CN101766810A - 一种含有重组人粒细胞集落刺激因子的药物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有与天然人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocytecolony stimulating factor，G-CSF)结构相同的重组G-CSF的药物制剂及其制备方法。该制剂活性成分是N端为脯氨酸的G-CSF，全长173个氨基酸，是人体内G-CSF天然结构形式的一种。该制剂克服了现有重组人G-CSF制品N端含有甲硫氨酸的缺点。本发明还提供了制备上述制剂的方法。

Description

一种含有重组人粒细胞集落刺激因子的药物制剂

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子的药物制剂及其制备方法。

发明背景

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种造血生长因子，作用于骨髓中性粒细胞系促进其增殖分化，并促进中性粒细胞的成熟与释放，增强成熟中性粒细胞的功能，其早期临床适应症为癌症化疗及骨髓移植后的中性粒细胞减少，以后逐步扩大到各种病因引起的中性粒细胞减少症。

随着分子生物学和基因工程技术的发展，通过蛋白质重组技术生产药物已经广泛应用。用于生产外源蛋白质的细胞包括真核细胞、酵母和原核细胞。一些活性依赖于糖基化的蛋白质和结构复杂的蛋白质通常通过哺乳动物细胞表达，如CHO、NSO等高等真核细胞；而一些不需要糖基化的蛋白质可以通过低等的大肠杆菌等表达。

大肠杆菌是常用的生产重组蛋白的表达系统。相对于真核表达系统而言，大肠杆菌表达系统有以下优势：1.对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究已相当彻底，已有很多不同抗药性、不同营养依赖型和不同校正突变型的菌种供选择应用，可以根据不同的载体而选择不同的菌种；2.尽管大肠杆菌细胞的空间小，但繁殖能力强，在营养条件充足时，20～30min即可繁殖一代，而且大规模发酵成本低，具有巨大的生产潜力；3.表达水平一般较真核系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5％～30％，且下游工艺简单、易于控制。但是大肠杆菌表达系统也存在不少缺点：1.缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统，如糖基化，而不少具有生物活性的蛋白是糖蛋白，因此无法用原核表达系统表达；2.细菌本身产生的热源、内毒素不易除去，产品纯化问题较多；3.蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性困难，易出现肽链的不正确折叠等问题。

外源蛋白质在宿主细胞内的生成过程包括基因转录、翻译、转运和翻译后加工等分子生物学过程。转运和翻译后加工对于一个蛋白质在宿主细胞内的成熟很关键。翻译后修饰一般分为四种：N-端甲酰甲硫氨酸(fMet)或甲硫氨酸(Met)的切除、二硫键的形成、化学修饰和剪切。部分原核生物的肽链，其N-端不保留fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶(deformylase)除去甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细胞中，fMet或者Met的去除是由氨肽酶(amino peptidase)水解来完成的。水解的过程有时发生肽链合成的过程中，有时在肽链从核糖体上释放以后。至于脱甲酰还是除去甲酰甲硫氨酸(fMet)常与邻接的氨基酸有关，切除效率还受整个蛋白质分子结构等因素的影响。

美国Amgen公司等公司开发上市的重组G-CSF(商品名“非格司亭Filgrastim”)是N末端未切除甲硫氨酸的修饰蛋白，还没有N端不含甲硫氨酸的G-CSF上市。N端的甲硫氨酸的蛋白质能够刺激机体产生抗体，这在生长激素等产品的研究中有报道。例如，使用N端带有甲硫氨酸的生长激素后，受试者抗体水平显著高于使用脑垂体来源的生长激素的受试者。(Clinical studies with recombinant-DNA-derived methionyl human growth hormone ingrowth hormone deficient children.Kaplan SL，Underwood LE，August GP，Bell JJ，Blethen SL，Blizzard RM，Brown DR，Foley TP，Hintz RL，Hopwood NJ，et al.Lancet.1986Mar 29；1(8483)：697-700.)

天然G-CSF前17个氨基酸对于其生物活性并非必须。有文献报道N端1-7个氨基酸缺失，G-CSF活性有不同程度的提高。研究表明，人体内的G-CSF大部分(约65％)以苏氨酸为N末端第一个氨基酸(Thr-Pro-Leu-Gly…………)，全长174个氨基酸；另外还有35％的分子以脯氨酸为第一个氨基酸(Pro-Leu-Gly………)，全长173个氨基酸(Alteration ofamino-terminal codons of human granulocyte-colony-stimulating factor increasesexpression levels and allows efficient processing by methionine aminopeptidase inEscherichia coli.Devlin PE，Drummond RJ，Toy P，Mark DF，Watt KW，Devlin JJ.Gene.1988May 15；65(1)：13-22.)。理论上，以这两种分子作为治疗药物最为适合。

发明内容

本发明的直接目的是获得含天然N端的重组人G-CSF的药物制剂，克服现有产品N末端甲硫氨酸切除困难的问题，改善产品质量。

在蛋白质翻译后修饰过程中，蛋白质N末端的甲硫氨酸是否能被切除的主要影响因素是其后面紧邻氨基酸的性质，整个蛋白质空间结构对切除效率也有一定影响。如甲硫氨酸后第一个氨基酸残基的旋转半径在1.22埃或者更小时，N末端的甲硫氨酸可以被甲硫氨酸胺肽酶切除。当甲硫氨酸后相邻的是精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸等氨基酸时，以脱甲酰基为主；如甲硫氨酸邻接的氨基酸是甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，则常常除去Met。但在基因工程实践中并不完全遵循这一规律。

为了获得N端不含甲硫氨酸的重组人G-CSF，根据分子生物学理论和基因工程相关技术，我们在基因设计等影响外源蛋白质表达的因素上进行了优化。

目标分子设计：目标分子是人G-CSF，具体地是N端为PLGPASSLPQS…的全长173个氨基酸的人G-CSF。人G-CSF基因和氨基酸序列已经收录到多种数据库，可以方便地检索获得人G-CSF序列，故在此不再详述。获得人G-CSF的基因可以通过公知的多种方法实现，如化学合成、反转录PCR等，这对于分子生物学人员已属于公知技术。我们的优化方案具体体现在，在起始密码子后面去除编码苏氨酸的密码子，使编码脯氨酸的密码子与起始密码子相连，希望以此来获得N端切除甲硫氨酸的重组人G-CSF，即N端序列为PLGPASSLPQS……的全长173个氨基酸的人G-CSF。另外，为了实现高水平的表达，需要在载体选择、SD序列等方面进行适当优化。

获得上述基因序列后，通过常规基因工程技术手段，把目标基因连接到可接受的原核表达载体，转化大肠杆菌，筛选获得菌种。菌种经过培养、诱导、收获、破碎、提纯等手段获得目标蛋白。目标蛋白中加入适当辅料制备成适当规格的治疗用药品。

菌种发酵和纯化结果显示，发酵后目标蛋白表达占全菌的20％左右，纯化后蛋白纯度达到95％以上；序列测定结果显示，本发明的目标蛋白分子N端第一个氨基酸为脯氨酸。

在本发明的一个实施例中，目标基因经过特定引物扩增，把设计方案体现到扩增基因产物中。具体的引物是：上游引物为5′AAGCTT ATG CCA TTA GGC CCT-3′，下游引物为：5′CGGGATCC TCA CGG CTG GGC AAG GTG GC-3′。其中上游引物是5’端磷酸化的引物。

至此，我们已经充分公开了本发明的设计思路和技术方案，并获得了较理想的效果。技术方案中需要用到的主要试剂有DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸底物、原核表达载体pBV220、核酸内切酶EcoRI和BamHI、宿主菌DH5α等均为常见分子克隆试剂，可以从国内外众多分子生物学试剂公司购买。DNA聚合酶链式反应模板可以在众多公司进行化学合成，或者从人白细胞中调取。

附图说明

图1克隆表达的人G-CSF全菌和纯化终产物电泳。图上第一泳道为本发明实施例获得的克隆菌发酵后全菌电泳，第二泳道为蛋白质分子量标准，第三和第四泳道为实施例获得的G-CSF纯品。

为了更好地对本发明进行描述，列举实施例如下：

实施例1.N端不含甲硫氨酸的人粒细胞集落刺激因子的克隆

表达载体pBV220由中国预防医学院病毒所病毒基因工程国家重点实验室惠赠。受体菌DH5α为本公司保存菌株，其基因型为SupE44△lac U169(80lacZ △M15)hsdR17recALend Al gyr A96thi-1rel AL。质粒DNA提取和纯化：参照Sambeook J等人编著的《分子克隆》(中文版，第二版，金冬雁等译，p16)中碱变性方法。

引物设计：经计算机辅助PCR引物设计，两引物无发夹结构，无4个碱基以上互补，上游引物(G+C)为47.6％，是较理想的引物设计。

上游引物为：-AAGCTT ATG CCA TTA GGC CCT-3′。第一个密码原为CCC，但因大肠杆菌系统CCC使用频率很低，故转变为大肠杆菌偏爱的CCA，同时G+C含量下降；

下游引物：5′-CGGGATCC TCA CGG CTG GGC AAG GTG GC-3′。

操作步骤：

参考《精编分子生物学》(奥斯伯，1998)第四章方法提取健康人白细胞总RNA，稀释后保存，作为模板；

参考《精编分子生物学》(奥斯伯，1998)第十五章方法进行PCR反应，BamHI酶切并电泳收集目的基因；

pBV220载体经EcoR I酶切后，用绿豆核酸酶削平，再经BamHI酶切，电泳回收载体目标片段；

上述目的基因片段和载体目标片段等摩尔数混合，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆；

实施例2.发酵纯化

种子培养基配方：1000mL含酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，葡萄糖2g，用氢氧化钠调pH到7.2-7.4，121℃高压灭菌20min。发酵罐培养基配方：每升中含蛋白胨5g，Na₂HPO₄·2H₂O 6g，KH₂PO₄ 3g，NH₄CL 1g，NaCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.13g，葡萄糖4g(后两种成份需单独高压灭菌)。以上培养基115℃高压灭菌30min。

种子培养：

一级种子在30℃、140r/min条件下振荡培养10h，以0.5％接种量转接二级种子，30℃，140r/min振荡培养过夜(15h)，以5％量转入发酵罐。

发酵罐培养：

30℃培养3-4h，OD₆₀₀＞1.5时，提高培养温度到42℃，连续通气培养3.5h，最后离心收集菌体(发酵培养前加100μg/ml氨苄青霉素)。每次发酵前进行空罐121℃，20min灭菌，装入培养基后121℃，20min再灭菌一次。

在30℃培养期间其参数如下：搅拌200RPM、通气量20L/min、溶氧100％、pH7.0、温度30℃。

当溶解氧低于50％时，应用搅拌与溶解氧级联控制模型，搅拌速度提高，使溶解氧恒定于50％，以满足氧的供给(通气量增加至30L/min)。

42℃诱导前质控指标：32℃培养3-4h，OD₆₀₀＞1.5可以升温诱导，否则放弃诱导。

诱导表达：温度为42℃，搅拌速度为150RPM，继续应用溶氧与搅拌的级联，通气量30L/min，保持发酵液溶解氧在30％。其余同30℃培养条件。

收集菌体：

发酵后用离心方法收取菌体，本工艺应用的是日立公司CR-21离心机连续流转头，离心速度300ml/min。转头速度12000rpm。

菌体的裂解：

以pH8.0缓冲液充分洗涤菌体，去除残余的培养基中的成分。洗涤后的菌体按1∶10(W/V)悬于pH8.0缓冲液中，加入1mg/ml溶菌酶，冰浴下超声300秒，采用脉冲模式，超声和间断时间各为50％，超声结束后，12000rpm/min离心收集沉淀，离心时间为10min。

重组人G-CSF的抽提：

用pH8.0缓冲液反复洗沉淀2-3次后，将沉淀再悬浮于10-15倍体积的上述缓冲液中，加入终浓度为1.5M的尿素和1mM的DTT，边加边搅拌15-30min，10℃12000rpm离心15min收集沉淀。

含有重组人G-CSF的包涵体再悬浮于5-10倍体积的Tris-HCl、EDTA-Na、10mM DTT、8M尿素、pH8.0的缓冲液中，剧烈混悬10-15min，10℃12000rpm离心10min，上清液即为含8M尿素、10mM DTT的重组人G-CSF抽提液。

重组人G-CSF的分离纯化：

用凝胶排阻层析进行初步分离纯化，所用填料为Pharmacia公司生产的Sephacryl S-200HR，重组人G-CSF粗提物经40℃，15min处理使重组人G-CSF完全还原后加入S-200柱(10×100cm)，控制流速为200ml/h洗脱，分部收集重组人G-CSF洗脱液，根据电泳结果合并分子量为18Kd的蛋白，此时可得电泳纯重组人G-CSF。合并后进行蛋白定量，方法采用280nm紫外吸光法。标准蛋白为BSA。

重组人G-CSF的复性：

将S-200HR分离的重组人G-CSF组分用S-200HR柱洗脱液调整浓度≤0.5mg/ml，装入透析袋中，对5-10倍体积的氧化和还原型谷胱甘肽4℃透析3次，第二天取出时室温搅拌透析30min，整个透析过程24h完成。在透析去除尿素和DTT的同时重组人G-CSF即完成复性过程。

超滤浓缩：

复性完成后的重组人G-CSF用截留分子量10kd的超滤膜超滤浓缩至蛋白浓度为2-4mg/ml，待离子交换柱分离。

离子交换层析精制：

离子交换层析柱规格10×40cm，填料DEAE-Sepharose  Fast Flow，由Pharmacia公司生产，将以上浓缩样品上样于DEAE柱，平衡缓冲液为20mM Tris-HCl，pH8.0，洗脱流速为480ml/h，上样后先用2-3倍柱体积的起始缓冲液洗柱，然后再用含0.2M NaCl的平衡缓冲液洗脱重组人G-CSF活性峰并收集，然后用含NaCl的平衡缓冲液洗脱杂质(主要为重组人G-CSF变异蛋白，核酸，脂多糖等)并再生DEAE柱。

收集的DEAE柱活性峰对10mM醋酸钠-醋酸缓冲液，pH4.0透析，使缓冲液逐渐过渡到酸性环境，完成缓冲液的交换。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察全菌表达和纯化蛋白。

对纯化的蛋白质进行序列测定，结果表明第一个氨基酸是脯氨酸。

实施例3重组人粒细胞集落刺激因子的活性测定

G-CSF生物学活性测定采用MTT比色法。实施例1样品测得的比活性为8×10⁷IU/mg。具体方法如下：

试剂：RPMI1640培养液：每升添加2.0g碳酸氢钠、2.383gHEPES，0.2923L-谷氨酰胺，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃保存；基础培养液：取100ml胎牛血清(FBS)，加入900mlRPMI1640培养液中，4℃保存；完全培养液：基础培养液加重组人粒细胞集落刺激因子至终浓度为20ng/ml或3000IU/ml；磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，加水使溶解成1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌；噻唑蓝(MTT)溶液：取MTT粉末0.25g，加入50ml PBS中，配制成5.0mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；裂解液：吸取盐酸14ml，Triton X-100溶液50ml，加异丙醇配制成500ml的溶液；标准品溶液的配制：取1支重组人粒细胞集落刺激因子效价测定标准品按说明书溶解后，用基础培养液稀释至50～100IU/ml。在96孔细胞培养板中，继续以2倍稀释度做稀释度稀释，共8个稀释度，每个稀释度做两个孔。以上操作在无菌条件下进行。

供试品溶液的配制：将供试品按标示量溶解后，用基础培养液稀释成约50～100IU/ml。在96孔细胞培养板中，继续以2倍稀释度做稀释度稀释，共8个稀释度，每个稀释度做两个孔。以上操作在无菌条件下进行。

测定法(a～e步骤在无菌条件下进行)

a NFS-60细胞株用完全培养液于37℃，5％CO₂培养，控制细胞浓度为1.0×10⁵～4.0×10⁵/ml，传代后24～36小时用于效价测定。

b将试验所用溶液预温至37℃。

c取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用基础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成2.0×10⁵/ml的细胞悬液，置37℃备用。

d在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入50μl细胞悬液，37℃，5％CO₂培养40～48小时。

e每孔加入20μl MTT溶液，37℃，5％CO2培养5小时。

f每孔加入200μl裂解液，混匀后在酶标仪上比色，测定波长540nm，参比波长630nm，记录测定结果。

结果计算：试验数据采用计算机程序或直线回归计算法进行处理。并按下式计算结果：

效价 $(\mathrm{IU}/\mathrm{ml})=\mathrm{Pr}\×\frac{\mathrm{Ds}\×\mathrm{Es}}{\mathrm{Dr}\×\mathrm{Er}}$

式中Pr为标准品效价，IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品半效稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。

计算结果表明，本发明制备的重组人粒细胞集落刺激因子比活性超过8×107IU/mg。

实施例4.含N端无甲硫氨酸的G-CSF制剂的配制

将实施例2制备的终产物超滤至G-CSF终浓度0.3mg/ml，取500ml；将50g甘露醇溶解于300ml，加入4ml吐温80母液(浓度为1％)；将上述各溶液混合，注射用水定容至1000ml。

将上述定容后中间品过滤除菌，分装成每支1mg的制剂。

Claims (3)

1.一种含有重组人粒细胞集落刺激因子的药物制剂，其主要组成是：1)以脯氨酸为N端第一个氨基酸、全长为173个氨基酸的重组人粒细胞集落刺激因子，是人体内天然存在的粒细胞集落刺激因子活性形式之一，是本制剂的活性成分；2)可以接受的药用辅料。

2.权利要求1所述的制剂的制备方法，主要步骤包括：

1)通过化学合成法、PCR法或者反转录PCR法获得编码权利要求1所述人粒细胞集落刺激因子的基因；

2)采用PCR法扩增1)获得的基因，上游引物为：5’AAGCTT ATG CCA TTA GGC CCT 3’；下游引物为：5’CGGGATCC TCA CGG CTG GGC AAG GTG GC3’；

3)PCR扩增出的DNA片段经BamH I酶切，琼脂糖凝胶电泳回收该基因片段；原核表达载体pBV220经EcoR I酶切，用绿豆核酸酶削平，再经BamH I酶切，电泳回收载体片段；

4)用T4连接酶连接步骤3)获得的基因片段和载体片段，转化大肠杆菌DH5α，筛选获得表达菌种；

5)菌种经过发酵和纯化获得重组人粒细胞集落刺激因子纯品，加入适当辅料制备成临床可接受的制剂，如但不仅限于注射剂、凝胶剂、喷雾剂。

3.权利要求1-2所述药物制剂在制备用于提升白细胞的药物中的应用。

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