのトリスpH7.4（１
回くりかえす）、２×SSC緩衝液（0.3MのNaCl、0.03Mの
Na−シトレート、pH7）、90％エタノール（１回くりか
えす）に浸漬した3mmのWhatmanペーパー片にフイルタ７
分間隔で配置することによってフイルタを処理した。こ
れらのフイルタを再び乾燥して真空オーブン中で75℃に
おいて２時間ベーキングした。
ベーキング後、フイルタを10mlの４×SSC、10×テン
ハーツ緩衝液、（0.2％牛血清アルブミン、0.2％ポリビ
ニルピロリドン、および0.2％フイコール）を含む密封
プラスチツクバツク中に入れた。65℃で２時間予備培養
を行なって放射性プローブの非特異性を減少させる。次
いでこの溶液を除いて4mlの新鮮な４×SSC、10×デンハ
ーツに置き換えた。次いで32P−標識プローブ（実施例
１記載のもの）を加えた（４×106cpm、比活性５×108c
pm/μｇ）。フイルタに結合したプローブとDNAとのハイ
ブリダイゼーシヨンは15℃で１時間つづけた。培養後、
フイルタを15℃において200mlの４×SSCで５回洗ってハ
イブリダイゼーシヨンしていないプローブを除いた。次
いでフイルタを乾燥し、その後に−80℃においてコダツ
クRP−５フイルムでオートラジオグラムをとった。約30
群のクローンはある程度のハイブリダイゼーシヨンを示
した。
ハーツ緩衝液、（0.2％牛血清アルブミン、0.2％ポリビ
ニルピロリドン、および0.2％フイコール）を含む密封
プラスチツクバツク中に入れた。65℃で２時間予備培養
を行なって放射性プローブの非特異性を減少させる。次
いでこの溶液を除いて4mlの新鮮な４×SSC、10×デンハ
ーツに置き換えた。次いで32P−標識プローブ（実施例
１記載のもの）を加えた（４×106cpm、比活性５×108c
pm/μｇ）。フイルタに結合したプローブとDNAとのハイ
ブリダイゼーシヨンは15℃で１時間つづけた。培養後、
フイルタを15℃において200mlの４×SSCで５回洗ってハ
イブリダイゼーシヨンしていないプローブを除いた。次
いでフイルタを乾燥し、その後に−80℃においてコダツ
クRP−５フイルムでオートラジオグラムをとった。約30
群のクローンはある程度のハイブリダイゼーシヨンを示
した。
サザン ブロツテイング はじめの選抜におけるハイブリダイゼーシヨンは標識
プローブを用いてえられたものなので、陽性のプールは
個々のクローンにまたは５のプールに細分化された。次
の迅速プラスミド法を使用してDNAを製造した。5mlの個
々のクローンまたは10mlのプール（５個のクローン）を
Ｌ−培養液プラス50μg/mlのテトラサイクリン中で一夜
生育した。細胞を5000γpmで10分間ペレツテイングした
後、これらを凍結し、解凍し、25％シユクロース、50mM
のトリス（pH8）の2.0mlにとかし、そして室温で５分間
培養した。10％トリス（pH8）中のリゾチームの5mg/ml
溶液の半分を加え、そしてこの溶液を５分間培養した。
1.1mlの0.25M−EDTA（pH8）を加えてこと溶液を５分間
培養した。この溶液を1.5mlの細胞溶解性混合物（2mlの
10％トリトン、10mMトリスpH8）（25mlの0.25M−EDTA）
（5mlの1MトリスpH8）（68mlのH2O）と混合し、この混
合物を室温で19分間培養した。溶菌生成物を次いで４℃
において15,000γpmで29分間遠心分離した。上澄液を等
容量のフエノール:CHCl3で抽出し、次いでエタノールを
沈殿させた。DNAをペレツトにして40μH2Oにとかし
た。次いで約20μを１％アガロースゲル上に置き（操
作緩衝液:40mMのトリスpH7.9、4mMのNaOAc、1mMのEDT
A）、25ボルトで一夜電気泳動させた。次いでアガロー
スゲル中のDNAをサザーンの方法〔E.M.Southern,J.Mol.
Biol.,98、503−517（1975）〕に従つてニトロセルロー
スに移した。次いでこのゲルを200mlの0.5M−NaOH、1.5
M−NaCl中に45分間入れ、そして200mlの0.5MトリスpH7.
0、3.0M−NaCl中に移した。45分後にこのゲルを貯蔵緩
衝液としての20×SSCによりブロツテイングした。この
移行を室温で一夜行なつた。ブロツテイングの後に、ニ
トロセルロースフイルタを２×SSC中で15分間洗浄し、
次いで真空オーブン中で75℃において２時間ベーキング
した。プレハイブリダイゼーシヨン、ハイブリダイゼー
シヨンおよび洗浄をはじめの選択について述べたのと同
様にして行なった。数種の個々のクローンからのDNAは
プローブとハイブリダイゼーシヨンした。制限酵素分析
およびDNA配列決定処理はこの方法がここにα−インタ
ーフエロンGx−１と命名した遺伝子を含むインターフエ
ロン・クローンを同定するのに有効であることを確証し
た。このクローンはナンバーA3−26と名づけた。A3−26
細胞の培養物を生育して前述のRubinsteinらのウイルス
抑制法によってインターフエロン活性を分析し、インタ
ーフエロン活性を検出した。
プローブを用いてえられたものなので、陽性のプールは
個々のクローンにまたは５のプールに細分化された。次
の迅速プラスミド法を使用してDNAを製造した。5mlの個
々のクローンまたは10mlのプール（５個のクローン）を
Ｌ−培養液プラス50μg/mlのテトラサイクリン中で一夜
生育した。細胞を5000γpmで10分間ペレツテイングした
後、これらを凍結し、解凍し、25％シユクロース、50mM
のトリス（pH8）の2.0mlにとかし、そして室温で５分間
培養した。10％トリス（pH8）中のリゾチームの5mg/ml
溶液の半分を加え、そしてこの溶液を５分間培養した。
1.1mlの0.25M−EDTA（pH8）を加えてこと溶液を５分間
培養した。この溶液を1.5mlの細胞溶解性混合物（2mlの
10％トリトン、10mMトリスpH8）（25mlの0.25M−EDTA）
（5mlの1MトリスpH8）（68mlのH2O）と混合し、この混
合物を室温で19分間培養した。溶菌生成物を次いで４℃
において15,000γpmで29分間遠心分離した。上澄液を等
容量のフエノール:CHCl3で抽出し、次いでエタノールを
沈殿させた。DNAをペレツトにして40μH2Oにとかし
た。次いで約20μを１％アガロースゲル上に置き（操
作緩衝液:40mMのトリスpH7.9、4mMのNaOAc、1mMのEDT
A）、25ボルトで一夜電気泳動させた。次いでアガロー
スゲル中のDNAをサザーンの方法〔E.M.Southern,J.Mol.
Biol.,98、503−517（1975）〕に従つてニトロセルロー
スに移した。次いでこのゲルを200mlの0.5M−NaOH、1.5
M−NaCl中に45分間入れ、そして200mlの0.5MトリスpH7.
0、3.0M−NaCl中に移した。45分後にこのゲルを貯蔵緩
衝液としての20×SSCによりブロツテイングした。この
移行を室温で一夜行なつた。ブロツテイングの後に、ニ
トロセルロースフイルタを２×SSC中で15分間洗浄し、
次いで真空オーブン中で75℃において２時間ベーキング
した。プレハイブリダイゼーシヨン、ハイブリダイゼー
シヨンおよび洗浄をはじめの選択について述べたのと同
様にして行なった。数種の個々のクローンからのDNAは
プローブとハイブリダイゼーシヨンした。制限酵素分析
およびDNA配列決定処理はこの方法がここにα−インタ
ーフエロンGx−１と命名した遺伝子を含むインターフエ
ロン・クローンを同定するのに有効であることを確証し
た。このクローンはナンバーA3−26と名づけた。A3−26
細胞の培養物を生育して前述のRubinsteinらのウイルス
抑制法によってインターフエロン活性を分析し、インタ
ーフエロン活性を検出した。
実質的に純粋な、細菌により生産したヒト−α−イン
ターフエロンGx−１はA3−26細胞を蛋白発現条件下で大
規模に培養し、次いで細胞の分解、および周知技術〔た
とえば英国特許出願第2,079,291A号（1982年１月20日発
行）の実施例Ｍ参照〕を使用するα−インターフエロン
Gx−１の抽出および精製を行なうことによってえられ
る。
ターフエロンGx−１はA3−26細胞を蛋白発現条件下で大
規模に培養し、次いで細胞の分解、および周知技術〔た
とえば英国特許出願第2,079,291A号（1982年１月20日発
行）の実施例Ｍ参照〕を使用するα−インターフエロン
Gx−１の抽出および精製を行なうことによってえられ
る。
【図面の簡単な説明】 第１図は本発明によるα−インターフエロンGx−１遺伝
子の開裂した制限酵素地図を示すもので、５′および
３′は該遺伝子のデオキシリボヌクレオチド配列の両端
部を示し、０、100、200、300、400、500、600、700、8
00、900、1000は該配列を構成アミノ酸のベース対の数
を表わす。
子の開裂した制限酵素地図を示すもので、５′および
３′は該遺伝子のデオキシリボヌクレオチド配列の両端
部を示し、０、100、200、300、400、500、600、700、8
00、900、1000は該配列を構成アミノ酸のベース対の数
を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/56 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 9282−4Ｂ (56)参考文献 「遺伝子組換え実用化技術集第２集」 （サイエンスフォーラム）（昭56−３− 15）Ｐ．15〜29
Claims (12)
- 【請求項１】デオキシリボヌクレオチド配列がコードす
る対応アミノ酸配列と共に表される下記のデオキシリボ
ヌクレオチド配列からなるヒトα−インターフェロンGx
−１遺伝子。 〔上記の５′から３′までのストランドはアミノ末端か
ら始まり、これらのアミノ酸はそれぞれ三文字コドンで
示され、 Ａはデオキシアデニル； Ｔはチミジル； Ｇはデオキシグアニル； Ｃはデオキシシトシル； ＸはＡ、Ｔ、ＣまたはG; ＹはＴまたはC; ＹがＣのとき、ＺはＡ、Ｔ、ＣまたはG; ＹがＴのとき、ＺはＡまたはG: ＨはＡ、ＴまたはC; ＱはＴまたはA; ＱがＴのとき、ＲはＣであってＳはＡ、Ｔ、ＣまたはG; ＱがＡのとき、ＲはＧであってＳはＴまたはC; ＭはＡまたはG; ＬはＡまたはC; ＬがＡのとき、ＮはＡまたはG; ＬがＣのとき、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはG; GLYはグリシン； ALAはアラニン； VALはバリン； LEUはロイシン； IEUはイソロイシン； SERはセリン； THRはスレオニン； PHEはフェニルアラニン； TYRはチロシン； TRPはトリプトファン； CYSはシステイン； METはメチオニン； ASPはアスパラギン酸； GLUはグルタミン酸； LYSはリジン； ARGはアルギニン； HISはヒスチジン； PROはプロリン； GLNはグルタミン； ASNはアスパラギン； をそれぞれ表す。〕 - 【請求項２】次のデオキシリボヌクレオチド配列から成
る特許請求の範囲第１項記載α−インターフェロンGx−
１遺伝子。 - 【請求項３】リーダー配列を含む次のデオキシリボヌク
レオチド配列から成るα−インターフェロンGx−１遺伝
子。 - 【請求項４】非暗号領域を含む次のデオキシリボヌクレ
オチド配列から成るα−インターフェロンGx−１遺伝
子。 - 【請求項５】α−インターフェロンGx−１遺伝子を含
み、原核生物中で複製能力を持つプラスミド。 - 【請求項６】原核生物中でヒトα−インターフェロンGx
−１をコードするデオキシリボヌクレオチド配列の転写
および翻訳を指示し得るプロモータ、オペレータおよび
翻訳開始配列を更に含む特許請求の範囲第５項記載のプ
ラスミド。 - 【請求項７】原核生物がエッセリキア属のものである特
許請求の範囲第５項記載のプラスミド。 - 【請求項８】プロモータ、オペレータおよび翻訳開始配
列がエッセリキア属の微生物中で転写および翻訳を指示
し得る特許請求の範囲第６項記載のプラスミド。 - 【請求項９】α−インターフェロンGx−１遺伝子を含
み、原核生物中で複製能力を持つプラスミドによって形
質転換された微生物。 - 【請求項１０】微生物がエッセリキア属である特許請求
の範囲第９項記載の微生物。 - 【請求項１１】エッセリキア属がコリ種である特許請求
の範囲第10項記載の微生物。 - 【請求項１２】微生物がA3−26と命名されアメリカンタ
イプカルチャーコレクションにATCC No.39063として寄
託されたエッセリキアコリの属および種である特許請求
の範囲第11項記載の微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36136482A | 1982-03-23 | 1982-03-23 | |
| US361364 | 1982-03-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201798A JPS58201798A (ja) | 1983-11-24 |
| JPH0822230B2 true JPH0822230B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=23421737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58047349A Expired - Lifetime JPH0822230B2 (ja) | 1982-03-23 | 1983-03-23 | アルファ―インターフェロンｇｘ―１ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH0822230B2 (ja) |
| AT (1) | ATE50597T1 (ja) |
| CA (1) | CA1210714A (ja) |
| DE (1) | DE3381246D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| EP0154186B1 (en) * | 1984-02-10 | 1992-07-22 | Cytoclonal Pharmaceutics Inc. | Isolation of a novel interferon gene and expression thereof |
| JPS60248185A (ja) * | 1984-02-10 | 1985-12-07 | ワドリ、テクナラジズ、インコーパレイティド | 新規インタ−フエロン遺伝子の分離およびその表現 |
| SU1364343A1 (ru) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 |
| IL76360A0 (en) * | 1984-09-26 | 1986-01-31 | Takeda Chemical Industries Ltd | Mutual separation of proteins |
| WO1986002068A1 (en) * | 1984-09-26 | 1986-04-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Mutual separation of proteins |
| DE3685044D1 (de) * | 1985-02-01 | 1992-06-04 | Ici Plc | Analoge interferon-polypeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen. |
| JPS61185189A (ja) * | 1985-02-08 | 1986-08-18 | Green Cross Corp:The | 新規インタ−フエロン−α↓１ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド及び形質転換体 |
| SE8502430L (sv) * | 1985-05-15 | 1986-11-16 | Kabivitrum Ab | En cdna-molekyl som kodar for expressionen av en polypeptid av typen interferon alfa, en bakteriell eller celluler verd transformerad med en sadan molekyl och en polypeptid som uppvisar interferonaktivetet framstelld me |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH657141A5 (de) * | 1980-07-01 | 1986-08-15 | Hoffmann La Roche | Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen. |
-
1983
- 1983-03-01 CA CA000422646A patent/CA1210714A/en not_active Expired
- 1983-03-23 EP EP83102893A patent/EP0089692B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-23 DE DE8383102893T patent/DE3381246D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1983-03-23 JP JP58047349A patent/JPH0822230B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-23 AT AT83102893T patent/ATE50597T1/de active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 「遺伝子組換え実用化技術集第２集」（サイエンスフォーラム）（昭５６−３−１５）Ｐ．１５〜２９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1210714A (en) | 1986-09-02 |
| ATE50597T1 (de) | 1990-03-15 |
| EP0089692B1 (en) | 1990-02-28 |
| EP0089692A3 (en) | 1984-03-28 |
| DE3381246D1 (en) | 1990-04-05 |
| EP0089692A2 (en) | 1983-09-28 |
| JPS58201798A (ja) | 1983-11-24 |
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