CN103215274B

CN103215274B - 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103215274B
Application number: CN201310166282.8A
Authority: CN
Inventors: 卢丹琪; 孙艳; 易诗白; 彭弯; 张勇; 林浩然
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: CN103215274A

Abstract

本发明涉及斜带石斑鱼干扰素IFNγ2基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备一种新的免疫增强剂的应用。本发明通过引物扩增基因片段和RACE全长扩增的方法，以特异性引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5从斜带石斑鱼头肾总RNA中克隆得到IFNγ2基因的开放读码框，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明的斜带石斑鱼干扰素IFNγ2蛋白经初步验证能够诱导相关免疫基因表达，可开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂。

Description

斜带石斑鱼干扰素IFNγ2及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及干扰素领域，更具体地，涉及斜带石斑鱼干扰素IFNγ2及其制备方法和应用。

背景技术

干扰素(IFN）是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），在细胞和机体受病毒感染或其他诱导剂作用后由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。根据同源性及受体特异性的不同，迄今为止，发现3类干扰素：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型IFN（IFNγ）也被称为免疫干扰素，是主要的巨噬细胞刺激因子和调控免疫反应的关键信号分子，能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞(NK)和巨噬细胞活性，促进免疫球蛋白的转换，具有抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用。干扰素IFNγ2和IFNγ2基因是鱼类IFNγ基因的两个亚型，其氨基酸序列的特征是含有[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E- [LF]-X2-[IV]这个保守结构，这与已研究过的其他种类中的IFNγ结构类似。

IFNγ具有广泛的生物学活性。IFNγ主要通过与其受体结合，活化 JAK-STAT 信号通路，激活下游基因的转录，包括相关转录因子和免疫分子，如 STAT1、IRF1、TLR3和MHCⅡ等，调节T细胞的增殖和分化以及增强抗原提呈作用，达到保护宿主的目的。

IFNγ是体内重要的免疫调节因子，其免疫调节作用是通过以下几方面实现的。IFNγ促进 MHCⅠ类及Ⅱ类抗原的加工提呈，能够从多方面上调细胞表面 MHCⅠ类分子的表达，IFNγ 通过上调 MHCⅡ类抗原提呈提升 CD4＋T细胞的肽特异性活性通过上调MHCⅠ类抗原的提呈途径增加细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）对病原体的敏感性，使 CTL 更有效地将病原体清除； IFNγ 是主要的巨噬细胞活化因子，其对巨噬细胞的调节功能包括：介导 T 细胞对巨噬细胞的激活，直接诱导参与呼吸爆发酶的合成，增强巨噬细胞杀伤微生物的能力等；此外，IFNγ也是 Th1 细胞的主要产物，而且能够进一步使免疫反应向 Th1 表型转化其能够使静止的CD4＋T细胞分化为Th1细胞，同时抑制 Th2 细胞的增殖 IFN 将天然免疫反应与获得性免疫反应桥连起来，其能够协调天然免疫细胞识别病原体，并诱导特异性免疫反应的发生。IFNγ的这种协调由固有免疫反应向获得性免疫反应转化的能力是其他干扰素所不具备的。

IFNγ的广谱抗病毒作用主要是通过与细胞表面受体的结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态从而发挥抗病毒作用，其抗病毒作用是非特异性的。IFNγ主要的效应分子有双链 RNA 依赖的蛋白激酶 R（PKR ）、Mx 2′-5′寡腺苷酸合成酶（2′-5′OAS）、核糖核酸酶L（RNase L）系统等。PKR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在与 dsRNA 结合后被激活，活化的 PKR 可使蛋白合成起始因子eIF-2及核因子抑制因子 IkB 磷酸化，从而抑制病毒和细胞蛋白的合成，起到抗病毒的作用；Mx 能够通过干扰某些负链病毒核酸片段向细胞内转运及某些病毒蛋白的功能而抑制病毒的增殖；2′-5′寡腺苷酸合成酶能够使ATP聚合为 2′-5′寡腺苷酸，激活核糖核酸酶 L降解ssRNA，从而干扰病毒复制。在诱导效应因子表达的同时，由于 IFNγ能够提高细胞表面MHC 分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但 IFNγ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。

与哺乳动物相似，鱼类IFNγ重组蛋白能够影响刺激免疫细胞的增殖，增加IFNγ自身的基因表达，以及诱导下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表达。Mx是 IFN系统中熟为人知的抗病毒蛋白，作为一种GTP 酶，它主要通过干扰病毒的聚合酶来抑制RNA的复制，从而发挥抗病毒的作用。它主要受Ⅰ型IFN诱导大量表达发挥其作用，Ⅱ型 IFN对其有一定的诱导作用。重组的IFNγ可影响鱼类的细胞免疫反应。初步研究的结果表明，一定浓度的重组虹鳟IFNγ在RTS-11 cells中会促进下游免疫基因IP10和MHCⅡβ的表达。

近年来鱼类病害发生频繁，其中某些疾病给水产养殖业造成灾难性的危害，这就使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日趋广阔的应用前景。IFNγ 由于其抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用在哺乳动物中的应用已非常广泛，对人的临床应用治疗疾病方面也已很普遍。而其在鱼类的研究与应用才开始起步，可以预测其具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于根据现有鱼类免疫防治方法中没有干扰素蛋白IFNγ的缺陷，提供一种新的鱼类干扰素IFNγ2基因及其编码蛋白。

首先提供斜带石斑鱼干扰素IFNγ2的基因序列，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的提供斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据需求，再提供一种斜带石斑鱼干扰素IFNγ1重组表达载体，所述的重组表达载体的核苷酸序列中，含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

根据需求再提供一种根斜带石斑鱼干扰素IFNγ2的基因序列的获取方法，以斜带石斑鱼头肾总mRNA为模板，以RNA Oligo dT为引物，反转录得到cDNA；再以此cDNA为模板，设计上游引物及下游引物进行PCR扩增，即得。

所述的RNA Oligo dT的序列如SEQ ID NO:3 所示。

所述的上游引物的序列如SEQ ID NO:4 所示。

所述的下游引物的序列如SEQ ID NO:5 所示。

根据所述的重组蛋白，再提供一种斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白的生产方法，包括以下步骤：

S1. 构建含干扰素IFNγ2的基因序列的重组表达载体；

S2. 将步骤S1得到的重组表达载体，转化入工程菌中；

S3. 培养工程菌，使得工程菌中的重组表达载体表达干扰素IFNγ2重组蛋白；

S4. 干扰素IFNγ2重组蛋白的纯化和变复性处理；

步骤S1所述的构建含干扰素IFNγ2的基因序列的重组表达载体，包括以下步骤：

S11. 以含斜带石斑鱼干扰素IFNγ2编码基因的质粒为模板，设计分别带有酶切位点的上下游引物，PCR扩增，所述的带有酶切位点的上游引物的序列如SEQ ID NO:6所示，所述的酶切位点的下游引物的序如SEQ ID NO:7所示；

S12. 将步骤S11所得PCR扩增产物克隆到原核表达载体pET22b上，即得含干扰素IFNγ2的基因序列的重组表达载体。

步骤S3所述培养工程菌的条件为：将单菌落接种至5ml含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃，250rpm振荡过夜培养，取过夜培养物以1 : 100比例接种于含氨苄青霉素抗性的新鲜LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600达到约0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃、250rpm诱导培养7小时后离心收集菌体。

步骤S4所述的干扰素IFNγ2重组蛋白的纯化和变复性处理，包括以下步骤，

S41. 将收集的菌体用bufffer B洗涤，再用bufffer B重悬，冰上震荡裂解菌体2h，经高速离心获得裂解上清液；

S42. 将收集的裂解液经固定化金属配体亲和层析纯化，尿素洗脱液进行洗脱处理，收集蛋白洗脱峰；

S43. 将收集的蛋白洗脱液预冷后放入处理好的透析袋中，两侧袋口扎紧转移至透析液，4℃透析过夜，每隔8h更换新的透析液，透析结束后将蛋白真空冻干。

步骤S2和S3所述的工程菌为大肠杆菌，优选为Rosetta（DE3）菌株。

根据提供的重组蛋白，再提供一种含所述的斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂。

与现有技术相比，本发明具有以下效益：

本发明利用斜带石斑鱼基因组数据库结合分子生物学方法设计了特异引物，PCR扩增克隆得到IFNγ2基因的ORF 序列，并构建原核表达载体，转化到大肠杆菌中培养，可大量表达斜带石斑鱼干扰素IFNγ2基因所编码的蛋白。本发明中斜带石斑鱼重组IFNγ2蛋白能够上调头肾细胞中的MHCⅡ和TLR3基因的表达，丰富了鱼类干扰素的系统信号通路理论，能为相关鱼类免疫增强剂的研发提供一定的理论依据，IFNγ2蛋白还可作为增强鱼类免疫的饵料添加剂适用于水产养殖。

附图说明

图1为斜带石斑鱼干扰素IFNγ2氨基酸序列与部分脊椎动物IFNγ氨基酸序列的比对结果图。

图2为斜带石斑鱼干扰素 IFNγ2成熟肽编码序列的 PCR 扩增产物电泳结果。

图3为基因IFNγ2的重组表达质粒构建示意图。

图4.斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白表达和纯化的SDS-PAGE (A)及Western杂交(B)分析图。

图5. 斜带石斑鱼 IFNγ2对头肾免疫细胞中MHCⅡ、IRF1和STAT1基因表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1. 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2的克隆

1. 斜带石斑鱼头肾总RNA的提取

取健康斜带石斑鱼全鱼，以冰浴麻醉约2 min后，杀鱼取样，分离头肾组织，采用Trizol试剂法抽提获得斜带石斑鱼头肾总RNA，其OD260/280 = 1.91。

2. cDNA第一链的合成

取1μg斜带石斑鱼头肾总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT（序列如SEQ ID NO:3所示）混合，进行反转录，所得产物置于-20℃保存备用。

3. 斜带石斑鱼IFNγ2基因cDNA全序列的克隆

根据斜带石斑鱼基因组数据库中的信息，在IFNγ开放读码框拼接序列两端设计特异引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4，下游引物序列如SEQ ID NO:5，以步骤2合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段大小为567 bp。电泳分离DNA片段，切胶回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pTZ57R/T载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。经BLAST同源性分析表明，目的产物确为IFNγ2基因的cDNA序列片段。

实施例2. 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白的表达

1.重组表达质粒的构建

以含有IFNγ2编码基因的pTZ57R/T质粒为模板，设计一对含有EcoRI酶切位点的上游引物SEQ ID NO:6和含有XhoI 酶切位点的下游引物SEQ ID NO:7，经PCR扩增得到产物大小在550 bp左右的单一条带，电泳结果如图2所示，其中，M为DNA Marker，1为带有酶切位点的 IFNγ2核苷酸目的片段。将斜带石斑鱼干扰素IFNγ2的成熟肽编码序列克隆至原核表达载体pET-22b上，构建重组表达载体pET22b-IFNγ2，（其构建过程如图3所示）。表达载体中的外源基因序列经测序鉴定无误。

2. 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2基因的原核表达

将步骤1中构建的表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导目的蛋白表达。基因工程菌经诱导后超声裂解得到上清液，经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株在受IPTG诱导后有明显特异表达产物带，与软件估算的含有His标签的IFNγ2重组蛋白分子量大小相近，结果如图5所示，其中，A为IFNγ2对MHCⅡ基因表达的影响，B为IFNγ2对IRF1基因表达的影响，C为IFNγ2对STAT1基因表达的影响；*表示与对照组有显著差异（P<0.05）。

对诱导温度和诱导剂量等条件的优化得出基因工程菌的最佳培养条件为：接单菌落至5ml的含氨苄青霉素LB 液体培养基中，37℃，250 rpm，振荡培养过夜；按1: 100体积比接种到150ml 37℃预热的含氨苄青霉素 TB液体培养基中，37℃，250 rpm，培养至OD600达到约0.6；加入IPTG至终浓度0.4mM，在37℃条件下，对IFNγ2蛋白表达工程菌诱导7h，可获得最大重组蛋白表达量。

3.斜带石斑鱼干扰素 IFNγ2重组蛋白的提取和纯化

将IFNγ2蛋白表达工程菌总菌体用Native Binding Buffer洗涤，再用Native Binding Buffer重悬，超声处理后，裂解上清液进行固定化金属配体亲和层析纯化，收集蛋白洗脱峰，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达和纯化结果。斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白能被镍金属亲和层析柱所吸附，用含不同浓度咪唑洗脱缓冲液洗镍层析柱时，能把目的蛋白洗下，经脱盐后获得斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白，结果如图4所示，其中，M为蛋白质分子量标准， 1为未诱导总菌蛋白；2为诱导后总菌蛋白；3为上清流出液；4为bufferC（pH6.3）；5为bufferD（pH5.9）；6为bufferE（pH5.4）；7为bufferF（pH5.0）；8为bufferG（pH4.5）。

实施例3. 实施例2所得的斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白对免疫相关基因表达影响的活性分析

对迅速冷冻麻醉的实验鱼取样，剪取头肾组织，浸泡于适量RPMI1640 培养基中，并置于冰上；将头肾组织置于超净工作台内稍微剪碎，剔走结缔组织后，用烘好的磨砂玻片磨砂面进行研磨，磨至末状；将磨好的细胞与培养基一起过Cell strainer（BD Falcon，70μm，Nylon）并转移至50ml离心管中：离心，弃上清液，加入RPMI 1640 培养基2ml重悬细胞，洗涤，离心后用完全培养基（RPMI 1640 含2 mM L-glutamine，10% FBS和1% penicillin /streptomycin）2 ml 重悬细胞，将细胞数调整至1 × 10⁷ /mL，分别向6孔培养板各孔中加入2 mL上述细胞悬浮液；分别向各分组孔中加入终浓度为1 ng/mL，10 ng/mL和100 ng/mL IFNγ2蛋白的完全培养基2 mL，并设置阴性对照组（细胞悬浮液和完全培养基各2 mL）。将细胞培养板置于27℃，5% CO₂培养箱中培养，孵育4 h后收集各孔细胞，Real Time-PCR检测IFNγ2蛋白对MHCⅡ和TLR3基因表达的影响。其中MHCⅡ基因表达所用引物上游引物序列如SEQ ID NO:10，下游引物序列如SEQ ID NO:11；TLR3基因表达所用引物上游引物序列如SEQ ID NO:12，下游引物序列如SEQ ID NO:13。18S rRNA作为内参基因来校正各模板起始cDNA量，18S rRNA基因片段的上游引物序列如SEQ ID NO:8，下游引物序列如SEQ ID NO:9。每组3个重复，数据用平均值±标准误表示，*表示与对照组有显著差异（P<0.05），结果如图5所示。

结果表明，在斜带石斑鱼头肾细胞中，1 ng/ml的IFNγ2蛋白孵育4小时后能显著上调MHCⅡ、IRF1和STAT1的mRNA 水平，而其中，高浓度的蛋白对IRF1的转录有极显著的上调作用，而对MHCⅡ和STAT1来说则没有显著影响。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2及其制备方法和应用

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

MVATVRAVICLCLWLSVCQVRGSHIPQEMNRTIQNLLQHY 40

RISTKDRFNGKPVFSREPLTTKMEAKRVFMGGVLEAYEKL 80

LGEMLKPTPSPQVTGNNQLPASAGTASNGEVAAGGDLRKQ 120

LSYLLKKVTDLRKHRYNEQEKVLQGLRDLKDIQMGDPIIQ 160

SKALWELPWLYEEASSLSNIQRERRRRRRQTRRVKTHQRA 200

<210> 2

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggttgcca cggtgagggc agtgatctgc ctgtgtctct ggctgtccgt ctgtcaggtc 60

agaggctccc acatccctca ggagatgaac agaaccatcc agaacctgct gcagcactat 120

aggatttcaa caaaagacag atttaacggg aagcccgtct tctccagaga accactgacc 180

accaagatgg aggctaagag agtgttcatg ggcggcgttt tggaggcgta cgaaaagctg 240

cttggcgaga tgttgaagcc caccccgagt ccacaggtca ccgggaacaa ccagctcccc 300

gcctctgccg gcaccgccag caatggtgag gtggcagcgg gcggagacct caggaagcag 360

ctgagctacc tcctgaagaa ggtgacggac ctgaggaaac accggtacaa cgagcaggag 420

aaggttctgc agggactgag agacctcaaa gacatccaga tgggtgaccc tatcatccag 480

agcaaagcat tgtgggagct gccatggctg tacgaggagg cgagctccct gtccaacatc 540

cagagggaga gaaggaggcg gcgacggcaa acacgcaggg tcaaaactca tcagagagcc 600

tga 603

<210> 3

<211> 91

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgacuggagc acgaggacac uggagugaag aguagaaagc ugucaacgau acguacguaa 60

cggcaugaca guguuuuuuu uuuuuuuuuu u 91

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcacagag ccaagtcaaac 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatttgtca ttaaacaccc tc 22

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccggaattcg tcccacatcc ctcaggagat 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgctcgagg gctctctgat gagttttga 29

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctgagaaac ggctaccaca tcc 23

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcaacttta gtatacgcta ttggag 26

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcctcttca tcagcctctacac 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccaacaaact tccccaaactg c 22

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gctgcctgcc agcccaaaat ctagaga 27

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgctgtcga ctgtgttctc ctgagtgg 28

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccactgcca agagcgtaga 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctgtcatgc cgttcacttc gt 22

Claims

1.一种斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白在基因表达影响中的应用；

所述基因为MHCⅡ、IRF1和STAT1的mRNA；

所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的斜带石斑鱼干扰素IFNγ2重组蛋白的生产方法，包括以下步骤：

S1. 构建含干扰素IFNγ2的基因序列的重组表达载体；

S2. 将步骤S1得到的重组表达载体，转化入工程菌中；

S4. 干扰素IFNγ2重组蛋白的纯化和变复性处理；

所述步骤S1中构建含干扰素IFNγ2的基因序列的重组表达载体，包括以下步骤：

S12. 将步骤S11所得PCR扩增产物克隆到原核表达载体pET22b上，即得含干扰素IFNγ2的基因序列的重组表达载体；

所述步骤S3培养工程菌的条件为：将单菌落接种至5ml含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃，250rpm振荡过夜培养，取过夜培养物以1 : 100比例接种于含氨苄青霉素抗性的新鲜LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃、250rpm诱导培养7小时后，10000rpm离心15min，收集菌体；

所述步骤S4的干扰素IFNγ2蛋白的纯化和变复性处理，包括以下步骤；

S43. 将收集的蛋白洗脱液预冷后放入处理好的透析袋中，两侧袋口扎紧转移至透析液，4℃透析过夜，每隔8h更换新的透析液，透析结束后将蛋白真空冻干；

所述步骤S2和S3的工程菌为大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株；

所述的斜带石斑鱼干扰素IFNγ2的基因序列的获取方法，以斜带石斑鱼头肾总mRNA为模板，以RNA Oligo dT为引物，反转录得到cDNA；再以此cDNA为模板，设计上游引物及下游引物进行PCR扩增，即得，

所述的RNA Oligo dT的序列如SEQ ID NO:3 所示，

所述的上游引物的序列如SEQ ID NO:4 所示，

所述的下游引物的序列如SEQ ID NO:5 所示；

所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的重组表达载体的核苷酸序列中，含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。