CN102260697A

CN102260697A - 融合表达重组制备人β干扰素

Info

Publication number: CN102260697A
Application number: CN2010101826504A
Authority: CN
Inventors: 刘日勇; 李祥; 陈海容; 谭克海; 胡春兰
Original assignee: Fujin Bio-Medicine Co Ltd Chongqing
Current assignee: Fujin Bio-Medicine Co Ltd Chongqing
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2011-11-30

Abstract

本发明公开了一种在大肠杆菌中利用融合表达重组制备可溶性人β干扰素的工艺，其中包含融合表达的重组质粒和专一性蛋白酶酶切位点，以及重组制备中不含SDS的工艺方法。经本发明制备的重组人β干扰素具有更高的抗病毒比活性和安全性。

Description

融合表达重组制备人β干扰素

技术领域本发明涉及DNA重组技术和药物领域，涉及通过融合表达的重组人β干扰素，含编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在治疗疾病领域的应用。

背景技术人β干扰素是成纤维细胞和上皮细胞产生的一类具有广泛生物学活性，包括抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用的重要细胞因子(KozovsKa ME，et al.Neurology〔J〕，1999，53：1692-1697)，具有5个α螺旋结构和22KDa的分子量(Arduini，et al.Protein Science〔J〕，1999，8：1867-1877)。目前人β干扰素分为β干扰素-1a和β干扰素-1b，其中β干扰素-1a是天然结构，包含有糖基化结构。而β干扰素-1b是将17位的Cys突变成Ser而成，且N端不含甲硫氨酸，由165个氨基酸组成(Goodkin DE，et al.Lancet〔J〕，1994，344：1057-1060)。大量研究表明，人β干扰素可在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞中实现稳定高效的表达(JacobsL，et al.Curr Opin Neuro〔J〕，1994，7：250-254)。1993年以来国外已批准多种重组β干扰素上市用于治疗多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)。

国外用于临床的IFN-β有IFN-β-1a和IFN-β-1b两种类型，均系基因重组产品。β干扰素作为治疗多发性硬化症的药物已经在国外上市的有先灵公司的Betaferon、诺华欧化公司的Extavia以及雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex。其中先灵公司的Betaferon和诺华欧化公司的Extavia属于IFN-β-1b，通过在E.coli中以包涵体形式表达的重组人β干扰素-1b(Ser¹⁷)，工艺中需经SDS变性后再复性。而雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex是通过CHO(Chinese hamster ovary)表达的重组人IFN-β-1a。重组IFN-β-1b和IFN-β-1a在结构与生物活性方面存在明显的差异，主要表现为CHO表达的IFN-β-1a的体外抗病毒比活性高于大肠杆菌包涵体表达制备的IFN-β-1b(Laura Runkel，et al.Pharmaceutical Research〔J〕，1998，15：641-649)。IFN-β-1b在重组制备中需采用SDS进行变性处理后再进行复性，对人体具有潜在的毒性风险。本发明提供了一种制备IFN-β的新方法，实现了人IFN-β经大肠杆菌表达和重组制备中无需SDS变性复性，制备的IFN-β具有更高的体外抗病毒活性。发明目的目前人β干扰素-1b(IFN-β-1b)以包涵体的形式表达，工艺中需用SDS先变性后再复性，制备工艺相对复杂，且含有SDS的残留，其抗病毒比活性仅为2×10⁷IU/mg。

本发明以TRX-Linker-IFN-β融合表达的方式，实现了可溶性形式表达，通过在TRX与IFN-β之间设计不同蛋白酶酶切位点，能高效专一的切除并分离融合蛋白TRX后，再进一步纯化制备重组人β干扰素。为了有利于表达的融合蛋白的纯化，在连接肽中引入6×His标签。工程菌经发酵罐扩大培养后，加入IPTG诱导后收集菌体。在特定的破菌缓冲液中破菌后离心收集上清，通过Ni柱纯化回收融合蛋白，经特定的蛋白酶酶切后通过反相C18柱纯化、离子交换和Superdex-75凝胶柱层析，制备的重组人β干扰素抗病毒生物学比活性达到5.0×10⁷IU/mg以上。

本发明的目的在于提供一种以融合方式表达的重组人β干扰素蛋白并进行有效的重组制备。还提供了编码所述融合表达的人β干扰素蛋白的DNA分子、含该DNA序列的载体以及含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的提供一种无需复性的制备工艺，获得抗病毒比活性更高的重组人β干扰素的方法。

本发明的另一目的是提供一种可用于治疗病毒性疾病如病毒性丙型肝炎或乙型肝炎，或者免疫性疾病如多发性硬化症的重组人β干扰素。

发明概述在本发明的第一方面，提供了一种融合表达重组人β干扰素蛋白的上游构建体系，它包括：通过与TRX融合表达的重组人β干扰素，更具体的，该融合蛋白中包含不同的Linker，在Linker中设计不同的蛋白酶酶切位点，包括EK、TEV、thrombin、凝血因子Xa等。还提供了所述人β干扰素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其第1位氨基酸前可带有甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)。

在本发明的第二方面，提供了编码本发明上述的人β干扰素蛋白DNA分子。

在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体，以及构建该表达载体的方法。

在本发明的第四方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞以及可能的转化或转染的方法。

在本发明的第五方面，提供了一种重组产生本发明融合表达人β干扰素蛋白的方法，它包括以下步骤：在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，表达出所述的融合蛋白；分离纯化所述的融合蛋白的方法。

在本发明的第六方面，提供了一种重组产生本发明融合蛋白，通过不同蛋白酶酶切的方法，以及分离纯化人β干扰素蛋白的方法。

在本发明的第七方面，提供了一种该重组人β干扰素蛋白的药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。

至此已对本发明进行了详细描述，参照以下实例能够对之有更清楚的理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。

附图说明

图1：重组质粒pET-32a-EK-IFN-β构建示意图。

图2：重组质粒(pET-32a-EK-IFN-β)双酶切验证(1-3：KpnI和HindIII双酶切质粒pET-32a-EK-β-IFN 4：PCR片段(EK-IFN-β)。

图3：A：SDS-PAGE检测融合蛋白TRX-EK-IFN-β的表达水平(1：诱导前；2-5：诱导后)；B：SDS-PAGE分析Ni柱的纯化效果(1：Ni柱上样；2：20mM咪唑洗脱；3：200mM咪唑洗脱)。

图4：融合蛋白TRX-EK-IFN-β的EK酶酶切(1：未酶切；2：酶切16小时)。

图5：A：SDS-PAGE分析制备的目的蛋白IFN-β；B：RP-HPLC分析制备的目的蛋白IFN-β。

图6：改造质粒pET-32a(-thrombin-S·Tag)(代号：^mpET-32a)改造示意图。

图7：改造质粒pET-32a(-thrombin-S·Tag)双酶切验证(1：XbaI和KpnI双酶切pET-32a质粒；2：PCR片段TRX-6×His；3-5：XbaI和KpnI双酶切质粒pET-32a(-thrombin-S·Tag))。

图8：重组质粒pET-32a-thrombin-IFN-β-Gly¹构建示意图。

图9：重组质粒(pET-32a-thrombin-IFN-β-Gly¹)双酶切验证(1：KpnI和HindIII双酶切质粒pET-32a-thrombin-IFN-β-Gly¹；2：PCR片段(thrombin-IFN-β-Gly¹)。

图10：体外抗病毒比活性测定曲线(1：β干扰素国际活性标准品；2：TRX-EK-β-IFN；3：TRX-thrombin-β-IFN-Gly¹；4：β-IFN；5：β-IFN-Gly¹)。

具体实施方式：

实例1融合蛋白TRX-EK-IFN-β在大肠杆菌中的重组融合表达和目的蛋白IFN-β(SEQ IDNO：1)的制备。

在本实施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-EK-IFN-β结构。根据IFN-β的氨基酸序列，并按照大肠杆菌偏爱的密码子，委托宝生物(大连)有限公司进行全基因合成，IFN-β的cDNA序列(SEQIDNO：2)。

根据设计要求合成2条引物P1、P2：

P1：5′-CGGGTACCGATGACGATGACAAGTCTTACAACCTGCTTGGT-3′(SEQ ID NO：3)

P2：5′-GCAAGCTTTCATTAGTTTCGGAGGTAACCTGT-3′(SEQ ID NO：4)

注：P1中CG为引物保护碱基，GGTACC为Kpn I酶切位点；P2中GC为引物保护碱基，AAGCTT为Hand III酶切位点。

以人工合成IFN-β的cDNA序列(SEQ ID NO：2)为模板，用引物P1和P2扩增IFN-β基因(P1头部含有Kpn I酶切位点和编码肠激酶酶切位点DDDDK的核苷酸序列，P2尾部含有终止密码子和Hand III酶切位点)。扩增的EK-IFN-β基因首尾分别加入Kpn I和Hand III酶切位点，插入原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-EK-IFN-β。

延伸PCR方法扩增EK-IFN-β基因的反应体系均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连)，按商家的说明书设置。PCR反应条件为：94℃1min，58℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min，结果显示获得了500bp(EK-IFN-β)(SEQ ID NO：5)的目标条带。

PCR产物经低熔点琼脂糖纯化后，用Kpn I和Hind III双酶切后，回收目的片段，用T4DNA连接酶与同样经Kpn I和Hind III双酶切回收的质粒pET-32a(购于Invitrogen)连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10F′，用双酶切验证的方法筛选重组质粒pET-32a-EK-IFN-β(附图1，2)，经DNA测序(TAKARA，大连)后表明，扩增的EK-IFN-β基因与设计完全一致(SEQ ID NO：5)。将上述测序正确的质粒转化大肠杆菌表达宿主菌Origami DE3(Novagen)，成功构建pET-32a-EK-IFN-β/Origami DE3重组工程菌。

将表达最佳工程菌株划线接种于LA琼脂平板，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1000mL，121℃，高压灭菌30min即可)试管中，30℃培养12小时，然后按1％的比例转接到含200mL LB培养液的1000mL三角瓶中，30℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含YT培养液的30L发酵罐中，37℃培养，整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30％以上，用28％的氨水调节pH并保持在7.0。至菌液OD600＝10～14时，加入终浓度为0.3mmol/L IPTG，同时下调温度为32℃，继续培养4小时后停止发酵(附图3：A)，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。

从-20℃冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液(50mmol/LTris-HCl、1％Zwittergent3-14、pH9.0)中溶解菌体，37℃下搅拌1小时后加入终浓度为10μg/ml的DNA酶作用3小时至镜检完全破菌，12000rpm离心10分钟，弃沉淀。收集上清。

粗纯化：将收集的上清通过Ni离子螯和纯化回收融合蛋白TRX-EK-IFN-β(附图3)，在透析液(50mmol/L Tris-HCl、0.15M Nacl、pH8.0)中透析过夜。

融合蛋白(TRX-EK-IFN-β)EK酶酶切：取透析过夜的融合蛋白，按质量比1∶200加入EK酶，于4℃下酶切16小时即可，酶切效率不低于90％(附图5：A、B)。

精纯化：酶切后的样品经RP-HPLC(Waters公司C₁₈柱)纯化(流动相A液：0.1％三氟乙酸、5％乙腈，流动相B液：0.1％三氟乙酸、95％乙腈)，0-100％B线性洗脱进行纯化，离子交换(SP Sepharose FF)以及Superdex-75(Amersham Biosciences)(缓冲为PBS，pH7.4)凝胶柱层析获得重组IFN-β(SEQ ID NO：1)蛋白，纯度大于98.0％(附图4：B)。

实例2融合蛋白TRX-thrombin-IFN-β-Gly¹在大肠杆菌中的重组表达和目的蛋白IFN-β-Gly¹(SEQ ID NO：6)的制备。

在本实施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-thrombin-IFN-β-Gly¹结构。由于pET-32a质粒自身含有一个thrombin酶切位点，为实现融合蛋白中仅含有一个thrombin酶切位点，首先需将pET-32a质粒进行改造。然后再以人工合成的基因序列(SEQ ID NO：2)作为模板，PCR扩增的目的基因具有thrombin-IFN-β-Gly¹结构，然后插入经改造的pET-32a质粒构建重组质粒。根据设计要求合成4条引物P2、P3、P4、P5：

P2：5′-GCAAGCTTTCATTAGTTTCGGAGGTAACCTGT-3′(SEQ ID NO：4)

P3：5′-CTCTAGAAATAATTTTGTTTAA-3′(SEQ ID NO：7)

P4：5′-CGGTACCACCAGAAGAATGATG-3′(SEQ ID NO：8)

P5：5′-CGGGTACCCTGGTGCCACGCGGTTCTTACAACCTGCTTGGT-3′(SEQ ID NO：9)

注：P2中GC为引物保护碱基AAGCTT为Hand III酶切位点；P3中C为引物保护碱基，CTCAGA为Xba I酶切位点；P4中C为引物保护碱基，GGTACC为Kpn I酶切位点；P5中CG为引物保护碱基，GGTACC为Kpn I酶切位点。

在本实施例中，涉及对pET-32a质粒的改造，具体实施方法为：将pET-32a质粒经Xba I和Kpn I双酶切后分别回收小片段TRX-6×His-thrombin-S·Tag和大片段pET-32a(-thrombin-S·Tag)。以小片段TRX-6×His-thrombin-S·Tag作为模板，用引物P3和P4通过PCR扩增基因片段TRX-6×His(P3头部含有Xba I酶切位点，P4尾部含有Kpn I酶切位点)。扩增的TRX-6×His基因首尾分别加入Xba I和Kpn I酶切位点，经Xba I和Kpn I双酶切后与回收的大片段pET-32a(-thrombin-S·Tag)经T4DNA连接酶连接，构建原核表达载体pET-32a(-thrombin-S·Tag)。

延伸PCR方法扩增TRX-6×His基因的反应体系均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连)，按商家的说明书设置。PCR反应条件为：94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min，结果显示获得了400bp(TRX-6×His)的目标条带。

PCR产物经低熔点琼脂糖纯化后，用Xba I和Kpn I双酶切后，回收目的片段，用T4DNA连接酶与同样经Xba I和Kpn I双酶切回收的大片段pET-32a(-thrombin-S·Tag)连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10F′，用双酶切验证的方法筛选改造质粒pET-32a(-thrombin-S·Tag)(代号：^mpET-32a)(附图6、7)，经DNA测序(TAKARA，大连)后表明，扩增的TRX-6×His基因与设计完全一致。

以人工合成IFN-β的cDNA序列(SEQIDNO：2)为模板，用引物P5和P2扩增IFN-β-Gly¹基因(P5头部含有Kpn I酶切位点和编码thrombin酶切位点LVPRGS的核苷酸序列，P2尾部含有终止密码子和Hand III酶切位点)。扩增的thrombin-IFN-β-Gly¹基因首尾分别加入KpnI和Hind III酶切位点，插入经改造的原核表达载体pET-32a(-thrombin-S·Tag)(代号：^mpET-32a)，构建重组质粒pET-32a-thrombin-IFN-β-Gly¹。

延伸PCR方法扩增EK-IFN-β-Gly¹基因的反应体系均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连)，按商家的说明书设置。PCR反应条件为：94℃1min，60℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min，结果显示分别获得了500bp(thrombin-IFN-β-Gly¹)(SEQ ID NO：10)的目标条带。

PCR产物经低熔点琼脂糖纯化后，用Kpn I和Hind III双酶切后，回收目的片段，用T4DNA连接酶与同样经Kpn I和Hind III双酶切回收的质粒pET-32a连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10F′，用双酶切验证的方法筛选重组质粒pET-32a-thrombin-IFN-β-Gly¹(附图8、9)，经DNA测序(TAKARA，大连)后表明，扩增的thrombin-IFN-β-Gly¹基因与设计完全一致(SEQ ID NO：10)。将上述测序正确的质粒转化大肠杆菌表达宿主菌Origami DE3(Novagen)，成功构建pET-32a-thrombin-IFN-β-Gly¹/Origami DE3重组工程菌。

将表达最佳工程菌株划线接种于LA琼脂平板，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基试管中，30℃培养12小时，然后按1％的比例转接到含200mL LB培养液的1000mL三角瓶中，30℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含YT培养液的30L发酵罐中，37℃培养，整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30％以上，用28％的氨水调节pH并维持在7.0。至菌液OD600＝10～12时，加入终浓度为0.3mmol/L IPTG，同时下调温度为32℃，继续培养4小时后停止发酵，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。

粗纯化：将收集的上清通过Ni离子螯和纯化回收融合蛋白TRX-thrombin-IFN-β-Gly¹，在透析液(50mmol/LTris-HCl、0.15M Nacl、pH8.0)中透析过夜。

融合蛋白(TRX-thrombin-IFN-β-Gly¹)thrombin酶酶切：取透析过夜的融合蛋白，加入终浓度为1IU/ml的thrombin酶，于4℃下酶切12小时即可，酶切效率不低于90％。

精纯化：酶切后的样品经RP-HPLC(Waters公司C₁₈柱)纯化(流动相A液：0.1％三氟乙酸、5％乙腈，流动相B液：0.1％三氟乙酸、95％乙腈)，0-100％B线性洗脱进行纯化，离子交换(SP Sepharose FF)以及Superdex-75(Amersham Biosciences)(缓冲为PBS，pH7.4)凝胶柱层析获得重组IFN-β-Gly¹(SEQ ID NO：6)蛋白，纯度大于98.0％。

实例3制备的融合蛋白及重组人β干扰素的体外抗病毒活性试验

采用VSV(水泡口炎病毒)病毒攻击Wish细胞病变法。按药典2005版第三部中干扰素生物活性测定方法(附录VIII)，每孔按2×10⁴个细胞铺入96孔平底培养板中培养过夜，然后将待检样品与不同稀释度的标准品分别加入已接种Wish细胞的培养板中作用16-24小时。吸出所有培养液，将VSV用攻击培养稀释液稀释至100TCID₅₀，加入攻击24小时。结晶紫染色冲洗后70％乙醇溶解，OD₅₇₀测定OD值。通过与β干扰素国际活性标准品作对照，用Softmaxpro5.3软件计算抗病毒比活性，结果见表1(图10)。

表1抗病毒生物学比活性结果(三次平均值)

其中β-干扰素国际活性标准品(NIBSC)的半效稀释倍数(Er)为79.3，Es代表测定样品的半效稀释倍数。

序列表

<110>重庆富进生物医药有限公司

<120>融合表达重组制备人β干扰素

<130>2010

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu

20 25 30

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

35 40 45

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

50 55 60

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

65 70 75

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

80 85 90 95

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

100 105 110

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

115 120 125

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130 135 140

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145 150 155

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

160 165

<210>2

<211>495

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tcttacaacc tgcttggttt cctgcaacgt tcttccaatt ttcagtctca gaagctcctg 60

tggcaattga atgggaggct tgaatattgc ctcaaggaca ggatgaactt tgacatccct 120

gaggagatta agcagctgca gcagttccag aaggaggacg ccgcattgac catctatgag 180

atgctccaga acatctttgc tattttcaga caagattcat ctagcactgg ctggaatgag 240

actattgttg agaacctcct ggctaatgtc tatcatcaga taaaccatct gaagacagtc 300

ctggaagaaa aactggagaa agaagatttc accaggggaa aactcatgag cagtctgcac 360

ctgaaaagat attatgggag gattctgcat tacctgaagg ccaaggagta cagtcactgt 420

gcctggacca tagtcagagt ggaaatccta aggaactttt acttcattaa cagacttaca 480

ggttacctcc gaaac 495

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgggtaccga tgacgatgac aagtcttaca acctgcttgg t 41

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcaagctttc attagtttcg gaggtaacct gt 32

<210>5

<211>510

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gatgacgatg acaagtctta caacctgctt ggtttcctgc aacgttcttc caattttcag 60

tctcagaagc tcctgtggca attgaatggg aggcttgaat attgcctcaa ggacaggatg 120

aactttgaca tccctgagga gattaagcag ctgcagcagt tccagaagga ggacgccgca 180

ttgaccatct atgagatgct ccagaacatc tttgctattt tcagacaaga ttcatctagc 240

actggctgga atgagactat tgttgagaac ctcctggcta atgtctatca tcagataaac 300

catctgaaga cagtcctgga agaaaaactg gagaaagaag atttcaccag gggaaaactc 360

atgagcagtc tgcacctgaa aagatattat gggaggattc tgcattacct gaaggccaag 420

gagtacagtc actgtgcctg gaccatagtc agagtggaaa tcctaaggaa cttttacttc 480

attaacagac ttacaggtta cctccgaaac 510

<210>6

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Gly Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu

20 25 30

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

35 40 45

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

50 55 60

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

65 70 75 80

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

85 90 95

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

100 105 110

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

115 120 125

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130 135 140

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145 150 155 160

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

165

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctctagaaat aattttgttt aa 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cggtaccacc agaagaatga tg 22

<210>9

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgggtaccct ggtgccacgc ggttcttaca acctgcttgg t 41

<210>10

<211>510

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ctggtgccac gcggttctta caacctgctt ggtttcctgc aacgttcttc caattttcag 60

tctcagaagc tcctgtggca attgaatggg aggcttgaat attgcctcaa ggacaggatg 120

aactttgaca tccctgagga gattaagcag ctgcagcagt tccagaagga ggacgccgca 180

ttgaccatct atgagatgct ccagaacatc tttgctattt tcagacaaga ttcatctagc 240

actggctgga atgagactat tgttgagaac ctcctggcta atgtctatca tcagataaac 300

catctgaaga cagtcctgga agaaaaactg gagaaagaag atttcaccag gggaaaactc 360

atgagcagtc tgcacctgaa aagatattat gggaggattc tgcattacct gaaggccaag 420

gagtacagtc actgtgcctg gaccatagtc agagtggaaa tcctaaggaa cttttacttc 480

attaacagac ttacaggtta cctccgaaac 510

Claims

1.一种在大肠杆菌中可溶性融合表达人β干扰素和重组制备方法，其特征在于：融合蛋白标签为硫氧还原蛋白(TRX)，融合表达方式为：TRX-Linker-IFN-β，其中TRX位于N末端，IFN-β位于C末端，中间由连接肽Linker相连。

2.权利1中所述人β干扰素序列(SEQ ID NO：1)，第1位氨基酸前可带有甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)。

3.权利要求1中所述的重组融合蛋白中连接肽(Linker)含有专一性的蛋白酶切位点。

4.权利要求1、3中所述重组融合蛋白中连接肽含有位于蛋白酶酶切位点前的6×His标签。

5.权利要求3、4中所述蛋白酶切位点可以是肠激酶酶切位点DDDDK，或凝血酶酶切位点LVPRGS，或TEV酶酶切位点ENLYFQG，或凝血因子Xa酶切位点IE(D)GR等。

6.权利要求1中所述的重组制备人β干扰素的方法包括：

(1)构建含编码TRX-Linker-IFN-β的cDNA序列的重组质粒；

(2)重组质粒转化大肠杆菌Origami DE3，获得可溶性表达TRX-Linker-IFN-β的融合蛋白的菌株；

(3)表达菌株经发酵培养和诱导表达可用于重组制备的菌体；

(4)含人β干扰素的重组融合蛋白经破菌、融合蛋白的Ni螯和纯化、蛋白酶酶切、反相分离层析、离子交换及Superdex-75凝胶柱层析等步骤，制备重组人β干扰素的过程。

7.权利要求6所述的重组制备的人β干扰素具有更高的抗病毒活性和免疫调节作用，可作为一种治疗病毒性疾病和免疫性病变的药物。