CN100371349C - 重组免疫治疗蛋白及其表达方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种重组免疫治疗蛋白及其表达方法与应用。本发明的重组免疫治疗蛋白，是天然存在的过敏原衍生的非天然存在的变异体与白介素衍生的非天然存在的变异体进行嵌合；所述的重组免疫治疗蛋白是在自主性克隆花粉中的泛过敏原及人源白介素的全长编码基因后，仅截取这两类基因的全长编码基因的开放阅读框，通过抗原性改造和嵌合后，装载在蛋白质表达载体中，在人工控制的条件下，获得高纯度的、非生物来源的重组蛋白质；该重组蛋白与特异性IgE的结合性能比所述天然存在的过敏原同特异性IgE的结合性能相当或减少，以该重组蛋白为主要成分的药物能调节人体Th1/Th2的平衡，达到免疫治疗的效果。

Description

重组免疫治疗蛋白及其表达方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组免疫治疗蛋白及其表达方法与应用。

背景技术

变态反应性疾病随着城市化及工业化进程的推进正不断增多，成为日益突出的健康问题，这一点已经引起世界范围的研究者的广泛关注。仅2000年01月01日至2004年09月01日的4年时间里，涉及变态反应疾病(allergy)的研究文献就多达30000多份，占同期免疫学方向研究文献的近四分之一。在我国，对过敏原的研究工作起步较晚，特别是在过敏原基因克隆、过敏原标准化、低过敏原性过敏原(Hypoallergen)疫苗等方面的研究显得相对较弱。在诊断治疗方面，国内一般多应用变应原浸提液，与医药现代化的要求相悖，随时可能被停止。因此，近年来应用UNICAP、ALK、阿罗格等方面的试剂盒进行诊断、治疗的比例不断增多；刚刚获得美国FDA认证的anti-IgE(Omalizumab，又名Xolair)，是一种具有广谱性治疗作用的生物工程药，虽然暂时没有进入中国市场，却被人们普遍期待。这些国外垄断产品的推广正逐渐在国内变态反应临床领域占有越来越多的份额。在这些先进技术的普遍应用环境下，我国曾经拥有的变态反应学优势地位的一些单位也经受着越来越激烈的考验。因此，寻求技术含量更高、应用效果更好的变应原疫苗应用于临床，是变态反应学发展的方向，也是我们紧跟国际前沿动态、巩固和扩大自身优势的唯一出路。采用生物技术手段开发新型多功能治疗性疫苗应用于免疫性疾病，对于捍卫潜力巨大的中国市场、促进民族医药工业的稳步发展，不仅十分必要，而且相当紧迫。

过敏原的交叉反应在三个层次上广泛发生。不同过敏原存在氨基酸一级结构上的同源性；一些蛋白质(如profilin等泛过敏原)在从植物到人类的整个进化树中相当保守，它们在过敏原交叉反应中起着重要作用，这类过敏原被称为泛过敏原；不同物种来源的某些过敏原间享有共同的空间结构特征，因而形成相似的抗原性表位及过敏原性表位。交叉反应性过敏原/泛过敏原的存在被认为是病人对多种过敏原过敏的主要原因。

免疫治疗法是过敏性疾病的最佳治疗方案，该方法首见报道于1911年，其后广泛采用而流传至今，制备过敏原疫苗是免疫治疗过程中的关键步骤。但是，传统的免疫疗法依赖于花粉浸提液，由于其成分复杂而且无法进行标准化定量，因此存在诸多缺点(如见效慢，需要病人长期坚持，有诱发过敏的危险等)，从而使其应用受到了一定的限制。

与天然过敏原浸提液相比，重组过敏原的产量高，生产条件稳定，方便进行过敏原的标准化，利于临床诊断和治疗。因此对重组过敏原基因的研究正呈现急剧增长的态势，并成为变态反应学的研究热点，大量的过敏原序列数据因此登录到了公共数据库。截止2005年9月12日，仅在国际免疫学联合会过敏原命名分会登记的过敏原就有494份之多，涉及173个物种。而从理论上讲，任何蛋白质都可能是潜在的过敏原，可以肯定地说，有更多的过敏原数据未曾被发掘。因而，简单意义上的重组过敏原的生产，其实质是穷举法的应用--重组所有可能的过敏原方能回避浸提液的应用，这对于利益迥异的各个研发单位而言，显然是不现实的。开发能有效治疗不同类型过敏症的免疫治疗疫苗已经成为新的研究热点。anti-IgE(Omalizumab，又名Xolair)即是针对I型变态反应的核心介质IgE、并对多种变态反应性疾病有效的新型药物。关于重组蛋白的表达方式，研究显示，采用毕植酵母表达的糖基化的和未糖基化的屋尘螨过敏原rDer f 1与天然的过敏原nDer f1之间并无差异，二者与过敏病人IgE结合特性相似。诸多其它类似的研究结果提示：应用酵母等真核表达载体所追求的糖基化等目标对于IgE结合特性可能贡献不大；应用原核表达载体获得的重组蛋白对于过敏原的临床应用而言一样有效。

白细胞介素(Interleukin，IL)是一组具有介导白细胞间相互作用的细胞因子，在免疫系统建成与发育过程中发挥着重要作用。自1979年第一个白细胞介素被命名后，发现和克隆新的白细胞介素一直是国际免疫学研究的热点。而从1999年11月开始到2000年底，由于生物信息学的快速发展，仅仅一年的时间里至少有5个新的白细胞介素被发现，并有一些白介素类似物被报道，形成了新的白介素研究热潮。1988年，白细胞介素10(IL-10)作为一类细胞因子生成抑制因子(CSIF)而被Mossman和Coffman发现，随后大量的研究围绕IL-10的结构与功能而展开。1991年，Vieira等首先克隆了人的IL-10cDNA，它编码178个氨基酸的多肽前体，该前体由两部分构成，N端18个氨基酸的信号肽和其后的160个氨基酸的成熟肽。与其它的细胞因子一样，IL-10在许多不同类型的细胞中发挥着多种生物学功能，被认为是最重要的细胞因子之一。

综合研究文献认为，IL-10是一类多效性细胞因子，可由巨噬细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、角质细胞和一些肿瘤细胞系产生，并在不同细胞上表达不同的功能。研究认为，T_R细胞发挥功能的标志性细胞因子为IL-10。IL-10能抑制炎性细胞(如单核细胞、淋巴细胞等)的粘附、浸润。如强烈抑制巨噬细胞、Th1细胞、B细胞和NK细胞，从而在控制自身免疫性疾病方面起着重要作用；它能通过抑制单核吞噬细胞等的表面抗原的表达，抑制表面抗原的提呈能力，减弱或消除T、B细胞介导的免疫应答，从而在抗过敏及抗炎过程中发挥着重要作用；IL-10能直接作用于T细胞上的CD28协同刺激受体，阻断CD28酪氨酸磷酸化过程和CD28分子介导的信号传导通路，从而有效抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生，诱导T细胞耐受。另一方面，IL-10能刺激肥大细胞，B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育，促进CD4⁺T细胞产生IFN-γ、TNF-a、IL-2和IL-4，从而启动获得性免疫。IL-10是一类有效的抗炎性细胞因子，具有免疫调节活性，在关节炎、结肠炎、节段性回肠炎、内毒素血症、过敏性鼻炎、哮喘等病理过程中起着非常重要的作用。它能抑制Th2细胞合成的多种细胞因子的分泌和炎症性酶类(如iNOS等)的合成与分泌、减少IgE产生、提供机体对过敏原的耐受性等。同时，IL-10还能促进抗炎症因子的表达，提高机体的免疫力。IL-10不仅抑制TNF和趋化性细胞因子，也抑制某些基质蛋白酶如MMP-9(可能破坏肺实质中的弹性蛋白)。此外，IL-10可增加MMPs组织抑制剂TIMPs(内源性MMPs抑制剂)的释放。

尽管IL-10可以被机体耐受，但对血液也有副作用。由于全身给药的副作用，单纯依赖天然的IL-10抑制Th2型细胞因子这一功能的希望不大。然而，作为非特异性细胞因子抑制剂，IL-10的副作用一方面可以通过局部用药或吸入途径得到降低，另一方面可以通过基因重组和杂合蛋白的方式对其进行改造。关于杂合蛋白的应用则可从最新的融合蛋白构建方法及低过敏原性过敏原的最新研究中得到启示。

吸入过敏原后肺部树突状细胞能瞬时表达IL-10，并进一步刺激CD4+T_R样细胞的发育并大量产生IL-10，从而诱导T细胞耐受。在养有动物或牲畜的家中长大的儿童较少发生过敏反应；而与猫有较多生活接触、暴露在大量的猫主要过敏原Fel d1中的儿童则会被诱导T细胞耐受。另外，一些泛过敏原(panallergen)蛋白质(如钙结合蛋白、profilin、转脂蛋白和病程相关蛋白等)在从植物到人类的整个进化树中相当保守，这些蛋白易于引起不同类型的变应原间的交叉反应，应用这类过敏原进行免疫治疗则会显示一定的广谱性特点。在这个意义上，泛过敏原与白介素之间有着某种天然的联系。将泛过敏原与白介素分别进行抗原性改造后予以拼接，遵循杂合蛋白的构建法则，预期能发挥其多效性特点，不仅对占总人口40-50％的变态反应性疾病显效，而且在涉及T_Reg细胞治疗功能方面的上述关节炎等免疫性疾病、某些感染性疾病甚至是癌症中将发挥明显作用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有免疫治疗上存在的问题，提供一种重组免疫治疗蛋白，以克服大量重组过敏原或浸提液应用的障碍，应用于变态反应特应性人群和其他类型免疫性疾病，以提高免疫治疗疗效，缩短治疗周期，从而替代过敏原免疫治疗。

本发明的另一个目的是提供编码上述重组免疫治疗蛋白的基因。

本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒载体。

本发明的另一个目的是提供上述基因转化的重组表达宿主。

本发明的另一个目的是提供上述重组免疫治疗蛋白的表达方法。

本发明的进一步目的是提供上述重组广谱型免疫治疗蛋白在制备用于治疗

烧伤、烫伤、各种炎症反应、器官移植后的抗排斥反应或Th1/Th2失衡疾病的药物或疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的重组免疫治疗蛋白，是天然存在的过敏原衍生的非天然存在的变异体与白介素衍生的非天然存在的变异体进行嵌合，得到一种新的基因和蛋白，构成重组广谱型免疫治疗蛋白的核心，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO∶1所示；所述的重组广谱型免疫治疗蛋白是在自主性克隆花粉中的泛过敏原及人源白介素的全长编码基因后，仅截取这两类基因的全长编码基因的开放阅读框，通过抗原性改造和嵌合后，装载在蛋白质表达载体中，在人工控制的条件下，获得高纯度的、非生物来源的重组蛋白质；该重组蛋白质的部分区段与所述天然出现的过敏原或白介素具有基本上相同的a-碳骨架结构，该重组蛋白与特异性IgE的结合性能比所述天然存在的过敏原同特异性IgE的结合性能相当或减少，以该重组蛋白为主要成分的药物能调节人体Th1/rh2的平衡，达到免疫治疗的效果。

本发明的重组广谱型免疫治疗蛋白的表达方法，具体如下所示：

(1)获得目的基因：抽提白干层、葎草或豚草花粉的总RNA，逆转录后进行聚合酶链式反应，PCR所得的条带回收并连接pGEM-T载体后，转化大肠杆菌DH5a，阳性克隆经测序证实后，得到全长泛过敏原基因TT；依据所得基因序列设计引物，进行cDNA末端快速扩增，获得不同cDNA末端，采用桥式PCR获得过敏原性得到改造的新的泛过敏原全长基因TT’；PCR退火温度为52～72℃。

(2)采用RT-PCR的方法从病人外周血单个核细胞中扩增得到白细胞介素全长cDNA，采用桥式PCR获得过敏原性得到改造的新的白细胞介素LL’；PCR退火温度为52～72℃；

(3)采用桥式PCR方法分别将新的泛过敏原全长基因TT’和新的白细胞介素LL’进行嵌合，得到嵌合基因LTT；PCR退火温度为52～72℃；

(4)将嵌合基因LTT导入表达载体pET44，以使得插入片段的起始密码子位于翻译的起始密码子位置，转化大肠杆菌DH5a，得到重组微生物，保藏号为CCTCC M 205107，保藏日期为2005年9月29日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址是中国武汉市武汉大学，分类命名是大肠杆菌(DE3)-LTT，Escherichia coli(DE3)-LTT。选择阳性克隆进行蛋白的直接表达；除了转化微生物外，本发明的嵌合基因还可以转化其它表达宿主，如酵母、昆虫、植物等。

(5)所得重组微生物发酵，培养温度为4～38℃，培养基为LB培养基，通过调整培养基中的氨基酸、蔗糖、葡萄糖的含量以及保持培养温度为4～38℃，从而获得目标蛋白的最大表达量及最佳的水溶性；

(6)通过蛋白快速纯化系统kTA FPLC纯化获得目标蛋白质：细菌经裂解液在室温条件下完全裂解后，以10000～40000g/min的离心力进行离心，上清液即为上柱样品，第一峰即为纯的重组蛋白，定量后冻干保存；所述裂解液为15-100mM Tris-HCl，50-300mM NaCl，0.01％-1.5％ Triton X 100。除以上方法外，本发明的重组蛋白还可以通过离心、过滤、压缩过滤、真空干燥或其它工业化的方法和过程进行纯化获得。

纯化后的蛋白上SDS-PAGE后，只看到一单条带(见图2)。

本发明的重组广谱型免疫治疗蛋白的表达，还可以直接采用所保藏的重组微生物发酵，纯化发酵物得到。具体如下：

(1)发酵：培养温度为4～38℃，培养基为LB培养基。

(2)所得发酵物通过蛋白快速纯化系统KTA FPLC及亲和纯化获得目标蛋白质：通过离心、过滤或压缩过滤收集菌体，后经裂解液在室温条件下完全裂解细菌后，以10000～40000g/min的离心力进行离心，上清液即为上柱样品；过柱后第一峰即为纯的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，定量后冻干保存；所述裂解液为15-100mM Tris-HCl，50-300mM NaCl，0.01％-0.5％ TritonX 100。

应用于本发明时PCR退火温度为52～72℃。

所得重组广谱型免疫治疗蛋白最多只有55％的氨基酸残基与已在GenBank中登录的过敏原基因序列或其它蛋白序列相同，即所述的重组广谱型免疫治疗蛋白所包含的泛过敏原和白介素这两个关键区段不会在其它嵌合蛋白中同时出现。

该重组广谱型免疫治疗蛋白与其它(嵌合)蛋白作相似性比较时，在非重复序列区段上所具有的相同或相似的氨基酸残基的个数不会超过160个；而所述的重组广谱型免疫治疗蛋白的两个区段泛过敏原和白介素分别与其它(嵌合)蛋白作相似性比较，其它(嵌合)蛋白的两个区段或组分享有的相同氨基酸残基数不会同时达到所述的重组广谱型免疫治疗蛋白中全部氨基酸残基数目的56％或以上。

本发明的重组广谱型免疫治疗蛋白可制成各种适用的药物剂型或疫苗，用于治疗免疫性疾病。还可以用于治疗烧伤、烫伤、各种可能的炎症反应、甚至是器官移植后的抗排斥反应及其它Th1/Th2失衡的疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的重组广谱型免疫治疗蛋白具有氨基酸序列的确定性及可塑性。确定性在于：该重组广谱型免疫治疗蛋白的基本构件LL和TT具有各自特有的结构域，该结构域不发生改变，则其功能和特征不会发生改变。同时，其非结构域区段的各种氨基酸的改变，并不会改变本重组广谱型免疫治疗蛋白的功能和特征，从而显示其可塑性。

2.本发明的重组广谱型免疫治疗蛋白的构造原理目前在国内外未见文献报道，也未见相类似的专利登记，该重组广谱型免疫治疗蛋白的功能在烧烫伤模型、过敏性鼻炎、哮喘等疾病中得到证实。

3.通过将本发明的重组广谱型免疫治疗蛋白应用于变态反应领域，可以在非特异性地确诊过敏性疾病后即开始展开治疗，而无需作特异性诊断，从而回避特异性诊断与治疗过程中多种过敏原的应用与制作，实现单一研发单位无力完成的研究任务。既节约大量的人力、物力和财力，同时能产生可观的社会经济效益。

4.本发明应用于治疗烧伤、烫伤，可以明显减轻炎症反应，促进伤口愈合；于器官移植后应用，可以明显减轻抗排斥反应。本项功能可在一定程度上降低移植配型的要求，从而为成功的移植提供保障。

附图说明

图1为基因克隆过程图；

图2为蛋白的表达与纯化鉴定试验结果图；

图3为重组免疫治疗蛋白应用于烫伤模型动物的实验结果图。

其中，图1中，A，从植物花粉(A1)和人血细胞(A2)提取的RNA经Agarose胶电泳结果；B，白介素编码基因前体cDNA(左)及泛过敏原基因编码区(右)的克隆；C，LTT嵌合基因的构建。图2中，A，蛋白的表达与纯化试验；B，目标蛋白表达的可溶性鉴定及纯化结果，示目标蛋白绝大部分为可溶，并且得到有效纯化；C，重组蛋白上KTA FPLC系统纯化时的紫外图谱，目标蛋白落在第一峰。

具体实施方式

实例1重组广谱型免疫治疗蛋白的表达与纯化

(1)获得目的基因：抽提豚草花粉的总RNA，逆转录后进行聚合酶链式反应，PCR所得的条带回收并连接pGEM-T载体后，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆经测序证实后，得到全长过敏原基因TT；依据所得基因序列设计引物，进行cDNA末端快速扩增，获得不同的cDNA末端，采用桥式PCR获得过敏原性得到改造的新的泛过敏原全长基因TT；PCR退火温度为58～68℃。

(2)采集人外周血，采用梯度离心Ficoll法分离单个核细胞并抽提RNA；采用RT-PCR的方法扩增得到白细胞介素全长cDNA，并行T/A克隆，测序验证后，采用桥式PCR获得过敏原性得到改造的新的白细胞介素LL；PCR退火温度为60～69℃；

(3)采用桥式PCR方法分别将新的泛过敏原全长基因TT和新的白细胞介素LL进行嵌合，得到嵌合基因LTT；PCR退火温度为58～70℃；见图1。

(4)将嵌合基因LTT导入表达载体pET44，以使得插入片段的起始密码子位于翻译的起始密码子位置，转化大肠杆菌DH5α，得到重组微生物，中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 205107。选择阳性克隆进行蛋白的直接表达；

(5)将所得重组微生物在培养基中培养10小时，保持培养温度为35℃，培养基的配方为基本的LB培养基，即胰蛋白胨2％，酵母提取物1％，盐2％。培养物离心后收集菌体。加入上样缓冲液后在沸水浴中裂解，上SDS-PAGE胶对比检测加入诱导剂与不加诱导剂的差异，及预期的目标条带与蛋白分子量标准的相对位置，从而初步判断目标蛋白得到正确表达。经免疫印迹试验对目标蛋白进行最后确证。

(6)按照上述条件对目标蛋白进行大量表达。通过蛋白快速纯化系统kTAFPLC纯化获得目标蛋白质：即细菌经裂解液在室温条件下完全裂解后，以20000-32000g/min的速度进行离心，上清液经蒸馏水充分透析并冻干后即为上柱样品。经两次凝胶过滤后，收集的第一峰即为纯的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，定量后冻干保存；所述裂解液为15-100mM Tris-HCl，50-300mM NaCl，0.01％-0.5％Triton X 100。纯化后的蛋白上SDS-PAGE后，看到只有一单条带(见图2)。

实例2重组广谱型免疫治疗蛋白对烫伤的治疗作用

将纯化后的目标蛋白溶于PBS溶液中，配制三种浓度的重组广谱型免疫治疗蛋白(64μg/ml、320μg/ml、1600μg/ml)，以市售烫伤1号和烫伤2号为对照，进行烫伤模型动物的治疗试验。首先，建立烫伤动物模型：随机挑选适龄的成年大鼠雌雄各10只，体重在250g以上，并编号，常规饲养1周后，用脱毛剂脱大鼠背部的长毛，面积约1.5×1.5厘米，饲养1天后进入试验。剪出1.5×1.5厘米的方形纱布块，沸水中泡煮待用。脱毛后的大鼠用乙醚麻醉后，将煮泡在开水中的纱布迅速贴在脱毛处，开始计时，30秒后取走纱布，结束烫贴，注射林格氏液约1.5ml防休克，等大鼠自行苏醒后，即开始涂药，每日早晚各一次，每天记录伤口愈合情况并照相，共20日。结果显示，在烫伤后第3天治疗组和对照组无显著性差别，在第10天，较对照组先脱痂，在第17天治疗组愈合情况较对照组好，创面更光滑，较少有渗液。最后综合评价结果认为：应用所述的重组蛋白组与药物对照组和阴性对照组比较，明显结痂快、脱痂早，创面愈合好。(见图3)。

Untitled.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>广州医学院第二附属医院

<120>重组免疫治疗蛋白及其表达方法与应用

<130>

<160>1

<170>Patentln version 3.2

<210>1

<211>293

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Ser Trp Gln Ala Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp Ile Asp

1               5                   10                  15

Gly Gln Gly Gln His Leu Thr Ala Ala Ala Ile Ile Gly Leu Asp Gly

            20                  25                  30

Ser Ile Trp Ala Gln Ser Ser Ser Phe Pro Gln Leu Lys Pro Gln Glu

        35                  40                  45

Ile Thr Asp Ile Thr Lys Asp Phe Glu Glu Pro Gly His Leu Ala Pro

    50                  55                  60

Thr Gly Leu His Leu Ser Gly Thr Lys Tyr Met Val Ile Gln Gly Glu

65                  70                  75                  80

Pro Gly Ala Val Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ser Gly Gly Val Thr Ile

                85                  90                  95

Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Ile Phe Gly Ile Tyr Glu Glu Pro Val

            100                 105                 110

Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Leu Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu

        115                 120                 125

Ile Asp Gln Gly Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser

    130                 135                 140

Cys Thr His Phe Pro Gly Ash Leu Pro Ash Met Leu Arg Asp Leu Arg

145                 150                 155                 160

Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu

                165                 170                 175

Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Lèu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr

            180                 185                  190

Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu

        195                 200                 205

Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val

    210                 215                 220

                                               Untitled.ST25

Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg

225                 230                 235                 240

Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln

                245                 250                 255

Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala

            260                 265                 270

Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr

        275                 280                 285

Met Lys Ile Arg Asn

    290

Claims (5)

1.重组免疫治疗蛋白，是由泛过敏原的非天然的变异体与人源白介素的变异体嵌合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有编码权利要求1所述重组免疫治疗蛋白的基因的重组质粒载体转化大肠杆菌DE3得到的重组微生物，于2005年9月29日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 205107。

3.一种权利要求1所述重组广谱型免疫治疗蛋白的表达方法，其特征在于，利用权利要求2所述保藏的重组微生物发酵，并收集发酵物处理后得到。

4.根据权利要求3所述的表达方法，具体如下：

(1)发酵：培养温度为4～38℃，培养基为LB培养基；

(2)所得发酵物通过蛋白快速纯化系统AKTA FPLC及亲和纯化获得目标蛋白质：通过离心、过滤或压缩过滤收集菌体，后经裂解液在室温条件下完全裂解细菌后，以10000～40000g/min的离心力进行离心，上清液即为上柱样品；过柱后第一峰即为纯的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，定量后冻干保存；所述裂解液为15-100mM Tris-HCl，50-300mM NaCl，0.01％-0.5％TritonX 100。

5.权利要求1所述重组免疫治疗蛋白在制备用于治疗烧伤、烫伤的药物中的应用。

Images