EA023379B1

EA023379B1 - ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)-pIE-GAMMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ГАММА ЧЕЛОВЕКА

Info

Publication number: EA023379B1
Application number: EA201101095A
Authority: EA
Inventors: Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ; Петр Иванович Голышев
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарма Ген"
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2016-05-31
Also published as: EA201101095A1

Abstract

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Предложена группа изобретений: штамм Escherichia coli BL21(DE3)-pIE-gamma - продуцент интерферона гамма человека и способ получения высокоочищенного препарата непроцессированного безметионинового нативного рекомбинантного интерферона гамма человека.

Description

Изобретение относится к медицинской биотехнологии.

Интерферон гамма является полифункциональным белком, вырабатываемым клетками иммунной системы (Т-клетками и ΝΚ-клетками), обладает иммуностимулирующей (активирует Т-клетки), противоопухолевой (антипролиферативной) - за счет увеличения количества молекул МНС I и индукции антиангиогенного эффекта посредством секреции зависимых от интерферона-гамма ΙΡ-10 и МЮ - и антивирусной активностями - активирует макрофаги за счет увеличения количества молекул МНС II.

Природный иммунный интерферон человека (интерферон гамма) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 16.9 кДа, является растворимым цитокином, с р1 9.7, синтезируется в виде предшественника из 166 аминокислотных остатков с сигнальным пептидом (20 аминокислотных остатков), содержит два сайта гликозилирования (48 и 120 аминокислотный остаток). Гликозилирование интерферона гамма играет важную роль при его секреции из клетки, при использовании же рекомбинантного белка интерферона гамма в терапевтических целях во время инъекции он попадает сразу в кровяное русло, минуя этап секреции. Более того, известно, что активность гликозилированной и негликозилированной форм интерферона гамма сравнима (8атепеуа Т. с1 а1., 1994). Это позволяет использовать для фармацевтических целей негликозилированный рекомбинантный белок интерферон гамма, полученный в бактериальных клетках Е.соЬ.

Создание микроорганизмов-продуцентов человеческого интерферона гамма позволило получать биологически активный рекомбинантный белок в количестве, необходимом как для проведения широких структурно-функциональных исследований, так и для использования в медицинской практике. Созданы лекарственные препараты на основе рекомбинантного интерферона гамма для лечения иммунных, онкологических и тяжелых вирусных заболеваний (Асйттипе - для лечения хронического гранулематоза, 1тикт для лечения псориаза, лепры, ревматоидного артрита, экземы и других заболеваний, Ингарон - для лечения хронического вирусного гепатита С, хронического вирусного гепатита В, ВИЧ/СПИД инфекции, туберкулеза легких в комплексной терапии, генитальной герпесвирусной инфекции и опоясывающего лишая (Негре8 /051ег) в монотерапии, урогенитального хламидиоза в комплексной терапии, онкологических заболеваний в комплексной терапии в качестве иммуномодулятора, в том числе в комбинации с химиотерапией, для профилактики инфекционных осложнений у больных с хронической гранулематозной болезнью и др.). Однако следует стремиться уменьшить количество и выраженность побочных эффектов от терапии человеческим интерфероном гамма в составе вышеперечисленных препаратов. Этого можно добиться благодаря созданию препарата, в составе которого интерферон гамма будет нативным, стерильным, нетоксичным, апирогенным и будет содержать минимальное количество эндотоксинов.

В конце 20 века исследования иммунного интерферона человека проводились на очень незначительных его количествах, что затрудняло изучение характеристик белка и использование в терапевтических целях. Интерферон гамма сначала получали, главным образом, митогенной индукцией лимфоцитов (патент РФ № 2092561). В 1981 г появилось сообщение о гораздо более тщательной, но все еще частичной очистке иммунного интерферона человека (Υ.Κ. Υίρ, К.Н. Рапд, С. ИтБап, апб 1. Убсек. РаШа1 рштйсабоп апб сЬагас1еп/а1юп οί Ьитап датта (1ттипе) ЬИегГегоп. Ргос Иаб Асаб δα υδΑ. 1981 МагсН; 78(3): 1601-1605). Данное соединение было получено из культур лимфоцитов, стимулированных сочетанием фитогемагглютина и форбола, и было очищено последовательными хроматографическими разделениями. В результате этой процедуры получили продукт с Мг 58 кДа.

Позже иммунный интерферон человека стали получать в очень малых количествах трансляцией мРНК в ооцитах, которые приобретали характеристики активности иммунного интерферона человека.

Некоторое время спустя появилась технология рекомбинантной ДНК, при которой конструируют генетическую конструкцию, основные элементы которой необходимы для ее репликации и возможности ее идентификации, в которой клонируют ген, экспрессия которого необходима, благодаря наличию в генетической конструкции участков, специфически расщепляемых рестиктазами, такой конструкцией трансформируют клетки реципиентного живого организма. Технология рекомбинантной ДНК позволила получить необходимый белок в больших количествах.

Одна из первых попыток синтеза интерферона гамма человека (патент РФ № 2092561) была осуществлена следующим образом. 1) Стимулировали митогенами выработку клетками селезенки человека или периферическими лимфоцитами крови иммунного интерферона. 2) Из такой клеточной культуры экстрагировали в присутствии ингибитора рибонуклеазы осадок клеток для выделения всей цитоплазматической РНК. 3) На олиго-аТ колонке выделяли полностью информационную РНК (мРНК) в полиаденилированной форме. Эту РНК фракционировали по размерам, используя градиент плотности сахарозы и гель-электрофорез в системе кислота-мочевина. 4) РНК от 12δ до 18δ превращали в соответствующую однонитевую комплементарную ДНК (кДНК), из которой получали двунитевую ДНК. После поли-бС сшивания ее включали в вектор, несущий один или более генетических маркеров. 5) Полученные таким образом векторы использовали для трансформации бактериальных клеток. 6) Из клонов-трансформантов выделяли соответствующую плазмидную ДНК и секвенировали. 7) ДНК с определенной последовательностью оснований встраивали ш νίΐτο в соответствующий вектор для экспрессии, которым трансформировали клетки хозяина.

При использовании колоночной хроматографии получают разброс мРНК (12δ-18δ), поэтому целесо- 1 023379 образнее использовать метод, позволяющий выделить конкретную мРНК, кодирующую интерферон гамма. Более того, в данном случае использовали два разных вектора, что усложняет метод и увеличивает время работы над получением препарата белка. Очевидно, что такой метод необходимо совершенствовать.

Более того, в данном случае организмом для экспрессии гена, кодирующего интерферон гамма человека, были дрожжи Бассйатотусск ссгсуыас. Экспрессию чужого гена в дрожжах может инициировать 6'-боковая последовательность ДНК (промотор) из дрожжевого гена, помещенная на 5'-конце недрожжевого гена. Кроме промотора, экспрессия недрожжевого гена в дрожжах требует второй дрожжевой последовательности, расположенной в плазмиде на З'-конце недрожжевого гена с тем, чтобы обеспечить соответствующее окончание транскрипции и полиаденилирование. Данную систему необходимо упростить для экономии времени и реактивов.

В методике, используемой нами, вышеуказанные проблемы решены. В работе используется один вектор, обеспечивающий синтез необходимого белка в клетках Е.сой, для работы с которыми не нужно модифицировать структуру гена, кодирующего интерферон гамма. Противовирусную активность проверяли более чувствительным и менее трудоемким методом.

Есть данные об еще одном способе получения интерферона гамма человека (патент РФ № 2214832). 1. Синтез интерферона гамма индуцировали в лимфоцитах периферической крови человека стафилококковым энтеротоксином Б, после чего клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ). 2. Выделяли мРНК, используя последовательно лизирующий буфер, содержащий додецил сульфат натрия и РНКазо/белковый расщепитель, 5 М №С1 и олиго(бТ)-целлюлозу, с которой вымывали мРНК на колонке. 3. Синтез кДНК проводили с мРНК, используя М-МиЬУ обратную транскриптазу, набор и протокол фирмы РЬагтааа Вю1ссй. 4. Необходимый фрагмент ДНК лигировали с плазмидой рИС 18. 5. Клетки Е.сой штамма 1М 83 трансформировали лигазной смесью с высевом на Ь-агар, содержащий Х-да1 и ИПТГ. 6. Необходимый фрагмент ДНК лигировали с синтетическим гетеродуплексом, содержащим рибосомсвязывающий сайт, и данный фрагмент помещали в плазмиду рТйу 315 (Шмелев В.А. и др., Молек. Генет. Микроб. Вирусол. - 1995. - 1. - с.9-14), из которой был удален фрагмент, кодирующий тимозин. 7. Полученной плазмидой трансформировали клетки Е.сой штамма НВ 2151 с высевом на Ь-агар, содержащий ампициллин. 8. Выделяли плазмидную ДНК. 9. Трансформировали полученной плазмидой подходящий штамм Е.сой (80 20050 или ВЬ 21) и культивировали клетки трансформированного штамма в обычной среде. 10. Лизировали клетки и отмывали агрегированный белок. 11. Проводили хроматографическую очистку на катионообменнике с одновременной ренатурацией (колонке с целлюлозой КМ-52). Полученный таким образом рекомбинантный человеческий интерферон гамма состоял из 144 а.о., был лишен трех Ν-концевых аминокислотных остатков Сук-Туг-Сук зрелого белка, в отличие от природного, и имел иную молекулярную массу (16,9 кДа) и р1 (10,36).

Использование описанной нами методики позволяет получить нативный непроцессированный рекомбинантный интерферон гамма человека без метионина на Ν-конце.

Наиболее близкий аналог изобретения описан в патенте РФ № 2097428. Это группа изобретений: рекомбинантная плазмида рТТдКт2, обеспечивающая синтез интерферона гамма человека в Е.сой, штамм-продуцент и способ получения рекомбинантного человеческого интерферона гамма. Плазмида рТТдКт2 сконструирована на основе плазмиды рИС 19, содержащей ген устойчивости к канамицину, триптофановый промотор, вслед за ним ген человеческого интерферона гамма и терминаторы транскрипции ггпВТДг. Эта плазмида введена в штамм С600 Е.сой, который и является штаммомпродуцентом интерферона гамма человека. Используемый здесь способ получения интерферона гамма включает культивирование клеток штамма-продуцента в среде с пониженным содержанием триптофана, лизис клеток, отмывку агрегированного белка, растворение интерферона гамма в 7 М растворе мочевины с цетавлоном, ренатурацию за счет десятикратного разведения водой, фракционирование и осаждение интерферона гамма сульфатом аммония и хроматографию на анионообменнике или дополнительно обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Недостатком плазмиды рТТдКт2 является то, что экспрессия гена человеческого интерферона гамма с триптофанового промотора запускается в средах с дефицитом триптофана. В обычных питательных средах работа триптофанового промотора ослаблена (репрессирована). При этом в компонентах обычных питательных сред (таких как дрожжевой экстракт, гидролизаты казеина: триптон, пептон) количество триптофана не ограничивается, поэтому поиск или приготовление сред с пониженным содержанием триптофана усложняет технологию и увеличивает себестоимость этапа культивирования.

Кроме того, использование в качестве штамма-продуцента рекомбинантного человеческого интерферона гамма штамма С600 Е.сой не вполне соответствует требованиям, предъявляемым к штаммампродуцентам, в частности по продуктивности и стабильности синтезируемых рекомбинантных белков. Более продуктивный штамм Е.сой, ВЬ 21, имеющий 1оп- и отрТ-мутации по генам протеаз, позволяет получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.

Способ получения интерферона гамма, указанный в патенте РФ № 2097428, включает ренатурацию за счет десятикратного разведения водой интерферона гамма, растворенного в 7 М растворе мочевины, а затем фракционирование и осаждение интерферона гамма сульфатом аммония. Это не технологично, так как операции с большими объемами растворов требуют большего расхода реагентов (того же сульфата

- 2 023379 аммония) и использования крупномасштабного оборудования. Далее в формуле изобретения указана хроматография на анионообменнике, а интерферон гамма имеет положительный заряд при рН от 0 до 10 и не может сорбироваться на положительно заряженные анионообменники.

Касаемо других этапов работы, а именно процесса выделения телец включения и дальнейшей экстракции белка из них, другими авторами (патент США № 4681930) было предложено провести химический лизис клеток штамма-продуцента Е.сой и одновременную солюбилизацию интерферона гамма из телец включения раствором 7 М гуанидинхлорида; удалить нерастворившиеся компоненты центрифугированием; 10-кратно разбавить целевую фракцию буфером рН 9,5 и отделить образующийся осадок белка центрифугированием; фракционировать белок на силикагеле (ЫиСе1-952 АС) и, наконец, провести аффинную хроматографию на сорбенте с моноклональными антителами.

Полученный продукт находился в растворе 20 мМ натрийфосфатного буфера, содержащего 1 М ЫаС1 и 1 М гуанидинхлорид (или 50% этиленгликоль), и представлял собой белок с Мг 18 кДа, гомогенный по электорофорезу. Выход из 25 г клеток составил 8 мг (25-32% от содержания в клеточном экстракте). Биологическая активность препарата по ингибированию цитопатического эффекта составила 10⁷ ед./мг белка.

По результату видно, что выход белка необходимо увеличивать. Поэтому была предложена модификация данного метода (патент № 2132386). Клетки разрушали в буферном растворе, затем центрифугированием клеточного экстракта отделяли большую массу балластных клеточных белков Е.сой от нерастворимого целевого продукта, находящегося в тельцах включения, при этом соли цинка и меди использовали для предотвращения протеолитической деструкции целевого белка. Применение для солюбилизации интерферона гамма из телец включения менее сильного, чем гуанидинхлорид, денатурирующего агента мочевины обеспечивает более эффективную ренатурацию белка (М. Ма18иЬата, Ό. ЫоЬага, Т. 8ака1//Сйет. Рйатт.Вий., 1992, ν. 40, № 2, р. 550-552). Использование для хроматографической очистки сорбента СООН-Биохром К-1 значительно упростило и удешевило способ, по сравнению с использованием иммунного сорбента.

Однако способ, используемый в наших экспериментах, еще более совершенный. За счет того что клетки лизировали не только в буфере (отличающемся от вышеуказанного), но и ультразвуком, обеспечили более эффективное разрушение клеток и отсутствие пагубного влияния веществ, составляющих буфер, на необходимый белок. Более того, в нашей работе тельца включения отмывали 0.2 М дезоксихолятом натрия 3 раза, посредством чего удаляли липополисахариды, поэтому получили чистый фармацевтический препарат, без примесей бактериальных эндотоксинов. Для солюбилизации интерферона гамма из телец включения мы также использовали мочевину, но для получения очищенного белка использовали §-§ерйато8е, которая обладает стабильностью при большом разбросе значений рН (4-13) и большей связывающей способностью.

Исследователями было предложено модифицировать аминокислотную последовательность белка интерферона гамма, а именно защитить С-концевую область молекулы, поскольку она чрезвычайно насыщена сайтами для различных протеаз (патент РФ № 2105813). Однако неизвестно, положительный ли эффект у пациента будет наблюдаться, если молекула будет долгоживущей. Более того, если вводить препарат в кровоток, нет необходимости защищать интерферон гамма от воздействия клеточных протеаз, поскольку в клетки молекула не попадет, лишь будет взаимодействовать с соответствующим рецептором. Также, в отличие от формы препарата для перорального введения, для инъекционной формы не столь важно быть устойчивой к протеазам ЖКТ. В связи с вышеперечисленными причинами, предложенный нами препарат не содержит Ν-концевой метионин и какие-либо модификации на С-конце.

Подробное описание изобретения

Предложен штамм ЕксйейсЫа сой ВЬ21(ПЕ3)-р1Е-датта - продуцент интерферона гамма человека, коллекционный номер ВКПМ В-11012. Штамм характеризуется устойчивостью к антибиотику - ампициллину.

Полученный высокоочищенный препарат нативного интерферона гамма человека обладает высокой удельной биологической активностью (2000000 ед. на 50 мкг) и стабильностью. По данным электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия не менее 95% основного вещества препарата находится в форме мономера, а в димерной форме - не более 5%. Полученный препарат реагирует только с антителами к интерферону гамма (фирма Рерто1есй, каталожный номер 500-М90), устойчив в диапазоне рН от 4,5 до 10. Удельная противовирусная активность составляет не менее 2-10⁶ МЕ/мг.

Концентрированный раствор интерферона гамма разводят до терапевтической концентрации (от 10 до 100 мкг/мл) водным буферным раствором, содержащим стабилизирующие добавки. Жидкий полуфабрикат лиофилизируют и хранят при температуре не выше +10°С в течение 1.5 лет.

Полученный препарат нетоксичен, апирогенен при испытаниях на животных, обладает контролируемой противирусной активностью при испытаниях на культуре клеток карциномы легкого человека (А549), зараженных вирусом ЕМС (от 50000 МЕ/мл раствора до 1 млн МЕ/мл раствора), не вызывает побочных реакций у испытуемых животных; препарат быстро, в течение нескольких секунд, растворяется в воде и физиологическом растворе для инъекций, раствор остается прозрачным при комнатной температуре не менее чем 48 ч.

Данный препарат получен благодаря проведению ряда экспериментов.

- 3 023379

Пример 1. Получение гена, кодирующего интерферон гамма человеческий (кДНК).

1.1. Получили моноцитарные клетки периферической крови (МКПК) человека методом центрифугирования гепаринезированной крови в градиенте плотности Нсо11-Рас|ис (Воуит, 1964): ресуспендированные клетки (10 мл) осторожно наслоили на 4 мл раствора НсоИ-Расцк (РЬагташа Вю1есЬ, Швеция) и отцентрифугировали при комнатной температуре в течение 30 мин при 400д на настольной центрифуге. Образовавшееся после центрифугирования кольцо клеток (моноциты и лимфоциты) осторожно отобрали пипеткой и ресуспендировали в 20-кратном объеме РВ§. МКПК трижды очистили центрифугированием в растворе РВ§ при комнатной температуре в течение 10 мин при 400д на настольной центрифуге. После третьей отмывки клетки ресуспендировали в 1 мл РВ§. Лимфоциты культивировали в среде РРМ1 1640, содержащей 10% РВ§.

1.2. Простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, в лимфоцитах раствором РМА (р1югЬо1 тупкОс асеГаГе. §1§та, США), при этом использовали аллостимуляцию гомологичных МКПК, полученных от разных индивидумов. Для этого по 10⁷ МКПК, полученных от 3 независимых индивидумов, смешали в одном фальконе, отмыли 1 раз РВ§ и ресуспендировали в 1 мл среды РРМ1 1640, содержащей 1% РВ§, добавили РМА до концентрации 25 нг/мл (стоковый раствор 1 мг/мл в ΌΜδΘ) и инкубировали 6-8 ч в СО₂-инкубаторе при +37°С. После инкубации клетки собрали центрифугированием, отмывали в РВ8 и использовали для выделения РНК.

1.3. Выделили РНК с помощью метода, основанного на использовании гуанидина изотиоционата, с последующей очисткой ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия.

Для этого простимулированные МКПК ресуспендировали в 300 мкл физиологического раствора (ЫаС1), к ним добавили 1 мл раствора, содержащего 5.5 М гуанидина изотиоционат, 50 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, 0.5% саркозил и 7 мкл β-меркаптоэтанола. Смесь перемешали и добавили 1 мл раствора, содержащего 5.7 М хлорид цезия, 25 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА. Полученную суспензию наслоили на 1.5 мл раствора, содержащего 5.7 М хлорид цезия, 25 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, помещенного в центрифужную пробирку ротора δν65 (Вестап, США). Центрифугирование провели при 100000д в течение 18 ч при +20°С. После центрифугирования слили надосадочную жидкость, а осадок, содержащий РНК, кодирующую интерферон-гамма, 3 раза промыли 70% этанолом и просушили в течение ночи при -20°С. РНК хранили в сухом виде или под 70% этанолом при -70°С.

1.4. Для получения последовательности кДНК, кодирующей интерферон гамма, провели реакцию ОТ-ПЦР. РНК, полученную из 10⁷-10⁸ простимулированных клеток МКПК, растворили в 20 мкл воды. На реакцию обратной транскрипции (ОТ) взяли по 5 мкл тотальной РНК и 0.5 мкг ойдо(бТ)₁₈ праймера. Реакцию провели в соответствии с инструкцией к набору РеуеПАЛ Ρίτκΐ δίππιά сОЫА 8уйЬе518 Κίΐ (Регтеп!ак, Литва). Полученную в результате ОТ первую (+)-нить ДНК использовали как матрицу в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации гена, кодирующего интерферон гамма. Для этого брали по 5 мкл результата ОТ-ПЦР и по 0.2 пМ каждого праймера (ΙΡΝ-γ-кр: 5'-СТСОСТАОССАССАТО ОССТТОАССТТТОСТ-3' и ΙΡΝ-γ-г 5'-ОТААОСТТАТСАТТССТТАСТТСТТАААСТ-3'). Реакцию провели в стандартных условиях для Тац-полимераэы (Реттейак, Литва) по программе: 95°С - 10 с, 58°С - 10 с, 72°С - 40 с в течение 35 циклов, 72°С - 2 мин для достройки концевых последовательностей.

Результат ПЦР проанализировали электрофорезом в 1% агарозном геле.

Пример 2. Создание плазмидной ДНК (ρΙΕ-датта), содержащей ген, кодирующий интерферон гамма человека.

2.1. По методике, описанной в примере 1, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в среде РРМ1 1640, содержащей 10% РВδ; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК.

2.2. Проклонировали кДНК гена, кодирующего интерферон гамма человека, в плазмидном векторе рОетТЕаку (Рготеда, США), используя реактивы данного набора.

Вектор рОетТЕаку содержит следующие компоненты: промотор для полимеразы фага Т7, что обеспечивает контроль уровня экспрессии гена, 1ас-оператор для обеспечения контролируемой экспрессии гена, кодирующего необходимый белок, сайт связывания с рибосомальным комплексом (ΚΡδ), старт кодон для трансляции клонированного фрагмента, фрагмент ДНК, кодирующий полигистидин, находящийся в рамке трансляции, что обеспечивает экспрессию необходимой нуклеотидной последовательности в виде белка, слитого с полигистидином, для удобства его дальнейшей очистки с использованием хроматографии, нуклеотидную последовательность, кодирующую У5 эпитоп в линкере, что обеспечивает синтез У5 эпитопа, сшитого с необходимым белком; моноклональные антитела к этому эпитопу позволяют анализировать экспрессию любого встроенного гена с помощью иммуноблоттинга, сайт для ТЕУ-протеазы, позволяющий получить белок в виде отдельной аминокислотной последовательности, без полигистидина и У5 эпитопа, фрагмент гор, обеспечивающий оптимальную копийность плазмиды, рВК322от1 для осуществления инициации репликации, 1ас1 - лактозный репрессор для обеспечения работы 1ас-оперона, сайт устойчивости к ампициллину для селекции клонов, содержащих данный вектор.

- 4 023379

Результат ПЦР осадили этанолом в присутствии 2 М ацетата аммония, центрифугировали при 10000д в течение 5 мин, осадок промыли 70% этанолом, просушили и растворили в 10 мкл воды.

На реакцию лигирования взяли 3 мкл раствора кДНК, 1 мкл раствора готового вектора рСетТЕаку, 5 мкл буфера для лигирования х2 и 1 мкл Т4-лигазы. Реакцию провели при +20°С в течение 2 ч.

После этого смесь прогрели при +95°С в течение 10 мин и очистили от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (МННроге, США). Диализ провели против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин.

Пример 3. Создание штамма Е.соН для амплификации плазмидной ДНК, содержащей ген, кодирующий интерферон гамма человеческий.

3.1. По методике, описанной в примере 2, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в среде РРМ1 1640, содержащей 10% РВ8; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК и получили плазмидную ДНК рГЕ-датта: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор рСетТЕаку.

3.2. Трансформировали клетки Е.еоН штамма ΌΗ10Β/Κ. (Е^-тегА, Д(тгг-Й8ЙРМ§-тсгВС), ф80Н/ас2ДМ 15, Д1асХ74, НеоР. гесА1, епНА1, агаЭ139, Д(ага,1еи)769, §а1И, да1КХ^-, гркЬ, иирС) плазмидной ДНК рГЕ-датта методом электропорации с использованием генератора высоковольтных импульсов ГВИ-1 (СПбГТУ, Санкт-Петербург). Для этого к 12 мкл компетентных клеток добавили 1 мкл диализованной лигазной смеси, поместили между электродами парационной ячейки и обработали импульсом тока напряженностью 1 кВ на 1 мм и длительностью 4 мс.

3.3. После трансформации клетки поместили в 1 мл 8ОС-среды (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ ЫаС1, 2.5 мМ КС1, 10 мМ М§С1₂, 10 мМ Мд§О₄, 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при +37°С.

3.4. Провели скрининг клеток Е.соН на наличие плазмид на селективной среде, содержащей ЬВагар, 100 мкг/мл ампициллина, 5 мМ 1РТС, 20 мкг/мл Х-да1. 10 колоний Е.соН, развивающих белую окраску на хромогенном субстрате Х-да1, проверили на наличие гена, кодирующего интерферон гамма, методом ПЦР. Условия реакции были те же, что и в реакции ОТ-ПЦР (см. пример 1).

3.5. Провели анализ скрининга электрофорезом в 1% агарозном геле. Колонии клеток Е.соН, содержащие плазмиды со вставкой гена, кодирующего интерферон гамма, были использованы в качестве ночной затравки для последующего выделения плазмидной ДНК.

3.6. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора Χνί/агН МНйргерх ΌΝΑ Рштйсайои §у81ет (Рготеда, США). Очищенную рекомбинантную плазмидную ДНК (р1Е-датта) проверили с помощью рестрикционного анализа и секвенирования.

Пример 4. Создание штамма Е.соН - продуцента интерферона гамма человеческого.

4.1. По методике, описанной в примере 3, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в среде РРМ1 1640, содержащей 10% РВ8; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК, получили плазмидную ДНК рГЕ-датта: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор рСетТЕаку и получили большое количество плазмидной ДНК рГЕ-датта, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки Е.соН штамма НН10В/Р плазмидной ДНК р1Е-датта; инкубировали в 8ОС-среде, провели скрининг клеток Е.соН на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК.

4.2. Подготовили клетки Е.соН штамма ВЬ21(НЕ3) с генотипом Р- отрТ Й8Й§В (гВ-тВ-) §а1 Нст гпе131 (ЮЕ3) следующим образом. Инкубировали клетки при +37°С в течение ночи в 5 мл Ь-бульона, содержащего 1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый. Развели культуру свежим Ьбульоном в 50-100 раз и вырастили на качалке при +37°С до оптической плотности 0,2-0,3 при длине волны 590 нм. При достижении оптической плотности более 0,3 культуру развели свежим Ь-бульоном до оптической плотности 0,1 и растили 30 мин. Перенесли 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осадили клетки при +4°С на 5000д в течение 10 мин. Супернатант слили, клетки ресуспендировали в 50 мл 0,1 М СаС1₂, охлажденного на льду. Инкубировали клетки 20 мин на льду. Осадили клетки в течение 10 мин при 5000 об/мин, +4°С. Супернатант слили, клетки ресуспендировали в 3 мл 0,1 М СаС12, охлажденного на льду.

4.3. Для экспресии гена, кодирующего интерферон гамма человеческий, трансформировали клетки Е.соН штамма ВЬ21[НЕ3], имеющего 1оп- и отрТ-мутации по генам протеаз и позволяющго получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах, созданной плазмидой методом электропорации.

Перенесли 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавили 5-10 мкг плазмидной ДНК р1Е-датта. Инкубировали на льду 1 ч. Перенесли пробирку на +42°С и выдержали 5 мин. Переносили клетки в колбу со 100 мл подогретого до +37°С Ь-бульона без антибиотика и инкубировали при +37°С в

- 5 023379 течение 1-1,5 ч. Затем клетки использовали непосредственно для засева в ферментер.

Полученная плазмида рГЕ-дашта после трансформации в компетентные клетки штамма Е.соП ВЬ21(НЕ3) обеспечивает высокий уровень биосинтеза рекомбинантного человеческого интерферона гамма, определяемый электрофорезом в 15% ПААГ-ДСН.

Пример 5. Получение интерферона гамма человеческого в клетках Е.сой индукцией синтеза белка 0.2% лактозой по методу Штудиера.

5.1. По методике, описанной в примере 4, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% РВ8; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК, получили плазмидную ДНК рГЕ-дашта: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор рОешТЕаку и получили большое количество плазмидной ДНК рГЕ-дашта, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки Е.сой штамма ΌΗ10Β/Κ плазмидной ДНК ρΙΕ-датта; инкубировали в 8ОС-среде, провели скрининг клеток Е.сой на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК, получили штамм Е.сой - продуцент интерферона гамма человеческого: подготовили клетки Е.сой штамма ВЬ 21 к трансформации плазмидной ДНК; трансформировали клетки Е.сой штамма ВЬ21[НЕ3] созданной плазмидой рГЕ-датша; перенесли клетки в Ь-бульон с температурой раствора +37°С без антибиотика; инкубировали при +37°С в течение 1-1,5 ч; засеяли трансформированные клетки в ферментер.

5.2. Для автоиндукции экспрессии по методу Штудиера (81иб1ет, 2005) использовалась среда ΡΥΡ5052, состоящая из 1% пептона (Сйсо. США), 0.5% дрожжевого экстракта (О&со, США), 50 мМ Ыа₂НРО₄, 50 мМ К₂НРО₄, 25 мМ (ЫН₄)₂§О₄, 2 мМ Мд§О₄, 0.5% глицерола, 0.05% глюкозы и 0.2% лактозы.

В среду ΡΥΡ-5052, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, инокулировали единичную колонию штамма-продуцента. После ферментировали при +37°С в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об/мин в течение 20 ч до отсутствия существенного изменения оптической плотности при длине волны 600 нм за 1 ч. Далее отобрали аликвоту клеток на анализ методом электрофореза, а оставшуюся биомассу осадили центрифугированием при 9000д и оставили храниться при -70°С для последующего выделения белка.

Пример 6. Получение чистого фармацевтического препарата нативного рекомбинантного интерферона гамма человеческого без примесей бактериальных эндотоксинов.

6.1. По методике, описанной в примере 5, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% ЬВ8; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон-гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК, получили плазмидную ДНК рГЕ-датша: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лигировали в вектор рОешТЕаку и получили большое количество плазмидной ДНК р1Е-датта, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки Е.сой штамма ОН10В/Р плазмидной ДНК р1Е-датта; инкубировали в 8ОС-среде, провели скрининг клеток Е.сой на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК, получили штамм Е.сой - продуцент интерферона гамма человеческого: подготовили клетки Е.сой штамма ВЬ21(НЕ3) к трансформации плазмидной ДНК; трансформировали клетки Е.сой штамма ВЬ21[НЕ3] созданной плазмидой р1Е-датта; перенесли клетки в Ь-бульон с температурой раствора +37°С без антибиотика; инкубировали при +37°С в течение 1-1,5 ч; засеяли трансформированные клетки в ферментер, синтезировали белок: индуцировали экспрессию гена, кодирующего интерферон гамма, 0.2% лактозой по методу Штудиера.

6.2. Выделили белок интерферон гамма в составе телец включения из клеток Е.сой посредством лизиса клеток. Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-НС1 рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Суспензию клеток обработали ультразвуком 7 раз по 30 с с интервалом в 30 с (частота ультразвука составляет 22 кГц). Лизат центрифугировали 10 мин при +4°С, 5000д. Надосадочную жидкость слили, к осадку добавили раствор 1 М мочевины из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешали. Повторили центрифугирование. Супернатант слили, осадок ресуспендировали в растворе 2 М мочевины того же объема. Повторили центрифугирование. Супернатант слили.

6.3. Отмыли тельца включения 0.2 М дезоксихолятом натрия 3 раза, посредством чего удалили липополисахариды, поэтому впоследствии (см. пример 7, пп.7.2-7.6) получили чистый фармацевтический препарат, без примесей бактериальных эндотоксинов.

7. Получение очищенного непроцессированного интерферона гамма человеческого без метионина на Ν-конце.

7.1. По методике, описанной в примере 6, синтезировали ген, кодирующий интерферон гамма человеческий: получили МКПК человека (моноциты и лимфоциты); культивировали лимфоциты в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% РВ8; простимулировали синтез мРНК, кодирующей интерферон гамма человеческий, лимфоцитами; выделили данную мРНК; синтезировали кДНК (необходимый ген) на матрице мРНК, получили плазмидную ДНК рГЕ-дашта: синтезированный ген (кДНК на матрице мРНК) лиги- 6 023379 ровали в вектор рСетТЕаку и получили большое количество плазмидной ДНК ρΙΕ-дашша, которую можно было теперь использовать для синтеза белка интерферона гамма человеческого: трансформировали клетки Е.сой штамма ΌΗ10Β/Κ плазмидной ДНК ρΙΕ-датта; инкубировали в 8ОС-среде, провели скрининг клеток Е.сой на наличие плазмид на селективной среде; выделили плазмидную ДНК, получили штамм Е.сой - продуцент интерферона гамма человеческого: подготовили клетки Е.сой штамма ВЬ21(РЕ3) к трансформации плазмидной ДНК; трансформировали клетки Е.сой штамма ВЬ21[ОЕ3] созданной плазмидой рГЕ-датта; перенесли клетки в Ь-бульон с температурой раствора +37°С без антибиотика; инкубировали при +37°С в течение 1-1,5 ч; засеяли трансформированные клетки в ферментер, синтезировали белок: индуцировали экспрессию гена, кодирующего интерферон гамма, 0.2% лактозой по методу Штудиера, выделили тельца включения из клеток Е.сой: лизировали клетки, удалили липополисахариды: отмыли тельца включения 0.2 М дезоксихолятом натрия 3 раза, посредством чего получили очень чистый фармацевтический препарат, без примесей бактериальных эндотоксинов.

7.2. Осадок растворили в буфере, содержащем 0,1 М аммония ацетат рН 7,5 и 8 М мочевину, того же объема. Отцентрифугировали. Надосадочная жидкость представляла собой раствор интерферон гамма около 60-70%-ной электрофоретической чистоты.

7.3. После содержания в 8 М растворе мочевины белок обработали ТЕУ протеазой для отщепления Ν-концевого метионина, сайта для ТЕУ-протеазы и полигистидиновой последовательности и пропустили через мембрану с отсекающими порами в 10 кДа, для отделения данных аминокислотных последовательностей от белка интерферона гамма.

7.4. Провели рефолдинг белка интерферона гамма человеческого. Поместили интерферон-гамма без Ν-концевого метионина в буфер для рефолдинга (0.1 М ТгЫ рН 8.0, 0.2 мМ ЭДТА) с 0.5 М Ь-Аргинином. Растворенные тельца включения сагрегировали в зависимости от количества Аргинина. Агрегацию наблюдали при длине волны 500 нм. Буфер перемешали при 10°С, добавили три раза по 10 мл ΙΒ с интервалом в 2 ч. Раствор инкубировали 36-48 ч, не перемешивая, при 10°С. При большей температуре преобладала агрегация.

7.5. Обессолили ренатурированный белок раствором 20 мМ Тп5-НС1 рН 8.0, содержащим 100 мМ мочевину. Диализ провели при 10°С до достижения проводимости 3-3.7 мкСм. Раствор центрифугировали на 10000 грт в течение 10 мин, был собран супернатант.

7.6. Провели хроматографическую очистку полученного раствора интерферона гамма человеческого, без Ν-концевого метионина. Около 1200 мл обессоленного супернатанта поместили на 20 мл 8Зерйагоке колонку, уравновешенную 20 мМ Тп5-НС1 рН 8.0. Колонку отмыли 200 мл 50 мМ ТгЫ рН 8.0, белок элюировали 160 мл линейного градиента 50 мМ ТгЫ рН 8.0 1 М №С1. Фракция очищенного на 8Зерйагоке интерферона гамма человеческого без Ν-концевого метионина была помещена на 8-100 колонку (2.5x80 см), предварительно уравновешенную фосфатным буфером. Фракции анализировались с помощью 8Э8-РАСЕ. Колонку откалибровали с использованием 10 мг бычьего сывороточного альбумина, овальбумина и соевого трипсинового ингибитора.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Штамм ЕксйейсЫа сой ВЬ21(ПЕ3)-р1Е-датта - продуцент интерферона гамма человека, ВКПМ В-11012.
2. Способ получения препарата рекомбинантного интерферона гамма человека, заключающийся в том, что осуществляют культивирование рекомбинантного штамма Е.сой - продуцента интерферона гамма в питательной среде, выделение агрегированного белка с последующей его ренатурацией и очисткой от примесей, отличающийся тем, что в качестве рекомбинантного штамма используют штамм Е.сой по п.1, после культивирования осуществляют индукцию экспрессии гена, кодирующего интерферон гамма человека, выделение агрегированного белка осуществляют в результате лизиса бактериальных клеток с последовательным использованием буфера 20 мМ трис-НС1 рН 7.5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид и ультразвука, трехкратного отмывания телец включения 0.2 М дезоксихолятом натрия с последующей обработкой ТЕУ-протеазой и пропусканием через мембранный фильтр, ренатурацию осуществляют с использованием 8 М раствора мочевины в буфере, содержащем 0.1 М ТгЫ рН 8.0, 0.2 мМ ЭДТА, 0.5 М Ь-аргинин, после чего ренатурированный белок обессоливают раствором 20 мМ ТП5-НС1 рН 8.0, содержащим 100 мМ мочевину, очистку полученного раствора белка осуществляют на 8-8ерйаго5е колонке и 8-100 колонке (2.5x80 см) с использованием соответствующих буферов, высокоочищенный раствор полученного непроцессированного безметионинового нативного рекомбинантного интерферона гамма человека смешивают с физиологически приемлемым носителем.