CN103789321B - 一种重组人胸腺肽α1的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种应用于生物制药技术领域中的重组人胸腺肽α1的制备方法，所述方法包括步骤，人工合成胸腺肽α1四串体的全基因序列，具体设计为：在天然胸腺肽α1序列前面加上核酸限制性内切酶EcoRⅠ、羟胺切割位点天冬酰胺-甘氨酸对应的核苷酸；在每两个天然胸腺肽α1序列之间加上甘氨酸对应的核苷酸；在天然胸腺肽α1序列后面加上终止密码子、核酸限制性内切酶XhoⅠ对应的核苷酸；采用双酶切方法将胸腺肽α1四串体基因克隆至pGEX-4T-2质粒相应位点，构建融合表达载体pGEX-4T-2-4Tα1，将其转化至大肠杆菌得到基因工程菌，在IPTG诱导下以包涵体形式表达。该发明采用基因工程技术制备重组胸腺肽α1，以克服化学合成成本高且污染环境，解决串联Tα1下游裂解浓度低的问题，投入少，产出高，利润空间大，作用机理独特，效果明显。

Description

一种重组人胸腺肽α1的制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域中的一种重组人胸腺肽α1的制备方法。

背景技术

胸腺肽α1（Thymosinα1，Tα1），2010年进入中国药典后改名为胸腺法新。Tα1是一种酸性多肽，含有28个氨基酸，pI为4.2，相对分子量为3066kD（N端乙酰化的为3108kD），不含甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸，无二硫键及糖基化，唯一的修饰是N端乙酰化，氨基酸序列如下：

N—Ser—Asp—Ala—Ala—Val—Asp—Thr—Ser—Ser—Glu—Ile—Thr—Thr—

Lys—Asp—Leu—Lys—Glu—Lys—Lys～Glu—Val—Val—Glu—Glu—Ala—Glu

—Asn—C。在Tα1的一级结构中存在丙一丙、丝一丝、苏一苏、赖一赖、缬一缬、谷一谷等6处氨基酸重复序列，约占总量的一半，这在其他活性多肽中未曾见过。在水中Tα1无特殊的构型；在双十四烷基磷脂酰胆碱与二羟甲基丙酸(10：1)的单层囊泡、十二烷基硫酸钠溶液内或锌离子出现时，Tα1呈现部分空间构型；在疏水性较强的三氟乙醇中Tα1出现2个区域特征，即β转角和α螺旋，转角位于第5和8个残基之间，α螺旋构型位于第17和24残基之间。随环境而发生的构型变化是胸腺肽α1与淋巴细胞相互作用所必需的，与调节免疫应答及淋巴细胞激活机制有关。

Tα1是一种生物反应调节因子，主要是T淋巴系统的免疫增强剂。Tα1可以恢复T淋巴细胞的功能并促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生。在临床上经常将Tα1作为免疫增强剂或免疫调节剂用于各种免疫缺陷病和免疫受抑制疾病的治疗，已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症等疾病。

天然的Tα1其N端被乙酰化。有文献报道，去乙酰化的Tα1同样具有生物学活性。Tα1最早是Goldstin等从牛胸腺组织提取的胸腺素组份5（TF5）中分离出来的，现已用固相多肽合成技术成功合成，目前临床所用的Tα1制剂为化学合成制剂，而使用化学合成方法生产的N端乙酰化的Tα1，不仅成本高，价格昂贵，且制备要求条件高，污染环境等。

利用基因工程技术制备重组Tα1是解决上述问题的最佳途径。但是由于Tα1分子量较小，给制备重组Tα1带来一定的技术困难。如表达单体Tα1时，由于其分子量只有3.0kD，使其在下游的分离纯化过程中难度很大；亦有报道将Tα1_n（n为2-8）基因串联起来，表达n个串联的Tα1，后续采用裂解技术将其分为单体Tα1，如羟胺裂解、胰蛋白酶降解方法。由于胰蛋白酶降解方法不但成本高，而且特异性低，所以不适合工业化生产；羟胺裂解法由于条件剧烈，盐浓度要求高，导致蛋白溶解量很低，仅为0.02mg/ml，为后续的规模化生产带来困难。本发明提供的羟胺蛋白裂解方法可将蛋白溶解浓度提高到10mg/ml，大大提高了裂解效率和重组Tα1单体的产量。因此，研究开发一种重组人胸腺肽α1的制备方法是目前亟待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人胸腺肽α1的制备方法，该方法采用基因工程技术制备重组胸腺肽α1，以克服化学合成成本高且污染环境等缺点，解决了串联Tα1下游裂解浓度低的问题，不受自然资源的限制，可根据市场需求不限量的生产，具有投入少，产出高，利润空间大，作用机理独特，效果明显，无或低毒副作用。

本发明的目的是这样实现的：一种重组人胸腺肽α1的制备方法，所述方法包括步骤如下，

（1）人工合成胸腺肽α1四串体的全基因序列，具体设计为：在天然胸腺肽α1序列前面加上核酸限制性内切酶EcoRⅠ、羟胺切割位点天冬酰胺-甘氨酸对应的核苷酸；在每两个天然胸腺肽α1序列之间加上甘氨酸对应的核苷酸；在天然胸腺肽α1序列后面加上终止密码子、核酸限制性内切酶XhoⅠ对应的核苷酸；

（2）采用双酶切方法将胸腺肽α1四串体基因克隆至pGEX-4T-2质粒相应位点，构建融合表达载体pGEX-4T-2-4Tα1，将其转化至大肠杆菌得到基因工程菌，在IPTG诱导下以包涵体形式表达；

（3）重组胸腺肽α1的制备与纯化，具体方法是：重组胸腺肽α1四串体包涵体的溶解；重组胸腺肽α1四串体的纯化；重组胸腺肽α1四串体的裂解；重组胸腺肽α1单体的纯化；

所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1四串体包涵体的溶解是将包涵体按2%的比例溶解于3%的SDS溶液中，40℃，磁力搅拌溶解12-15小时；所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1四串体的纯化是将包涵体溶液直接经过Superose12层析柱，收集重组胸腺肽α1四串体存在于洗脱主峰；所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1四串体的裂解是将重组胸腺肽α1四串体的洗脱峰溶液对20mMTris，pH9.0的缓冲液透析，然后于45℃、pH9.0条件下，经终浓度为2.0M的羟胺裂解4h，即得单体胸腺肽α1；所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1单体的纯化是将裂解后的含单体胸腺肽α1的溶液直接经过SephadexG-25层析柱去盐，然后经HPLC制备液相精细纯化。

本发明的要点在于重组人胸腺肽α1的制备方法。其制备工艺基本原理是：（1）单体胸腺肽α1分子量较小，不利于下游的分离纯化，将其四个串联起来可以很好的进行后续纯化工艺。（2）建立羟胺裂解条件，不但提高了蛋白裂解浓度，也大大提升了裂解效率和单体胸腺肽α1的产量。（3）利用反相高效液相色谱法进行纯化可以很好地提高蛋白纯度。

一种重组人胸腺肽α1的制备方法与现有技术相比，具有该方法采用基因工程技术制备重组胸腺肽α1，以克服化学合成成本高且污染环境等缺点，解决了串联Tα1下游裂解浓度低的问题，不受自然资源的限制，可根据市场需求不限量的生产，具有投入少，产出高，利润空间大，作用机理独特，效果明显，无或低毒副作用等优点，将广泛的应用于生物制药技术领域中。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。

图1是pGEX-4T-2-4Tα1原核表达载体构建方案图。

图2是表达载体的酶切图谱。

图3是发酵菌体表达的重组胸腺肽α1四串体图。

图4是HPLC液相分离纯化结果图。

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

实施例一

1．构建胸腺肽α1四串体融合表达载体pGEX-4T-2-4Tα1。

将含胸腺肽α1四串体的质粒与pGEX-4T-2质粒分别用EcoRⅠ，XhoⅠ双酶切，然后连接，构建胸腺肽α1四串体融合表达载体pGEX-4T-2-4Tα1（如图1、图2所示）。

2．重组胸腺肽α1四串体的发酵及高效表达，具体是：工程菌的活化、发酵、诱导及包涵体的回收：取-70℃保存的工程菌株接种到含Amp的营养琼脂平板培养基上，37℃培养12-15小时；挑取单个菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃摇床培养12-15小时；将菌液按1:100比例接种到含Amp的发酵培养基内，37℃摇床培养12-15小时；将菌液按1:10比例接种到发酵罐内，37℃条件下培养；待菌液浓度达到OD₆₀₀约为2.0后，IPTG诱导培养4小时，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0。培养结束后，离心收集菌体，菌体用TE缓冲液悬浮，冰浴条件下，超声破碎菌体，反复4次。离心破碎后的菌体，收集沉淀，即为包涵体（如图3所示）。

3．重组胸腺肽α1四串体的溶解及纯化，具体是：

3.1包涵体的洗涤和溶解：称取适量包涵体，加入包涵体洗涤液洗涤2次后，按照2%的比例加入包涵体溶解液，室温下，磁力搅拌溶解12-15小时；4℃，9000rpm，离心10min，收集上清液，立即纯化。

3.2重组胸腺肽α1四串体的纯化：用平衡液平衡Superose-12层析柱，将上述溶解液浓缩后上样，流速为2.5ml/min；用平衡液洗脱，收集洗脱峰，经SDS蛋白电泳鉴定，目的蛋白存在于1号洗脱峰中。

3.3重组胸腺肽α1四串体的裂解：将上述1号洗脱峰样品对20mMTris，pH9.0的缓冲液透析过夜，每4小时换液一次，然后于45℃、pH9.0条件下，经终浓度为0.1M的Tris，2.0M的盐酸羟胺裂解4h，用无水甲酸调pH4.0左右终止裂解反应，即得单体胸腺肽α1。

3.4重组胸腺肽α1单体的纯化：用平衡液平衡SephadexG-25层析柱，将上述裂解后的样品上样去盐，流速为5ml/min，用平衡液洗脱，收集洗脱峰，采用尿素电泳鉴定。然后采用色谱系统为流动相A：0.1%TFA；流动相B：90%乙腈/水（含0.1%TFA）；10%-50%B线性梯度洗脱，流速2ml/min，50min内，得到纯度大于95%的胸腺肽α1单体（如图4所示）。

4．上述各液体配方范围及准备如下：

（1）LB液体培养基：以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌。胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。

（2）发酵培养基：以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌。胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl1g，CaCl₂0.1g，NH₄Cl1.5g，葡萄糖5g（115℃，单独高压），NaH₂PO₄·2H₂O1.5g，Na₂HPO₄·12H₂O6g。

（3）1mol/LIPTG：过滤除菌，-20℃保存。IPTG0.48g，水20ml。

（4）氨苄青霉素（Amp）：应用浓度为100μg/ml。Amp0.5g，水5ml。

（5）包涵体洗涤液：以1000ml为单位按下列比例配制。Tris1.21g，TritonX-1001ml，调pH8.0并补水至1000ml。

（6）包涵体溶解液：以100ml为单位按下列比例配制。SDS3g，补水至100ml。

（7）Superose12层析柱平衡液：以1000ml为单位按下列比例配制。Tris1.21g，SDS1.0g，调pH8.5并补水至100ml。

（8）SephadexG-25平衡液：以1000ml为单位按下列比例配制。1MTris50ml，NaCl5.85g，0.5MEDTA2ml，调pH8.0并补水至100ml。

在图2中M：分子量标准，从大到小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；1-10：表达载体pGEX-4T-2-4Tα1的酶切图谱。在图3中M：分子量标准，从大到小依次为97.2、66.7、44.3、29.8kD；1、2：诱导表达菌体沉淀；3：未诱导菌体沉淀。

Claims (2)

1.一种重组人胸腺肽α1的制备方法，其特征在于：所述方法包括步骤如下，

（1）人工合成胸腺肽α1四串体的全基因序列，具体设计为：在天然胸腺肽α1序列前面加上核酸限制性内切酶EcoRⅠ、羟胺切割位点天冬酰胺-甘氨酸对应的核苷酸；在每两个天然胸腺肽α1序列之间加上甘氨酸对应的核苷酸；在天然胸腺肽α1序列后面加上终止密码子、核酸限制性内切酶XhoⅠ对应的核苷酸；

（2）采用双酶切方法将胸腺肽α1四串体基因克隆至pGEX-4T-2质粒相应位点，构建融合表达载体pGEX-4T-2-4Tα1，将其转化至大肠杆菌得到基因工程菌，在IPTG诱导下以包涵体形式表达；

（3）重组胸腺肽α1的制备与纯化，具体方法是：重组胸腺肽α1四串体包涵体的溶解；重组胸腺肽α1四串体的纯化；重组胸腺肽α1四串体的裂解；重组胸腺肽α1单体的纯化；

所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1四串体包涵体的溶解是将包涵体按2%的比例溶解于3%的SDS溶液中，40℃，磁力搅拌溶解12-15小时；

所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1四串体的纯化是将包涵体溶液直接经过Superose12层析柱，收集重组胸腺肽α1四串体存在于洗脱主峰；

所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1四串体的裂解是将重组胸腺肽α1四串体的洗脱峰溶液对20mMTris，pH9.0的缓冲液透析，然后于45℃、pH9.0条件下，经终浓度为2.0M的羟胺裂解4h，即得单体胸腺肽α1。

2.根据权利要求1所述的一种重组人胸腺肽α1的制备方法，其特征在于：所述方法的步骤（3）重组胸腺肽α1单体的纯化是将裂解后的含单体胸腺肽α1的溶液直接经过SephadexG-25层析柱去盐，然后经HPLC制备液相精细纯化。