CN102180962A

CN102180962A - 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102180962A
Application number: CN2011100644560A
Authority: CN
Inventors: 卢丹琪; 张旭; 贝锦新; 陈洁琳; 易诗白; 冷婷婷; 林浩然
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-03-17
Also published as: CN102180962B

Abstract

本发明公开了一种黑青斑河鲀干扰素IFNγ1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，编码基因的制备方法，是用引物序列SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为引物克隆得到干扰素蛋白IFNγ1的编码基因；同时还公开了干扰素蛋白IFNγ1的制备方法，是将黑青斑河鲀IFNγ1的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河鲀干扰素IFNγ1。本发明的黑青斑河鲀干扰素IFNγ1可以用于制备鱼类免疫调节添加剂或免疫佐剂，具有诱导鱼类免疫基因表达的作用。

Description

黑青斑河鲀干扰素IFNγ1及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种黑青斑河鲀Ⅱ型干扰素IFNγ1的编码基因、蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

细胞免疫因子γ干扰素（IFNγ），作为干扰素系统中重要的Ⅱ型IFN，是主要的巨噬细胞刺激因子和调控免疫反应的关键信号分子，能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞(NK)和巨噬细胞活性，促进免疫球蛋白的转换，具有抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用。干扰素IFNγ1和IFNγ2基因是鱼类IFNγ基因的两个亚型，其氨基酸序列的特征是含有两个保守结构，包括：氨基酸序列中的6个α-螺旋和在靠近其氨基酸序列 C 端的F螺旋中均存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[IV]这个保守结构，这与已研究过的其他区中的IFNγ二级结构类似。

IFNγ具有广泛的生物学活性。目前已知干扰素作为细胞因子的重要类型，是细胞和机体受到病毒感染或受核酸、细菌内毒素等诱导时，由受体细胞分泌的一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，能诱导细胞进入抗病毒状态。IFNγ是由Th1细胞产生的细胞因子。它主要通过与其受体结合，活化 JAK-STAT 信号通路，激活下游基因的转录，包括相关转录因子和免疫分子，如 STAT1、IRF1、ICSBP和MHCⅡ等，从而诱导巨噬细胞产生毒性物质消灭胞内细菌，诱导宿主内一些抗病毒蛋白的合成，调节T细胞的增殖和分化以及增强抗原提呈作用，达到保护宿主的目的。

IFNγ抗病毒机理主要是能提高细胞表面 MHC 类分子表达，有助于向细胞毒性T细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解，此外还可以通过下游基因的转录及抗病毒效应基因表达而达到抗病毒作用。对于表达 MHCⅠ类抗原的细胞，IFNγ可以诱导Ⅰ类抗原以更高的水平表达；对于无法检测到的Ⅰ类抗原基本表达水平的细胞，IFNγ也可以诱导Ⅰ类抗原的表达，且一般比Ⅰ型干扰素IFNα/β具有更强的作用。在体注射 IFNγ可以导致许多组织中Ⅰ类抗原表达水平的广泛增高。IFNγ对 MHCⅡ类分子表达的调节作用：MHCⅡ类分子仅存在于专职的抗原呈递细胞(如树突状细胞及 B细胞)，其他细胞中 MHCⅡ类分子均可由IFNγ 诱导产生。Ⅱ类抗原呈递途径的所有关键基因的正常表达都是必需的，它们受一个单一的受 IFNγ诱导的转录因子Ⅱ类反式激活蛋白 (cⅡTA)的调节。

IFNγ能够激活吞噬细胞的杀菌活性。活化的巨噬细胞表现最突出的是对许多细胞内的和吞噬的生物体如分支杆菌、刚地弓形虫、锥虫和利什曼原虫的杀菌活性大大增强。

与哺乳动物相似，鱼类IFNγ重组蛋白能够影响刺激免疫细胞的增殖，增加IFNγ自身的基因表达，以及诱导下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表达。Mx是 IFN系统中熟为人知的抗病毒蛋白，作为一种GTP 酶，它主要通过干扰病毒的聚合酶来抑制RNA的复制，从而发挥抗病毒的作用。它主要受Ⅰ型IFN诱导大量表达发挥其作用，Ⅱ型 IFN对其有一定的诱导作用。重组的IFNγ可影响鱼类的细胞免疫反应。初步研究的结果表明，一定浓度的重组虹鳟IFNγ在RTS-11 cells中会促进下游免疫基因IP10和MHCⅡβ的表达。

近年来鱼类病害发生频繁，其中某些疾病给水产养殖业造成灾难性的危害，这就使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日趋广阔的应用前景。IFNγ 由于其抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用在哺乳动物中的应用已非常广泛，对人的临床应用治疗疾病方面也已很普遍。而其在鱼类的研究与应用才开始起步，可以预测其具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术鱼类免疫防治中没有干扰素蛋白IFNγ的缺陷，提供一种黑青斑河鲀干扰素IFNγ1。

本发明的另一目的是提供黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因。

本发明的又一目的是提供黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的制备方法。

本发明的再一目的是提供黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种黑青斑河鲀干扰素IFNγ1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，共179个氨基酸；等电点为7.882，分子量为20.18千道尔顿。黑青斑河鲀干扰素IFNγ1氨基酸编码序列含有一段N段信号肽序列，使用 Jpred 方法预测其蛋白的二级结构，发现它含有 6 个 α-螺旋结构，且在靠近其氨基酸序列 C 端的 F 螺旋中存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[IV] 这个保守结构，这与其他已鉴定的IFNγ一样。此外，对干扰素 IFNγ1进行糖基化位点的预测发现其含有一个糖基化位点。同时，通过对氨基酸序列的 C 末端进行分析，发现在黑青斑河鲀干扰素 IFNγ1 氨基酸序列的 C 末端没有类似核定位序列（NLS）的 RRRR 序列。

上述黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上述黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因的制备方法，其特征在于以黑青斑河鲀总mRNA为模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO:3为引物，进行反转录，得到cDNA；再以cDNA为模板，设计上游引物SEQ ID NO:4，下游引物SEQ ID NO:5，进行PCR，得到黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因。

黑青斑河鲀干扰素IFNγ1可以通过表达载体在大肠杆菌中以胞内不溶的形式表达，具体制备方法是将黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化至大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河鲀干扰素IFNγ1。

所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET32a，重组表达质粒的构建包括以下步骤：以含黑青斑河鲀干扰素IFNγ1编码基因的质粒为模板，设计含有BamH

酶切位点的上游引物SEQ ID NO:6，含HindⅢ酶切位点的下游引物SEQ ID NO:7进行PCR，PCR产物克隆到原核融合表达载体pET32a上，得到重组表达质粒，该质粒含有6×His亲和标记位点。该表达载体是以T7为启动子，获得的蛋白的C端有6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。

所述培养转化的大肠杆菌的培养条件为接单菌落至含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃，250 rpm，振荡培养过夜，按1: 50体积比接种到200 ml 37℃预热的含氨苄青霉素 TB液体培养基中，37℃，250 rpm，培养至OD600达到0.6。大肠杆菌优选BL21（DE3）。

所述诱导为加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，经诱导后收集菌体。诱导时间优选为7小时，可以获得最大的可溶性重组蛋白表达量。

所述纯化是将总菌体用 Bug Buster Master Mix混匀重悬，收菌后可以免除细胞破碎，室温下将重悬的细胞液孵育10-20min；（孵育后获得的抽提物不是粘稠的）4℃下 16,000g离心20 min以去除不溶的细胞碎片，沉淀重悬于 Bug Buster Master Mix，吸打涡旋，重悬沉淀，涡旋 1 min；4℃，5,000g 离心15 min，移去上清，收集沉淀，沉淀即包涵体；将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的Bug Buster Master Mix 中，涡旋混匀，离心；取沉淀再涡旋混匀离心，再次重悬，于4℃，16,000 g离心15min并去除上清；最终沉淀（IFNγ1 包涵体）加盐酸胍裂解液洗涤，这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样，经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。优选盐酸胍裂解液的pH 7.8，含500mmol/L NaCl。

所述酶切是用rEK酶，上述步骤获得的重组蛋白N端含有Trx融合蛋白，根据融合蛋白上含有S-tag标签，可以结合到S-protein Agarose上，而目的蛋白IFNγ1不结合，可被洗脱，在经过EKapture? Agarose去除重组蛋白中的rEK酶，可得到单一的IFNγ1目的蛋白。

通过对培养时间、诱导时间和温度等条件的摸索和优化，使得到的蛋白的表达量较高，IFNγ1处于不溶状态，纯化时要经过变性，复性，得到可溶的IFNγ1重组蛋白；优化了重组蛋白的纯化条件后，表达产物的超声裂解液经固定化金属配体亲和层析，得到的蛋白纯度在90%以上。

本发明制备的黑青斑河鲀干扰素IFNγ1在制备鱼类免疫调节添加剂或鱼类免疫佐剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用黑青斑河鲀基因组数据库结合分子生物学方法设计了特异性引物，PCR扩增克隆得到IFNγ1基因的ORF 序列，并构建表达载体，转化到大肠杆菌中培养，可大量表达黑青斑河鲀干扰素IFNγ1基因所编码的蛋白。本发明黑青斑河鲀干扰素IFNγ1能够影响黑青斑河鲀头肾细胞中的MX和ISG15基因的表达，丰富了鱼类干扰素系统信号通路的理论，并能有效促进疫苗产生的免疫佐剂，还可作为增强鱼类免疫的饵料添加剂。

附图说明

图1. 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1氨基酸序列与部分脊椎动物IFNγ氨基酸序列的比较结果图，其中，在比较中采用空格以获得最大的同源性序列，“-----”表示此位置无此氨基酸；

图2. 黑青斑河鲀干扰素 IFNγ1成熟肽编码序列 PCR 扩增产物电泳结果，其中，M为100 bp DNA Marker，NC为阴性对照，1为带有酶切位点的 IFNγ1核苷酸目的片段；

图3. Real Time-PCR 分析黑青斑河鲀干扰素IFNγ1基因在LPS 和 Poly I:C 不同孵育刺激时间下头肾细胞中的表达，其中，A是LPS刺激下IFNγ1基因的表达量变化，B是Poly I:C刺激下IFNγ1基因的表达量变化，LPS为脂多糖，Poly I:C为双链 RNA 类似物；

图4. 基因IFNγ1的重组表达质粒构建图；

图5. 在N端含有Trx融合蛋白的黑青斑河鲀干扰素IFNγ1重组蛋白表达和纯化的SDS-PAGE (A)及Western杂交(B)分析图，其中，M为蛋白质分子量标准，1为未诱导总菌蛋白，2为诱导后总菌蛋白，3为经纯化透析后的蛋白样品；

图6. 切除黑青斑河鲀干扰素IFNγ1重组蛋白上的Trx融合蛋白后的IFNγ1的SDS-PAGE分析图，M为蛋白质分子量标准，1为IFNγ1蛋白，2为Trx融合蛋白；

图7. 黑青斑河鲀 IFNγ1对头肾免疫细胞中ISG15和MX基因表达的影响，A为IFNγ1对ISG15基因表达的影响，B为IFNγ1对MX基因表达的影响，*表示与对照组有显著差异（P<0.05）。

具体实施方式

实施例1. 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1编码基因的制备

1. 黑青斑河鲀头肾总RNA的提取

取健康黑青斑河鲀（Tetraodon nigriviridis），体长约 3~5cm，体重约4~6g，以 20 ~ 30℃ 循环过滤的水饲养，每天以赤虫喂食一次。驯养 2 周后取健康的鱼进行实验。以冰浴麻醉约2 min后，杀鱼取样，分离出肝、脾、肠、头肾、腮、心脏、皮肤及肌肉，存放于 -80℃ 冰箱备用。采用Trizol试剂法提取获得黑青斑河鲀头肾总RNA，其OD_260/280 = 1.85。

2. cDNA第一链的合成

取5 μg黑青斑河鲀头肾总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT（序列如SEQ ID NO:3所示）混合，进行反转录，所得产物置于-20℃保存备用。

3. 黑青斑河鲀IFNγ1基因cDNA全序列的克隆

根据 Ensembl 及 NCBI 的 Tetraodon nigriviridis 基因组数据库中的数据，在IFNγ开放读码框两端设计特异引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4，下游引物序列如SEQ ID NO:5，以步骤2合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段大小为540 bp。所得PCR产物上样至1.8%琼脂糖凝胶，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pTZ57 R/T载体转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。Blast同源分析表明，目的产物为IFNγ1基因的cDNA序列片段。

实施例2. 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1基因在分裂原活化的头肾细胞中的表达

使用不同分裂原刺激黑青斑河鲀头肾细胞，检测该基因在离体受到外界刺激时，是否直接参与应激反应。

用剪刀分离黑青斑河鲀的头肾组织，用烘好的磨砂玻片磨砂面进行研磨，磨至末状；将磨好的细胞与培养基一起过细胞滤网 (BD Falcon，70 μm，Nylon)转移至 50 ml 离心管中；洗涤、离心后使用完全培养基（RPMI 1640 含2 mM L-glutamine，10% FBS和1% penicillin /streptomycin）2 ml 重悬细胞，计数后将细胞数调整至合适水平，加入含分裂素Poly I:C和LPS的完全培养基至终浓度分别为100 μg/ml和10 μg/ml，另以不含刺激剂的完全培养基作为阴性对照组；将细胞培养板置于27℃，5% CO₂ 培养箱中培养，分别孵育1 h，2 h和4 h后收集各孔细胞，提取总RNA并进行反转录。18s rRNA作为内参基因来调节各样品模板cDNA量。18s rRNA基因的上游引物序列如SEQ ID NO:8，下游引物序列如SEQ ID NO:9，IFNγ1编码基因的上游引物如SEQ ID NO:10，下游引物序列如SEQ ID NO:11，进行RealTimePCR扩增，利用罗氏LightCycle480软件分析数据结果，数据表示为平均值±标准误差（means±S.E.M），取5个独立样品的数据平均值（n = 5），结果见图3。

实验结果表明Poly I:C和LPS短时间刺激后，IFNγ1基因在头肾细胞中的表达量明显增加，随着刺激时间的增加，基因表达量逐渐下降。

实施例3 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的制备

1. 重组表达质粒的构建

根据IFNγ1编码基因的两端序列合成一对引物，上游引物含有Bam H I切割位点，序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物含有Hin dⅢ切割位点，其序列如SEQ ID NO:7所示。

以含有IFNγ1编码基因的pTZ57R/T质粒为模板，进行PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在550 bp左右，电泳结果如图2。将PCR扩增产物克隆至原核表达载体pET22b上，得到重组表达载体（其构建过程如图4所示）。表达载体中的外源基因序列经测序鉴定正确。

2. 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1基因的表达

将步骤1中所构建的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。基因工程菌超声裂解上清经SDS-PAGE电泳分析表明，工程菌在受IPTG诱导后与无IPTG诱导的总菌蛋白相比在约35 kDa的地方出现一条蛋白条带，与软件估算的含有Trx融合蛋白的IFNγ1重组蛋白分子量大小相近（图5）。

经rEK酶切除Trx融合蛋白后，SDS-PAGE电泳分析表明，IFNγ1重组目的蛋白约在18.0—25.0 kDa 之间的地方出现一条蛋白条带，与软件估算的重组IFNγ1蛋白分子量大小相近（图6）。

对培养时间，诱导浓度，温度等条件的优化得出基因工程菌的最佳培养条件为：接单菌落至5 ml的含氨苄青霉素LB加富液体培养基中，37℃，250 rpm，振荡培养过夜；按1: 50体积比接种到200 ml 37℃预热的含氨苄青霉素 TB液体培养基中，37℃，250 rpm，培养至OD600达到0.6；在30℃，加入IPTG至终浓度0.3mM，对IFNγ1蛋白表达工程菌诱导7h，可获得最大的可溶性重组蛋白表达量。

3. 重组黑青斑河鲀干扰素 IFNγ1蛋白的纯化

将IFNγ1蛋白表达工程菌总菌体用盐酸胍裂解液洗涤，再用结合缓冲液重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达和层析的结果。从SDS-PAGE结果可以得出：6×His-黑青斑河鲀干扰素IFNγ1基因编码的蛋白能被固定化镍金属亲和层析柱所吸附，用洗脱缓冲液洗镍层析柱时，能把目的蛋白洗下，经透析后获得黑青斑河鲀干扰素IFNγ1重组蛋白（如图5中3）。获得的IFNγ1重组蛋白N端含有Trx融合蛋白，经rEK酶切除融合蛋白后，获得单一的IFNγ1目的蛋白（图6中1）。

实施例4. 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1对免疫相关基因表达影响的活性分析

头肾细胞分离如实施例2，将细胞数调整至1 × 10⁷ /mL，分别向6孔培养板各孔中加入2 mL上述细胞悬浮液；分别向各分组孔中加入终浓度为1 ng/mL，10 ng/mL和100 ng/mLIFNγ1蛋白的完全培养基2 mL，并设置阴性对照组（细胞悬浮液和完全培养基各2 mL）。将细胞培养板置于27℃，5% CO₂培养箱中培养，孵育4 h后收集各孔细胞，Real Time-PCR检测IFNγ1蛋白对ISG15和MX基因表达的影响。其中ISG15基因表达所用引物上游引物序列如SEQ ID NO:12，下游引物序列如SEQ ID NO:13；MX基因表达所用引物上游引物序列如SEQ ID NO:14，下游引物序列如SEQ ID NO:15。18s rRNA作为内参基因来调节各样品模板cDNA量，反映IFNγ1蛋白的活化能力及对下游基因表达的影响。18s rRNA基因的上游引物序列如SEQ ID NO:8，下游引物序列如SEQ ID NO:9。每组六个重复，数据用平均值±标准误表示，*表示与对照组有显著差异（P<0.05），结果如图7所示。结果表明，在头肾细胞中，1 ng/ml 和 10 ng/ml 的IFNγ1蛋白孵育头肾细胞 4 小时后能显著上调ISG15 mRNA 水平，而高浓度的蛋白则对 ISG15 转录没有显著影响。

鱼类所特有的 IFNγ1各浓度均能显著性抑制 MX基因的表达，表明IFNγ1 可能是Ⅰ型 IFN 起效的负调控因子。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 黑青斑河鲀干扰素IFNγ1及其制备方法和应用

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Pro Leu Cys Leu Leu Phe Leu Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser

1 5 10 15

Gln Ala Ser Phe Gln Phe Ile Ser Gln Met Leu Lys Lys Asp His Glu

20 25 30

Val Val Ala His Ala Leu Lys Leu Thr Gln Val Glu Phe Ile Ala Gly

35 40 45

Pro Leu Phe Ser Ser Val Ile Arg Asn Val Asn Ser Ser Cys Gln Arg

50 55 60

Arg Asp Asp Val Gln Met Met Ser Thr Thr Leu Asp Val Tyr Asp Arg

65 70 75 80

Thr Gln Val Glu Phe Ile Ala Gly Pro Leu Phe Ser Ser Val Ile Arg

85 90 95

Asn Val Asn Ser Ser Cys Gln Arg Arg Asp Asp Val Gln Met Met Ser

100 105 110

Thr Thr Leu Asp Val Tyr Asp Arg Met Lys Thr Leu Lys Gly Lys Leu

115 120 125

Lys Gln Met Asn Glu Lys Arg Glu Glu Glu Leu Asp Arg Leu Lys Thr

130 135 140

Ile Glu Val Asp Asp Val Leu Val Gln Lys Lys Ala Leu Ala Gln Phe

145 150 155 160

Lys Ala Val Tyr Gln Ala Ala Ser Leu Ile Gly His Cys Gly His Ala

165 170 175

Leu Ser Asp

<210> 2

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtctcccc tctgtctgct gttcttactg ggagctgtgg gaacttctca ggcttcattc 60

cagttcatct ctcagatgct aaagaaggac catgaagttg ttgcacatgc actgaaactg 120

acacaggtgg aattcatcgc tggacccctc ttcagctccg tcatcaggaa cgtcaacagc 180

tcctgtcaga gacgcgatga tcatcaggaa cgtcaacagc tcctgtcaga gacgcgatga 240

atcttctcca gcattcagaa gcagaaggag cagcaggacc aggccgacac cctgctgagc 300

caggtgcctc cgtcccagcg ttccgaggtg gagagcgcgc tccagcacct gcagcagaga 360

atgaagacgt tgaaggggaa gctgaagcag atgaacgaga agcgagagga ggagctggac 420

aggctgaaga ccatcgaggt ggacgacgtc ctggtccaga agaaagctct ggcccagttc 480

aaagccgttt accaggcggc ttctctgatt ggccactgtg gccacgccct ctcggactga 540

<210> 3

<211> 91

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgacuggagc acgaggacac uggagugaag aguagaaagc ugucaacgau acguacguaa 60

cggcaugaca guguuuuuuu uuuuuuuuuu u 91

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aattagacgg cacgactc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgtgactt ggtgaaaac 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcggatcct cattccagt 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccaagcttt cagtccgaga 20

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcaacttta gtatacgcta ttggag 26

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctgagaaac ggctaccaca tcc 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcacctgca gcagagaatg 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atcagtccga gagggcgt 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atccaggtgc tactgaaaac 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caatggtgct ctggttct 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tggacaaggg gacagagga 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cagagtttgg aaatggggg 19

Claims

1.一种黑青斑河鲀干扰素IFNγ1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求2所述黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因的制备方法，其特征在于以黑青斑河鲀总mRNA为模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO:3为引物，进行反转录，得到cDNA；再以cDNA为模板，设计上游引物SEQ ID NO:4，下游引物SEQ ID NO:5，进行PCR，得到权利要求2所述黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因。

4.权利要求1所述黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的制备方法，是将黑青斑河鲀干扰素IFNγ1的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化至大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河鲀干扰素IFNγ1。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET32a，重组表达质粒的构建包括以下步骤：以含黑青斑河鲀干扰素IFNγ1编码基因的质粒为模板，设计上游引物SEQ ID NO:6，下游引物SEQ ID NO:7进行PCR，PCR产物克隆到pET32a上，得到重组表达质粒。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述培养转化的大肠杆菌的培养条件为含氨苄青霉素LB液体培养基，30℃，250rpm振荡培养过夜，再接种到37℃预热的含氨苄青霉素 TB液体培养基中，培养至OD600达到0.6。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述诱导为加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，诱导时间为7小时。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述纯化是将总菌体用Bug Buster Master Mix混匀重悬，室温下孵育10-20min；4℃离心、沉淀用Bug Buster Master Mix重悬、4℃再离心，移去上清，沉淀即包涵体；将包涵体重悬于经1:10稀释的Bug Buster Master Mix 中，4℃离心，最终沉淀加盐酸胍裂解液洗涤，盐酸胍裂解液的pH7.8，含500mmol/L NaCl。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述酶切是用rEK酶。

10.权利要求1所述黑青斑河鲀干扰素IFNγ1在制备鱼类免疫调节添加剂或鱼类免疫佐剂中的应用。