JP2612149B2

JP2612149B2 - α−インターフェロン及びその製造方法

Info

Publication number: JP2612149B2
Application number: JP6153677A
Authority: JP
Inventors: メイヤーフランコイス
Original assignee: チバ−ガイギーアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1981-10-03
Filing date: 1994-07-05
Publication date: 1997-05-21
Anticipated expiration: 2012-05-21
Also published as: AU8895882A; GR76992B; FI80719B; NZ202058A; JPH06104066B2; PT75643A; DE3280174D1; NO166494C; PH23119A; NO823314L; EP0076489A2; IL66920A0; PT75643B; KR920007665B1; HU197047B; US5089400A; IE54051B1; FI823356A0; GB2108510A; ES8504936A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトα−インターフェ
ロン活性を有するポリペプチド、及びその製造方法、す
なわち組み換えＤＮＡ技術（手段）を用いて行なうこと
を提供するものである。本発明のポリペプチドは免疫モ
デレーター（調節体）として有用であり、特に抗−ウイ
ルス性、抗癌性、および抗−腫瘍性剤である。従って、
該ポリペプチドを含む医薬組成物およびウイルス性感
染、癌および腫瘍の治療方法をも提供する。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロン（“ＩＦＮ”）は分子
量１００００から４００００である大部分グリコシド化
したポリペプチドである。それは、ウイルス、二重鎖Ｒ
ＮＡ、細胞内微生物、微生物の生成物または種々の化学
剤のようなＩＦＮ誘発物質に触れることによって脊椎の
細胞によって生成される（１）。ＩＦＮｓは正常な細胞
においては通常見られない。ウイルス性感染および他の
攻撃物から防護するために脊椎動物の正常細胞を補助す
る。ＩＦＮｓは免疫モデレーター活性を有することが発
見されている。

【０００３】インターフェロン・ポリペプチドの学名は
まだ確立していない。最近の勧告によると、分類は動物
の種（たとえば“Ｈｕ”ヒト由来を示す）、抗原特異性
（α，βおよびγ型、各々α−，β−，またはγ−ＩＦ
Ｎ−抗体との抗原−抗体反応に基づく）、構造および生
理学上の相違（サブタイプはアラビア数字、すなわちα
₁，α₂などで表わす）、および細胞由来のタイプ（Ｌ
ｅは白血球由来であり、Ｌｙはリンパ芽球細胞由来であ
り、Ｆは線維芽細胞由来である）に基づいている。

【０００４】たとえばＨｕＩＦＮ−α₁（Ｌｙ）または
ＨｕＬｙＩＦＮ−α₁は、サブタイプ１のα−タイプイ
ンターフェロンを示し、それはヒトリンパ芽球細胞から
誘導される。これらの命名（種類）に加えて、インター
フェロンが直接“親”細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃ
ｅｌｌ）から直接得られるか、または微生物内で合成か
ら得られるか分類することおよびインターフェロンが特
別のサブタイプであるかまたは２つもしくはそれ以上の
インターフェロンサブタイプの混合物であるか明らかに
することが必要である。

【０００５】ＩＦＮポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列、組み換えＤＮＡ分子およびそれらを含むホストに関
する学名もまたまだ確立していない。インターフェロン
に関するＤＮＡ配列に対して用いられている学名は、省
略形でコード化されており、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（Ｚ−ｐＢＲ
３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−２ｈ）は、組み換えプ
ラズミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡＺ−ｐＢＲ３２２
（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−２ｈを含む細菌株（Ｅ．ｃｏｌ
ｉＨＢ１０１）すなわちＰｓｔＩの位置（異なる外
来のＤＮＡの挿入の位置）にＨｃＩＦ−α₁挿入体を含
むプラズミドｐＢＲ３２２でチューリッヒ（Ｚ）で発
明されたことを示す。

【０００６】“Ｈ”はヒト由来であり“Ｃ”は相補的Ｄ
ＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を示しおよびα₁
はサブタイプを表わす〔ｃｆ．Ｃ．ワイスマン、
（３）〕。与えられた学名の場合、ＩＦＮ遺伝子（白血
球）の由来を表示してはいない。本出願において、同様
の単名を採用されるが、ＩＦＮ遺伝子の由来を（リンパ
芽球細胞）表わす。

【０００７】現在までＨｕＩＦＮｓの三つの類が同定さ
れ：ＨｕＩＦＮ−α，ＨｕＩＦＮ−βおよびＨｕＩＦＮ
−γが挙げられる。ＨｕＩＦＮ−α（以前はＬｅＩＦＮ
と命名され、白血球インターフェロンもしくはＬｙＩＦ
Ｎ、リンパ芽球インターフェロン）はヒト白血球（ヒト
の供与血液から得られる新鮮な細胞）およびたとえばウ
イルスの誘発によるリンパ芽球細胞〔Ｅ．Ａ．ハアベル
ら、（４）およびＡ．Ｄ．サガルら、（５）〕によって
生成される。pH２で安定であり（ＩＦＮｓは酸に対して
安全であり、以前は“タイプＩ”として表わされてい
た）、主としてグリコシル化の程度〔例、Ｍ．ルビンス
タインら、（６）およびアミノ酸組成（下記参照）〕が
異なる個々のインターフェロンポリペプチドの混合物か
らなる。

【０００８】単離され、精製された二つの成分、一方
は、分子量１５０００から１８０００で、グリコシル化
されていず、他方は、分子量２１０００から２２０００
で、グリコシル化されている。Ｗ．Ｅ．ステュワート、
IIら（７）は、非−グリコシル化インターフェロンは、
ほとんどもしくはすべてのＨｕＩＦＮ−α活性を保有し
ていることを報告している。リンパ芽球細胞からのアミ
ノ酸配列の部分は報告されている〔Ｋ．Ｃ．ゾーンら、
（８）〕。構造的に、生理学的に異なったＨｕＩＦＮ−
αの種々の型はすでに知られている。特にヒト個体は、
ＨｕＩＦＮ−αの対立形質多様性を生ずる可能性があ
る。

【０００９】ＨｕＩＦＮ−β（以前にＦＩＦＮもしくは
ＦｉＦＮ、“タイプＩ”と称する）はｄｓＲＮＡの誘発
から生ずるヒトの線維芽細胞（たとえば新生児の包皮）
によっておよびごくわずかの程度、ＨｕＩＦＮ−αとと
もに、ウイルスの誘発から生ずるヒトリンパ芽球細胞に
よって生成する。ＨｕＩＦＮ−βもpH２で安定（従って
“タイプＩ”に属する）である。少なくてもＨｕＩＦＮ
−βの二つのタイプは記載されている３３，４８）。分
子量は、約２００００および２２０００である。アミノ
酸配列は部分的に知られている。

【００１０】ＨｕＩＦＮ−γ〔以前はＩＩＦＮと称する
（免疫インターフェロンもしくは“タイプII”インター
フェロン）〕は抗原もしくはミトゲン（ｍｉｔｏｇｅ
ｎ）に対応してＴ−リンパ球によって生成される。pH２
で酸不安定であり、ＨｕＩＦＮ−αおよびＨｕＩＦＮ−
βは、血清学上区別される。ＨｕＩＦＮｓは抗−ウイル
ス性、抗−癌性および抗−腫瘍性剤として有用である。

【００１１】抗−ウイルス性剤として、たとえばウイル
ス性呼吸器感染、ヘルペスシンプレックスケラテテス、
急性出血性結膜炎、水痘帯状疱疹、肝炎Ｂ、巨大細胞封
入体症および他の治療のために用いられる。抗−癌性ま
たは抗−腫瘍性剤としてＨｕＩＦＮｓは骨肉腫、急性骨
髄性白血病、多発性骨髄腫、ホドキンス病、メラノマ、
胸癌、リンパ肉腫および乳頭腫および他の治療のために
用いられる。

【００１２】ＨｕＩＦＮｓは、経口もしくは非経口的投
与たとえば、局部的に静脈内、筋肉内、鼻内、皮内また
は皮下投与のために医薬として許容され得る形状で、た
とえば経口投与用として錠剤、バイアル、シロップ、粉
末、溶液または懸濁液、注射もしくは注入溶液、または
懸濁液、目薬、軟膏、スプレー、およびその他存在す
る。

【００１３】製剤は、通常たとえば筋肉内に一日に１〜
３回約１０⁶−１０⁷ユニット用量（病気に適用の状態
および患者の状態によって）を投与する。ウイルス感染
では通常、毎日または一日に三回まで数日間−数週間に
わたって処理し、一方癌および腫瘍では数カ月−数年に
わたって一日に１回−数回または週に一回−数回処理す
る。

【００１４】本発明のα−インターフェロンの有効量に
相当する量をマウスに投与してもほとんど急性毒性を示
さない。現在までＨｕＩＦＮ−αの不十分な量が誘発ヒ
ト細胞、たとえばヒトリンパ芽球細胞（例、ブルキット
スリンパ“ナワルワ（Ｎａｍａｌｗａ）”細胞）また
は、供与者の新鮮な血液から得られるヒト白血球からの
み生成されている。ＨｕＩＦＮ−βは主にヒト線維芽細
胞から得られる。粗ＨｕＩＦＮ−α（２．６×１０ ⁹Ｉ
Ｕ）は培養ナワルワ細胞の８００１から得られ、粗Ｈｕ
ＩＦＮ−αの約１０ ¹¹ＩＵは毎年血液センターで（例ヘ
ルシンキのフィンランド赤十字センター）で得られる。
ＨｕＩＦＮ−αの特異活性は、４×１０⁸−１０⁹ＵＩ
／mgの範囲である。広範囲でかつ市販用に適用のために
要するＨｕＩＦＮ−αの量は、他の医薬用化合物に比し
て非常に低い。

【００１５】純粋なＨｕＩＦＮ−αの１００ｇは１０−
３０００万投与量を提供しうる。しかしながらこのよう
な量は工業的に合理的なコストでヒト組織培養、かつヒ
ト白血球を用いての経費および技術的に生産することは
できない。大規模生産への他の欠点としては、インター
フェロン−混合物が得られ、それらを各々のサブ−タイ
プに分離するのには厄介であり、費用がかかりすぎる。
従って純粋な、個々のインターフェロン種の治療への適
用に際しては、満足すべき評価を得ることはむずかし
い。

【００１６】これらの方法の工業的応用は、培養できる
ヒト細胞（ヒト腫瘍細胞およびある種の線維芽細胞）ま
たは相対的に多量得ることのできるヒト細胞（白血球お
よびリンパ球）によって生成されるＨｕＩＦＮｓに限ら
れる。しかしながらこれらの方法は、費用がかかりかつ
複雑である。インターフェロンの個々の種の工業的な大
量生成のための問題への解決は分子生物学の進歩から、
すなわち細菌細胞における特異性非−細菌性成熟核遺伝
子を発現することが可能になったことからなされた。最
近、Ｓ．Ｎ．コーエンとＨ．Ｗ．ボイヤー（９）は生物
学的に機能を有するＤＮＡ配列を複製する一般方法につ
いて報告している。この方法は環状プラスミドＤＮＡを
開裂して第一の線状（棒状）ＤＮＡ断片（Ｓｅｇｍｅｎ
ｔ）を与える段階；この第一の断片に表現型体積のため
の遺伝子を持った第二の線状ＤＮＡ断片を挿入して組み
換えＤＮＡ分子を与える（修復された環状プラスミド）
段階；組み換えＤＮＡ分子を持つ単細胞微生物への形質
転換；形質転換体を適当な栄養条件下に非−形質転換微
生物とともに増殖させる；およびＰ−単細胞微生物から
形質転換体を分離することからなる。形質転換体は望ま
しい蛋白質を生成しうる。

【００１７】ＨｕＩＦＮ−α−およびＨｕＩＦＮ−β−
様活性をもつポリペプチドのためにコード化されたヒト
白血球および線維芽細胞から誘導したＤＮＡ配列、該Ｄ
ＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ分子、該組み換えＤＮＡ
分子で形質転換したホスト、ポリペプチド、該ポリペプ
チドを含む培養液およびこれに関する組成物の生成につ
いての方法は種々の特許出願書および他の出版物におい
て記載されている。

【００１８】センダイウイルスで誘発されたヒト白血
球、いくつかのＨｕＩＦＮ−α−様活性をもつＤＮＡ配
列をもつポリペプチド、組み換えＤＮＡ、およびそれら
の製造のためのホストを出発物質として用いることが
Ｃ．ワイスマンによって報告されている〔３；Ｓ．ナガ
タら、（１０）、Ｎ．ナンタイら、（１１）およびＭ．
ストロイリら、（１２）参照〕。

【００１９】白血球、特にセンダイウイルスで誘発され
たヒト骨髄芽生球細胞ラインＫＧ−１から誘導された、
部分的に精製した分子量２１０００をもつＨｕＩＦＮ−
α−様ポリペプチド、対応するＤＮＡｓ同じく８つの異
なるヒトＬｅＩＦＮｃＤＮＡｓの構造はＤ．Ｖ．ゴエデ
ルら、（１３，１４）によって報告されている。ＨｕＩ
ＦＮ−α−様活性をもつポリペプチドの製造方法は、ヒ
トリンパ芽球ナワルワ細胞またはヒト血液白血球で開始
し、ニューキャスル病ウイルスで誘発されることが一般
的概念でヨーロッパ特許出願番号３４３０７（１５）に
開示されているがしかし、具体的なデータおよび詳細は
述べられていない。

【００２０】ヒト線維芽細胞、特に新生児の包皮から得
られたものから開始し、ＨｕＩＦＮ−βのためコード化
に、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）ＤＮＡｓによって誘発され
た、組み換えＤＮＡ分子、およびそれらを含む微生物
は、ヨーロッパ特許出願２８０３３〔（１６）；タニグ
チら、（１７）〕、デアニクら、（１８）およびゴエデ
ルら、（１９）参照〕に記載されている。

【００２１】ｍＲＮＡｓ，ＤＮＡｓ，組み換えＤＮＡ分
子およびＨｕＩＦＮ−β₁およびＨｕＩＦＮ−β₂を生
成できる細菌株は英国特許出願２，０６３，８８２（２
０）記載のように二重らせんポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で
誘発されたヒト線維芽細胞、特に包皮細胞ＦＳ１１また
はＳＶ８０から開始する遺伝子工学の方法によって得ら
れる。

【００２２】ＤＮＡｓ、組み換えＤＮＡ分子、後者を含
むＥ．ｃｏｌｉおよびヒト線維芽細胞から得られたｍＲ
ＮＡ経て製造された、ＨｕＩＦＮ−β活性をもつポリペ
プチド、特にポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で誘発されたヒト
包皮ＦＳ−４およびそれを製造するための方法は、ベル
ギー特許番号８８７３９７（２）に開示されている。一
般的に、いかなる具体的なデータ、または詳細なしにＨ
ｕＩＦＮ−β−様活性をもつポリペプチドを製造するた
めの方法は、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で誘発されるヒト
線維芽細胞（新生児の包皮）からの開始は、ヨーロッパ
特許出願３４３０６（２２）に開示されている。

【００２３】ヒトリンパ芽球インターフェロン“ＨｕＩ
ＦＮ（Ｌｙ）”は種々の誘発体での刺激によってナマル
ワ細胞において多様な量を生成することができる〔Ｍ．
Ｏ．ジョンストンら（２４）〕。センダイウイルスによ
って誘発されたナマルワ細胞によって生成したＨｕＩＦ
Ｎ（Ｌｙ）は、ＨｕＩＦＮ−α（Ｌｙ）（７０−９０
％）およびＨｕＩＦＮ−β（Ｌｙ）（１０−３０％）を
含むことが示されている。

【００２４】それは少なくても７つの成分からなる
〔Ｋ．Ｃ．ゾーンら、（８）およびＧ．アレンら（２
５）；Ｅ．Ａ．ハアベルら、（４）およびＡ．Ｄ．サー
ガルら、（５）参照〕。リンパ芽球インターフェロンポ
リペプチドの全構造は現在まで未知であるけれども、Ｈ
ｕＩＦＮ−α（Ｌｙ）はＨｕＩＦＮ−α（Ｌｅ）とは異
なっている。リンパ芽球インターフェロンの主成分のグ
リコシル化はほとんどないように思われる。種々の成分
はまだ単離されておらず精製されていない。

【００２５】

【発明が解決しようとする課題】臨床試験はリンパ芽球
ＨｕＩＦＮｓの混合物で行なわれており、それらの治療
効能を測定するためには個々に生成し、および種々の成
分に分解することが望ましい。前記載の組み換えＤＮＡ
過程のいずれもヒトリンパ芽球インターフェロンの合成
に指図されていない。本発明の目的はこの問題を組み換
えＤＮＡ技術（手段）で解決することである。更に本発
明の目的は、ＨｕＩＦＮｓの種々のサブタイプの構造
（アミノ酸配列）を説明することであり、および多くの
患者の治療のために安全な供給をするために十分な量の
個々のインターフェロンを製造することを可能にせしめ
ることである。

【００２６】

【課題を解決するための手段】本発明は量において（多
量）リンパ芽球ＨｕＩＦＮｓと同様の生物学的活性を持
つ個々のポリペプチドの生成の問題を解決することであ
る。単一ポリペプチドは今まで知られているＨｕＩＦＮ
−α（Ｌｅ）およびＨｕＩＦＮ−βの成分と同一である
か異なっているかのどちらかである。免疫学上、および
生物学上ＨｕＬｙＩＦＮ−αまたはＨｕＬｙＩＦＮ−β
の活性を示すポリペプチドを含む医薬用剤および使用方
法を提供する。

【００２７】〔用語、使用される省略語についての説
明〕クローン（Ｃｌｏｎｅ）：単細胞から無性的に誘導され
た細胞個体群。このような個体群は遺伝的に同一である
と仮定する。オペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）：隣接した遺伝子からなる遺
伝子ユニットは対等にオペレータ−およびレプレサーの
制御下に表わす。

【００２８】コントロール配列の発現（表示）（Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）：
実施的に遺伝子に連結している場合、構造遺伝子の発現
を制御し、調整するヌクレオチドの配列、他の間すなわ
ちプロモーターおよびリボゾームの結合位置を含む。プロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｏｒ）：ＲＮＡポリメラー
ゼが結合しおよび転写を始めるＤＮＡ断片（セグメン
ト）。

【００２９】リボゾームの結合位置（Ｒｉｂｏｓｏｍａ
ｌｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）：翻訳のためにかくこ
とのできないリボゾームへのｍＲＮＡの結合をさせる配
列発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：転写および翻訳からな
る過程転写（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）：ＤＮＡに含まれ
る遺伝情報をＲＮＡ鎖に相補的な塩基配列をもつように
刻まれる塩基対を含む過程翻訳（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）：ｍＲＮＡに存在する
遺伝情報を蛋白質合成中特別のアミノ酸を刻むようにす
る過程。

【００３０】ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）：
プリン、ピリミジン塩基、リボースまたは２−デオキシ
リボース残基からなる核酸の構成体。リボヌクレオチド
塩基はＡ，Ｇ，ＣおよびＵであり、一方デオキシリボヌ
クレオチドにおいてはＵはＴで置き換わる。ベクトルまたはクローニングベイクル（Ｖｅｃｔｏｒ
ｏｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ）：ＤＮＡ配列、
たとえばプラスミドまたはファージＤＮＡ、それはホス
ト細胞において自主的に複製でき、形質転換細胞の同定
における使用に適するマーカーを含む、たとえばテトラ
サイクリン抵抗性（不応性）もしくはアンピシリン抵抗
性（不応性）、および他のＤＮＡ断片（セグメント）は
付着した断片（セグメント）の複製をもたらすように実
験的に付着させうる。

【００３１】プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）：ホスト細
胞で複製できるクロマトゾーム外の環状の二重鎖ＤＮ
Ａ。組み換え（交雑）ＤＮＡ〔Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ｈ
ｙｂｒｉｄ）ＤＮＡ〕：生きている細胞の外で会合する
異なった遺伝子からのＤＮＡ断片（セグメント）からな
り、あるホスト細胞を感染することができ、その中で持
続できる。

【００３２】ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）：核酸
のホスホジエステル結合の鎖を開裂することができる酵
素。リボヌクレアーゼ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）：ＲＮ
Ａのホスホジエステル結合を開裂することができる酵
素。制限エンドヌクレアーゼ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅ
ｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）：重合体鎖以内で特別の目標
配列でポリヌクレオチドを切断する酵素。開裂化合物
は、“ブラントｂｌｕｎｔ”（“フラッシュｆｌｕｓｈ
ｅｄ”）末端もしくは“スタガードｓｔａｇｇｅｒｅ
ｄ”（“ステッキィｓｔｉｃｋｙ”）末端を持つＤＮＡ
断片（フラグメント）を増加させる。

【００３３】エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａ
ｓｅ）：鎖の末端からＤＮＡを分解する酵素。リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）：ある細菌の細胞壁に
ある多糖類を分解する酵素。リバーストランスクリプターゼ（Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒ
ａｎｓｃｒｏｐｔａｓｅ）：ＲＮＡテンプレートから
相補的な一本鎖ＤＮＡを合成し、そのＤＮＡ鎖を二重ら
せん型に転換するＲＮＡ腫瘍ウイルスによってコード化
された酵素。

【００３４】ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ）：ＤＮＡの３′−５′ホスホジエステルの
結合の生成を触媒する酵素。ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡｌｉｇａｓｅ）：エンドヌク
レアーゼによって導入された型の一本鎖ＤＮＡホスホジ
エステル結合の開裂の修復を触媒する酵素。ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｋｉｎａｓｅ）：ＤＮＡの５′−位の水酸基のリ
ン酸化を触媒する酵素。

【００３５】形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ）：外因性のＤＮＡ、たとえばプラスミドまたは交雑
ＤＮＡを細胞内への導入は細胞内における該ＤＮＡの確
立という結果になる。略語Ａ：アデノシンもしくはデオキシアデノシン−リン酸残
基Ｕ：ウリジン−リン酸残基Ｔ：デオキシチミジン−リン酸残基Ｃ：シチジンもしくはデオキシシチジン−リン酸残基Ｇ：グアノシンもしくはデオキシグアノシン−リン酸残
基Ｉ：イノシン−リン酸残基ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＣＴＰ：デナキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＭＰ：デオキシシチジン一リン酸ｄＧＭＰ：デオキシグアノシン一リン酸ＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｔＲＮＡ：転移リボ核酸ｒＲＮＡ：リボゾームリボ核酸ｄｓＲＮＡ：二重鎖リボ核酸ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補性デオキシリボ核酸（酵素的にｍＲＮＡ
配列から合成される）ｄｓｃＤＮＡ：二重鎖相補性デオキシリボ核酸ＡｐＰｒ：β−ラクトアメーゼ遺伝子のコントロール配
列の発現ＩＦＮ：インターフェロンＨｕＬｙ：ヒトリンパ芽球細胞本発明はα−インターフェロン−ポリペプチドをコード
するＤＮＡ、またはそれとハイブリダイズするＤＮＡ、
特に組み換えＤＮＡ、ヒトリンパ芽球細胞から誘導され
たＤＮＡ配列、または該配列の断片、変種または突然変
異体を含むＤＮＡ。該組み換えＤＮＡｓの少なくとも１
つで形質転換したホスト、ヒトリンパ芽球インターフェ
ロン、または断片またはその誘導体の免疫学上および生
物学上の活性を示すポリペプチド、該ペプチドを含んで
なる医薬組成物およびヒトにおけるウイルス性感染、
癌、腫瘍の治療で、該医薬組成物の形態で該ポリペプチ
ドの効果的な量を投与すること、に関するものである。

【００３６】本発明は、該組み換えＤＮＡの少なくとも
１つで形質転換したホストを培養し、望ましいポリペプ
チドを集めることを特徴とする、ヒトリンパ芽球インタ
ーフェロンの免疫学および生物学上活性を示すポリペプ
チドを生成する方法および形質転換したホスト微生物を
生成するための方法に関するものである。形質転換した
ホスト微生物の生成のための方法は、次の段階からな
る：（１）誘発ヒトリンパ芽球細胞からヒトリンパ芽球ポリ
（Ａ）ＲＮＡを分離し、ＨｕＬｙＩＦＮ−ｍＲＮＡのた
めに濃縮する、（２）このテンプレート（鋳型）から一
本鎖相補性ＤＮＡを、そこから二本鎖ｃＤＮＡ製造す
る、（３）ｄｓｃＤＮＡを適当なベクトルＤＮＡに導入
する、（４）得られた組み換えＤＮＡで適当なホスト微
生物を形質転換する、（５）ヒトリンパ芽球ＩＦＮｃＤ
ＮＡもしくはＤＮＡ断片で形質転換した、クローンを選
択しおよびホスト微生物を培養する、任意に、形質転換
したホストから組み換えＤＮＡｓを分離し、必要に応じ
てＩＦＮ活性をもつポリペプチドのレベルを改善するた
めに組み換えＤＮＡｓを変異させ、（４）および（５）
の段階を再び行なう。

【００３７】１．ヒトリンパ芽球細胞の誘発およびＨｕ
ＬｙＩＦＮｍ−ＲＮＡのために濃縮したヒトリンパ芽球
ポリ（Ａ）ＲＮＡの単離ＨｕＬｙＩＦＮｍ−ＲＮＡのために濃縮したヒトリンパ
芽球ポリ（Ａ）ＲＮＡの分離は、種々の既知の方法によ
って達成され得る。本発明において用いられる方法は次
の段階からなる：ａ．ＬｙＩＦＮ合成のためヒトリンパ芽球細胞の誘発、ｂ．誘発細胞の破壊、ｃ．蛋白、リポ蛋白、ＤＮＡｓおよび異種のＲＮＡｓを
混同物からのリンパ芽球ポリ（Ａ）ＲＮＡの分離、ｄ．ＬｙＩＦＮ特異性ｍＲＮＡのための濃縮。

【００３８】ａ．ＬｙＩＦＮ合成のためヒトリンパ芽球
細胞の誘発ＩＦＮ誘発体への露出の結果として、ヒトリンパ芽球細
胞は、ＬｙＩＦＮｍＲＮＡおよび続いてヒトＬｙＩＦＮ
を生成する。適するＩＦＮ誘発は、たとえば種々の化学
剤、二本鎖ＲＮＡ〔例ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）〕、また
は特にある種のウイルス、特にパラミクソウイルス、プ
ソイドミクソウイルスおよびレオビリジアル科であり、
例としてはニューカッスル病ウイルス（株１１０，Ｂ
１，ラ・ソタまたはテキサス）、センダイウイルス、青
舌病ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイル
ス、パラ−インフルエンザＩ型、II型または III型また
はセムリキ森林ウイルスが挙げられる。

【００３９】ヒトリンパ芽球細胞は好都合にブルキット
スリンパ腫の患者から得られる。このような細胞系統の
１つであるナマルワはウイルス性の刺激で、ＩＦＮの高
レベルを生成する（２６）。ナマルワ細胞とは別に、リ
ンパ芽球細胞、たとえばダウディ細胞、アクバ細胞、Ｎ
Ｃ−３７細胞、ＲＮ−２細胞および当該分野で既知の他
の細胞が用いられる。

【００４０】誘発以前に、リンパ芽球細胞は低級直鎖ア
ルカン酸、たとえば、リンパ芽球細胞によるＩＦＮ生成
を高めることが知られているブチル酸もしくはその塩で
前処理する（２７，２８）。更に必要に応じてもしくは
所望ならばリンパ芽球細胞を、同類体ＩＦＮの少量と処
理することによってプライマー化する。リンパ芽球細胞
の誘発は、文献記載の類似の方法を用いて行なう。リン
パ芽球細胞、たとえばナマルワ細胞は、慣例上の栄養培
地（例ＲＰＭＩ１６４０培地）、で約１０％胎牛血清を
加え、十分な細胞密度（例、１０⁶−１０⁷細胞／ml）
で増殖させる。遠心によって培地から分離した細胞は栄
養培地で懸濁し、適するウイルスを適当な期間で（例、
５−１６時間）１０⁶細胞に対して約２００血球凝集ユ
ニットの濃度になるように添加（例、ニューカッスル病
ウイルス）して、誘発させる。誘発細胞が十分な滴定量
（力価）で、ＩＦＮを生成したらすぐに、細胞は採取
し、そして更に下記載のように処理する。ＩＦＮ活性は
たとえばアームストロング（２９）によって考案された
色素−吸収法によって測定する。

【００４１】ｂ）誘発細胞の破壊核酸分離における第一段階は、細胞破壊物からなる成分
からの分離、混合している蛋白を除去することである。
細胞破壊に用いられる方法は、くり返して凍結および解
凍することおよび、機械的な破壊、たとえばガラス−ホ
モゲナイザーでモーターつきのテフロン棒でホモゲナイ
ズすること、浸透圧によって破裂させること、超音波に
よる破壊、およびアニオン浄化剤のような溶菌化できる
化学剤、たとえば硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、
硫酸ドデシルリチウム、４−アミノサリチル酸ナトリウ
ム、サルコシンドデシルナトリウム、またはトリ−イソ
プロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムが挙げられ
る。

【００４２】ある場合には、アニオン浄化剤の適用は蛋
白−複合体から核酸を部分的に遊離するおよび部分的に
ＲＮＡｓｅ活性を抑制する結果となり得る。好ましく
は、操作は高濃度の浄化剤でおよび、核酸特に最小限度
の分解であるＲＮＡの完全な遊離を達成するために簡単
な露出期間で行なう。好都合に、誘発細胞は適当なアニ
オン浄化剤（例、硫酸ドデシルナトリウム）を慣例的な
緩衝液（例、ＴＮＥ）中で、作用させ溶菌化する。簡単
な露出期間後、懸濁液は、ｃ項記載のように脱蛋白剤と
処理する。

【００４３】ｃ）蛋白、リポ蛋白、ＤＮＡｓおよび異種
のＲＮＡｓの混同物からのリンパ芽球ポリ（Ａ）ＲＮＡ
の分離得られた核酸混合物の脱蛋白は、化学剤、たとえば１−
４％１−ペンタノールを含むクロロホルム、または特に
フェノール、の作用によって達成し得る。蛋白はたとえ
ばプロナーゼもしくはプロテアーゼｐ、いかなる蛋白も
アミノ酸にほとんど分解しうるプロテアーゼによる分解
によっても除去し得る。蛋白を完全に除去するために２
つの化学脱蛋白剤、フェノールとクロロホルム、もしく
はプロテアーゼ処理後、続いて化学脱蛋白剤（例、フェ
ノール）で処理するような組み合わせで行なっても良
い。

【００４４】特に、核酸混合物の脱蛋白は、プロテアー
ゼ（例、プロナーゼ）と培養し、得られた混合物をフェ
ノールで、次いでクロロホルムで抽出をくり返す。フェ
ノール系を適用すると、すべての変性した、かつ分解し
た蛋白はフェノール相および中間相に移る。ポリ（Ａ）
ＲＮＡ回収のためのこの段階および続く次の段階は放射
能活性のあるラベルしたマーカーｍＲＮＡ（例、¹²⁵Ｉ
−グロビンｍＲＮＡ）の少量を加えることによってｍＲ
ＮＡ分解のための制御することができる。

【００４５】精製したデオキシリボヌクレアーゼ（ＲＮ
Ａａｓｅを含まない）は混同したＤＮＡを分解するため
に用いられる。必要に応じて、ＲＮＡはＣｓＣｌグラジ
エントにおける平衡遠心によって、ＤＮＡと混同するこ
となく得られる。更に、ＲＮＡはクロマトグラフィー
（例、ヒドロキシ燐灰石カラムクロマトグラフィ）によ
ってＤＮＡから分離することができる。

【００４６】純粋な溶液中に存在しているｍＲＮＡは、
他のＲＮＡ種、（例、ｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡ）か
ら、その３′−末端でアデノシンヌクレチドの長い非−
中断配列（１００−２００残基長さ）によって異なる。
ポリ（Ａ）鎖は、常法、たとえばオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースもしくは（Ｕ）セファロースへのくり返しのバッチ
吸収、によって、ｍＲＮＡを選択することが利用され
る。結合したポリ（Ａ）ＲＮＡは、次いで、弱いイオン
強度で溶液（例、水）の数回の洗浄で溶出される。

【００４７】たとえば誘発細胞（段階１ｂ）のプロテア
ーゼ溶解化後、得られた核酸混合物からなるポリ（Ａ）
ＲＮＡの分離の好ましい具体化は、変性した、および分
解した蛋白を除去のために、フェノール次いでクロロホ
ルムで抽出し、得られた溶液をオリゴ（ｄＴ）セルロー
スクロマトグラフィーにかけ、結合したポリ（Ａ）ＲＮ
Ａを水で溶出する。所望ならばまたは必要に応じて、オ
リゴ（ｄＴ）セルロースへの吸収を数回くり返す。

【００４８】この段階でポリ（Ａ）ＲＮＡは、イン．ビ
ドロ．翻訳系（例、レティキュロサイト翻訳系、セップ
スラエビス）におけるＨｕＩＦＮ活性を示すポリペプチ
ドの合成効力を直接に測定することができる。ＩＦＮ特
異性ポリペプチドは放射線免疫検査または特に細胞病理
生物検査を用いて同定できる。この目的のために、回収
したポリ（Ａ）ＲＮＡを適当な溶媒、たとえば水、希釈
した（例１mM）ＥＤＴＡ溶液または慣例上の緩衝液に溶
解し、コルマンら、（３０）に従って、アフリカン．ク
ロー．トード（ゼノプスラエビス）の卵母細胞にマイク
ロ−注入する。

【００４９】卵母細胞において生成したＩＦＮは細胞病
理生物検査たとえばアームストロング（２９）による色
素−結合分析の使用によってまたはスチュワートら、
（３１）による適する攻撃ウイルスたとえば小水疱性口
内炎ウイルス（ＶＳＶ）をヒト細胞系統、たとえばＣＣ
Ｌ−２３細胞またはＨｅｐ−２細胞への適用に基づく細
胞病理効果の減少を用いて測定する。所望ならばここで
記載の操作のいかなる段階でも、いかなる精製形態で分
離されたもしくは対応するＤＮＡから誘導された（例、
二重鎖ｃＤＮＡ）ＲＮＡのＨｕＩＦｍＲＮＡ活性は、上
記載のいずれかの検査方法によって測定できる。

【００５０】ｄ）ＬｙＩＦＮ特異性ｍＲＮＡについての
濃縮他と混同しているＲＮＡ種、たとえばｔＲＮＡ，ｒＲＮ
ＡまたはＤＮＡ（１ｃ項参照）の除去後、０．５mM−１
mMＥＤＴＡ中のポリ（Ａ）ＲＮＡ溶液は、フェノールで
の付加的抽出によっておよび二価カチオンを除去するた
めにキレックス（Ｃｈｅｌｅｘ）カラムを通すことによ
って精製する。

【００５１】リンパ芽球ＨｕＩＦＮｍＲＮＡのためのポ
リ（Ａ）ＲＮＡ画分の濃縮は、文献から知られているい
ろいろの方法によって達成し得る。本質的に合体した単
一ｍＲＮＡ種の異なる分子量の大きさに基づく。大きさ
に基づくポリ（Ａ）ＲＮＡの画分は、たとえばデキスト
ラン誘導体またはポリアクリルアミドのカラムゲルろ
過、その場合、ゲル粒子中により小さい分子はいろいろ
の程度で入りこみ、大きい分子はとどまることなく容易
に通過することによって得ることができる。更にポリ
（Ａ）ＲＮＡ種の混合物は、ポリアクリルアミド、澱粉
またはアガロースゲルのゾーン電気泳動によって分画す
ることができる。ポリ（Ａ）ＲＮＡは５−２３％のシュ
クロース溶液をグレディエントとしてのシュクースデン
シティグレディエント（糖密度勾配）を用いての遠心に
よって沈降速度に基づいて分離する。

【００５２】たとえば、ポリ（Ａ）ＲＮＡ混合物の画分
は、次のようにして得られる。他の混同したＤＮＡおよ
びＲＮＡ種から遊離したポリ（Ａ）ＲＮＡ溶液は、ごく
少量のＥＤＴＡを含む慣例上の緩衝液中のシュクロー
ス、デンシティグレディエント（例、５−２３％）を用
いての遠心によって、大きさに基づいて分画する。画分
は集め、前記載（１ｃ項）のようにＩＦＮｍＲＮＡ活性
の測定をする。最も高いＩＦＮｍＲＮＡ活性を示す画分
は、合わせてオリゴ（ｄＴ）セルロースまたはポリ
（Ｕ）セファロースカラムにかける。ＨｕＬｙＩＦＮｍ
ＲＮＡのためにかなり濃厚である結合したポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡは水で溶出され、そしてエタノールで沈澱する。

【００５３】この段階で、ＨｕＬｙＩＦＮｍＲＮＡ活性
を、再度、前記載の方法（１ｃ項参照）によって測定す
る。一般的に、シュクロース、グレディエント遠心でＨ
ｕＬｙＩＦＮｍＲＮＡ１０−２０倍濃縮した結果を得
ることができる。２．ＨｕＬｙＩＦＮｄｓｃＤＮＡを含むリンパ芽球二重
鎖ｃＤＮＡの製造前記載（１ｄ項）のように得られたＨｕＬｙＩＦＮｍＲ
ＮＡのために濃縮されたポリ（Ａ）ＲＮＡは、二重鎖ｃ
ＤＮＡを得るためのテンプレートとして用いることがで
きる。この転換は、単一鎖ｃＤＮＡの製造第二のＤＮＡ
鎖の合成および第一段階で生じた終末端の“ヘアーピン
ｈａｉｒｐｉｎ”構造の分解を含む。

【００５４】ａ．単一鎖ｃＤＮＡの製造前記載（１ｄ項）のポリ（Ａ）ＲＮＡに相補性を示す
（Ａ）一本鎖ＤＮＡは、該ＤＮＡの送転写によって製造
することができる。合成はＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（リバーストランスクリプターゼ）、たとえば鳥
類の骨髄芽球ウイルス（ＡＭＶ）によって触媒される。
ＡＭＶリバーストランスクリプターゼは一本鎖ＲＮＡ上
のＤＮＡ合成を開始しない。ＲＮＡテンプレート鎖をも
つ塩基−対合である遊離３′−水酸基をもつプライマー
を必要とするＤＮＡポリメラーゼと同様である。という
のはポリ（Ａ）末端はｍＲＮＡｓの３′−終末に付着
し、好ましくは、たとえばプライマーとしてオリゴデオ
キシチミジレート〔オリゴ（ｄＴ）〕またはポリ（Ｕ）
を用いる。排列情報が役に立つ場合、興味ある遺伝子の
ために選択的にｃＤＮＡ合成を前もって行なうことが可
能である。

【００５５】たとえば、一本鎖ｃＤＮＡの合成は次のよ
うに行なわれる。前記載のように分離され、精製された
ポリ（Ａ）ＲＮＡは、慣例上の緩衝液中でプライマー、
たとえばオリゴ（ｄＴ）、マグネシウム塩（例、塩化マ
グネシウム）、メルカプトン、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ），ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰおよ
びＡＭＶリバーストランスクリプターゼと混合し、反応
させる。好ましくは、デオキシヌクレオシドトリホスフ
ェートの高濃度は、実物大模写の合成をうながすために
選択される。

【００５６】続いての一本鎖ｃＤＮＡの精製段階は、用
いられる４つのデオキシヌクレオシドトリホスフェート
の１つが³²Ｐでラベルされている場合、容易に行なうこ
とができる。反応はたとえばＥＤＴＡおよびＳＤＳを含
む阻害の混合物の添加によって停止する。反応の停止
後、生成物はたとえば、フェノールおよびクロロホルム
での溶液の抽出によって脱タンパクし、次いで、塩およ
び取り込まれないデオキシヌクレオシドトリホスフェー
トを除くためにセファデックスカラムでクロマト処理す
る。

【００５７】合成されたｃＤＮＡ（デオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートの一つが³²Ｐでラベルされたのが提
供され、用いられる画分の同定は、容易にセレンコフ放
射線によって達成できる）を含む画分はプールし、核酸
（ＲＮＡおよびｃＤＮＡ）は、たとえばエタノールによ
る沈澱によって分離する。テンプレートＲＮＡはリボヌ
クレアーゼたとえばＲＮＡｓｅＡまたはＲＮＡｓｅＴ₁
もしくは好ましくは、たとえば水酸化ナトリウムのよう
なアルカリ加水分解によって、除去する。残りのｃＤＮ
Ａの大きさは、アルカリアガロースゲルもしくは知られ
た長さのマーカーＤＮＡｓ（例、３２）を用いて適切な
ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動移動度から測
定できる。

【００５８】ｂ）二重鎖ｃＤＮＡの製造前記載のように製造された一本鎖ｃＤＮＡは３′−終末
端“ヘアーピン”構造を有する。この“ヘアーピン”構
造は、続いての第二のＤＮＡ鎖の合成のために、ｃＤＮ
Ａセルフ−プライミング（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ）
をする短二重鎖領域を構成する。従って付加的なプライ
マーは必要としない。

【００５９】二重鎖ｃＤＮＡは、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡ
−ポリメラーゼ（例、ＡＭＶリバース、トランスクリプ
ターゼ）によって、一本鎖ｃＤＮＡの合成における前記
載と同様の操作で（ポリ（Ａ）ＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡ
によって置換しおよびプライマーを省くことを除いて）
合成することができる。任意に、デオキシリボヌクレオ
チド前駆物質からＤＮＡの合成を触媒する他の酵素も同
様に用いることができ、例としてＴ₄ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ（クレノゥ断片）
または好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ
が挙げられる。

【００６０】第二鎖の合成は、一本鎖ｃＤＮＡ、マグネ
シウム塩（例、塩化マグネシウム）、メルカプタン、ジ
チオスレイトール（ＤＤＴ）、４つのデオキシヌクレオ
シドトリホスフェート、（そのなかの１つは放射能的
に、たとえば³Ｈでラベルされた）、およびＤＮＡポリ
メラーゼ（例、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ）
を含む緩衝液を用いて行なう。反応の停止後、混合物の
脱タンパク（２ａ項参照）し、ＤＮＡはエタノールで沈
澱させる。

【００６１】得られたｄｓＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖に
関連する“ヘアーピン”ループを含む。ループは、Ｓ１
ヌクレアーゼで切断し塩基−対合終末端をもつｄｓｃＤ
ＮＡを得る。分解は緩衝混合液中で、亜鉛塩（例、硫酸
亜鉛）の存在下に、第二鎖合成の生成物をＳ１ヌクレア
ーゼで処理することで行なわれる。分解はＳＤＳおよび
ＥＤＴＡの添加によって停止することができる。フェノ
ールで脱タンパク後、溶液はセファデックスカラムでク
ロマト処理する。ｄｓｃＤＮＡを含む画分（たとえば各
々の画分をセレンコフ放射線を測定することによって決
定できる）はプールし、ｃＤＮＡはエタノールで沈澱さ
せる。

【００６２】好都合なことに、まだ多くの異種からなる
合成されたｄｓｃＤＮＡは、更に、この段階で、実物大
ｄｓｃＤＮＡのために濃縮化される。この目的のために
適する方法としては、ゲルろ過、ポリアクリルアミドも
しくはアガロースゲルでの電気泳動、またはシュクロー
ス、グレディエントを用いての遠心が挙げられる。既知
分子量のＤＮＡ分子の補助的電気泳動または遠心を行な
い、期待されるＩＦＮｄｓｃＤＮＡｓ（先に出版された
データ：１４，１６，１８，３３によると、７００−１
２００塩基−対合である）の分子量を所有するｄｓｃＤ
ＮＡ分子の局在化を可能にする。

【００６３】たとえば、慣例上の緩衝溶媒中に溶解した
ｄｓｃＤＮＡをシュクロースグレディエント（例、５−
２３％）を用いての遠心にかける。適するマーカーＤＮ
Ａより早く沈降するＤＮＡ種を平行してグレディエント
（例、７００−８００塩基対合マーカー）にかけ、分離
する。３．ＨｕＬｙＩＦＮｄｓｃＤＮＡのために濃縮したｄｓ
ｃＤＮＡのクローニングａ．一般的な考慮前記載のように（２ｂ項）得られたｄｓｃＤＮＡのクロ
ーニングは、既知の方法によってできる。操作には、ｄ
ｓｃＤＮＡを適当なベクトルＤＮＡに会合させ、および
複製することができる適当なホスト細胞中に得られる組
み換えＤＮＡを転移する（形質転換）ことを含む。

【００６４】ベクトルＤＮＡは、ホスト細胞に転移する
場合、その自己複製を確実にする遺伝的機能を含むＤＮ
Ａ分子である。更に、プラスミド−運搬ホスト細胞（形
質転換体）を細胞の大集団、その大部分はプラスミドを
含まない細胞から選択されることによる遺伝子を含むベ
クトルＤＮＡが望ましい。遺伝子工学で通常用いられる
ベクトルＤＮＡｓの例は、実験的にｄｓｃＤＮＡが付着
しうにバクテリオファージの環状プラスミドＤＮＡおよ
びＤＮＡであり、例として、バクテリオファージ入の誘
導体、特にプラスミドｃｏｌＥ１またはその誘導体、た
とえばｐＭＢ９，ｐＳＦ２１２４，ｐＢＲ３１７および
特にｐＢＲ３２２が挙げられる。

【００６５】記載のプラスミドはアンピシリン抵抗性
（不応性）および部分的にテトラサイクリン抵抗性に対
する遺伝子を有する。従ってこのようなプラスミドを含
むホスト細胞は、親（ｐ）ホストから形質転換体を分離
できうる表現型を示す。たとえば組み換えＤＮＡ分子を
得るために、好適なプラスミド（例、ｐＢＲ３２２）を
開裂し、ｄｓｃＤＮＡを線状プラスミド中に挿入し、環
を再閉して挿入したｄｓｃＤＮＡ断片からなる増補した
組み換えプラスミド分子形成する。好都合なことに、プ
ラスミドＤＮＡは限定された位置で開裂する。この目的
のために、制限エンドヌクレアーゼの多数は、有効であ
り、それには特異性ＤＮＡ排列を認めることができる。

【００６６】いくつかの制限エンドヌクレアーゼは、両
ＤＮＡ鎖を同一点で開裂し、“ブラント”終末端を生ず
る。他の制限エンドヌクレアーゼは、二、三のヌクレオ
チドによって、お互いから分離される結合の開裂を触媒
し、開裂された遊離の一本鎖領域で分子の各々の終末端
（“スタガード”末端）を生ずる。ＤＮＡ断片は、通常
一本鎖結合力のある終末端で会合し、ＤＮＡリガーゼ
（例、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）によって、共有結合的に閉
じられる。相補性末端は、二つの限定した方法におい
て：“スタガード”切断をするおよび結合力のある末端
生成する制限酵素に開裂または制限された一本鎖排列の
添加（例、ホモポリメリック末端）によって行なわれ
る。任意に、十分に塩基−対合したＤＮＡ−重複、ブラ
ント−終末端は、Ｔ４リガーゼによって会合され得る。

【００６７】たとえばプラスミド（例、ｐＢＲ３２２）
は適する制限エンドヌクレアーゼ（例、Ｐｓｔ１）によ
って開裂され、線状プラスミドおよび挿入されうるｄｓ
ｃＤＮＡは、各々適当な酵素（例、末端デオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ）の存在下に、一本鎖ホモ
ポリメリック末端ともに延長する。たとえばポリ（ｄ
Ｃ）末端は、１方のＤＮＡ製造に加えることができ、ポ
リ（ｄＧ）末端は他（任意にｄＡおよびｄＴ末端は同じ
く選択できる）に加えることができる。ＤＮＡの二つの
型はそれらの相補性末端を通じて会合されうる。

【００６８】有用なホストとして、たとえば酵母、特に
形質転換に可能な細菌、および制限酵素および修復（修
正）酵素を欠く細菌たとえば大腸菌株（例、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＸ１７７６，Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１）または枯草菌
系統〔例、バシルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、
プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ヘモフィ
ルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプコッカス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）および他の細菌〕およ
びその突然変異体が挙げられる。

【００６９】前記載のように製造された組み換えＤＮＡ
分子は、通常のたとえばホスト細胞のＣａ⁺⁺前処理を含
む形質転換操作によって、適するホスト細胞に転移する
ことができる。ホスト細胞への表現型特性〔例、テトラ
サイクリン抵抗性（不応性）〕を授けられている組み換
えプラスミドＤＮＡを含む細胞は、アガロースプレート
上の選択的（例、テトラサイクリン−含有）栄養培地に
おける平板培養によって選択される。

【００７０】本発明において、好ましいベクトルＤＮＡ
はプラスミドｐＢＲ３２２であり、それは適当な制限エ
ンドヌクレアーゼ、特にＰｓｔＩによる開裂後、相補性
ホモポリメリック末端、特にｄＧ：ｄＣ−末端を経てｄ
ｓｃＤＮＡに結鎖する。得られる組み換えＤＮＡは、
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１に転移する。前記載に基づくｄ
ｓｃＤＮＡ合成経路を経て製造されたＩＦＮ遺伝子のか
わりに、対応するクロマトゾームＤＮＡは、同様にＩＦ
Ｎ活性をもつポリペプチド生成可能なクローンの製造の
ために用いられる。

【００７１】クロマトゾームＤＮＡは、ナマルワ細胞の
ようなヒトリンパ芽球細胞から、当該分野において既知
の方法、たとえば全クロマトゾームＤＮＡのＡｌｕＩに
よる部分的な開裂および得られた断片のλカロン４Ａア
ーム（λ Ｃｈａｒｏｎ４Ａａｒｍｓ）に連結する
ＥｃｏＲＩによる会合するかまたは制限酵素（例、Ｋｐ
ｎＩまたはＨｉｎｄ III）によるクロマトゾームＤＮＡ
の開裂によっておよび得られた断片をプラスミドｐＢＲ
３２２またはコスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ＤＮＡのような
ベクトルＤＮＡに連結することによって得られる。

【００７２】組み換えベクトルＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉの
ようなホストに形質転換することができる。クロマトゾ
ームＩＦＮαおよびβ遺伝子を含むコロニーはコロニー
ハイブリダイゼーションによって、（４ａ章参照）放射
能でラベルした合成オリゴデオキシヌクレオチドもしく
は放射能でラベルしたαおよびβ特異性ＩＦＮｃＤＮＡ
を試験材料として、使用することによって同定される。
サブ−フラグメント（断片）は、適当なエンドヌクレア
ーゼによる同定された断片を制限することによってもし
くはそれらを適当なエキソヌクレアーゼで分解すること
によって得られる。

【００７３】従って、本発明は、ヒトリンパ芽球細胞も
しくは断片から誘導されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ変種
または、インターフェロン−様ポリペプチドのためのコ
ード化の該配列の突然変異体または該ＤＮＡに交雑する
ＤＮＡの製造方法に関するものであり、次の過程を含
む。（１）ＨｕＬｙＩＦＮ−ｍＲＮＡから一本鎖相補性ＤＮ
Ａを製造する、必要に応じてそこから二本鎖ｃＤＮＡま
たは（２）ヒトリンパ芽球細胞のクロマトゾームＤＮＡ
の部分的開裂、およびクロマトゾームＬｙＩＦＮ遺伝子
を含む断片の選択、該配列の断片が必要な場合、該ＤＮ
Ａを適当なエンドヌクレアーゼで限定し、または該ＤＮ
Ａを適当なエキソヌクレアーゼで分解しまたは組み換え
ＤＮＡが必要な場合、適当なベクトルＤＮＡに該ＤＮＡ
を導入する。

【００７４】ｂ．線状、デオキシヌクレオチド−延長し
たｐＢＲ３２２の製造本発明に係る好ましいベクトル、プラスミドｐＢＲ３２
２は４３６１塩基一対からなる小さなプラスミドであ
る。細菌受容体細胞で各々アンピシリンおよびテトラサ
イクリン抵抗性（不応性）を授けられる２つの遺伝子
（ａｍｐ^r，ｔｅｔ ^r）を含む、そしてそれは形質転換
した細胞の選択および同定のために用いられる。ｐＢＲ
３２２内には、いくつかの限定位置が存在する。

【００７５】単一ＰｓｔＩ位置はａｍｐ^r遺伝子内にあ
り、一方ｓｏｌｅＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄIII およびＳ
ａｌＩはｔｅｔ^r遺伝子内にある。単一ＥｃｏＲＩ位置
はどこにでも存在する（３４）。異名の制限エンドヌク
レアーゼの一つを適当する場合、ａｍｐ^r遺伝子または
ｔｅｔ^r遺伝子のどちらかまたは両方の遺伝子はそのま
ま残る。従って例証された酵素のどちらかが開裂および
ｐＢＲ３２２の線状化に適する。

【００７６】プラスミドｐＢＲ３２２を線状化の後、デ
オキシヌクレオチド鎖は終末端デオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼの存在下に両３′−末端に加えられ
得る。好ましくは、約２０−５０デオキシヌクレオチド
残余体を相補性デオキシヌクレオチド鎖によって延長し
たｄｓｃＤＮＡに、安定な結合を確実にするために加え
る。

【００７７】たとえばプラスミドｐＢＲ３２２を、塩化
マグネシウム、メルカプタン（例、２−メルカプトエタ
ノール）および担体タンパク源（牛血清アルブミン、ゲ
ラチン）を含む適当に緩衝化した水溶液で、付加的に制
限エンドヌクレアーゼ（例、ＰｓｔＩ）とともに処理す
る。分解が終了した後、溶液は、たとえばフェノールで
脱タンパクする。デオキシヌクレオチジル残余体の最終
的な添加を、塩化マグネシウム、カコジルナトリウムお
よび担体タンパク（例、牛血清アルブミン）を含む慣例
上の緩衝液系において、デオキシヌクレオシドトリホス
フェートの十分な量（例、ｄＧＴＰ）および末端デオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに処理す
る。

【００７８】ｃ．デオキシヌクレオチド−延長したｄｓ
ｃＤＮＡの製造前記載のように（２ｂ項）得られたｄｓｃＤＮＡの延長
は、相補性デオキシヌクレオシドトリホスフェート
（例、ｄＧＴＰの代りにｄＣＴＰ）を用いて、好ましく
は塩化マグネシウムの代りに塩化コバルトを用いての線
状のデオキシヌクレオチド−延長したプラスミドｐＢＲ
３２２（３ｂ項参照）の合成のように同様の方法で行な
う。

【００７９】たとえばｄｓｃＤＮＡはカコジルナトリウ
ム、塩化コバルト、タンパク（例、牛血清アルブミ
ン）、対応するデオキシヌクレオシドトリホスフェート
（例、ｄＣＴＰ）および末端デオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼを含む緩衝液で培養する。ｄ．線状の、鎖−延長したｐＢＲ３２２および鎖−延長
したｄｓｃＤＮＡのアニール化線状の、鎖−延長したプラスミドｐＢＲ３２２および鎖
−延長したｄｓｃＤＮＡはアニール化でき、常法で、す
なわち相補性デオキシヌクレオチド鎖の塩基−対合によ
って再環状化できる。

【００８０】環生成の促進およびコンカトマー（ｃｏｎ
ｃａｔｏｍｅｒｓ）を妨げる（異なる線状ハイブリドプ
ラスミドの結合）ために、反応は両鎖−延長したｄｓｃ
ＤＮＡおよび線状ｐＢＲ３２２分子の低濃度で行なわな
ければならない。たとえば、デオキシヌクレオチド−延
長した（例、ｄＣＭＰ−延長した）ｄｓｃＤＮＡおよび
線状のデオキシヌクレオチド−延長した（例、ｄＧＭＰ
−延長した）ｐＢＲ３２２の混合物は、４連続１ｈ段階
で異なった温度（例、６５℃，４６℃，３７℃および２
０℃）で培養する。アニール化したＤＮＡは、適合した
細菌（例、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１）への形質転換のた
めに直接用いることができる。

【００８１】この点において、アニール化操作（方法）
による生成物は、組み換えＤＮＡ分子を含み、その中で
ごく２，３がＨｕＬｙＩＦＮに関連しており、なぜなら
ば組み換えの大部分はＬｙＩＦＮｍＲＮＡよりも他のｍ
ＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ挿入体を含む。ｅ．アニール化した交雑プラスミドを用いてのＥ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１の形質転換得られたアニール化ハイブリドプラスミドは、Ｅ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１の形質転換に用いることができる。プラ
スミドは細胞内で複製され、プラスミド複製体は、細胞
分裂の際娘−細胞に配分される。アニール化ハイブリド
プラスミドでのＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の形質転換は、
文献に記載の既知の方法で行なう。この操作にはＤＮＡ
の利用（摂取）（ＤＮＡｕｐｔａｋｅ）をさせる
〔例．（３５）〕と同様に細胞のＣａ⁺⁺−前処理および
ハイブリドプラスミドとの培養を含む。

【００８２】次いで細胞は、親細胞から形質転換した細
胞の分離をする選択的増殖培地へ転移する。なぜなら、
ハイブリドプラスミドはｔｅｔ^r遺伝子を含み、成長阻
害物質として、テトラサイクリンを含むアガール（寒
天）培地は好都合に選択される。たとえばハイブリドプ
ラスミドおよびＣａ⁺⁺で前処理したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１細胞をＣａ⁺⁺塩（例、塩化カルシウム）およびＭｇ
⁺⁺塩（例、塩化マグネシウム）を含む緩衝液で培養す
る。

【００８３】十分な培養時間（例、１０−４０分）後、
細菌を熱−パルス（３５−４２℃）に、短時間（１−５
分）かけ、細胞は冷却し、たとえばトリプトン・アガー
ル、またはマックコンケイ・アガールで、テトラサイク
リンの十分量で補足した寒天培地で平板培養する。この
ような培地で生き残った細胞は再環状プラスミドもしく
はハイブリドプラスミドＤＮＡを含む。従って増殖した
コロニーは、通常なクローンのスクリーンするために用
いられる。

【００８４】４．リンパ芽球ＩＦＮｃＤＮＡを含むクロ
ーンの同定ａ．ＬｙＩＦＮｃＤＮＡを含むクローンの同定のために
適する方法特異遺伝子を含むコロニーはいろいろの方法によって同
定することができ、たとえば一方ではＲＮＡ選択ハイブ
リダイゼーション、特異ハイブリダイゼーション、合成
検体でのハイブリダイゼーションによって同定すること
ができ、または他方では特別な遺伝生成物を生成するク
ローンは、免疫学的または生物学的（分析）検査によっ
て同定できる。

【００８５】一方免疫学的または生物学的アプローチ
は、免疫学的または生物学的に検出可能な遺伝生成物の
生成により、初めの一連の方法は、基本的に、非−特異
性交雑生成を妨げるために、十分に精製された条件下に
ある適当な検体の入手可能性に依存している。適する検
体は望ましいもしくは対応するｃＤＮＡに相補的なｍＲ
ＮＡである。

【００８６】ヒト白血球および線維芽細胞ＩＦＮを含む
細菌クローンのためのスクリーニングに関するいくつか
のアプローチは知られている。たとえばゴエデルら、
（１３）およびスガノら、（１６）は、ＩＦＮ遺伝子を
二つのハイブリダイズセットの視覚的比較によって同定
する。第一のセットは、プライマーとして合成デオキシ
アンデカヌクレオチド（ゴエダル）またはオリゴ（ｄ
Ｔ）（スガノ）およびラベル剤として³²Ｐ−ラベルした
ＣＴＰを用いて、誘発細胞から得られたｍＲＮＡ混合物
の逆転写によって合成された放射性ｃＤＮＡとハイブリ
ダイズする。

【００８７】第二のセットは、未誘発細胞から得られた
ｍＲＮＡ混合物から同様の操作で生成された放射能ｃＤ
ＮＡと交雑する。この操作は、示めされたデータからは
明らかなように、特異性および再現性を欠くことに特徴
がある。ワイスマンによって報告された他のアプローチ
は、ＲＮＡ選択ハイブリダイゼーション操作を用いてお
り、望ましいクローンのために、根気のいる、困難な、
多くの段階の探索からなる。

【００８８】記載の方法は、ＬｙＩＦＮ−αおよびＬｙ
ＩＦＮ−β遺伝子の分離のための本発明の目的に適用す
ることはできない、理由はＩＦＮ−βの濃度はヒトＬｙ
ＩＦＮにおけるＩＦＮ−αの約１０％に相当するからで
ある。この少量はそれらの方法の検出限界下にある。こ
の発明に関する当該分野の不満足なアプローチの結果と
して、新規の方法が開発され、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ
−βｍＲＮＡｓに相補的な５′−末端ラベル化したオリ
ゴデオキシヌクレオチドの合成、プライマーとして、該
オリゴデオキシヌクレオチドを用いてＬｙＩＦＮｍＲＮ
Ａのために濃縮されたポリ（Ａ）ＲＮＡの逆転写および
イン・シトウでのラベルしたｃＤＮＡ検体を用いてのフ
ィルター−結合プラスミドＤＮＡｓのコロニー交雑化か
らなる。

【００８９】このアプローチは、合成されたプライマー
オリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列を含むＩＦＮ−
αおよび−β遺伝子の特異的、迅速なおよび直接の検出
を可能にし、先行当該分野記載のように、更に厄介なハ
イブリダイゼーション−翻訳分析（検査）をする必要が
ない。イン・シトウでのコロニーハイブリダイゼーショ
ンは、グルンスタインとホッグネス（３６）によって報
告された方法もしくはその変形に基づいている。

【００９０】この操作において、コロニーは増殖し、ま
たはニトロセルロースフィルターに転移し、アルカリ処
理によって溶菌化し、イン・シトウでフィルターに固定
する。望ましい遺伝子に相補的な放射能ラベルした核酸
の検体を、順次にフィルター結合ＤＮＡに交雑化する。
ハイブリダイズした検体はオートラジオグラフで検出す
ることができ、ハイブリダイズされうるＤＮＡを含む対
応するコロニーは、ニトロセルロースフィルターの参照
セットから分離することができる。

【００９１】クローン化したヒトＩＦＮ−αおよびＩＦ
Ｎ−βのｃＤＮＡｓの伸長コード化の比較は、両方ｃＤ
ＮＡｓ（および、自明に対応するｍＲＮＡｓ）は共通で
ある１３ヌクレオチドの伸長を示めす（２３）。従っ
て、上記載の隣接塩基配列をもつ合成、１３−ｍｅｒオ
リゴデオキシヌクレオチドは、ヒトリンパ芽球ＩＦＮ−
αおよびＩＦＮ−βｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成のプライ
ム化のために用いることができる。

【００９２】ｂ．³²Ｐ−ラベル化したヒトＩＦＮ−αお
よびＩＦＮ−β特異性ｃＤＮＡ検体の製造与えられた構造のオリゴデオキシヌクレオチド（３７）
を合成するために、いくつかの証明されたアプローチが
ある。たとえばオリゴデオキシヌクレオチド合成は化学
的方法、たとえばジエステルまたはトリエステル法によ
って影響される。ジエステル法の基礎的な段階はホスホ
ジエステル結合を含むジデオキシヌクレオチド生成のた
めに、二つの適する保護されたジオキシヌクレオチドの
連結をすることである。

【００９３】トリエステル法はトリエステル法から区別
され、有機溶媒にデオキシヌクレオチドおよびオリゴデ
オキシヌクレオチドを可溶にするリン酸基から生ずる付
加的有機保護基の存在下に行なう。任意に、合成はポリ
ヌクレオチドホスホリラーゼを用いて酵素的に行ないそ
の際、制御された条件下に、優位に単一デオキシヌクレ
オチドを短いオリゴデオキシヌクレオチドに加える。反
応は溶液中または最近、高度に完成された固体相技術
（手段）で行なうことができる。

【００９４】たとえば式５′−ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣ
ＴＧ−３′のヒトＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βｍＲＡに
相補的な、１３−ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドの
合成は、出発物質として保護されたモノ−，ジ−，およ
びトリデオキシヌクレオチドを用いるイタクラ（３８）
およびデローイジイ（３９）によって報告されたよう
に、トリエステル−法によって行なうことができる。操
作（方法）の単一段階はジヌクレオチドの合成を示めし
た次の式：

【００９５】

【化１】

【００９６】（式中、Ｒ₁，Ｒ₂およびＲ₃は保護基で
あり、ｄＮおよびｄＮ′はプリンもしくはピリミジン塩
基であり、ｃｏｎｄは縮合剤である）で表わされる。本
合成に用いられる出発物質（保護されたまたは部分的に
保護されたモノ−、ジ−、またはトリデオキシヌクレオ
チド）は文献記載から知られている。好都合に、ヌクレ
オチド３′−５′−連結の開裂なしに緩和な条件下に継
続的に除去することができるような保護基を選択する。
適する保護基Ｒ₁は、たとえばモノメトキシトリチル基
またはジメトキシトリチル基であり、Ｒ₂は、たとえば
２−クロロフェニル基、およびＲ₃は、たとえば２−シ
アノエチル基である。

【００９７】アデニン、グアニンおよびシトシン残基に
おける環外のアミノ機能は、特にアシル基、たとえばベ
ンゾイル基またはイソブチリル基によって保護される。
縮合剤として、たとえば２，４，６−トリイソプロピル
ベンゼンスルフォン酸が用いられる。中間化合物におけ
る単一保護基（例Ｒ₃，Ｒ₁およびＲ₂）の特別の除去
および十分に保護された１３−ｍｅｒオリゴデオキシヌ
クレオチドの脱解離（脱遮断）は、既知の方法によって
行なわれる。

【００９８】たとえば２−シアノエチル基Ｒ₃はアルカ
リ処理によって除去でき、モノメトキシトリチル基Ｒ₁
は８０％酢酸処理によって除去でき、２−クロロフェニ
ル基Ｒ₂はテトラブチルアンモニウムフルオライド処理
によって除去できる。当該分野で知られている他の方法
も、同じく用いることができる。合成の各々の段階は図
２で示めす。

【００９９】製造された１３−ｍｅｒオリゴデオキシヌ
クレオチドプライマーは、常法のクロマトグラフイ法た
とえばＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフイまた
は／および高度液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）に
よって精製する。プライマーは継続の交雑操作における
交雑検体の検出を可能にせしめる５′−³²Ｐ−ラベル化
されている。

【０１００】ラベル化は、ラベル化したリン酸化剤、た
とえば〔ｒ−³²Ｐ〕で合成されたプライマーと常法で用
いられる緩衝混合液におけるＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼと反応させることによってなされる。³²Ｐ−ラベル
したプライマーを含む得られた溶液は脱タンパク（例、
フェノール）、クロマト処理（例、セファデックスクロ
マトグラフイーまたはポリアクリルアミドゲル電気泳
動）によって精製する。

【０１０１】ＬｙＩＦＮｍＲＮＡのために濃縮したポリ
（Ａ）ＲＮＡ（段階１ｄ参照）は次のようにＩＦＮ−α
およびＩＦＮ−β特異性ｃＤＮＡ検体の合成のためにテ
ンプレートとして用いる：ｃＤＮＡ合成は、５′−ラベ
ルした合成オリゴデオキシヌクレオチドをオリゴ（ｄ
Ｔ）の代りにプライマーとして用いることをのぞいて、
前記載（段階２ａ）のように同様の操作でもたらされ
る。ラベルしたｃＤＮＡ生成物は、たとえばフェノール
で脱タンパクし、エタノールでの沈澱によって集める。
更に精製は、たとえばｃＤＮＡ生成物のポリアクルアミ
ドゲル電気泳動によって行なうことができる。生成物
は、オートラジオグラフで目に見えるようにすることが
できる。

【０１０２】誘発細胞からのポリ（Ａ）ＲＮＡに特異的
でありおよび非誘発細胞からのポリ（Ａ）ＲＮＡの使用
によって得られた生成物に存在しない単一ＤＮＡ帯は、
ゲルから抽出される。その大きさは、たとえば既知の長
さのラベルしたマーカーＤＮＡｓとの関係における相対
的移動度から決定する。生成物は、³²Ｐ−ラベルしたヒ
トＬｙＩＦＮ−αおよび−β特異ｃＤＮＡ実験材料（検
体）である。

【０１０３】ｃ．リンパ芽球ＩＦＮｃＤＮＡを含むクロ
ーンのためのスクリーニングテトラサイクリンで補足した寒天培地（３ｅ項参照）で
生き残りそして増殖したコロニーを、リンパ芽球ＩＦＮ
ｃＤＮＡを含むクローンのためにスクリーンする（ふる
い分ける）。この目的のために、イン・シトウでコロニ
ー交雑操作は、前記載のように選択する（４ｅ項）。形
質転換コロニーは、ニトロセルロースフィルターに転移
し、およびそれらのコロニーの引例のセットは、付加的
寒天プレートにレプリカ平板培養によって得られる。フ
ィルター上のコロニーは、溶菌化され、ＤＮＡは変性
し、イン・シトウでフィルターに固定する（３６）。

【０１０４】交雑操作前に、フィルター上で変性ＤＮＡ
は、低いバックグランドを得、および非−特異性交雑位
置を飽和するために、たとえば異由来のＤＮＡを含む混
合物で、有利に前−交雑化する。続いて、前記載のよう
に製造した（４ｂ項）放射能ラベルしたｃＤＮＡ検体を
鉱油でカバーしたフィルター結合ＤＮＡに交雑化する。
フィルターから鉱油および他の混同物（汚染物質）を除
いた後、交雑化の結果は、Ｘ−線フィルム上のオートラ
ジオグラフ分析によってモニターすることができる。コ
ロニーは、Ｘ線露出に陽性（＋）反応を示めし、引例セ
ットから見分けることができ、更に研究のために用いる
ことができる。

【０１０５】好ましくは、形質転換コロニーの１部分は
ニトロセルロースフィルターに転移する。残りのコロニ
ーは、更に下記に詳細に記載のスクリーニング操作に用
いられる（４ｄ項）。たとえば、ニトロセルロースフィ
ルターに固定したＤＮＡは、変性ＤＮＡ、たとえば変性
こうし−胸腺ＤＮＡ、牛血清アルブミン、フィコールお
よびポリビニルピロリドンを含む常法の前−ハイブリダ
イゼーション混合物で処理し、次いで標準ハイブリダイ
ゼーション操作を用いてのパラフィン油のもとで放射能
ラベルしたｃＤＮＡ検体（４ｂ項参照）でハイブリダイ
ズ化する（３６）。ハイブリダイゼーションが終了した
後、フィルターは、連続的にパラフィン油および未−ハ
イブリダイズｃＤＮＡを除去するために、クロロホルム
およびＳＤＳおよび低い塩を含む緩衝液で洗浄する。フ
ィルターは、オートラジオグラフィーのためにＸ線フィ
ルムに露光させる。ハイブリダイズしたコロニーは、陽
性（＋）反応を示し引例セットから見分けることができ
る。

【０１０６】同定したコロニーは、ｃＤＮＡ検体に相補
的な挿入体を有する組み換えＤＮＡｓすなわち、ヒトリ
ンパ芽球遺伝子またはその断片に対応するＤＮＡ断片を
含む。時折一種以上の組み換えＤＮＡ分子、ハイブリド
プラスミドＤＮＡを含む形質転換した細胞の第一のクロ
ーンは、陽性にハイブリダイズしたクローンから分離さ
れ、前記載（３ｅ項）のようにＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１
の再形質転換のために用いる。ハイブリドプラスミドＤ
ＮＡｓは、たとえば、次の方法によって分離される。初
めに、同定された各々のコロニーは適当な栄養培地、た
とえばトリプトン培地、いかなるプラスミドも含まない
混同（汚染）細胞を除去するためにテトラサイクリンの
存在下に培養する。

【０１０７】生き残りの細胞を採取し、慣例上の緩衝系
に溶解し、細胞外膜内にクロモゾゾームが残るように緩
和な条件で破壊する。この過程には、たとえばリゾチー
ム、ＥＤＴＡおよび非イオン性浄化剤（例、トリシン）
の連続的添加が含まれる。細胞破片物、およびクロマト
ゾームＤＮＡは遠心によって分離される。上澄液は脱タ
ンパクし（例、フェノール）、ＲＮＡはＲＮＡｓｅ
（例、ＲＮＡｓｅＡ）で分解する。ハイブリドプラスミ
ドＤＮＡは、ポリエチレングリコールによる沈澱によっ
てＲＮＡ断片から分離され、エタノールによる再沈澱に
よって精製される。

【０１０８】この段階で、各々分離された交雑ＤＮＡの
開裂パターンは、適当な制限エンドヌクレアーゼによる
開裂によって決定することができ、この酵素は特にｄｓ
ｃＤＮＡが挿入（３ｂ項参照）される位置で、ｐＢＲ３
２２を線状化するために用いる。制限断片の大きさは、
たとえば既知の長さのマーカーＤＮＡｓに関連して、ア
ガロースゲルにおける電気泳動移動度から測定できる。

【０１０９】分離されたハイブリドＤＮＡｓの各々は、
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１へ再形質転換し、テトラサイク
リンを含む適当な寒天培地（３ｅ項参照）で増殖させ
る。各々の再形質転換から、いくつかのクローンを見分
け、各々のクローンのハイブリドプラスミドＤＮＡｓを
再度、制限分析をし、ｃＤＮＡ挿入体の完全なまたは部
分的なヌクレオチド排列分析を、更に進行（処置）のた
めに適するハイブリドＤＮＡｓの選択のために行なう。
更に、部分的な排列分析は、挿入されたＩＦＮｃＤＮＡ
断片がヒトリンパＩＦＮ−αまたは−β遺伝子に対応す
るかどうか明らかにする。

【０１１０】現在までに、いくつかの迅速法は、ＤＮＡ
分子配列化のために有効である。主要な合成法で、特に
サンガー（４０）によって開発された方法は、プライマ
ーとして、制限エンドヌクレアーゼ分解によって生成し
た放射能でラベルしたＤＮＡ断片を用いて、一本鎖ＤＮ
Ａテンプレートの相補性模写を正確に合成するＤＮＡポ
リメラーゼの効力（能力）を使用するものである。マッ
クサムおよびジルバートら（４１）によって開発された
任意の化学的ＤＮＡ配列化法を選択することも可能であ
る。

【０１１１】この方法において、配列化されるＤＮＡ
は、末端−ラベル化、特に４つの異なった反応において
４つの塩基の各々で開裂化し、生成物は、大きさによっ
て、たとえば変性する条件下でのゲル電気泳動の手段で
分画する。ＤＮＡ配列は、放射性帯のパターンから解読
することができる。ＤＮＡの選択された伸長の完全なヌ
クレオチド排列を決定するために、この領域のＤＮＡを
切断する制限エンドヌクレアーゼを必要とする。

【０１１２】マックサムとジルバートの方法により、切
断から同方向における１００−１５０塩基までの配列
は、一つの実験で解決することができ得る。たとえば、
分離されたハイブリドＤＮＡｓは、適する制限エンドヌ
クレアーゼ（例、ＰｓｔＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢｇｌII，Ｐ
ｖｕIIまたはＡｌｕＩ）で、ｃＤＮＡ挿入体内に起こる
位置で、分解される。得られたＤＮＡ断片は末端にたと
えれば〔ｒ−³²Ｐ〕−ＡＴＰで、ポリヌクレオチドキナ
ーゼの存在下でラベルし、ｄｓＤＮＡの一本鎖だけが末
端にラベルされて残るように、第二の制限エンドヌクレ
アーゼで開裂する。適当なＤＮＡ断片は、たとえばポリ
アクルアミドゲル電気泳動によって分離される。次い
で、ＤＮＡ断片をマックサムとジルバート（４１）によ
って報告された塩基−特異性開裂反応に処する。生成物
を電気泳動（例、ポリアクルアミドゲル）によって、変
性する条件下に（例、７Ｍ尿素）分画し、ＤＮＡ断片を
オートラジオグラフで目で見分けることができる。

【０１１３】ｄ．リンパ芽球ＩＦＮｃＤＮＡを含む付加
的クローンの同定前記載のように（４ｃ項）、形質転換
コロニーの一部はニトロセルロースフィルターに転移
し、その固定されたＤＮＡは、イン・シトゥで、検体と
して放射能でラベルしたｃＤＮＡ（例、ＩＦＮ特異ｃＤ
ＮＡ検体）を用いてのコロニーハイブリダイゼーション
を行なう。陽性のハイブリダイズしたコロニーの組み換
えＤＮＡｓは、同じもしくは関連したＤＮＡ挿入体
（例、ＩＦＮに関連した排列）をもつ組み換えＤＮＡ分
子を含む付加的なクローンのためのスクリーンに用いる
ことができる。

【０１１４】この目的のために、最初のスクリーン操作
（４ｃ項）において得られた同定されたコロニーの各々
のプラスミドＤＮＡｓ（異なったＩＦＮ遺伝子または遺
伝子断片に対応して）は、前記載のように分離され、Ｉ
ＦＮｃＤＮＡ挿入体もしくはその一部分を含むプラスミ
ド断片が得られるように制限エンドヌクレアーゼで開裂
する。これらのプラスミド断片を５′−末端にラベルし
た後、適当なＤＮＡ断片（例、放射能でラベルしたＩＦ
Ｎ挿入体もしくはその一部分）を、たとえばポリアクル
アミドゲル電気泳動によって分離し、それらを単一にも
しくは任意に、混合物として用いることができる。

【０１１５】ハイブリダイゼーションのために、形質転
換コロニー（前記載）は、ニトロセルロースフィルター
に転移し、溶菌化する。それらのＤＮＡは変性化し、イ
ン・シトゥでフィルターに固定しグルンスタインとホッ
グネス（３６）の報告に基づいて、ＩＦＮ特異性、放射
能でラベルしたＤＮＡ断片とハイブリダイズする。ハイ
ブリダイズしたコロニーはオートラジオグラフィーで目
で見ることができ引例セットから見分けることができ
る。

【０１１６】検体として、同一のもしくは類似のｃＤＮ
Ａ挿入体をもつ組み換えＤＮＡ分子を含む同一コロニー
を用いる。このスクリーン操作によって、付加的クロー
ンがリンパ芽球ＩＦＮ−αもしくは−βＩＦＮ遺伝子ま
たはその断片を含むことを同定できる。各々同定したコ
ロニーのプラスミドＤＮＡは分離でき、前記載（４ｃ
項）のように制限分析および部分的排列分析によって特
徴づけることができる。

【０１１７】５．ＨｕＬｙＩＦＮ−特異性組み換えＤＮ
Ａｓを含むＥ．ｃｏｌｉによるＨｕＬｙＩＦＮ−様活性
をもつポリペプチドの合成、本発明に係るＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡ挿入体は、ｐＢＲ
３２２のＰｓｔＩ位置にハイブリダイゼーションを経て
挿入される（前記載）。なぜならｐＢＲ３２２のＰｓｔ
Ｉ位置は、β−ラクトア（ラクタ）マーゼ遺伝子内にあ
り、ｃＤＮＡ挿入体を転写に関する特有な配向における
位置、および翻訳に関する特有解読のフレームにおける
位置に連結（開裂と、共役して結合）する際、癒合（合
着）したタンパクとなりうる。もし挿入されるｃＤＮＡ
はそれ自体開始信号および／または停止信号をβ−ラク
トア（ラクタ）マーゼ配列をもつ相において有する場
合、開始および／または再開始は第二の開始信号で起こ
り、非−癒合（合着）タンパクが得られる。

【０１１８】それにもかかわらず、それらのクローンは
重要であり、ＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡは存在するけれど
も、いかなるＩＦＮ活性も示さない。この場合、ｃＤＮ
Ａ挿入体は、分離され、望ましいポリペプチドの発現の
高レベルを得るために、適当な様式で（７項参照）発現
対照領域に連結される。ＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡ挿入体
をもつ組み換えＤＮＡを含むクローンは、常法によって
ＩＦＮ活性のためのテストをすることができる。たとえ
ば、培養は十分な細胞密度に増殖されうる。細胞は採取
し、再懸濁し、溶菌化する（１ｂ項参照）。無細胞抽出
物はたとえば細胞病理バイオアッセイを用いて分析でき
る。

【０１１９】十分な程度にＨｕＬｙＩＦＮ活性をもつポ
リペプチドを合成するクローンは、大規模生産に適合す
る。クローンは培養され、ポリペプチドは７章および８
章に記載のように回収することができる。６．ＨｕＬｙＩＦＮ活性をもつポリペプチドの高レベル
を発現することができる組み換えプラスミドの構成、十分に発現させるために、遺伝子は正しく転写の開始体
（プロモーター）および翻訳（リボゾーム結合位置）を
含む対照領域に関して局在化（集積化）されねばならな
い。

【０１２０】前記載のように（３ｄ項）、プラスミドｐ
ＢＲ３２２は、適当な制限エンドヌクレアーゼで開裂
し、ＨｕＬｙｃＤＮＡと連結する。得られた組み換えプ
ラスミドＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換
するために用いられる。たとえば、もしＰｓｔＩを制限
エンドヌクレアーゼとして使用する場合、ＨｕＬｙｃＤ
ＮＡの挿入はｐＢＲ３２２のβ−ラクトア（ラクタ）マ
ーゼ内に起こる。更に連結が、特有の配向および特有の
解読フレームで行なわれるならば、癒合（合着）したタ
ンパクは、ＨｕＬｙＩＦＮアミノ酸配列に従うβ−ラク
トアマーゼ鎖の部分からなる結果になる。ｃＤＮＡが特
有の解読フレームおよび／または配向に挿入されない場
合は、得られるタンパクは、いかなるＩＦＮ活性も示さ
ない。

【０１２１】不適当な配向の場合、プラスミドは適する
制限エンドヌクレアーゼ（本発明においてすべての挿入
体は、ＰｓｔＩによって切断される）でｃＤＮＡ挿入体
を切断することによって再配向できおよびｃＤＮＡと線
状プラスミドの再連結（開裂と共役して結合）すること
ができる。得られた交雑プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１に形質転換でき、そして順次に通常ＩＦＮ活性
の検査（分析）ができる。

【０１２２】ＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡ挿入発現の効率を
高めるために、過剰でないヌクレオチド（および従って
アミノ酸）が先の遺伝子（および従ってＨｕＬｙＩＦＮ
活性をもつポリペプチド）であるように前記載の発現対
照配列の付近で、ＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡを局在化する
ことが必要である。更にＨｕＬｙＩＦＮｓの場合におい
て、第一の翻訳生成物は、成熟インターフェロンのＮ−
末端に付着した信号ペプチドからなるプレ−インターフ
ェロンである。

【０１２３】信号ペプチド排列は、ポスト−翻訳的に初
めのプロゲニター細胞に移す。しかしながらＥ．ｃｏｌ
ｉは蛋白質融解的にプレ−排列を移すことはできない。
従って、プレ−排列は、好都合にｃＤＮＡ挿入から、第
一の翻訳生成物が成熟ＩＦＮ−様ポリペプチドであり得
るように適当な方法（下記参照）によって除去できる。
この目的のために、成熟ＨｕＬｙＩＦＮのためのコード
化遺伝子は、イン・ビトロで再構成され、発現制御配列
に付着した（操作的に連結した）プラスミド（例、β−
ラクトアメーゼ遺伝子の発現制御排列）に再挿入する。

【０１２４】他の発現制御配列、プロモーターおよびリ
ボゾーム結合位置も同様に用いることができ、たとえば
ラクトースオペロンの制御配列、トリプトファンオペロ
ン、アラビノースオペロンその他対応するファージλＮ
−遺伝子の排列およびファージｆｄコートタンパク遺伝
子、または当該分野で知られている他の排列のようなも
のを挙げることができる。発現制御配列は、すでにｃＤ
ＮＡ挿入体を含むプラスミドに挿入でき、または両ＤＮ
Ａ断片を継続的にプラスミドに挿入できる。

【０１２５】たとえば成熟ＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡは、
β−ラクトアマーゼ発現制御配列の制御下におくことが
できる。なぜなら成熟ＨｕＬｙＩＦＮ−様ポリペプチド
のためのコード化成熟ｃＤＮＡ挿入は、翻訳開始のため
に必要である暗号（コドン）ＡＴＧで開始されず、ＡＴ
Ｇ−トリプレットは、合成的に入れなければならない。
たとえば知られているヌクレオチド塩基配列およびその
結果として、ｐＢＲ３２２およびＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮ
Ａの制限ヌクレアーゼパターンは、次のアプローチに用
いることができる。

【０１２６】プラスミドｐＢＲ３２２をβ−ラクトアマ
ーゼ遺伝子内ＰｓｔＩで開裂し、エキソヌクレアーゼ、
たとえばＢａ１３１で分解し、β−ラクトアマーゼコー
ド化配列を短くする。任意に、Ｅ．ｃｏｌｉからのλ−
エキソヌクレアーゼ（５′−エキソヌクレアーゼ）もし
くは３′−エキソヌクレアーゼおよびＳｌヌクレアーゼ
の併用は、同じく用いることができる。制限されたプラ
スミドは、合成されることのできる、（たとえば前記載
（４ｂ項）のトリエステルアプローチによって）ｄｓＤ
ＮＡリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）と連結させる。

【０１２７】リンカーは、適当な制限エンドヌクレアー
ゼ、たとえばＢｃｌＩ（Ｓａｕ３Ａ）の認知配列を含
む。得られたプラスミド断片は、アニール化したリンカ
ー（例、ＢｃｌＩ）へ特徴のある制限エンドヌクレアー
ゼで、および次いでＥｃｏＲＩ（β−ラクトアマーゼ発
現制御配列の付近に局在化するｐＢＲ３２２内にＥｃｏ
ＲＩ位置が存在する）で開裂する。得られたＤＮＡ断片
（例、ＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩＤＮＡ断片）は本質的にβ
−ラクトアマーゼ（ＡｐＰｒ）の発現制御配列およびア
ニール化リンカーからなり、ポリアクルアミド電気泳動
によって分離することができる。

【０１２８】一方において、ＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡ挿
入は、それを含む組み換えＤＮＡ分子から（４ｄ項）、
たとえば制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩによる分解に
よって、切断する。単離されたＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡ
挿入は、信号ペプチドのためのコード化するＤＮＡ排列
を移すために更に他の制限エンドヌクレアーゼで（必要
ならば、二つの他の制限エンドヌクレアーゼおよび部分
的再連結された）開裂される。得られた成熟ＨｕＬｙＩ
ＦＮｃＤＮＡは、前記載のＡｐＰｒＤＮＡ断片（例、Ｓ
ａｕ３Ａ“ステッキィ”終末端）に相補的な“ステッキ
ィ”終末端をもつ。

【０１２９】成熟ＨｕＬｙＩＦＮｃＤＮＡおよびＡｐＰ
ｒＤＮＡ断片は、通常リガーゼによってアニール化され
る（３ｄ項参照）。アニール化は、特有の解読フレーム
を確立するために、成熟ｃＤＮＡの第一暗号に先んずる
ＡＴＧ暗号の生成の結果にならねばならない。得られる
交雑ＤＮＡはβ−ラクトアマーゼ発現制御領域、ＡＴＧ
翻訳開始暗号、完全なＨｕＬｙＩＦＮのためのコード化
ＤＮＡ配列、および開裂されたプラスミドｐＢＲ３２２
におけるハイブリドＤＮＡを挿入するために適する二つ
の制限エンドヌクレアーゼ−終末端（例、ＥｃｏＲＩお
よびＰｓｔＩ終末端）を含む。

【０１３０】得られたハイブリドプラスミドは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉＨＢ１０１の形質転換およびＨｕＬｙＩＦＮ活性
をもつポリペプチドの高レベルの合成に導くために用い
られる。７．ＨｕＬｙＩＦＮ−特異性組み換えＤＮＡｓを含むク
ローンの培養、本発明に係る形質転換したホストは、ＨｕＬｙＩＦＮ活
性をもつポリペプチド生成のために用いることができ
る。該ポリペプチドを生成する方法は、形質転換ホス
ト、特に形質転換したＥ．ｃｏｌｉ株（系統）は炭素、
窒素および無機塩の同化できる源を含む液体栄養培地で
培養することを特徴とする。

【０１３１】いろいろの炭素源を用いることができる。
たとえば好ましい炭素源として、グルコース、マルトー
ス、マンニットールまたはラクトースまたはアセテート
のような同化できる炭化水素であり、単一もしくは適す
る混合物で使用することができる。好適な窒素源とし
て、たとえばカスアミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏａｃｉ
ｄ）のようなアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質およ
びその分解生成物（例、トリプトン、ペプトン）または
肉抽出物更に酵母抽出物、麦芽抽出物、コーン浸液、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニ
ウムのようなアンモニウム塩が挙げられ、単一もしくは
適する混合物で使用することができる。使用される無機
塩としては、たとえば硫酸塩、塩化物、リン酸塩および
ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウ
ム塩が挙げられる。

【０１３２】任意に、栄養培地は、増殖を助長する物質
および／またはＨｕＬｙＩＦＮ−特異性組み換えＤＮＡ
のロスを妨げるために選択的圧力を加える物質を含む。
増殖を助長する物質には、たとえば鉄、亜鉛、マンガ
ン、その他の微量元素および特有のアミノ酸がある。Ｈ
ｕＬｙＩＦＮ活性をもつポリペプチドのためのコード化
遺伝子は別として、本発明に係る組み換えＤＮＡｓは、
好ましくは、抗生抵抗性（不応性）たとえばアンピシリ
ンおよび／またはテトラサイクリンに対する抵抗性（不
応性）を授けられる遺伝子を含む。このような抗生物質
を培地に加える場合、組み換えＤＮＡを含む細胞は、生
き残り、増殖し、一方該組み換えＤＮＡまたは培地に混
同する外来抗生−感受性微生物を含まない細胞は、生き
残ることはない。

【０１３３】培養は常法による手段で行なう。温度、培
地のpHおよび発酵時間のような培養条件は、ＩＦＮ−様
ポリペプチドの最大値を得られるようなやり方で選択す
る。好ましくは選択されたＥ．ｃｏｌｉ株は好気的条件
下に、約２０−４０℃の温度で好ましくは３０℃でpH４
−９で、好ましくはpH７で、約４−２０時間、好ましく
は８−１２時間、攪拌しながらまたは振りながら深部培
養する。培養の結果として、ＩＦＮ−様ポリペプチド
は、細胞内に集積する。

【０１３４】８．ＩＦＮ活性をもつポリペプチドの分離
および精製本発明に係るヒトリンパ芽球インターフェロンは、形質
転換したホスト細胞から該ポリペプチドの遊離および精
製の段階を含んでなる培養肉汁からの回収である。形質
転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞を満足すべき細胞密度に増殖
した後、発現された（表現）ポリペプチドの回収のため
の第一段階は細胞内部からそれの遊離を含む。この目的
のために細胞は、ＳＤＳまたはトリトンのような浄化剤
によって溶菌化する。任意に、剪断力のような機械力、
（例、Ｘ−プレス、フレンチプレス）またはガラスビー
ズまたはアルミナと振り回ることによって、細胞を破壊
する。

【０１３５】得られたポリペプチド混合物は、常法によ
って、すなわち硫酸アンモニウムまたはトリクロロ酢酸
による沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー
（例、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ−排除
（排他）クロマトグラフィー、または反転相ＨＰＬＣお
よびその他）を用いて、ヒトＬｙＩＦＮを濃縮する。最
終的な精製前の精製は、たとえば、抗体親和性クロマト
グラフィーによってなされる。主に精製段階は、ヒト白
血球インターフェロンの精製のために開発したステェフ
ェリンら（５１）の方法によって行なわれる。

【０１３６】たとえば、ヒトＬｙＩＦＮの精製および分
離は、次の段階を経て行なう：（１）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の溶菌化（２）ポリエチレンイミン処理による非−蛋白質分解物
質の一部の除去（３）硫酸アンモニウムでの溶液飽和によるポリペプチ
ドの沈澱（４）適当な緩衝混合液における透析（５）ＤＥＡＥ−セルロースのカラムクロマトグラフィ
ー（６）親和性モノクロナル抗体のカラムクロマトグラフ
ィー（７）適合するセファデックス登録商標の分子サイズの
カラムクロマトグラフィー十分な精製生成物を得るために、付加的な精製段階が、
必要とされる、たとえばカチオン、またはアニオン交換
クロマトグラフィー、水酸化燐灰石への吸収、反転相Ｈ
ＰＬＣなどがある。一方前記の段階の１つもしくはそれ
以上、可能ならば、削除することができるし、または段
階の順序を変えることもできる。

【０１３７】本発明は、本発明に係るポリペプチドの誘
導体および断片を含んでなり、たとえば蛋白質融解的に
開裂したポリペプチド、十分にもしくは部分的に保護さ
れた、たとえばアシル化，シリル化および特にグリコシ
ル化ポリペプチド、およびその塩およびそれらの製造の
ための常法による過程を含む。本発明は、特に本発明の
結果として精製された形態でのＤＮＡｓおよびポリペプ
チド、および特別にＤＮＡｓ、形質転換したホスト，ポ
リペプチド、および実施例で記載のようにその製造過程
に関するものである。

【０１３８】本発明のポリペプチドおよび適するその誘
導体、たとえばグリコシル化した生成物は、ヒトの癌，
腫瘍，およびウイルス感染の治療のために知られている
インターフェロンと類似して用いられ、必要に応じて他
の抗ウイルス性，抗癌性，または抗腫瘍性剤と併用して
用いられ、好ましくは、活性成分とともにまたは、有機
もしくは無機の固体または液体、好ましくは非経口投与
に適する医薬として許容され得る担体と混合して、効果
量含む医薬製剤の形である。

【０１３９】本発明に係る医薬として活性のある化合物
は、好ましくは製剤でまたは非経口（例、筋肉注射、静
脈注射）のための注入溶液の形態である。このような溶
液は、好ましくは使用前に製造された等張性水溶液また
は懸濁液であり、それは活性成分のみまたは医薬として
許容されうる担体を含む凍結乾燥（親液性化）した調合
物から製造する。

【０１４０】医薬製剤は、殺菌しおよび／または補助
薬、たとえば保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳
化剤、可溶化剤、浸透圧を調整するための塩、および／
または緩衝液を含む。本医薬製剤は、所望ならば、更に
医薬的に価値のある物質を含むこともでき、既知の方法
によって生産され、たとえば、常法によって溶解した
り、凍結乾燥（親液性化）によって行ない、活性成分は
約０．１−１００％、特に約１−５０％、凍結乾燥（親
液性化）の場合は１００％まで含むことができる。

【０１４１】本発明は、医薬として活性ある化合物を、
医薬として許容されうる担体と混合することを特徴とす
る医薬組成分を生成する方法に関するものである。病症
の本質（特性）、および患者の容態に依存して、製剤
は、たとえば筋肉内に一日に三回約１０⁶−１０⁷ユニ
ットの投与量で投与する。次の実施例は、本発明を例示
しており、本発明の範囲を限界するものとして解釈すべ
きではない。

【０１４２】実施例次の略語は、実施例において用いられる。ＥｔＢｒ：エチジウムブロマイドＢＳＡ：牛血清アルブミンＤＴＴ：１，４−ジチオスレイトール（１，４−ジメル
カフト−２，３−ブタンジオル）ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシイル硫酸ナトリウムＴＮＥ：１００mM ＮａＣｌ，５０mMトリス・塩酸（pH
７．５）、および５mMＥＤＴＡを含む溶液Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ）：トリス−（ヒドロキシメチ
ル）−アミノメタンＴｒｉｓ・ＨＣｌ：トリス１塩酸１．ＨｕＩＦＮｍＲＮＡのために濃縮されたポリ（Ａ）
ＲＮＡの分離（図１）ａ）ナマルワ細胞の誘発ナマルワ細胞は、胎子牛血清１０％を含む培養培地ＲＰ
ＭＩ１６４０で３７℃のもとで増殖させる。細胞の密
度が、３・７０６細胞／mlに到達した時、懸濁液を室温
で８００×ｇで１０分間遠心する。集められた細胞は、
グルタミン（０．０２７％／容積）、ペニシリン（２０
０ユニット／ml）およびストレプトマイシン（５０μｇ
／ml）を含む培地（２００ml）に再懸濁する。細胞は、
９０分間３７℃でニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ１
１０）を１９０ＨＡＵ／１０⁶細胞（ＨＡＵ：血球凝集
ユニット）の割合で培養する。新しい培地を添加するこ
とによって、細胞の密度を１・３・１０⁶細胞／mlに調
整し、細胞懸濁液を３４℃で１００r.p.m.で振り回す。

【０１４３】１２時間後、６・１０⁹細胞は、採収し、
リン酸−緩衝化した塩水（５０ml）〔“ＰＢＳ”；１１
ＰＢＳは、塩化ナトリウム（８０ｇ）、塩化カリウム
（２ｇ）、リン酸水素ナトリウム（１４．４ｇ）および
リン酸２水素カリウム（２ｇ）を含む〕に再懸濁する。
細胞を採収する前に、サンプルを移し、インターフェロ
ン活性を、チャレンジウィルスとして、小水疱性口内炎
ウィルスおよびＣＣＬ−２３細胞を用いて、アームスト
ロング（２９）の方法に基づいて測定する。４３００Ｉ
ＦＮユニット／mlが検出される。

【０１４４】ｂ）細胞の破壊および脱タンパク化細胞懸濁液（６・１０⁹細胞／５０mlＰＢＳ）を室温
で、０．０５Ｍトリス塩酸（pH７．５）、０．１Ｍ塩化
ナトリウム、５mM ＥＤＴＡおよび２％ＳＤＳ（結晶、
研究用、セルバ）からなる溶菌緩衝液（８００ml）を加
える。溶菌化したものは、前培養した（３７℃で２時
間）プロテアーゼ（プロテアーゼｐ、VI型、シグマ）
（０．２mg／ml）加えて、室温のもとで攪拌しながら１
時間分解する。溶液をＴＮＥ飽和−フェノール（５００
ml×３）およびクロロホルム（５００ml×３）で抽出す
ることによって脱タンパク化する。２６０nmの吸収によ
って測定されるように核酸（５００mg) が得られる。

【０１４５】ｃ）混合しているＤＮＡおよびＲＮＡの除
去前記載のように得られたかすかにビスコース状水溶液
（段階１ｂ）は、０．３Ｍ塩化ナトリウムで調整し、オ
リゴ（ｄＴ）セルロース（１ｇ）（７型、Ｐ−Ｌ生化
学）を加える。懸濁液を室温で３０分間攪拌した後、室
温でソルバルＲＣ−３遠心機を用いて１l ソルバル管
で、４０００rpm で１０分間遠心し、得られたオリゴ
（ｄＴ）セルロース−スラリイを、０．５％ＳＤＳを含
むＴＮＥ（４０ml×２）洗浄する。結合したポリ（Ａ）
ＲＮＡは、水（２．５ml）で、５回連続的洗浄によって
溶出する。

【０１４６】ポリ（Ａ）ＲＮＡ（７２０μｇ）の収量
は、光学的濃度を測定することによって決定する。初め
の吸着からの上澄ＲＮＡ溶液は、二回目にオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロース（１ｇ）に吸着させ、前記載のように溶
出し、ポリ（Ａ）ＲＮＡ（３２０μｇ）が得られる。溶
出液はプールしＴＮＥで調整し、ポリ（Ａ）ＲＮＡを６
７％エタノールで−２０℃のもとで１０時間で沈澱させ
る。ＲＮＡはソルバルＲＣ−５Ｂ遠心機を用いて、１０
分間０℃のもとで１００００rpm で遠心することによっ
て、集めることができる。沈澱物（１mg）は、１mM Ｅ
ＤＴＡ（１ml）に溶解する。

【０１４７】ＲＮＡは、次のようにゼノプルラエビスの
卵母細胞への注入によって、ＨｕＩＦＮｍＲＮＡ活性の
ための分析をすることができる：ＲＮＡ溶液（５０nl）
を２０卵母細胞の各々に注入する。卵母細胞は、ゴルド
ン（４２）、バース（４３）およびコルマンら（３０）
によるバース培地（２mMトリス、８８mM塩化ナトリウ
ム、１mM塩化カリウム、０．３３mM硝酸カルシウム、１
結晶水、０．８２mM硫酸マグネシウム・７結晶水、２．
４mM炭酸水素ナトリウム、０．０１mg／mlペニシリン、
０．０１mg／mlストレプトマイシンを含む溶液を塩酸で
pH７．６に調整する）で培養する。

【０１４８】注入した卵母細胞は、４２−４８時間培養
し、培地を除去し、エッペンドルフ遠心機で５分間遠心
し、上澄みは分析に使用するまで−２０℃または−８０
℃で貯蔵する。ＩＦＮ活性は、本質的にアームストロン
グ（２９）に基づいて、〔ＶＳＶをチャレンジウィルス
としてＨｅｐ−２細胞（フローラボラトリイー）に用い
ることを除いて〕分析する。卵母細胞抽出物は、注入さ
れたＲＮＡμｇにつき６００ＩＵインターフェロンの特
異活性をもつ。

【０１４９】ｄ）ＨｕＩＦＮｍＲＮＡのためのポリ
（Ａ）ＲＮＡ濃縮ポリ（Ａ）ＲＮＡを、０．５mlベット−容積のキレック
ス−１００カラム（２００−４００メッシュ、ビオーラ
ド）に通過させる。カラムは１mM ＥＤＴＡ（１ml) で
リンスする。溶出液（ポリ（Ａ）ＲＮＡ１mg／ＥＤＴＡ
２ml）を２分間１００℃で加熱し、シュクロースデンシ
ティグレディエント〔６５０mMトリス−塩酸（pH７．
５）、０．２Ｍ塩化ナトリウムおよび１mM ＥＤＴＡを
含む１４mlシュクロース溶液を５％から２３％（ｍ／
Ｖ）まで濃度を増加させる〕を用いて遠心する。遠心
は、ＴＳＴ４１ローター（コントロンＡＧ）を用いて、
３５０００rpm で１６時間、５℃のもとで行う。０．３
mlずつの画分は、ＩＳＣＯグレディエントコレクターで
集める。

【０１５０】各々の画分にエタノール２容量加えて、溶
液を１０時間−２０℃で放置する。沈澱したｍＲＮＡは
遠心（ソルバル、ＨＢ−４ローターを用いて、１０００
０rpm で１０分間０℃のもとで）をする。各々の画分の
沈澱物は、１mM ＥＤＴＡ（２５μｌ）に再溶解して、
前記載（段階１ｃ）のように（２０のかわりに、ＲＮＡ
サンプルにつき１０卵母細胞に注入されることを除い
て）ヒトＩＦＮｍＲＮＡ活性のために分析する。結果
は、表１に示す。

【０１５１】

【表１】

【０１５２】画分２３−２９をプールし、ポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡは、次のように精製する：ポリ（Ａ）ＲＮＡ溶液
は、０．５％ＳＤＳを含む２×ＴＮＥで調整し、オリゴ
（ｄＴ）セルロースカラム（２００μｌ）にかける。カ
ラムを０．５％ＳＤＳを含む２×ＴＮＥで洗浄し、ポリ
（Ａ）ＲＮＡは水（０．５ml×５）で溶出する。溶出液
は、ＴＮＥで調整し、同容量のＴＮＥ飽和−フェノール
で２回抽出し、更に同容量のクロロホルムで２回抽出す
る。ポリ（Ａ）ＲＮＡをエタノール（２容量）で−２０
℃のもとで、１０時間沈澱させ、前記載のようにＨＢ−
４ローターを用いての遠心によって沈澱を得る。

【０１５３】ポリ（Ａ）ＲＮＡは、０．５mM ＥＤＴＡ
（１００μｌ）に溶解する。収量は（４０μｇ）光学的
濃度を測定することによって決定される。ポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡの部分は、前記載のように、分析につき２０卵母細
胞を用いて、ヒトＩＦＮ活性のための分析を行う。ポリ
（Ａ）ＲＮＡ製剤はＲＮＡ（μｇ）につき８１００ＩＵ
インターフェロンの特異活性をもつ。

【０１５４】２．二重一鎖ｃＤＮＡの製造（図１）ＨｕＩＦＮｍＲＮＡのために濃縮されたポリ（Ａ）ＲＮ
Ａ（段階１ｄ参照）は、本質的にエフストラテアデスら
（４４）、マニアテスら（４５）およびホエイジマーカ
ーら（４６）によって報告されているように、二重鎖ｃ
ＤＮＡを製造するためのテンプレートとして用いる。

【０１５５】ａ）第一鎖の合成４０mMトリス・塩酸（pH７．５）、３０mM塩化ナトリウ
ム、５mM塩化マグネシウム、０．５mM ＤＤＴ（カルビ
オケミ）、１mM ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｐ−
Ｌ生化学）および１mM³²Ｐ−ｄＡＴＰ（アマースハム比
活性５００００cpm ／nmole)、２０μｇ／mlオリゴ（ｄ
Ｔ）_12-18（Ｐ−Ｌ生化学）、４０μｇ／mlポリ（Ａ）
ＲＮＡおよび鳥類骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）リバー
ストランスクリプターゼ（ライフ、サイエンス、Ｉｎ
ｃ.,Ｓｔペータースブルグ、フロリダ）を含む反応混合
物（２５０μｌ）を８０分間３７℃で培養する。反応
は、溶液を１０mM ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳで調
整することによって停止する。

【０１５６】反応混合物をフェノールの１容量で一回抽
出する。水相をクロロホルム（１容量）で再抽出し、セ
ファデックスＧ−５０（ファーマシア、ファイン）カラ
ム（３ml）にかける。各画分（０．１ml）を集める。各
々の画分の放射能活性は、セレンコフ放射線を測定する
ことによって決定する。放射能画分は、プールし、核酸
はエタノール（２容量) で、−２０℃のもとで１０時間
沈澱させる。この画分を、ＨＢ−４ローターを用いて１
０，０００rpm で０℃のもとで２０分間遠心する。

【０１５７】沈澱を水（９５μｌ）に溶解する。１０Ｎ
水酸化ナトリウム（５μｌ）を加えて混合物を２５℃の
もとで４０分間培養する。５Ｍ酢酸中和後、水（５０μ
ｌ）およびエタノール（２容量）を加え、−２０℃のも
とで１０時間放置する。沈澱は、前記載のように遠心に
よって集め、０．１mM ＥＤＴＡ（２００μｌ）に再溶
解する。一本鎖ｃＤＮＡの収量は３．７μｇである。ｃ
ＤＮＡのサイズは、既知の長さのマーカーＤＮＡｓに関
連して（３２）、７Ｍ尿素を含むトリス−ホウ酸−ＥＤ
ＴＡ〔トリス（１０８ｇ）、ＥＤＴＡ２ナトリウム塩
（９．３ｇ）、ホウ酸（５５ｇ）を含むpH８．３である
１ｌ溶液〕における６％ポリアクリルアミドゲルの電気
泳動の移動度から測定されるように７００−１５００ヌ
クレオチドの長さである。

【０１５８】ｂ）第二の鎖の合成およびＳ₁エンドヌク
レアーゼ分解得られたｃＤＮＡ溶液は１００℃で９０秒間加熱し、冷
却し、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH６．９）、１
０mM塩化マグネシウム、１０mM ＭＤＴＴ（カルバイオ
ケミ）１mM ｄＡＴＰ，１mM ｄＣＴＰ，１mM ｄＴＴ
Ｐ（Ｐ−Ｌ、生化学）、１mM³Ｈ−ｄＧＴＰ（アマース
ハム、比活性の４０００cpm ／nmole)およびＥ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡポリメラーゼＩ（バイオラボ、ニューイング
ランド）（１６５ユニット／ml）からなる反応混合物
（４００μｌ）で１５℃のもとで８時間培養する。

【０１５９】反応は、ＥＤＴＡおよびＳＤＳを加えて、
最終濃度各々１０mMおよび０．１％になるようにして停
止する。混合物はフェノールおよびクロロホルムで抽出
し、セファデックスＧ−５０（ファーマシア、ファイ
ン、ベット容量２ml）でクロマト処理し、前記載（段階
２ａ）のようにエタノールで沈澱させる。得られたＤＮ
Ａは、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、５０mM酢酸ナトリウ
ム（pH４．５）およびＳ₁エンドヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌ
生化学）の６ユニットを含む１mM硫酸亜鉛を含む培養溶
媒（５０μｌ）で３７℃のもとで３０分間培養する。反
応は０．１％ＳＤＳおよび１０mM ＥＤＴＡで停止す
る。反応混合物はフェノール（５０mM酢酸ナトリウムで
飽和した、pH４．５）およびクロロホルムの１容量で脱
タンパク化する。

【０１６０】水相は、セファデックスＧ−５０（ファー
マシア、ファイン）（２ml）カラムでＴＮＥ中でクロマ
ト処理をする。１００μｌ画分は集められ、各々の画分
におけるセレンコフ放射線を測定する。除外された画分
はプールし、ＤＮＡは、エタノール量（２容量）で前記
載のように−２０℃のもとで１０時間沈澱させる。沈澱
は、ＨＢ−４ローター（下記参照）を用いて遠心し、集
められた沈澱は、１０mMトリス・塩酸（pH７．５）およ
び０．５mM ＥＤＴＡを含む１００μｌに溶解する。Ｄ
ＮＡ（４μｇ）が得られる。

【０１６１】ＤＮＡは５０mMトリス・塩酸（pH７．５）
および１mM ＥＤＴＡでのシュクロース、デンシティ、
グレディエント（５−２３％）でＴＳＴ−６０ローター
（コントロンＡＧ）を用いて分画化する。遠心は、５５
０００rpm で５時間１５℃のもとで行う。８００塩基対
マーカーＤＮＡより速く沈降するＤＮＡをパラレルグレ
ディエントで行い、プールし、ＴＮＥで調整し、６７％
エタノールで−２０℃のもとで１０時間沈澱させる。二
重鎖ｃＤＮＡ（０．４μｇ）が得られる。

【０１６２】３．ｐＢＲ３２２−連結したｃＤＮＡの
製造（図１）ａ）ｄ−ＣＭＰ−延長したｃＤＮＡの製造得られたｄｓｃＤＮＡ（０．１μｇ）の３′−末端
は、１００mMカコジレートナトリウム（pH７．２）、
２．５mM塩化コバルト、ＢＳＡ（カルバイオケミ）（５
０μｇ／ml）、１mM ｄＣＴＰおよび末端デオキシヌク
レチオジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌ生化学）（１０
ユニット／ｄｓｃＤＮＡμｇ）を含む反応容積（１０
μｌ）中でポリ（ｄＣ）末端（尾）に提供（反応）す
る。培養後（２７℃で２０分間）、ＥＤＴＡは１０mMに
なるように加え、使用するまで−２０℃で保存する。

【０１６３】ｂ）ＰｓｔＩ開裂したｄＧＭＰ延長したｐ
ＢＲ３２２の製造ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（１０μｇ）を５０mM
塩化ナトリウム、６mMトリス・塩酸（pH７．５）、６mM
塩化マグネシウム、６mM２−メルカプトエタノールおよ
び１００μｇ／mlゲラチンを含む溶液（１００μｌ）に
ＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ（バイオラボ）の１０ユ
ニットで１時間３７℃で分解する。溶液は、フェノール
およびクロロホルムの１容量で抽出する。溶液をＴＮＥ
で調整し、線状（棒状）ＤＮＡはエタノール（２容量）
で−２０℃のもとで５時間沈澱させる。

【０１６４】線状プラスミドＤＮＡは、１００mMカコデ
レートナトリウム（pH７．２）、５mM塩化マグネシウ
ム、２０mMリン酸二水素ナトリウム、ＢＳＡ（５０μｇ
／ml）、１mM ｄＧＴＰ、末端デオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌ生化学）（１００ユニッ
ト）を含む反応容量（２００μｌ）におけるｄＧＭＰで
延長する。３７℃で２０分間培養後、ＥＤＴＡを１０mM
になるように加え、反応混合物を使用するまで−２０℃
で凍結する。

【０１６５】ｃ）ｄＧＭＰ−延長したｐＢＲ３２２のｄ
ＣＭＰ−延長したｄｓｃＤＮＡへのアニール化ＴＮＥ緩衝液におけるｄＣＭＰ−延長した二重鎖ｃＤＮ
Ａ（０．１μｇ）およびｄＧＭＰ−終末端線状化したｐ
ＢＲ３２２（０．５μｇ）の混合物を６５℃で１時
間、４６℃で１時間、３７℃で１時間、２０℃で１時間
培養する。ｐＢＲ−３２２−連結したｃＤＮＡを含む溶
液を氷上に置き、形質転換のために直ちに使用する。

【０１６６】４．アニール化した交雑（雑種）プラスミ
ドをもつＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の形質転換カルシウム処理したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１は、マ
ンデルら（３５）の方法によって形質転換のために準備
する。前記載（段階３ｃ）のように製造されたアニール
化したｐＢＲ３２２交雑プラスミドＤＮＡｓを含む反
応混合物（１０μｌ）を、１０mM塩化マグネシウムにお
けるカルシウム処理したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１
（１５０μｌ）、１０mM塩化カルシウムおよび１０mMト
リス・塩酸（pH７．５）を含む混合物（全量２００μ
ｌ）に加える。

【０１６７】混合物を氷上で２０分間冷却し、４２℃で
１分間加熱し、２０℃で１０分間培養する。トリプトン
培地〔トリプトン培地は、蒸留水（１ｌ）中にバクト−
トリプトン（１０ｇ）（デフコ）、酵母抽出液（１ｇ）
（デフコ）、グルコース（１ｇ）、塩化ナトリウム（８
ｇ）および塩化カルシウム、２結晶水を含む〕（１ml）
を加え、混合物を３０分間３７℃で３００rpm で振り回
しながら培養する。混合物をテトラサイクリン（１０μ
ｇ／ml）（シグマ）で補足した２寒天プレート（マック
コンケイアガール、デフコ；０．６ml／プレート）にか
ける。プレートは、３７℃のもとで１２−１７時間培養
する。形質転換したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の約５６
００テトラサイクリン抵抗性コロニーが製造される。

【０１６８】５．ＨｕＩＦＮｃＤＮＡを含むクローンの
同定ａ）１３−ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ーの合成（図２）ＨｕＩＦＮ−α₁およびＨｕＩＦＮ−βｍＲＮＡを共有
する１３ヌクレオチドの伸長に相補的オリゴデオキシヌ
クレオチドは、ホスホトリエステル法〔イタクラら（３
８）、ローイジら（３９）〕によって、化学的に合成さ
れる。合成の個々の段階は、図２に概略してある。図２
のライン１で示された出発物質（保護基を運ぶモノおよ
びジデオキシヌクレオチド）は、文献から知ることがで
きる。

【０１６９】保護基は、イタクラらによって報告された
ような方法で開裂（解離）させることができる：水酸基
を置換した５′−モノメトキシトリチル基（Ｍ）もしく
はジメトキシトリチル基（Ｄ）の脱解離は、室温で酢酸
（８０％）で行われ、およびβ−シアノエチルリン酸基
は、室温でジオキサン−水（４：１）における０．１Ｎ
水酸化ナトリウムで行われる。生成ブロックの縮合は、
活性化剤としてトリイソプロピルベンゼンスルフォニル
クロライドを用いて、図２のライン７に表示した十分に
保護した１３−ｍｅｒプライマーまでのオリゴデオキシ
ヌクレオチドを得るために行う。最終段階（すべての保
護基の完全な除去）は次のように行う：ジオキサン（３
ml）およびアセトニトリル（１ml）中に十分保護された
１３−ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチド（６４．６m
g）を含む溶液は、シン−ｐ−ニトロベンツアルドキシ
ン（２００mg）およびＮ¹，Ｎ¹，Ｎ³，Ｎ³−テトラ
メチルグアニジン（１２４mg）と反応させ、２７時間放
置する。２５％アンモニア（１０ml）を加え、溶液は、
５０℃で２４時間保持する。溶媒を、真空下に蒸発させ
た後、残留物は、水に溶解し、酢酸でpH４に調整し、溶
液をクロロホルムで２０回抽出する。

【０１７０】水溶液は、真空下で蒸発させ、残留物は８
０％酢酸（１ml）に溶解する。溶液を一時間放置し、水
（６ml）で希釈し、クロロホルムで３回抽出し、凍結乾
燥する。得られた粗生成物の１／３はＤＥＡＥ−セファ
デックスＡ２５のクロマトグラフィー（カラムサイズ：
１０・１・３cm）を用いて、０．２−１．２Ｍトリエチ
ルアンモニウム２カルボン酸塩グレディエント（２００
ml）を通して精製する。主な画分の溶出は、グレディエ
ント濃度が０．８７Ｍで起こる。

【０１７１】主画分は、ＨＰＬＣテストによって示され
ているように純粋な生成物からなり、３倍に濃縮し、ダ
ウエックス５０Ｗ（アンモニウム塩）（１０ml）でろ過
し、凍結乾燥する。ＨＰＬＣ（パーマフェースＡＡＸ．
カラムサイズ９０・０．３cm、６０℃、２ml／分；グレ
ディエント：Ａ＝０．００５Ｍリン酸二水素カリウム、
Ｂ＝０．５Ｍリン酸二水素カリウム、０．５Ｍ塩化カリ
ウム、pH４．５；２０％Ａ→１００％Ｂ３０分間）：ｔ
_R１１．８分。

【０１７２】ｂ）³²Ｐ−ラベルヒトＩＦＮ−αおよびＩ
ＦＮ−β特異性ｃＤＮＡ（実験材料検体）の製造（図
３）合成１３−ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ー（段階５ａ）（４０pmol）および〔ｒ−³²Ｐ〕−ＡＴ
Ｐ（５７００Ｃｉ・mmol^-1、アマースハム）（４０pmo
l）を１０mM塩化マグネシウムおよび５mM ＤＴＴを含
む５０mMトリス・塩酸（pH９．５）（１００μｌ）中で
結合させる。Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ生
化学）（５０ユニット）を加え、３７℃で３０分後、更
に酵素の２０ユニットを加えて、培養は更に３７℃のと
もで１５分間続ける。³²Ｐ−ラベルしたプライヤーを含
む水溶液は、フェノール抽出によって精製する。

【０１７３】更に精製は、４mlセファデックスＧ−５０
カラム（ファーマシア、ファイン）のクロマトグラフィ
を用いて１mMトリス・塩酸（pH８．０）で処理する。各
画分（０．１ml）を集める。各々の画分の放射能は、セ
レンコフ放射線の測定によって決定する。４・１０⁶セ
レンコフcpm ／オリゴデオキシヌクレオチドpmole の比
活性が得られる。³²Ｐ−ラベルプライマー（４０pmol）
は凍結乾燥し、ポリ（Ａ）ＲＮＡ（段階１で記載のよう
に誘発ナマルワ細胞から製造された）（１４μｇ）を含
む水（９５μｌ）に再懸濁し、１００℃で６０秒間加熱
する。

【０１７４】４Ｍ塩化カリウム（９μｌ）を加え、混合
物を２５℃で６０分間培養する。リバーストランスクリ
プターゼミックス（４５０μｌ）を４０μＭトリス・塩
酸（pH８）、４μＭ塩化マグネシウム、１mM ＤＴＴ
（カルバイオケミ・Ｉｎｃ）、７４mM塩化カリウム、１
mM ｄＡＴＰ，１mM ｄＧＴＰ，１mM ｄＣＴＰ，１mM
ｄＴＴＰ（Ｐ−Ｌ生化学）および鳥類骨髄芽球症ウィル
スの９０ユニットからなる反応容量にするように加え
る。培養は、３７℃で１時間続ける。溶液はフェノール
（ＴＮＥで飽和した）（１容量）で抽出し、核酸は、エ
タノール（２容量）で、−２０℃のもとで１０時間沈澱
させる。

【０１７５】沈澱は、遠心（ＨＢ−４ローター、２０分
間、１００００rpm ，０℃）で集め、９０％（容量／容
量）ホルムアミド（メルク・プロアナリシス）、１mM
ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモ・フェノールブルーおよび
０．０５％キシレンシアノールブルーを含む色素混合液
（２０μｌ）に溶解する。サンプルを９０℃のもとで２
分間加熱し、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ〔ピーコックら
（３２）〕における５％ポリアクリルアミドゲルにかけ
る。

【０１７６】単一体は、プラスミドｐＢＲ３２２のＨ
ａｅ III 分解から得られた２６７bpと４３５ bp ³²Ｐ
−ラベルしたマーカーＤＮＡ断片の間に移動するオート
ラジオグラム上で見ることができる。³²Ｐ−ラベルｃＤ
ＮＡ断片は、ゲルから抽出し、ミューラーらによって報
告されたように（４７）精製する。³²Ｐ−ラベルしたヒ
トＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β特異性ｃＤＮＡ検体の２
００００セレンコフcpm が得られる。

【０１７７】ｃ）ＨｕＩＦＮｃＤＮＡを含むコロニーの
ためのスクリーン化（図３）前記載（段階４）のように製造した形質転換コロニーの
１６５０は、ニトロセルロースフィルターＢＡ８５（シ
ュライヒル＆シューエル、８cm直径）に移す。細胞は、
溶菌化し、それらのＤＮＡは変性させ、グルンスタイン
およびホックネス（３６）に基づいてインシトウで、フ
ィルターに固定する。コロニーのついたフィルターは、
４×ＳＥＴ〔０．１５Ｍ塩化ナトリウム、３０mMトリス
・塩酸（pH８．０）、１mM ＥＤＴＡを含む溶液〕、
０．１％（重量／容量）フィコール４００（ファーマシ
ア）、０．１％（重量／容量）ポリビニールピロリドン
（ＰＶＰ−３６０、シグマ）、０．１％（容量／容量）
ＢＳＡ、０．５％ＳＤＳ、および５０μｇ／ml変性牛−
胸腺ＤＮＡ〔次のように製造される：５mg牛−胸腺ＤＮ
Ａ（Ｃ１型、シグマ）を１０分間、０．５Ｍ水酸化ナト
リウム中でＤＮＡを剪断変形するために煮沸し、５Ｍ酢
酸で中和し、エタノール（２容量）で−２０℃のもとで
沈澱させる。沈澱は、ＨＢ−４ローターを用いて、１０
分間０℃のもとで遠心して集め、０．５mM ＥＤＴＡ
（５００μｌ）に再溶解する〕を含むフィルターにつき
２０mlの混合溶液で、６５℃のもとで、４時間前交雑
（雑種）化し、ニトロセルロースフィルターにつき³²Ｐ
−ラベルした検体の１０³セレンコフcpm で、５×ＳＥ
Ｔ、０．０２％（重量／容量）フィコール、０．０１％
ポリビニルピロリドン、０．０２％（容量／容量）ＢＳ
Ａ、０．２％ＳＤＳおよび５０μｇ／ml変性牛−胸腺Ｄ
ＮＡを含む溶液において交雑化する。交雑化は、６５℃
のもとで３６時間行う。

【０１７８】フィルターは一回クロロホルムで、二回Ｓ
ＥＴ、０．５％ＳＤＳで室温のもとでリンスし、６０℃
のもとで二回ＳＥＴ、０．５％ＳＤＳで１時間、および
室温のもとで一回３mMトリズマ塩基でリンスする。フィ
ルターを、３ＭＭ−ペーパー（ホワトマン）で吸い取る
ことによって乾燥し、Ｘ−線フィルム（フジ）で、スク
リーン（イルフォード増強スクリーン）を用いて、−８
０℃のもとで７２時間フィルターに露出させる。

【０１７９】９つの陽性（＋）コロニーが、オートラジ
オグラム上で同定され、更に研究に用いられる。形質転
換した細胞の第一クローンは、しばしば組み換えＤＮＡ
分子の１種以上を含み、交雑プラスミドＤＮＡｓは、９
つ陽性のハイブリダイズするクローンから分離され、前
記載のように再形質転換Ｅ．ｃｏｌｉのために用いられ
る。

【０１８０】ハイブリドプラスミドＤＮＡは、次のよう
に分離する：１コロニーはエルレンマイヤーフラスコ
（２５ml）内に前記載のようにテトラサイクリン（１０
μｇ／ml）で補足したトリプトン培地（１０ml）に、接
種する。培養は、３７℃で１５−１８時間３００rpm で
振り回しながら行う。細胞は、遠心によって（ソルバ
ル、ＨＳ−４ローター、４００rpm で１０分間、４℃）
採収する。約１ｇの細胞が得られ、５０mMトリス・塩酸
（pH８．０）（１ml）に再懸濁する。リゾチーム溶液
（０．２５ml）、〔リゾチーム１０mg／５０mMトリス、
塩酸（pH８．０）、リゾチームはシグマから得られた〕
を加え、０℃で１０分間培養後、０．５ＭＥＤＴＡ
（pH７．５）（０．１５ml）加える。

【０１８１】更に０℃で１０分間培養後、２％トリトン
Ｘ−１００（メルク）（６０μｌ)を加える。０℃で３
０分間保持した後、サンプルは、１５０００rpm で３０
分間４℃のもとで、ソルバルＳＡ−６００ローターを用
いて遠心する。上澄みは、フェノール（ＴＮＥで飽和し
た）（１容量）で脱タンパク化する。相を遠心（ソルバ
ルＨＢ−４ローター）によって、５０００rpm で４℃の
もとで、分離する。上相は、クロロホルム（１容量）で
２回抽出する。膵臓のＲＮＡｓｅＡ（シグマ；８５℃で
１０分前−加熱したＴＮＥ１mlに１０mg溶解する）を最
終濃度２５μｇ／mlになるように加え、混合物を３７℃
で４０分間培養する。

【０１８２】溶液を１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０％ポ
リエチレングリコール６０００（フルカ、１２０℃で２
０分間圧熱滅菌する）で調整した後、−１０℃で２時間
培養する。沈澱はソルバルＨＢ−４ローター（０℃のも
とで１００００rpm で２０分間）を用いての遠心によっ
て集め、ＴＮＥ（１００μｌ）に再溶解する。ＤＮＡ
は、フェノール（１容量）で抽出し、ＤＮＡは、エタノ
ール（２容量）で、−８０℃のもとで１０分間沈澱させ
る。沈澱物は、エッペンドルフ遠心機を用いての遠心に
よって集める。ＤＮＡは、０．５mM ＥＤＴＡを含む１
０mMトリス・塩酸（pH７．５）（２０μｌ）に再溶解す
る。ハイブリドプラスミドＤＮＡ（８−１０μｇ）は培
養液（１０ml）から回収される。

【０１８３】Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１は、９つの分
離された交雑ＤＮＡｓの各々で形質転換され、形質転換
した細胞は、前記載のように、（段階４）テトラサイク
リンを含む寒天プレートに平板培養する。各々の形質転
換から、抵抗性クローンをとりあげ、１０ml培養を製造
し、前記載のように培養からハイブリドＤＮＡｓを分離
する。

【０１８４】再形質転換前および後のＤＮＡサンプルの
すべてはＰｓｔＩエンドヌクレアーゼによる開裂および
１mM ＥＤＴＡを含む５０mMトリス−酢酸塩（pH７．
８）における電気泳動によって分析する。すべてのサン
プルは、再形質転換前および後に、同一の開裂パターン
を示す。再クローン化した組み換えＤＮＡ分子の１つ
は、２つの帯を示し、一方はＰｓｔＩ−開裂したｐＢＲ
３２２の移動度をもち他方は、約１０００bpに対応す
る移動度をもつ。それはＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙ
ｃＩＦＮ−１′ｂを意味する。

【０１８５】他の組み換えＤＮＡは３つの帯を示し、一
つは、ＰｓｔＩ−開裂したｐＢＲ３２２の移動度をも
ち、一つは約６００bpの移動度をもち、一つは約１５０
bpの移動度をもつ。このクローンにおける組み換えＤＮ
Ａ分子は、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β
₁を示す。ｄ）クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
１′ｂおよびＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
β₁の特徴クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１′
ｂおよびＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β₁の
組み換えプラスミドＤＮＡｓは、前記載のように（段階
５ｃ）培養から分離され、マックサムとジルバート（４
１）によって報告された方法を用いてｃＤＮＡ挿入のヌ
クオチド配列を確立することによって特徴づけられる。
基本的には、次のアプローチが用いられる：分離された
組み換えプラスミドＤＮＡは、種々の制限エンドヌクレ
アーゼで分解される。酵素は、本質的に供給源（ニュー
イングランドバイオラボ）によって記載されているよう
に（酵素緩衝液において、ＢＳＡをゲラチンによって置
き換えることを除いて）適用する。制限されたＤＮＡを
含む溶液を、フェノール（ＴＮＥで飽和した）で脱タン
パクする。ＤＮＡはエタノールで沈澱させ、５０mMトリ
ス・塩酸（ｐＨ８．０）に、５０μｇ／mlの濃度で再溶
解し、牛腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー）
０．１ユニット／ＤＮＡ５′末端pmole を用いて、３７
℃で３０分間培養する。

【０１８６】酵素は、溶液を６５℃で６０分間加熱する
ことによって不活性化させる。ＤＮＡを、ミューラーら
（４７）によって報告されているようにＤＥＡＥ−セル
ロースクロマトグラフィーによって精製し、エタノール
で沈澱させる。次いでＤＮＡを５′−末端に〔ｒ−
³²Ｐ〕−ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ／m moleアマースハ
ム）でラベルし、マックサムとジルバートによって報告
されているように（４１）Ｔ ₄ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｐ−Ｌ生化学）（ＤＮＡをキナーゼ反応前に変性さ
せないことを除いて）と反応させる。一般的に、比活性
は１−３・１０⁶cpm／p mole ５′−末端になる。

【０１８７】ラベルしたＤＮＡ断片を、第二の制限エン
ドヌクレアーゼで、開裂し、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ
緩衝液における６％、８％または１０％ポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動によって生成物を分離する。ＤＮＡ
断片をゲルから抽出し、ミューラーらによって報告され
た（４７）ように精製する。ヌクレオチド配列の決定の
ために、ＤＮＡ断片を、化学的に分解し、生成物をマッ
クサムとジルバートによって報告された（４１）ように
ポリアクリルアミド電気泳動によって分離する。

【０１８８】特に、クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／Ｈ
ＬｙｃＩＦＮ−１′ｂの単離されたプラスミドＤＮＡｓ
は、次のように処理する。一方において、プラスミドＤ
ＮＡ（５μｇ）を５′末端でラベルしたＢｇ１ IIで分
解し、Ｐｖｕ IIで開裂させる。Ｐｖｕ II−Ｂｇ１
II^*（^*ラベルされた位置を示す）およびＢｇ１ II−
Ｐｖｕ II^*ＤＮＡ断片は、６％ポリアクリルアミドゲ
ルで分離する。他方において、プラスミド（５μｇ）を
５′−末端でラベルしたＡｌｕＩで分解し、Ｐｓｔ
Ｉで開裂させる。ＰｓｔＩ−ＡｌｕＩ^*ＤＮＡ断片
を８％ポリアクリルアミドゲルで分離する。

【０１８９】個々の断片は、順次に分解し、マックサム
とジルバートの報告に基づいて、連鎖させる。得られた
ヌクレオチド配列は、図４に示されている。約２５−３
５デオキシグアノシン残基の伸長は、ｃＤＮＡ挿入の
５′−終末端で先に起こる。示されているヌクレオチド
配列は、いくぶんかゴエテルら〔（１４），バイスマン
（３）〕によって報告されたＩＦＮ−α（Ｆ型）ｃＤＮ
Ａに類似しており、それにもかかわらず、得られるアミ
ノ酸（図４）に影響する多くの明らかな偏位（一点の突
然変異）を示す。

【０１９０】クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ
ＩＦＮ−β₁の分離されたプラスミドＤＮＡを同様の方
法で処理する。プラスミド（５μｇ）をＰｖｕ IIで分
解し、５′−末端でラベル化する。混合物の半分をＰｓ
ｔＩで開裂し、残りはＢｇ１ IIで開裂する。Ｐｓｔ
Ｉ−Ｐｖｕ II^*およびＢｇ１ II −Ｐｖｕ II ^*断
片は、６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によっ
て、分離され、前記載のように分離する。

【０１９１】ヌクレオチド配列（Ｎ−末端配列）は、図
５に示されており、ｃＰＮＡ挿入が、タニグチら（１
７）によって報告されているようにＩＦＮ−β₁ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド信号１０２で開始することを示してい
る。従って、ｃＤＮＡ挿入は、Ｎ−末端で、１１アミノ
酸を欠くヒトＩＦＮ−β₁のためにコード化する力をも
つ。ｃＤＮＡ挿入は、約２０−２５デオキシグアノシン
残基のストレッチ（伸張）によって５′−終末端で攻撃
され、位置１５３で一点の突然変異を示し、得られるア
ミノ酸に影響をすることなくＣをＴ残基に転換する。

【０１９２】ｅ）ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−１′ｂおよびＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−β₁の挿入体に交叉−ハイブリダイズする組み換え
ＤＮＡ分子を含むクローンの同定クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１′
ｂおよびＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β₁の
組み換えプラスミドＤＮＡｓを、前記載（段階５ｃ）の
ように培養から分離する。ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃＩＦＮ−１′ｂプラスミドＤＮＡ（５μｇ）を、
５′−末端でラベルされたＢｇ１ IIで分解し、Ｐｖｕ
IIで開裂させる。一方において、分離したＣＧ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−βプラスミド（５μｇ）
を、５′−末端でラベルしたＰｖｕ IIで分解し、Ｂｇ
１ IIで開裂させる。Ｐｖｕ II−Ｂｇ１ II^*（３５
１bp）ＤＮＡ断片（検体Ａ）およびＰｖｕ II^*−Ｂｇ
１ II（３６８bp）ＤＮＡ断片（検体Ｂ）は、前記載の
ように（段階５ｄ）８％ポリアクリルアミドゲルで分離
し、イン・シトウでコロニーのハイブリダイゼーション
（下記参照）のために用いる。プラスミドＤＮＡｓの制
限、ＤＮＡ断片のラベル化および精製は、前記載（段階
５ｄ）のように同様の方法で行う。

【０１９３】前記載のように（段階４）製造した形質転
換コロニー（４０００）をニトロセルロースフィルター
ＢＡ８５（シュライヒル＆シューエル、８cm直径）に移
す。細胞を溶菌化し、それらのＤＮＡを変性させ、グル
ンスタインとホッグネース（３６）の方法に基づいて、
イン・シトウでフィルターに固定する。検体ＡおよびＢ
（両方の検体を混合する）へのハイブリダイゼーション
は、前記載のように（段階５ｃ）行う。６つの陽性コロ
ニーは、オートラジオグラフィーによって固定され、そ
れら３つは次のようであり：E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −４_1, E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −５₁およびE. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −８₁′ 更に研究のために用いられる。それらのクローンのプラ
スミドＤＮＡｓは、分離され、再形質転換され、前記載
のように（段階５ｃ，５ｄ）のように再分離する。

【０１９４】組み換えＤＮＡｓの挿入の特性を確立する
ために、ＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列（部分的もしく
は完全に）は、前記載（段階５ｄ）のように一般的アプ
ローチを用いることによって明らかにすることができ
る。特に、分離されたプラスミドＤＮＡｓＣＧ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−４₁（５μｇ）およびＣ
Ｇ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８₁′（５μ
ｇ）を、各々５′−未満でラベルしたＰｖｕ IIで分解
し、ＰｓｔＩで開裂する。ＤＮＡ断片を、８％ポリア
クリルアミドゲル上で分画し、８₁′ＤＮＡからＰｓｔ
Ｉ−Ｐｖｕ II^*（〜１２０pb）および４₁ＤＮＡか
らＰｓｔＩ−Ｐｖｕ II^*（８２pb）を例のとおりに
分離する。

【０１９５】分離されたプラスミドＤＮＡＣＧ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５₁を、次のように処理
する。一方においてプラスミドＤＮＡ（５μｇ）を５′
−未満でラベルしたＨａｅ III で分解し、ＰｓｔＩ
で開裂させる。ＰｓｔＩ−Ｈａｅ III ^*（５７bp）
ＤＮＡ断片は、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離す
る。他方において、プラスミド（５μｇ）を５′−未満
でラベルしたＥｃｏＲ・Ｉで分解し、ＰｓｔＩで開裂
させる。ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ^*（２３５bp）および
ＥｃｏＲＩ^*−ＰｓｔＩ（〜７００bp）ＤＮＡは、８
％ポリアクリルアミドゲルで分離する。いろいろのＤＮ
Ａ断片を、マッキサムとジルベルト（４１）による配列
分析をする。

【０１９６】ｃＤＮＡ挿入ヌクレオチド配列を、図６−
８に示す。図６において、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃＩＦＮ−４₁のｃＤＮＡ挿入の部分的配列を示す。
挿入は、２３−デオキシグアノシン残基のストレッチに
よって５′−終未満で攻撃され、ストロイリら（１２）
によって報告されたＩＦＮ−α₂（Ｌｅ）ｃＤＮＡの部
分からなる。３′−エクストラシストロニック領域（ｅ
ｘｔｒａｃｉｓｔｒｏｎｉｃｒｅｇｉｏｎ）におい
て、いくつかの少ない偏位（一点の突然変異）および付
加的３１８ヌクレオチドのストレッチがある。

【０１９７】ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
８₁′のｃＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列は、図７に示
す。挿入は２０−２３デオキシグアノシン残基のストレ
ッチによって５′−終未満で攻撃され、ゴエデルら
〔（１４）、マンタイら（１１）参照〕によって報告さ
れたＩＦＮ−α（Ｄ型）ｃＤＮＡに類似しているが、同
一ではない。前述のｃＤＮＡ領域における相違とは別
に、ひき続いてのＩＦＮコード化配列、ＧＴＣおよびＧ
ＴＧのかわりにアラニンのためにコード化するおよびバ
リンのためにコード化する２８−３０ＧＣＧトリプレッ
トおよび４０９−４１１ＧＣＧトリプットの位置にＩ
ＦＮ遺伝子を含む。結局、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃＩＦＮ−５₁のｃＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列
（図８）は、５′−終未満で、１７デオキシグアノシン
のストレッチを示す。

【０１９８】ヌクレオチド配列は、ゴエデルら（１４）
によって報告されたＩＦＮ−α（Ｂ型）ｃＤＮＡの配列
に関係がある。しかしながら、ＨＬｙｃＩＦＮ−５₁の
５′−終未満に付加的なヌクレオチドがあり、エクスト
ラシストロニック領域において、一点の突然変異、除
去、挿入およびＩＦＮコード化配列において、特に２２
および３６１−３７２の位置に、同様に存在する。

【０１９９】６．ヒトＩＦＮ−特異性組み換えＤＮＡ分
子を含むＥ．ｃｏｌｉによるヒトインターフェロンの合
成ヒトＩＦＮ特異性組み換えＤＮＡ分子を含むことを示す
５つのクローン、すなわちE. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −１′ｂE. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −４₁，E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −５₁，E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −８′_{1 ,}お
よびE. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −β_{1 ,} は、ＩＦＮ活性をテストし、各々は次のような方法で行
う：対応するＥ．ｃｏｌｉクローン（３０ml懸濁液）の
培養は、トリプトン培地で光学的濃度（ＯＤ６５０）１
に増殖させる。細胞を採収し、３０mM塩化ナトリウムお
よび５０mMトリス・塩酸（pH８．０）を含む水溶液
（０．５ml）に再懸濁する。リゾチーム（１mg／ml）
（シグマ）を加える。

【０２００】０℃で３０分間保持した後、凍結（液体窒
素）させ、５回解凍（３７℃で）させ、４℃のもとで、
ＳＳ３４ソルバルローターを用いて２００００rpm で２
０分間遠心する。上澄みを、段階１ｃで記載のようにア
ームストロング（２９）の方法に基づいて、サイトパテ
ックバイオアッセイ（細胞病理的生物活性法）を用いて
ＴＦＮ活性を測定する。次の活性が検出される：抽出材料ＩＦＮ活性組み換えＤＮＡを含むE.coli HB 101 （ＩＵ／ml） CG−pBR 322 ／HLycIFN −１′ｂ０；０ CG−pBR 322 ／HLycIFN −４₁ ０：０ CG−pBR 322 ／HLycIFN −５₁ 10000；10000 CG−pBR 322 ／HLycIFN −８′₁ 100；100 CG−pBR 322 ／HLycIFN −β₁ ０；０測定できないＩＦＮ活性を示すクローンは、ＨｕＣｙＩ
ＦＮ−ｃＤＮＡ挿入が、転写の方向に関連して不適当な
配向にある組み換えＤＮＡｓを含む可能性もある。従っ
て、実物大ｃＤＮＡ挿入を含むこのようなクローン（Ｃ
Ｇ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１′ｂ）の組み
換えＤＮＡは、次のように再配向される：クローンＥ．
ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃＩＦＮ−１′ｂの１プラスミドＤＮＡを、前記載
（段階５ｃ）のように分離し、ＰｓｔＩで開裂する。

【０２０１】開裂したＤＮＡ（０．５μｇ）を２０mMト
リス・塩酸（pH７．８）、１０mM塩化マグネシウム、１
０mM ＤＴＴ、２５mM塩化ナトリウムおよび５０μｇ／
mlゲラチンを含む緩衝液（２０μｌ）中で、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（バイオラボ）（０．２ユニット）および
０．５mM ＡＴＰで、１５℃のもとで２時間反応させ
る。Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１は、前記載のように
（段階４）ｃＤＮＡ混合物で形質転換される。形質転換
されたコロニーは、テトラサイクリンで補足したマック
・コンケイ寒天プレートで選択し、ニトロセルロースフ
ィルターに、レプリカ−平板化する。

【０２０２】組み換えＤＮＡＣＧ−ｐＢＲ３２２／
ＨＬｙｃＩＦＮ−１′ｂ（段階５ｅ）の³²Ｐ−ラベルＰ
ｖｕ II−Ｂｇ１ II^*断片（３５１pb）にハイブリダ
イズする４−バクテリア、コロニーは、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
１′ｂ₁−１′ｂ₄に示めされる。４・クローンの抽出
物は、前記載のように、ＩＦＮ活性のために準備され、
テストされる。次の活性が検出される：抽出材料ＩＦＮ活性組み換えＤＮＡを含むE.coli HB 101 （ＩＵ／ml） CG−pBR 322 ／HLycIFN −１′ｂ₁ ０；０ CG−pBR 322 ／HLycIFN −１′ｂ₂ ０：０ CG−pBR 322 ／HLycIFN −１′ｂ₃ ０；０ CG−pBR 322 ／HLycIFN −１′ｂ₄ ３０；３０プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
１′ｂ₄は、ＩＦＮ活性をもつポリペプチドの合成を方
向づけることのできるｃＤＮＡ挿入を含む。

【０２０３】７．ＩＦＮ活性をもつポリペプチドの高レ
ベル生成のできる組み換えプラスミドの構成およびそれ
らのプラスミドをもつＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の形
質転換Ａ．ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１組み換
えプラスミドの構成クローンＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ
３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１′ｂ，のＩＦＮ特異性タン
パク収量を改良するために、図９に系統的に示めしたよ
うに次の作成が行われる。

【０２０４】ａ．ｃＤＮＡ挿入の製造クローンＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ
３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１′ｂの組み換えプラスミド
ＤＮＡ（１５０μｇ）を標準法（段階５ｄ）を用いてＰ
ｓｔＩ（バイオラボ）で開裂させる。次いでフェノー
ルで抽出し、エタノールで沈澱させ、除去された挿入
は、５０mMトリス・塩酸（pH８．０）および１mM ＥＤ
ＴＡを含むシュクロース、デンシティグレディエント遠
心（５−２３％）によって分離する。遠心は、１５℃の
もとでＴＳＴ４１ローター（コントロンＡＧ）を用い
て、３５０００rpm で１６時間行う。

【０２０５】各々の画分（０．３ml）をＩＳＣＯグレデ
ィエントコレクターを用いて１ml／分の速度で集める。
小さい断片を含む画分（例・挿入体）は、プールする。
ＤＮＡをエタノールで、例のように沈澱させ、沈澱物は
０℃のもとで、ＨＢ−４ローター（ソルバル）を用い
て、１００００rpm で１０分間遠心することによって集
める。沈澱物は、１０mMトリス・塩酸（pH７．５）およ
び０．０５mM ＥＤＮＡを含む緩衝液（６０μｌ）に再
溶解する。ＤＮＡ（３０μｇ）は、光学的濃度を測定す
ることによって決定され、回収される。

【０２０６】挿入ＤＮＡ（１０μｇ）を、Ｈａｅ III
（バイオラボ）で分解し、断片は５０mMトリス、５０mM
ホウ酸、１mM ＥＤＴＡおよび０．５μｇ／mlエチジウ
ムブロマイドを含む溶液における２％アガロースゲル上
で分画化する。最も大きいＤＮＡ断片、Ｈａｅ III −
ＰｓｔＩ（８６９bp）およびＨａｅ III −ＨａｅII
I （８２bp、図９参照、断片３および４）は各々ゲルか
ら切り取り、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０mMトリス
・塩酸（pH８．０）、１mM ＥＤＴＡを含む溶液（５m
l）中に注射器のついた細い針を通じて噴出させ、一夜
振とうすることによって溶出する。

【０２０７】溶出液は、ＤＮＡを吸着させるために１０
０μｌＤＥ−５２（ホワトマン）パスツールピペットカ
ラムを通過させる。カラムを同じ緩衝液（２ml）で洗浄
し、ＤＮＡを１．５Ｍ塩化ナトリウム、５０mMトリス
（pH８．０）および１mM ＥＤＮＡを含む溶液（４００
μｌ）で溶出する。ＤＮＡは、エタノール（２容量）で
−２０℃のもとで一夜沈澱させる。沈澱物を、エッペン
ドルフ遠心機での遠心によって集める。

【０２０８】Ｈａｅ III −Ｈａｅ III ＤＮＡ断片
（８６pb）は、再溶解し、Ｓａｕ３Ａ（バイオラボ）
で分解する。酸素は６５℃もと３０分間で熱−不活性化
する。Ｈａｅ III −ＰｓｔＩＤＮＡ断片（８６９
bp）（１μｇ）を加え、溶液を１０mM塩化ナトリウム、
１０mM ＤＴＴおよび０．５mM ＡＴＰで調整し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）（３０ユニット／μ
ｌ）、反応容器に加える。溶液を、１５℃のもとで１０
時間培養する。

【０２０９】次いでフェノールおよびクロロホルムで抽
出し、混合物を、エチジウムブロマイドの存在下に、ト
リス−ホウ酸−ＥＤＴＡにおける２％アガロースゲル上
で分画化する。Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片
（図９参照、断片５）は前記載のように抽出され、エタ
ノールで沈澱させ、１０mMトリス・塩酸（pH７．５）お
よび０．０５mM ＥＤＴＡを含む溶液（１０μｌ）に再
溶解する。

【０２１０】ｂ．ｐＢＲ３２２のβ−ラクトア（ラク
タ）アマーゼ調整領域（ＡｐＰｒ）を含むＤＮＡ断片の
製造プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔＩ（段階３ｂ）で
開裂し、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１（ベネスダ、
リサーチ、ラボ）（４ユニット／ml）で３０℃のもとで
４−１０分間、β−ラクトアマーゼコード化断片を除去
するために処理する。

【０２１１】式５′−ＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡ
Ｔ−３′の化学的ＤＮＡリンカーは、前記載（段階５
ａ）の方法を用いて合成される。リンカーは、好都合に
連結することによってＢａｌ３１処理したｐＢＲ３
２２ＤＮＡに加える。得られるハイブリド分子を、制
限エンドヌクレアーゼＢｃＩ（バイオラボ）およびＥ
ｃｏＲＩで開裂させる。分解した生成物は前記載のよう
に（段階２ａ）トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡにおける８％
ポリアクリルアミドゲルで分画する。ＤＮＡ断片（Ａｐ
ＰｒＤＮＡ断片）は１８４bpおよび２３４bpマーカー
ＤＮＡｓの間に移動し、前記載のように（段階７ａ）分
離され、例のようにエタノールで沈澱させる。沈澱物は
１０mMトリス・塩酸（pH７．５）および０．０５mM Ｅ
ＤＴＡを含む溶液に再溶解する。

【０２１２】ｃ．ＡｐＰｒＤＮＡ断片のｃＤＮＡ挿入
への連結およびプラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌｙ
ＩＦＮ−α−１の製造ＡｐＰｒＤＮＡ断片およびｃＤＮＡ挿入を含む溶液を
プールする。混合物を１０mM塩化マグネシウム、１０mM
ＤＴＴおよび０．５mM ＡＴＰで調整し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（バイオラボ）（３０ユニット／μｌ）で、
１５℃のもとで１２時間培養する。次いでフェノールお
よびクロロホルムで抽出し、混合物を０．１％低融解す
るアガロースゲル（バイオラド）で分画化する。得られ
たＡｐＰｒ−ｃＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ（バイオラ
ボ）およびＥｃｏＲ（バイオラボ）で次の操作で開裂し
た大きな断片に加える。

【０２１３】ＡｐＰｒｃＤＮＡ断片（約２０μｌ）を
含むゲル部分を、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片と混合し、６５℃のもとで２分間融解し、３
７℃に冷却し、０．５mM ＡＴＰ、１０mM ＤＴＴ、お
よび１０mM塩化マグネシウムで調整し、組み換えプラス
ミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１を含む
溶液を得るために、１２時間、１５℃のもとでＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（バイオラボ）（３０ユニット／μｌ）で
培養する。

【０２１４】ｄ．プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ
ｙＩＦＮ−α−１をもつＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の
形質転換１００mMトリス・塩酸（pH７．５）、１００mM塩化カル
シウム、および１００mM塩化マグネシウムを含む溶液１
／１０に、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−１を含む溶液に加える。合わせた溶液を、１０
分間、６５℃で、リパーゼで不活性化し、３７℃のもと
で冷却する。溶液を、前記載（段階４）のようにＣａ⁺⁺
処理したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１に形質転換するた
めにとり、テトラサイクリン１０μｇ／mlで補足したマ
ックコンケイ寒天プレートに平板化する。

【０２１５】形質転換したコロニーは、ＩＦＮ活性（段
階６）のためにスクリーンする。ＩＦＮ活性の最も高い
レベルを生成するクローンを選択し、Ｅ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１
を企図する。原クローンＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１
ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１′ｂに比し
て、１３００倍刺激を示す、４００００（ＩＵ／ml）の
活性が、検出される。

【０２１６】クローンＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−１の組み換えプラスミドＤＮＡは、前記載のよ
うに（段階３ｃ）培養から分離し、ｃＤＮＡ挿入（ＩＦ
Ｎ遺伝子）のヌクレオチド配列およびβラクトアマーゼ
調節領域を確立することによって特徴づけられる。結果
を図１０にまとめて示す。Ｂ．組み換えプラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）ＬｙＩＥ
Ｎ−α３クローンＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ
３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８′₁のＩＦＮ特異性タンパ
ク収量は、次のように改良される（図．１１）：ａ．ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１からβ
−ラクトアマーゼ調節領域を含むＤＮＡ断片の製造ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１（１００
μｇ）を、ＨｉｎｄIII （バイオラボ）およびＢｇ１
（II）（バイオラボ）で開裂させる。次いでフェノール
抽出およびエタノール沈澱、切断除去したＤＮＡ断片
を、５０mMトリス・塩酸pH８．０および１mM ＥＤＴＡ
を含むシュクロースデンシティグレディエント遠心（５
−２３％）によって分離する。遠心は、ＴＳＴ６０ロ
ーター（コントロンＡＧ）を用いて５８０００rpm で１
５℃のもとで４時間行う。各画分（０．２ml）を前記載
のように集める。小さな断片（Ｈｉｎｄ III −ＢｇＩ
II）を含む画分は、プールし、ＤＮＡを、エタノールで
例のように沈澱させる。沈澱物を１０mMトリス・塩酸
（pH７．５）および０．０５mM ＥＤＴＡを含む２０μ
ｌに再溶解する。

【０２１７】ｂ．ｃＤＮＡ挿入の製造ｃＤＮＡ挿入は、前記載のように（７ａ章）ＰｓｔＩ
で、組み換えプラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙ
ｃＩＦＮ−８′₁から切断除去する。ｃＤＮＡ挿入（２
μｇ）をＳａｕ３Ａ（バイオラボ）（２．５ユニッ
ト）、臭化エチル（１０mM／ml）中で分解し、３７℃で
６０分間培養する。分解物（消化物）を、フェノールで
抽出し、ＤＮＡをエタノールで前記載のように沈澱させ
る。ＤＮＡ断片は、５０mMトリス、５０mMホウ酸、１mM
ＥＤＴＡおよび０．５μｇ／mlエチジウム・ブロマイ
ドの溶液における１．２％アガロースゲルで分画化す
る。

【０２１８】第二の最も大きいＤＮＡ（Ｓａｕ３Ａ−
ＰｓｔＩ：６９３bp）をゲルから抽出し、７ａ）章記
載のように精製する。ＤＮＡを１０mMトリス−塩酸（pH
７．５）および０．０５mM ＥＤＴＡを含む溶液（２０
μｌ）に再溶解する。ｃ．ｃＤＮＡ挿入（Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ）へのＨ
ｉｎｄ III −Ｓａｎ３ＡＤＮＡ断片の連結両方のＤＮＡ断片（〜５０ng）の等量を、１０mM塩化マ
グネシウム、１０mMＤＴＴ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（バ
イオラボ）（３０ユニット／μｌ）を含む０．５mM Ａ
ＴＰに加え３時間、１５℃のもとで、培養する。混合物
を、８０℃で１５分間培養し、５０mM塩化ナトリウムで
調整する。ＤＮＡ混合物を、ＰｓｔＩ（バイオラボ）
（０．５ユニット）およびＨｉｎｄ III （バイオラ
ボ）（１ユニット）で２０分間、３７℃で分解させる。
ＤＮＡは、フェノール抽出し、エタノールで沈澱させ、
１０mMトリス・塩酸（pH７．５）および０．０５mM Ｅ
ＤＴＡからなる液（２０μｌ）に再溶解する。

【０２１９】得られた混合物の１／２は、１０mM塩化マ
グネシウム、１０mM ＤＴＴ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（バ
イオラボ）（３０ユニット／μｌ）を含むＡＴＰにおけ
るプラスミドｐＢＲ３２２（〜１００ng）の大きいＨ
ｉｎｄ III −ＰｓｔＩＤＮＡ断片に加え、２時間、
１５℃のもとで、組み換えプラスミドＣＧ−ｐＢＲ（Ａ
Ｐ）／ＬｙＩＦＮ−α−３を含む溶液を得るまで、連結
化させる。

【０２２０】ｄ．プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ
ｙＩＦＮ−α−３をもつＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の
形質転換前記の１／１０溶液は、段階４）に記載のようにＥ．ｃ
ｏｌｉＨＢ１０１を形質転換するために用いる。形
質転換したコロニーは、前記載のようにＩＦＮ活性のた
めのテストに用いられる。

【０２２１】ＩＦＮ活性の最も高いレベルを生成するク
ローンを選択し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−
ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３を企図する。ＩＦ
Ｎ活性を、前記載のように（段階６）測定する。原クロ
ーンＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２
／ＨＬｙｃＩＦＮ−８′₁に比して７００倍刺激を示
す。７００００（ＩＵ／ml）の活性が検出される。

【０２２２】クローンＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−３の組み換えプラスミドＤＮＡは、前記載（段
階３ｃ）のように培養から分離され、ｃＤＮＡ挿入のヌ
クレオチド配列およびβ−ラクトアマーゼ調節領域の確
立によって、特徴づけられる。結果を図１２にまとめて
示す。プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−
α−３のための構成（作成）プロトコールは、すべての
α−ＩＦＮｃＤＮＡ遺伝子に対して用いることがで
き、または適当に、一般的にクロマトゾームα−ＩＦＮ
遺伝子を切断することもできる。

【０２２３】たとえば、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２
２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５₁から開始して、プラスミドＣ
Ｇ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−２が、プラスミ
ドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３に対して
記載されたと同様の方法で得られる。この新しいプラス
ミドは、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５ ₁
のＤＮＡ挿入、およびＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−１からのβ−ラクトアマーゼ調節領域を含む。
前記載のように、企図されたクローン、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α
−２を選択する。原Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ
−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５ ₁に比して、５
倍刺激を示す。５００００（ＩＵ／ml）のＩＦＮ活性が
検出される。ｃＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列およびプ
ラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−２の
β−ラクトアマーゼ調節領域は、前記載のように確立さ
れ、図１３に示す。

【０２２４】８．Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−
ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３株の発酵規模での
培養Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／
ＬｙＩＦＮ−α−３株は、１溶液につき次の成分を含む
培地番号Ｘで培養する：リン酸１水素ナトリウム・７結晶水１３．２５ｇリン酸２水素カリウム３．０塩化ナトリウム０．５塩化アンモニウム１．０塩化カルシウム・２結晶水０．０１５硫酸マグネシウム・７結晶水０．２５クエン酸鉄（III) ０．００６カスアミノ酸１８．０酵母抽出物２．０セレロース８．０テトラサイクリン０．０１培地集団とは別に、セレロースおよびテトラサイクリン
は、加熱滅菌および殺菌ろ過で各々殺菌する。培地番号
Ｘの５００mlを含む３つの２ｌ−振とうフラスコ中に、
良く増殖した寒天プラントから細胞を接種する。振とう
フラスコを４つのバッスル装置をし、３０℃のもとで、
１１時間回転振とう培養をする。

【０２２５】この前培養の１．５ｌを培地番号Ｘの３０
０ｌを含む５００ｌ発酵のバッフルに移し、次の条件下
で培養する：振とう３５０−５００rpm （平板な翼ター
ビン）通気速度０．３−１．０ｌ／１ｍｉｎ、発酵上部
圧０．３bar 、温度３０℃、溶解した酸素のレベルは、
通気速度を増加させることによって５０％飽和以下に落
ちることから妨げられ、必要に応じて、振とう速度を最
大値にすることができる。

【０２２６】pHは、水酸化ナトリウムを添加することに
よって６．８以上に調整する。約１０時間の培養後、培
養は最大インターフェロン滴定値に達し〔アームストロ
ング（２９）の方法によって測定〕、採収する。９．ＨＬｙＩＦＮ−α−３の分離および精製ａ）モノクローン抗体カラムのためのポリペプチド製造 pH７．２の培養肉汁（２８０ｌ）を１０℃に冷却し、細
胞をＡｌｆａ−ＬａｖａｌＢＲＰＸ−２０７ｄｅ−
Ｓｌｕｄｇｅｒを用いて分離する。上澄みは、ＩＦＮ−
活性を示さない。集める前に、細胞塊は、ｄｅ−Ｓｌｕ
ｄｇｅｒの固いボウル内に集積し、上澄みを、２０ｌ溶
菌化（溶解化）緩衝液〔５０mMトリス・塩酸、５０mM
ＥＤＴＡ、０．２Ｍ塩化ナトリウム、１mM ＰＭＳＦ
（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１mM Ｌ
−システィンを含む液を塩酸でpH８．２に調整する〕に
移し、遠心ボウルの中味（７ｌ）を全−ｄｅ−Ｓｌｕｄ
ｇｉｎｇで排出する。

【０２２７】ｄｅ−Ｓｌｕｄｇｅｒを、３回溶菌化緩衝
液Ａで洗浄する。得られた細胞塊は、緩衝液Ａで調整し
て２０ｌにし、pH６．９にする。５−１０℃に冷却後、
懸濁液を、ポリウレタン振とうデスクおよび１１７０ml
ガラス球（直径０．５−０．７５mm）を用いて、振とう
速度３３５０r.p.m 、供給速度５ｌ／ｈで、ＤＹＮＯ登
録商標−ミル（型ＫＤＬ−Ｐｉｌｏｔ，１．４１）を通
過させ、細胞を破壊する。溶菌化緩衝液Ａ（８００ml）
（ポリエチレンイミン１００ｇを加えて塩酸でpH８．２
に調整する）を破壊した細胞の懸濁液に２℃もとでおだ
やかにかきまぜながら加える。約pH７．６の懸濁液は、
３時間−２℃に冷却し、遠心する。

【０２２８】上澄み液（１７．２ｌ）に硫酸アンモニウ
ム（３０２８ｇ）加える。かすかに混濁した混合物を、
６℃で一時間放置した後、遠心する。上澄み液を硫酸ア
ンモニウム（４３２４ｇ）加え、一夜放置した後、３０
００rpm で遠心する。湿った遠心化物（約１２２４ｇ）
は、緩衝液Ｂ（２５mMトリス・塩酸に１０μＭＰＭＳ
Ｆを加えて塩酸でpH８．５に調整する）に望ましいペプ
チドを含む液（２８００ml）を得るために溶解する。

【０２２９】ポリペプチド溶液７００mlを、室温で緩衝
液Ｂ（７ｌ）を用いて、アミコンＤＣ−２ホローフィー
バーシステム（ＡｍｉｃｏｎＤＣ−２，Ｈｏｌｌｏｗ
ＦｉｂｒｅＳｙｓｔｅｍ）によって、ＨＩＰＩＯホロ
ー・フィルター・カートリッジを通して分離ろ過する。
フィルターカートリッジ緩衝液Ｂで洗浄し、分離ろ過し
た液と洗浄液を合わせて（１４４０ml）、前もって緩衝
液Ｂで平衡化した４５０mlのベット容積のＤＥＡＥカラ
ム（トリサクリル登録商標ＭＤＥＡＥ，ＬＫＢ２２
０５−３００）に、流速２００ml／ｈで、通過させる。

【０２３０】２８０nmでＵＶ吸収をもつ第１ポリペプチ
ド画分は捨てる。カラムを更に緩衝液Ｂで、少なくても
５倍のベット容量が、２８０nmでベースライン吸収をも
つまで洗浄する吸着されたポリペプチドを、緩衝液Ｃ
（０．２Ｍ塩化ナトリウム、２５mMトリス・塩酸、pH
８．５）で溶出する。カラムクロマトグラフィーは、４
℃で行う。溶出液はアームストロング（２９）の方法に
よって測定し、ＩＦＮ活性１・４・１０⁵ＩＵ／mgポリ
ペプチドを示す。溶出液は、２Ｍ塩酸でpH７．４に調整
し、液（１００ml）は、モノクロナル抗体カラムに使用
するまで、−２０℃もとで、凍結しておく。

【０２３１】ｂ）モノクロナル抗体カラムでのヒトＬｙ
ＩＦＮ−α−３の精製モノクロナール抗体カラム１Ｋ２−２０（ベッド容積
０．８ml下記参照）をＰＢＳ（リン酸−緩衝化塩化ナト
リウム：０．１３７Ｍ塩化ナトリウム、０．００２７Ｍ
塩化カリウム、０．００７７Ｍリン酸１水素ナトリウム
・１２結晶水、０．００１５Ｍリン酸２水素カリウム、
pH７．４）で平衡化し、前記ポリペプチド溶液（１０m
l）をこのカラムに、室温のもとで、流速１０ml／ｈで
適用する。

【０２３２】吸収されないポリペプチドを含む最初の画
分およびＰＢＳ洗浄液（３ml）を捨てる。更に非特異性
結合ポリペプチドを、付加的０．５Ｍ塩化ナトリウムお
よび０．２％トリトン×１００を含むＰＢＳ（３ml）で
溶出する。カラムをＰＢＳ（３ml）で洗浄し、特異的に
吸収したポリペプチドを、緩衝液Ｄ（０．１Ｍクエン
酸、０．３Ｍ塩化ナトリウム、pH２）（３ml）で溶出す
る。この画分と続いてのＰＢＳ−洗浄液を合わせて、２
Ｎ水酸化ナトリウムでpH６．３に調整し、４℃のもとで
液浸用−ＣＸ^TM分子分離器（ミリポレ登録商標）を用い
て１０倍に濃縮する。濃縮液を、０．０２５Ｍヒスチジ
ン・塩酸pH６．３で平衡化したセファデックスＧ−２５
ファインカラム（２．６×３４cm ,２００mlベット容
積）に、適用する。

【０２３３】４℃のもとで、カラムは、流速４２ml／ｈ
で、０．０２５Ｍヒスチジン・塩酸pH６．３で溶出し、
各々の画分（１０．５ml）で２０画分を集める。ポリペ
プチドを含む画分を、２８０nmでの吸収で検査する。画
分７および８にアームストロング（２９）の方法によっ
て検査されるようにＩＦＮ活性をもつポリペプチドが含
まれる。ＬｙＩＦＮ−α−３を含む活性画分を、更に使
用するまで−２０℃で保存し、または氷浴におく。画分
のＩＦＮ活性は、１・８・１０⁸ＩＵ／mgポリペプチド
（２９）である。

【０２３４】前記画分を凍結乾燥することによって、１
ml溶液からポリペプチド（２０−４０μｇ）が得られ
る。得られたＬｙＩＦＮ−α−３のＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動〔（４９）参照〕の結果は、分子
量、約１８ｋダルトンであることを示す。ポリアクリル
アミドゲル（１００μＭ）上でウルトラ薄層等電性フォ
ーカスでpH４．５−６．５の範囲内で、Ｂ．Ｊ．ラドラ
（５０）に方法に基づいて行い、純粋な活性ヒトＬｙＩ
ＦＮ−α−３の５．３−５．４pHユニットの等電点を示
す。

【０２３５】ｃ）モノクロナル抗体カラム１Ｋ２−２０
の製造（Ａ）マウスの免疫法Ｂａｌｂｌｃマウス（８週目、シッセルン動物農場、ス
イス）に、ヒト白血球ＩＦＮの（純度１％）の３×１０
⁵ユニット〔完全なフロイドの補助剤（デフコ）におい
て、４フートパット（ｆｏｏｔｐａｄｓ）に配分し
て〕を注入する。３０日目に、不完全なフロイド補助剤
におけるＩＦＮの同量を、同様の方法で注入する。第三
の注入は、８５日目に行われ、塩化ナトリウムにおける
ヒト白血球ＩＦＮの４×１０⁵ユニットを腹腔内に注入
する。四日後に、脾臓は融合のためにとり出される。

【０２３６】（Ｂ）ハイブリドマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａ）の製造Ｘ６３−Ａｇ８−６５３ミエロマ系列（５２）を用いて
のすべての融合実験は、ケーラーとミルスタイン（５
３）の方法に基づいて、５０％ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ１５００，セルバ）の１mlに１０⁸脾細胞と１
０⁷ミエロマ（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞を混合することに
よって（５４）、本質的に行われる。洗浄後、細胞を、
標準ドルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ）最小エキス培地
（キブコＧｉｂｃｏ）４８mlに再懸濁する。

【０２３７】融合につき１５％胎子牛血清および正常マ
ウス腹腔浸出細胞（３×１０⁶）を供給細胞として加え
る。細胞を４８×１mlコスター、ウイル（ｃｏｓｔａｒ
ｗｅｌｌｓ）に分配する。培養に週に二回、標準選択
培地（５３）を３−６週間供給する。雑種が増殖した
後、凍結し、上澄み液は下記載のように抗−ＩＦＮ活性
の検査をする。雑種細胞（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌ
ｌｓ）のクローニングは、ミクロー滴定（ｍｉｃｒｏｔ
ｉｔｅｒ）プレートにおける希釈の限界によってなされ
る。

【０２３８】（Ｃ）抗体分析（検査）ＩＦＮ−α（最終１０−２０ユニットＩＮＥ／ml）の上
澄み（５μｌ）の抗−ＩＦＮ活性のテストのために、室
温のもとで、培養上澄み（５０μｌ）と培養し、３０−
６０分後ＩＦＮの残余活性を、標準ＩＦＮ分析法によっ
て、テストする。この方法は、好都合な抗体のために、
失敗したか、もしくはハイブリド又は上澄みの分析のた
めに非再現性の結果を与えるかにとって具合いが良い。
次の組み合わせ免疫−沈降（沈澱）−生物検査は、この
目的のために開発した。

【０２３９】粗ＩＦＮ−α（１０⁴Ｕ／ml）５０μｌを
同量の培養上澄みと混合（マイクロチューブ３８１０中
で、エッペンドルフ）し、混合物は、２−４時間３７℃
で培養する。次いで、先に滴定したラビット抗−マウス
Ｉｇ抗体（ノルディク）５０μｌを加え、混合物を、は
じめ３７℃で１時間、次いで４℃のもとで１６時間免疫
コンプレックスが生成するまで培養する。チューブは５
分間冷室内で１２，０００rpm で遠心する。上澄みをと
り、沈澱は、一度緩衝化塩化ナトリウムpH７．２（１m
l）、で洗浄する。洗浄後、沈澱を塩化ナトリウム液pH
２．２（２００μｌ）に再溶解する。ＩＦＮ活性はアー
ムストロング（２９）の方法に基づいて測定する。

【０２４０】（Ｄ）腹水液から分離した抗−ＩＦＮ抗体
の精製。Ｂａｌｂｌｃマウスに、前もって腹腔内にプリスタン
０．４ml（カールルス）を注入する。一週間後、マウス
に腹腔内にハイブリドマ細胞を注入する。腹水液をくり
返し、各々のマウスから採液する。液は、プールし、−
８０℃で凍結する。上部の脂肪は吸い上げて捨てて、残
破片物（デブリス）のない上澄みは、とっておく。必要
な場合、遠心をくり返す。粗イムノグロブリン画分は、
室温のもとで腹水液を１８％硫酸ナトリウム沈澱させる
ことによって得られる。

【０２４１】次いで、この画分をセファアクリルＧ２０
０（ファーマシア）にかけファーマシアによる指示どお
りに０．１Ｍトリス・塩酸緩衝液pH８．２を用いて溶出
する。活性画分をプールし、アミコンＸＭ５０フィルタ
ー（アミコン）で濃縮する。タンパクは、２８０nmで１
cmのキュベットを使用して、タンパク１mgで１．２吸収
になるように調整して、ＯＤ２８０で測定する。

【０２４２】（Ｅ）免疫吸収カラム１Ｋ２−２０安定させたアフィーゲル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ）１０（バ
イオーラド）１mlに、バイオーラドの指示に従って、モ
ノクロナル抗−ＩＦＮ抗体のイムノグロブリン（１５ｉ
ｎｇ）とカップリングさせる：アフィーゲル１００は、
ガラスで接続した漏斗上で冷蒸留水、次いで０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム液pH８．０（カップリング緩衝液）で
洗浄する。カップリング緩衝液における５０％ゲルを、
プラスチックチューブに移し、同量の精製した抗体溶液
と混合し、４時間室温で回転させる。

【０２４３】カップリング後、ゲルをカップリング緩衝
液で洗浄し、未反応位置をしゃ断するために、ゲルmlに
つき１Ｍエタノールアミン−塩酸（pH８．０）０．１ml
と、室温のもとで反応させる。ゲルは、１０mM三窒化ナ
トリウムの存在下で、リン酸−緩衝化塩化ナトリウムで
洗浄し、４℃で保つ。得られるゲル０．８mlは、ヒトＬ
ｙＩＦＮ（上記参照）の製造のために使用するモノクロ
ナル抗体カラム（１Ｋ２−２０）製造のために用いる。

【０２４４】１０．医薬用製造（非経口的投与）リンパ芽球インターフェロン（２mg）、たとえば、１・
８・１０⁸ユニット／mgの特異活性をもつクローンＥ．
ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌｙ
ＩＦＮ−α−３（例９参照）から分離したＬｙＩＦＮ−
α−３を５Ｎヒト血清アルブミン（３０ml）に溶解す
る。得られる溶液を細菌学で用いられるフィルタを通過
させ、ろ液を無菌条件下に、精製したリンパ芽球インタ
ーフェロン各々３．６×１０⁶ユニットを含む１００バ
イヤルに分ける。このバイヤルは非経口投与に適してお
り、好ましくは冷暗所（例−２０℃）に保存する。

【０２４５】同様の操作で、７．２×１０⁶もしくは
１．０×１０⁷ユニットを含むバイヤルを、各々上記の
リンパ芽球インターフェロン４もしくは６mgを用いて製
造することも可能である。

【０２４６】準備された微生物の保管ここで記載された方法によって製造された組み換えＤＮ
Ａ分子および微生物は、培養によって例示され、農学研
究培養コレクション（ＮＲＲＬ）（１９８１年９月１４
日）の培養コレクションにおいて保管されており、次の
継承番号が割り当てられている。

【０２４７】E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN
−β₁：NRRL B−12528E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −４₁：NRRL
B−12529E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −１′ｂ：NR
RL B−12530E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −５₁：NRRL
B−12531E. coli HB 101 CG−pBR 322 ／HLycIFN −８′₁：NR
RL B−12532

【０２４８】参考文献１．Ｗ．Ｅ．スチュワート，II，インターフェロンシス
テム、スプリンガー出版社、ビエンナ（１９７９）２．インターフェロンノメンクラチャー、Ｎａｔｕｒｅ
２８６巻、１１０ページ（１９８０）３．Ｃ．ヴェイスマン“ＤＮＡ配列、組み換えＤＮＡ分
子およびヒトインターフェロン−様ポリペプチド生成の
ための方法”ヨーロッパ特許出願番号３２１３４（バイ
オケンＮ．Ｖ．）４．Ｅ．Ａ．ハベルら、“ヒトリンパ芽球（ナマルバイ
ンターフェロンの特性”、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３
８巻、５１−５９ページ（１９７７）５．Ａ．Ｄ．サーガルら、“センダイウィルス−誘発ヒ
トリンパ芽球（ナマルバ）細胞およびニューキャスル病
ウィルス−誘発ムリン線維芽（Ｌ）細胞の異質性”、Ｎ
ｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９巻、１４９−１６０ペ
ージ（１９８１）６．Ｍ．ルベンスタインら、“ヒト白血球インターフェ
ロン生成、同質性への精製および第一の特徴”、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６巻、６４
０−６４４ページ（１９７９）

【０２４９】７．Ｗ．Ｅ．スチュワート、IIら“ヒト白
血球インターフェロンの生成および特性についてのグリ
コシル化阻害剤の影響”、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９７巻、
４７３−４７６ページ（１９７９）８．Ｋ．Ｃ．ゾーンら、“ヒトリンパ芽球細胞インター
フェロンの主な成分のアミノ末端排列”、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２０７巻、５２７−５２８ページ（１９８０）９．Ｓ．Ｎ．コーエンおよびＨ．Ｗ．ボイヤー“生物学
的に機能のある分子キメラス（ｃｈｉｍｅｒａｓ）生成
のための方法”米国特許番号４，２３７，２２４（レラ
ンドスタンフォードＪｒ．大学）１０．Ｓ．ナガタら、“ヒト白血球インターフェロン活
性をもつポリペプチドのＥ．ｃｏｌｉにおける合成”、
Ｎａｔｕｒｅ２８４巻、３１６−３２０ページ（１９
８０）１１．Ｎ．マンタイら、“クローン化したヒト白血球イ
ンターフェロンとＤＮＡのヌクレオチド配列”、Ｇｅｎ
ｅ１０巻、１−１０ページ（１９８０）１２．Ｍ．ストロイリィら、“少なくとも三つのヒトα
型インターフェロン：α２の構造”、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２０９巻、１３４３−１３４７ページ（１９８０）

【０２５０】１３．Ｄ．Ｖ．ゴエデルら、“Ｅ．ｃｏｌ
ｉによって生成されたヒト白血球インターフェロンは生
物学的に活性がある”、Ｎａｔｕｒｅ２８７巻、４１
１−４１６ページ（１９８０）１４．Ｄ．Ｖ．ゴエデルら、“８つの明らかなクローン
化したヒト白血球インターフェロンｃＤＮＡｓ”Ｎａｔ
ｕｒｅ２９０巻、２０−２６ページ（１９８１）１５．Ｊ．クローネベルグら、“ヒトインターフェロン
のアミノ酸配列をもつ微生物学的に合成されたポリペプ
チド、ＤＮＡおよびプラスミド、この配列のためにコー
ド化された微生物、それはこの遺伝情報を含むおよびそ
の合成方法”ヨーロッパ特許出願番号３４３０７（ヒェ
ーヒストアクチェンゲゼルシャフト）：１６．Ｈ．スガノら、“新規なＤＮＡ、クローン化した
ＤＮＡ，ＤＮＡを含む組み換えプラスミド、組み換えプ
ラスミドを含む微生物およびそれらの生成のための過
程”ヨーロッパ特許出願番号２８０３３（日本癌研究財
団）

【０２５１】１７．Ｔ．タニグチら、“ヒト線維細胞イ
ンターフェロンｃＤＮＡのヌクレオチド配列”Ｇｅｎｅ
１０巻、１１−１５ページ（１９８０）１８．Ｒ．デルイニクら、“ヒト線維芽細胞インターフ
ェロン遺伝子の分離および構造”、Ｎａｔｕｒｅ２８
５巻、５４２−５４７ページ（１９８０）１９．Ｄ．Ｖ．ゴエデルら、“Ｅ．ｃｏｌｉによるヒト
線維芽細胞インターフェロンの合成”、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓＲｅｓ．８巻、４０５７−４０７５ページ（１
９８０）２０．Ｍ．レベルら、“遺伝子工学によるインターフェ
ロンの生成”英国特許出願番号２，０６３，８８２（イ
エダ研究および開発会社）２１．“ヒトインターフェロンに類似のタンパク質を発
現するための遺伝子、誘導されたプラスミド組み換えお
よび修正されたバクテリア細胞”ベルギー特許番号８８
７，３９７（シィーレ＆Ｃｏ．）２２．Ｊ．グローネベルグら、“ヒトインターフェロン
のアミノ酸配列をもつ微生物学的に合成されたポリペプ
チド、ＤＮＡおよびプラスミド、この配列のためにコー
ド化した微生物、それはこの遺伝情報を含みおよびそれ
らの合成方法”ヨーロッパ特許出願番号３４３０６（ヒ
エーヒストアクチェンゲゼルシャフト）

【０２５２】２３．タニグチら、“ヒト白血球および線
維芽細胞インターフェロンは構造的に関係がある”Ｎａ
ｔｕｒｅ２８５巻、５４７−５４９ページ（１９８
０）２４．Ｍ．Ｄ．ジョンストンら、“ヒトリンパ芽球細胞
によるインターフェロンの生成に影響する要因”、Ａｄ
ｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１１０巻、６１−７４
ページ（１９７８）２５．Ｇ．アレンら、“ヒトリンパ芽球（白血球−型）
インターフェロンのための構造上の遺伝子系列”Ｎａｔ
ｕｒｅ２８７巻、４０８−４１１ページ（１９８０）２６．Ｈ．ストランダーら、“ヒトリンパ芽球インター
フェロンの生成”、１巻、１１６−１１７ページ（１９
７５）２７．Ｍ．Ｄ．ジョンストン“インターフェロン生成の
過程におけるまたは過程に関連する改良”、ヨーロッパ
特許出願番号５２０（ウエルカム財団）２８．Ｐ．スヴェトリイら、“リンパ芽球細胞からヒト
インターフェロンの合成に関する改良法”、ドイツ公開
公報番号２，９４６，２７５（トマエ）２９．アームストロング、“ラビットインターフェロン
のためのセミ−ミクロ色素−結合分析”、Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１巻、７２３−７２５ページ（１
９７１）

【０２５３】３０．Ａ．コルマンら、“ゼノプスラエビ
スの卵母細胞から蛋白質の輸送”、Ｃｅｌｌ１７巻、
５１７−５２６ページ（１９７９）３１．Ｗ．Ｅ．ステュワートIIら、“実験的にラビイウ
ィルスで感染したハムスターにおけるインターフェロン
生成”Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．
１２３巻、６５０−６５３ページ（１９６６）３２．Ａ．Ｃ．ピーコックら、“ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による多様なリボ核酸種の解析”、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ６巻、１８１８−１８２７ページ
（１９６７）３３．Ｐ．Ｂ．Ｓｅｈｇａｌｅｔａｌ.,“ＲＮＡ種
におけるポリ（Ｉ）．ポリ（Ｃ）−誘発ヒト線維芽細胞
インターフェロンの異質性”、Ｎａｔｕｒｅ２８８巻、
９５−９７ページ（１９８０）３４．Ｊ．Ｇ．ストクリッフェ“ＤＮＡ配列から誘導さ
れたｐＢＲ３２２制限地図：４３６１ヌクレオチド対
−長までの正確なＤＮＡサイズマーカー”Ｎｕｃｌ，Ａ
ｃｉｄｓ，Ｒｅｓ、５巻、２７２１−２７２８ページ
（１９７８）

【０２５４】３５．Ｍ．マンデルら、“カルシウム−依
存性バクリオファージＤＮＡ感染”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．５３巻、１５９−１６２ページ（１９７０）３６．Ｍ．グルンスタインおよびＤ．Ｓ．ボックネス、
“コロニー交雑：特異性遺伝子を含むクローン化したＤ
ＮＡの分離方法”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．７２巻、３９６１−３９６５ページ（１９７９）３７．Ｋ．イタクラら、“化学的なＤＮＡ合成および組
み換えＤＮＡ研究”、Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９巻、１４
０１−１４０５ページ（１９８０）３８．Ｋ．イタクラら、“ペンタデカチミジリン酸合成
のための改良トリエステルアプローチ”Ｊ．Ａｍ．Ｓｏ
ｃ．９７巻、７３２７−７３３２ページ（１９７５）３９．Ｊ．Ｆ．Ｍ．デローイジら、“ホスホトリエステ
ル中間体を経ての相補性ＮＮＡ断片の合成”、Ｒｅｃ
ｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ９８巻、５
３７−５４８ページ（１９７９）４０．Ｆ．サンガーら、“鎖−末端阻害体をもつＤＮＡ
配列”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７４巻、５４６３−５４６７ページ（１９７７）４１．Ａ．Ｍ．マックサムおよびＷ．ギルバート“ＤＮ
Ａ配列のための新規な方法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４巻、５６０−５６４ページ
（１９７７）；ならびにＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６５
巻、４９９−５５９ページ（１９８０）

【０２５５】４２．Ｊ．Ｂ．ゴルドン、Ｊ．Ｅｍｂｒｙ
ｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．２０巻、４０１−４１４ペ
ージ（１９６８）４３．バース、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐ
ｈ．７巻、２１０−２２２ページ（１９５９）４４．Ａ．エフストラテアデスら、実物大およびグロビ
ンおよびコリオンｍＲＮＡの別個の部分的な逆転写、Ｃ
ｅｌｌ４巻、３６７−３７８ページ（１９７５）４５．Ｔ．マニアテスら、“インビトロで合成されたβ
−グロビン遺伝子の拡張および特性化”、Ｃｅｌｌ８
巻、１６３−１８２ページ（１９７６）４６．Ｊ．Ｈ．Ｊ．ホエイジマーカスら、“トリパノゾ
ースブルセイの異なる表面グルコプロティンのためのｍ
ＲＮＡに相補的ＤＮＡを含むプラスミドの分離”、Ｇｅ
ｎｅ８巻、３９１−４１７ページ（１９８０）

【０２５６】４７．Ｗ．ミューラーら、“ＤＮＡにおけ
る位置−配向性の突然変異：アミノ酸１２１−１２３に
対応する位置でクローン化βグロビン相補性ＤＮＡにお
ける変異特性の発生”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２４
巻、３４３−３５８ページ（１９７８）４８．Ｊ．ヴァイセンバッハら、“ヒト線維芽細胞にお
ける２つのインターフェロン：インビトロにおける翻訳
およびＥｃｏｌｉクローニング研究”、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７巻、７１５２−
７１５６ページ（１９８０）．４９．Ｕ．Ｋ．Ｌエンリ、Ｎａｔｕｒｅ２２７巻、６
８０−６８５ページ（１９７０）．５０．Ｂ．Ｊ．ラドラ、“電気泳動”、Ｐ．７９−９
４、ワルターデグルイターベルリン−ニューヨーク１９
８０．５１．Ｔ．ステェヒリンら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５６巻、９７５０−９７５４ページ（１９８１）．５２．Ｊ．Ｆ．ケルネィら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．
１２３巻、１５４８ページ（１９７９）．５３．Ｇ．ケェラーおよびＣ．ミルスタイン、Ｎａｔｕ
ｒｅ２５６巻、４５９ページ（１９７５）．５４．Ｇ．ガルフレら、Ｎａｔｕｒｅ２６６巻、５５
０ページ（１９７７）．

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、＋マルワds ｃＤＮＡの合成プロセス
および組み換えＤＮＡ分子の構成の説明図である。

【図２】図２は、α₁およびβ ＩＦＮｍＲＮＡへの
相補的なＤＮＡプライマー（１３mer ）の合成プロセス
の説明図であり、図中、Ｍはモノメトキシトリチル基で
ある。

【図３】図３はＨｕＩＦＮ−βおよびＨｕＩＦＮ−α特
異性検体の合成プロセスおよびヒトリンパ芽球ＩＦＮ−
含有クローンの同定のための使用の説明図である。

【図４】図４は組み換えプラスミドＤＮＡＣＧ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−Ｉｂのｃ−ＤＮＡ挿入の
ヌクレオチド配列の説明図である。

【図５】図５は組み換えプラスミドＤＮＡＣＧ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β₁ｃ−ＤＮＡ挿入のヌ
クレオチド配列の説明図である。

【図６】図６は、組み換えプラスミドＤＮＡＣＧ−ｐ
ＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−４₁のｃ−ＤＮＡ挿入
のヌクレオチド配列の説明図である。

【図７】図７は、組み換えプラスミドＤＮＡＣＧ−ｐ
ＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８′₁のｃ−ＤＮＡ挿
入のヌクレオチド配列の説明図である。

【図８】図８は、組み換えプラスミドＤＮＡＣＧ−ｐ
ＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５₁挿入のヌクレオチ
ド配列の説明図である。

【図９】図９は、ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−
α−１組み換えＤＮＡの構成の説明図である。

【図１０】図１０は、ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−１の配列の説明図である。

【図１１】図１１は、組み換えＤＮＡプラスミドＣＧ−
ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３の構成の説明図で
ある。

【図１２】図１２は、ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−３の配列の説明図である。

【図１３】図１３は、ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−２の配列の説明図である。

【図１４】図１４は、図４〜８において使用された記号
の説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＹ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次のアミノ酸配列： MET ALA LEU THR PHE TYR LEU LEU VAL ALA LEU VAL VA
L LEU SER TYR LYS SER PHE SER SER LEU GLY CYS ASP LEU PRO GLN THR HI
S SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILU LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG IL
E SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GL
U GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HI
S GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER AL
A ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GL
N LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SE
R PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN AR
G ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VA
L VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LY
S ARG LEU LYS SER LYS GLU を有するＨＬｙｃＩＦＮ−５₁；及び次のアミノ酸配列： CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG AR
G ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CY
S LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LY
S GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GL
N THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU TH
R LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GL
U SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TRY GL
U ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LE
U THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU IL
E MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LY
S GLU を有するＬｙＩＦＮ−α−２；から成る群から選択され
たヒトα−インターフェロン活性を有するポリペプチ
ド。
【請求項２】ＨＬｙｃＩＦＮ−５₁である請求項１に
記載のヒトα−インターフェロン活性を有するポリペプ
チド。
【請求項３】ＬｙＩＦＮ−α−２である請求項１に
記載のヒトα−インターフェロン活性を有するポリペプ
チド。
【請求項４】次のアミノ酸配列： MET ALA LEU THR PHE TYR LEU LEU VAL ALA LEU VAL VA
L LEU SER TYR LYS SER PHE SER SER LEU GLY CYS ASP LEU PRO GLN THR HI
S SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILU LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG IL
E SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GL
U GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HI
S GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER AL
A ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GL
N LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SE
R PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN AR
G ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VA
L VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LY
S ARG LEU LYS SER LYS GLU を有するＨＬｙｃＩＦＮ−５₁；及び次のアミノ酸配列： CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG AR
G ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CY
S LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LY
S GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GL
N THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU TH
R LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GL
U SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TRY GL
U ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LE
U THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU IL
E MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LY
S GLU を有するＬｙＩＦＮ−α−２；から成る群から選択され
るα−インターフェロン活性を有するポリペプチドの製
造方法であって、（１）前記ＨＬｙｃＩＦＮ−５₁及びＬｙＩＦＮ−α−
２から選択されたα−インターフェロンポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡの少なく
とも１つにより宿主細胞を形質転換し；（２）該形質転換された宿主を培養し；そして（３）前記所望のポリペプチドを採取する；ことを特徴
とする方法。
【請求項５】前記α−インターフェロン活性を有する
ポリペプチドがＬｙＩＦＮ−α−２である請求項４に記
載の方法。
【請求項６】次のアミノ酸配列： MET ALA LEU THR PHE TYR LEU LEU VAL ALA LEU VAL VA
L LEU SER TYR LYS SER PHE SER SER LEU GLY CYS ASP LEU PRO GLN THR HI
S SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILU LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG IL
E SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GL
U GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HI
S GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER AL
A ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GL
N LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SE
R PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN AR
G ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VA
L VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LY
S ARG LEU LYS SER LYS GLU を有するＨＬｙｃＩＦＮ−５₁；及び次のアミノ酸配列： CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG AR
G ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CY
S LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LY
S GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GL
N THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU TH
R LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GL
U SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TRY GL
U ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LE
U THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU IL
E MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LY
S GLU を有するＬｙＩＦＮ−α−２；から成る群から選択され
るヒトα−インターフェロン活性を有するポリペプチド
の有効量を医薬として許容されるキャリヤーと共に含ん
で成る抗ウイルス又は抗腫瘍剤。
【請求項７】ＬｙＩＦＮ−α−２を含有する請求項６
に記載の抗ウイルス又は抗腫瘍剤。