CN1641026A

CN1641026A - 基因工程重组胸腺素α1的制备工艺

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Publication number: CN1641026A
Application number: CN 200410025834
Authority: CN
Inventors: 党化宁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-01-17
Filing date: 2004-01-17
Publication date: 2005-07-20

Abstract

本发明涉及基因工程药物生物技术领域，具体涉及基因工程重组胸腺素α1的制备工艺。本发明要克服现有技术存在的成本高、价格昂贵，样品纯化复杂且污染环境的问题。它依次包括下述步骤，(1)重组胸腺素α1基因工程菌的构建：按照大肠杆菌惯用密码子将Tα1的28个氨基酸转化为核苷酸序列，在其基因前依次设计上核酸内切酶EcoRI、蛋氨酸、内切酶BamHI、天冬酰氨和甘氨酸对应的核苷酸序列；在其基因后依次设计上甘氨酸、核酸内切酶BglII、终止密码子和核酸内切酶PstI对应的核苷酸序列，采用酶切后实现基因的串联，得到Tα1的n(2－8)串体；(2)对基因工程菌进行诱导表达；(3)诱导基因工程菌的培养和高密度发酵；(4)融合蛋白的粗提、纯化和裂解；(5)胸腺素α1的纯化。

Description

基因工程重组胸腺素α1的制备工艺

所属技术领域：

本发明涉及基因工程药物生物技术领域，具体涉及基因工程重组胸腺素α1的制备工艺。

背景知识：

胸腺素α1(thymosin alpha 1，Tα1)是由28个氨基酸残基组成的热稳定酸性多肽，其结构为Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，分子量3108Ku，pI 4.2。Tα1是一种具有多种生物活性的免疫调节剂，能够增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原激活后产生IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7和CSF等多种淋巴因子的分泌；增加T细胞表面淋巴因子受体的水平；还能影响NK前体细胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后变得更有细胞毒性；在活体内Tα1能增加ConA激活后的小鼠淋巴细胞分泌IL-2，并增加IL-2受体的表达水平；配伍其它细胞因子还具有抗肿瘤作用。Tα1临床用途广泛，现已广泛应用于治疗乙肝、丙肝、恶性癌症和免疫缺陷等疾病的临床治疗和研究中。但目前国内外所应用的Tα1均为化学合成品，存在的问题是：1、成本高、价格昂贵，目前的价格是960元/支；2、样品纯化复杂，不利于扩大再生产；3、污染环境：在化学合成过程中，有机溶剂会对环境造成较大的污染。

发明内容：

本发明利用基因工程技术克服现有技术存在的成本高、价格昂贵，样品难以纯化、合成量较低且污染环境的问题。

基因工程重组胸腺素α1产品的制备工艺，其特殊之处在于，它依次包括下述步骤，(1)、重组Tα1基因工程菌的构建：按照大肠杆菌惯用密码子将Tα1的28个氨基酸转化为核苷酸序列，在其基因前依次设计上核酸内切酶EcoRI、蛋氨酸、内切酶BamHI、天冬酰氨和甘氨酸对应的核苷酸序列；在其基因后依次设计上甘氨酸、核酸内切酶BglII、终止密码子和核酸内切酶PstI对应的核苷酸序列，采用克隆载体酶切后实现基因的串联

EcoRI Met BamHI Asn Gly——Gly BglII Stop Pst I

GAATTC ATG GGATCC AAC GGC——GGC AGATCT TGA CTGCAG得到Tα1的n(2-8)串体，分别表示为Tα1①、Tα1②、Tα1③……Tα1 其表达载体转化大肠杆菌得到基因工程菌；

(2)对基因工程菌进行诱导表达；

(3)基因工程菌的培养和高密度发酵；

(4)融合蛋白的粗提、纯化和裂解：

①所述粗提用高温骤冷方法；

②所述纯化是层析方法；

③所述裂解是用羟胺法进行裂解，裂解出天然Tα1单体。

上述步骤(1)具体是：①合成以下4条目的基因片段

F1：AATTCATGGGATCCAACGGCAGCGACGCCGCCGTGGACACCAGCA(45mer)

F2：GCGAGATCACCACCAAGGACCTGAAGGAGAAGAAGGAGGTGGTGGAGGAGGCCGAGAACGGCAGATCTTGACTGCA(76mer)

F3：GTCAAGATCTGCCGTTCTCGGCCTCCTCCACCACCTCCTTCTT(43mer)

F4：CTCCTTCAGGTCCTTGGTGGTGATCTCGCTGCTGGTGTCCACGGCGGCGTCGCTGCCGTTGGATCCCATG(70mer)；②将合成片段断制备得到Tα1的n串体：将合成片段经磷酸化与退火，与克隆载体pGEM-3zf质粒连接，转化感受态大肠杆菌，进行重组质粒的序列测定，取正确的重组质粒进行Tα1基因串联得到Tα1的n串体，分别表示为Tα1①、Tα1②、Tα1③……Tα1 ；③经高效表达载体的构建和工程菌的建立，得到基因工程菌。

上述步骤(4)中所述的粗提是取诱导表达的菌体按比例加入Tris-HCl缓冲液中，利用细胞破碎仪破碎细胞，4℃搅拌裂解3～5h。60～85℃热处理5～20min，迅速冷却至0℃，离心、收集上清。把上清装入透析袋，用磷酸盐缓冲液透析24～36h，中间换液2～3次，离心收集上清液。

上述方案还包括(5)天然Tα1单体的纯化步骤：该步骤是将步骤(4)得到的物质中按比例加入NaAc-HAC缓冲液，4℃搅拌溶解，离心，上清上样于SP-Sheparose Fast Flow柱，收集各峰液，经Tricine-SDS-PAGE鉴定后确定单体所在峰。再经冷冻干燥后按比例加入Tris-HCl缓冲液溶解后上Q-Sheparose Fast Flow柱，平衡后，用0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，Tα1存在于洗脱主峰中。其纯度可达95％以上。

与现有技术相比，本发明的优点是：

①通过基因工程技术来制备Tα1：精巧的基因设计位点，经羟胺化学裂解后可以释放出天然Tα1，因此纯化出的Tα1与天然Tα1的结构完全相同，即Tα1的氨基端乙酰化这在国内外都是独一无二的，该产品与进口的化学合成产品在蛋白质结构和生物学活性方面完全相同；

②产品的表达量高：生物Tα1基因以串联体(相同的几个基因串在一起)的形式表达，增加了产品的表达量，融合蛋白的表达量可以达到40～50％；

③可实现大规模生产：制备过程中菌体的高密度发酵及目的蛋白的高效表达，为Tα1的大量制备提供了原材料，同时采用本工艺Tα1的回收率高，可达到15～20％。

具体说明如下，采用Tα1⑤工程菌发酵，以30L发酵罐为例，发酵密度OD₆₀₀为40-50，每升发酵液收集湿菌体50-100克，30升共发酵1500-3000克(平均2000克)，若每批发酵周期为2天，每周发酵3批，每个月发酵12批，(Tα1的产率及月经济效益分析)月共计收集湿菌体2000×12＝＝24000克，干菌体重24000×30％＝＝7200g(干重得率为30％)，菌体总蛋白：7200×50％＝＝3600g(菌体总蛋白占菌体干重的50％)，Tα1

融合蛋白：3600×45％×25％＝＝405g(融合蛋白的表达量40-50％，回收率20-30％)，Tα1得率：405×17.5％＝＝70.875g(融合蛋白裂解后，Tα1的回收率15-20％)；

④本发明工艺简单、可靠，生产成本大为降低。

附图说明：

图1是本发明的工艺流程图；

图2是胸腺素α1重组质粒的构建过程图。

具体实施方式：

下面将通过具体实施例对本发明作详细的描述。

参见图1和图2，本发明依次包括下述步骤

一、重组胸腺素α1基因工程菌的构建：

基因构建的设计方案是：按照大肠杆菌惯用密码子将人Tα1的28个氨基酸转化为核苷酸序列，在其基因前依次设计上核酸内切酶EcoRI、蛋氨酸、内切酶BamHI、天冬酰氨和甘氨酸对应的核苷酸序列；在其基因后依次设计上甘氨酸、核酸内切酶BglII、终止密码子和核酸内切酶PstI对应的核苷酸序列，采用酶切后实现基因的串联(如下所示)。

EcoRI Met BamHI Asn Gly——Gly BglII Stop PstI

GAATTC ATG GGATCC AAC GGC——GGC AGATCT TGA CTGCAG

基于上述的设计方案：1.1先合成出以下4条基因片段

F1：AATTCATGGGATCCAACGGCAGCGACGCCGCCGTGGACACCAGCA(45mer)

F3：GTCAAGATCTGCCGTTCTCGGCCTCCTCCACCACCTCCTTCTT(43mer)

F4：CTCCTTCAGGTCCTTGGTGGTGATCTCGCTGCTGGTGTCCACGGCGGCGTCGCTGCCGTTGGATCCCATG(70mer)

1.2合成片断的磷酸化与退火：溶解F1，F2，F3，F4使其终浓度为50-100pmol/μL，用T4多核苷酸激酶磷酸化后，100℃，2min，自然冷却至室温。

1.3 pGEM-3zf质粒的制备：挑取pGEM-3zf/DH5α单菌落，接种于含氨苄青霉素100μg/μL的10mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日收集菌体，提取质粒，溶于50μL水中备用。

1.4酶切、连接反应：取pGEM-3zf质粒1μg，用EcoRI和PstI双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下线性载体pGEM-3zf，回收纯化酶切片断。取退火的片断5μL，T4DNA连接酶1.0μL，连接缓冲液1.5μL和回收纯化的酶切片断5μL，纯水2.5μL，16℃连接过夜。

1.5感受态细胞制备：LB培养板上，挑取DH5α单菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养过液，次日晨按1％转接一次，继续振荡培养至OD₆₀₀0.3左右，停止培养，菌体冰浴10min，倒入预冷的无菌离心管中，4℃ 8000rpm离心5min，弃上清，加入1/2体积预冷的75mmol/L CaCl₂悬浮，再离心5min，弃上清，用100μl 25％甘油的75mmol/L CaCl₂悬浮，分装于Eppendorf管中，-70℃保存备用。

1.6宿主菌的转化：将1.4中的连接产物加入感受态细胞中，混匀后冰浴30min，42℃热休克90s，再冰浴5min，均匀涂布于含Amp100μg/mL的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜。

1.7重组克隆质粒DNA的提取及筛选：挑取单个菌落，接种于5mL含Amp100μg/mL的LB培养基中，37℃振荡培养过液。次日晨收集菌体，按质粒提取试剂盒提取质粒，取8μL提取的质粒DNA做酶切鉴定，1.5％琼脂糖电泳，紫外灯下观察电泳结果。经EcoRI和PstI双酶切，可见切下有120bp的片段，表明已成功地构建pEGM-3zf与Tα1重组质粒，命名为pEGM-3zf-Tα1①。

1.8重组质粒的序列测定：酶切鉴定的阳性克隆，接种于10mL含Amp100μg/mL的LB中，培养过夜，用试剂盒提取质粒DNA，测序进一步证实。

1.9 Tα1基因的串联：取酶切、测序证明正确的克隆经扩大培养后，提取质粒，分为2份。一份用BamHI和PstI酶切，回收其小片断(120bp)，一份用BglII和PstI酶切，回收其大片断(2698bp)。把回收的大小片断用T₄DNA连接酶连接，即得Tα1的2串体。经酶切测序证明正确的2串体克隆，同样可以得到Tα1的n(2-8)串体，分别表示为Tα1③……Tα1⑧。

1.10高效表达载体的构建：将含重组胸腺素α1基因的pEGM-3zf经EcoRI和PstI双酶切，回收Tα1

聚体，克隆入经EcoRI和PstI双酶切的pThioHisA中，形成pThioHisA-Tα1 重组质粒。

1.11基因工程菌的构建：将连接好的pThioHisA-Tα1⑤重组质粒用CaCl₂法转化TOP10菌株，在含Amp的LB琼脂平板上挑选菌落，接种于含Amp的LB培养液中过夜培养，提取质粒，用EcoRI和PstI双酶切鉴定和序列测定，筛选出目的菌株。

二、融合蛋白的诱导表达及鉴定

2.1基因工程菌的诱导表达：筛选出的目的菌株，接种于5mL含Amp 100μg/mL的LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀约0.4左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导表达4.5h。

2.2鉴定：

2.2.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：融合表达质粒pThioHisA-Tα1⑤转化E.coliTOP10，挑取克隆37℃培养过夜，按1％转接入含Amp100μg/mL的LB中，37℃振荡培养，1mmol/L的IPTG诱导，取500μL诱导和未诱导菌液离心取沉淀，加入30μL水及30μL 2×载样缓冲液混匀，沸水中煮5min，12000prm离心5min，取10μL上清进行12％SDS-PAGE，上样后电压为90V约20min，样品进入分离胶后电压升至110V约1.5h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2h，脱色直至背景清晰后进行胶的保存。12％SDS-PAGE检测表达情况，IPTG诱导者与未诱导者相比，在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带，与预计融合蛋白的分子量大小相符。

2.2.2 Western-Blot检测产物：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，转移缓冲液(25mmol/L Tris、192mmol/L Glycine、20％甲醇)，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02mol/LpH7.4 TBS、0.4％Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃1h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加鼠抗PH-ThioHisA，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入兔抗鼠IgG-AP二抗，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸镏水冲洗终止反应。表达产物经12％SDS-PAGE后，转移至NC膜，以鼠抗PH-Thioredoxin为I抗，兔抗鼠抗体为II抗，碱性磷酸酶显色，在NC膜上相应位置上呈现阳性结果，可见一明显显色带，分子量一致，未诱导菌株，标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性反应。

三、基因工程菌的培养及高密度发酵

3.1一级种子的制备挑选LB(含氨苄青霉素)平板上的单菌落接种于10mlLB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37℃160rpm振荡培养过夜。

3.2发酵种子液的培养把一级种子按1％的接种量接种于适量的改良的LB液体培养基(含氨苄青霉素)中，同样条件下培养菌体的密度至OD₆₀₀为2左右。

3.3基因工程菌的高密度发酵按5％的接种量把发酵种子液接种于含蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸盐、甘氨酸和甘油等为主要成分的复合培养基中，搅拌速度为100-800rpm，溶氧控制在20-40％，温度为37℃条件下，补料流加至OD₆₀₀约为30时，加入终浓度为5mmol/L的IPTG，再发酵4小时离心收集菌体。

四、融合蛋白的粗提、纯化及裂解

4.1融合蛋白的粗提：取诱导表达的菌体30g，用150mL 20mmol/L pH8的Tris-HCl(1.5ml 1mol/LMgCl₂，3.5mgDNase，适量EDTA)细胞破碎仪破碎细胞，4℃搅拌裂解3h。80℃热处理10min，冰浴，迅速冷却至0℃，4℃12000rpm离心15min，收集上清。上清装入透析袋，用pH5.5 10mmol/L的PB透析24-36h，换液2-3次，离心收集上清液。

4.2融合蛋白的纯化：取阴离子交换基质Q-Sepharose Fast Flow装柱，柱体积5.4×20cm，用10mmol/L pH5.5的PB平衡，上样后用含0.5mol/L NaCl的10mmol/L pH5.5的PB线性梯度洗脱，收集主峰即得到融合蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现表达的融合蛋白全部存在于上清中，说明诱导表达的重组蛋白是以可溶性形式存在的。

4.3融合蛋白的裂解：收集的融合蛋白在含2.0mol/L羟胺的0.1mol/LChes缓冲液(pH7.0)中45℃裂解24h。由于羟胺能够特异水解Asn-Gly之间的肽键，使Tα1氨基端恰好是乙酰基，裂解出天然Tα1单体。

五、胸腺素α1单体的纯化：

将步骤四得到的裂解的融合蛋白用50mL pH5.0的NaAc-HAC缓冲液(10mmol/L乙酸钠，1mmol/L 2-巯基乙醇和0.1mmol/L DTT)4℃搅拌溶解，12000rpm 4℃离心10min后，上清上样于SP-Sheparose Fast Flow柱，收集各峰液，经Tricine-SDS-PAGE鉴定后确定单体所在峰。再经冷冻干燥后用30mL50mmol/L pH8.0的Tris-HCl溶解后上Q-Sheparose Fast Flow柱平衡后，用0.5mol/L NaCl，50mmol/L pH8.0的Tri .HCl缓冲液线性梯度洗脱，收集各峰进行Tricine-SDS-PAGE分析。裂解后的融合蛋白经SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析，经Tricine-SDS-PAGE分析，Tα1仅存在于穿过液峰中，再经Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用0.5mol/L NaCl进行线性梯度洗脱，收集各峰进行分析，Tα1存在于洗脱主峰中，在0.13mol/L NaCl时被洗脱，纯度达95％以上。

六：合格样品的分装及冷冻干燥样品制剂的制备

6.1样品的分装：取检测合格的样品，经无菌过滤用pH6.8磷酸钠缓冲液稀释成含1.6mg/0.5ml(含6％的甘露醇)的Tα1溶液，装入灭菌的西林瓶中。

6.2冷冻干燥：对样品进行冷冻干燥、封口、包装和保存，并对样品进行抽检。

依据本发明得到的胸腺素α1的主要指标的鉴定方法如下：

1、胸腺素α1的分子量测定按资料配制16％T，6％C的分离胶和6％T，3％C的浓缩胶，将蛋白质样品与上样缓冲液混合均匀，沸煮2min，12000prm离心5min，进行Tricine-SDS-PAGE电泳。内槽装阴极缓冲液，外槽装阳极缓冲液，上样后，先40V约1h，当样品进入分离胶时，电压升至60V约2h。染色、脱色和胶的保存与一般SDS-PAGE类同。以肽分子量标准和被测纯化的Tα1进行Tricine-SDS-PAGE分析，以肽分子量的对数(1gMr)和样品在分离胶中迁移的距离(μ)进行线性回归分析。回归方程为y＝-0.0378x+4.5512，相关系数为r＝-0.962，查及被测Tα1的分子量为3135Ku，与其实际分子量(3108Ku)相符。

该技术较公知的测定方法简单，在普通实验室，利用常见设备即可完成。

2、胸腺素α1的pI测定：应用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦。制胶(7％)：向一小容器中依次加入3.45mL的30.8％的单体母液，0.75mL两性电解质，1.5mL97％甘油，9.15mL水及75μL 10％的过硫酸铵，充分混合后，用注射器加入模具中，室温凝固，4℃冰箱过夜。电泳：预先打开循环冷却器，使水温保持在4-10℃，冷却板上加几滴1％Tritonx-100做绝缘剂，铺上模板并加几滴1％Tritonx-100，将凝胶平铺于模板上。取10μL样品加至1×1.5cm滤纸片上，贴在凝胶表面，取宽0.8cm，长与凝胶宽度相等的纸分别用阴极电极液(1mol/LNaOH)，阳极电极液(1mol/L H3PO4)浸湿，置于凝胶两侧，将电极放在电极条上，功率1W/cm宽凝胶，1h后去掉点样纸片，继续通电1h。染色：电泳完毕，凝胶置于12.5％AcCl₃中固定30min，平衡液(乙醇100mL，冰醋酸32mL，水268mL)中放置30min，染色液(平衡液500mL，考马斯亮兰R-250 500mg)染色60min，平衡液中脱色至背景干净。纯化的Tα1样品，上样10μL，同时取标准蛋白上样。电泳时阳极为稀酸溶液，阴极为稀碱溶液。未通电时两性电解质Ampholine pH值约为7。通电后，两性电解质最低等电点的分子移向阳极，最高等电点的分子移向阴极，在净电荷为零的位置停止泳动，根据分子pI大小，在两个电极之间，从正极到负极等电点渐增，排成线性pH梯度。标准蛋白的pI值依次为：4.55 5.20 5.85 6.55 6.85 7.35 8.15 8.45 8.659.30，分析Tα1样品pI在3.50-4.55范围之内，与化学合成Tα1的pI4.2相符。

3、胸腺素α1的纯度鉴定：应用高压液相色谱，色谱柱为HypersilC₁₈(200mm×4mm)，流动相A液为0.1％三氟乙酸，B液为0.1％三氟乙酸与60％乙氰的混合物进行梯度洗脱，检测波长为228nm，样品用适量三氟乙酸溶解，精确吸取20ul注入液相色谱柱中，记录峰面积，按面积归一法计算Tα1的纯度。

4、胸腺素α1的生物活性测定：用³H-TdR掺入法，取小鼠脾脏在钢筛上研磨后用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，PBS洗后，悬于含10％FCS的1640培养液中，向96孔培养板中加入4×10⁵/孔的脾细胞和12.5μg/孔的ConA，每样设5个重复。CO2孵箱中37℃培养6h，再加入不同浓度的融合蛋白和胸腺素α1，继续培养72h，每孔加入³H-TdR 18.5×10³GBq继续培养6h，收获细胞于玻璃纤维滤纸上，晾干后测定cpm值，按下列公式计算出增殖率。

Claims

1、基因工程重组胸腺素α1的制备工艺，其特征在于：它它依次包括下述步骤，(1)、重组Tα1基因工程菌的构建：按照大肠杆菌惯用密码子将Tα1的28个氨基酸转化为核苷酸序列，在其基因前依次设计上核酸内切酶EcoRI、蛋氨酸、内切酶BaomHI、天冬酰氨和甘氨酸对应的核苷酸序列；在其基因后依次设计上甘氨酸、核酸内切酶BglII、终止密码子和核酸内切酶PstI对应的核苷酸序列，采用克隆载体酶切后实现基因的串联

EcoRI Met BamHI Asn Gly——Gly BglII Stop PstI

GAATTC ATG GGATCC AAC GGC——GGC AGATCT TGA CTGCAG

得到Tα1的n(2-8)串体，分别表示为Tα1①、Tα1②、Tα1③……Tα1 其表达载体转化大肠杆菌得到基因工程菌；

(2)对基因工程菌进行诱导表达；

(3)基因工程菌的培养和高密度发酵；

(4)融合蛋白的粗提、纯化和裂解：

①所述粗提用高温骤冷方法；

②所述纯化是层析方法；

③所述裂解是用羟胺法进行裂解，裂解出天然Tα1单体。

2、如权利要求l所述的基因工程重组胸腺素α1的制备工艺，其特征在于：所述步骤(1)具体是，①合成以下4条目的基因片段

F1：AATTCATGGGATCCAACGGCAGCGACGCCGCCGTGGACACCAGCA(45mer)

F3：GTCAAGATCTGCCGTTCTCGGCCTCCTCCACCACCTCCTTCTT(43mer)

3、如权利要求1或2所述的基因工程重组胸腺素α1的制各工艺，其特征在于：所述步骤(4)中所述的粗提是取诱导表达的菌体按比例加入Tris-Hel缓冲液中，利用细胞破碎仪破碎细胞，4℃搅拌裂解3～5h；60～850℃热处理5～20min，迅速冷却至0℃，离心、收集上清；把上清装入透析袋，用磷酸盐缓冲液透析24～36h，中间换液2～3次，离心收集上清液。

4、如权利要求3所述的基因工程重组胸腺素α1的制备工艺，其特征在于：还包括(5)天然Tα1单体的纯化步骤，该步骤是将步骤(4)得到的物质中按比例加入NaAc-HAC缓冲液，4℃搅拌溶解，离心，上清上样于SP-Sheparose FastFlow柱，收集各峰液，经Tricine-SDS-PAGE鉴定后确定单体所在峰；再经冷冻干燥后按比例加入Tris-HCl缓冲液溶解后上Q-Sheparose Fast Flow柱平衡后，用0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，Tα1存在于洗脱主峰中。