CN100391969C - 幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th表位肽、其编码DNA、疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了三个幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th细胞表位肽及编码DNA，并提供包含此三个表位肽及额外的一个尿素酶B亚单位的B细胞表位(序列为SIKEDVQF)的疫苗。其中Th表位肽是具有下列氨基酸残基序列之一的多肽：具有序列表中序列2、序列3、序列7的氨基酸序列。包含本发明多肽的表位疫苗是具有序列表中序列12中的氨基酸序列的蛋白疫苗。本发明多肽作为活性成分制成的疫苗或药物，可以起到清除幽门螺杆菌感染的作用，在医药领域具有广阔的应用前景。

Description

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th表位肽、其编码DNA、疫苗及其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及来自幽门螺杆菌(Hp)的多肽、其编码DNA及应用。其中优选的3个多肽为来自尿素酶B亚单位(UreB)的辅助性T淋巴细胞(Th)表位，本发明涉及含有这些表位肽的组合物，该组合物可以用于治疗和(或)预防幽门螺杆菌感染。本发明提供了包含3个优选Th表位及一个B细胞表位(SIKEDVQF)的表位疫苗，此外本发明还涉及包含这些Th表位的合成肽疫苗、基因重组亚单位疫苗及核酸疫苗等。

背景技术

1982年澳大利亚学者Warren和Marshall首先从人胃粘膜中分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)，他们的发现使得在过去的20多年中，对于溃疡病的认识和治疗发生了很大的变革。2005年10月3日，诺贝尔奖评审委员会宣布，将2005年度诺贝尔生理学和医学奖授予这两位澳大利亚科学家，以表彰他们发现了幽门螺杆菌(Hp)以及这种细菌在胃炎和胃溃疡等疾病中的作用。研究已证实Hp是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，与胃癌的发生相关，世界卫生组织已经把Hp列为胃癌的I类致病因子。有效的治疗和根除Hp感染已成为人们关注的焦点。

目前临床主要采用抗生素多联疗法治疗Hp感染，虽然可以达到85％的根除率，但存在以下缺点：1、药物疗法毒副作用大；2、复杂的联合用药导致病人的依从性差；3、药物不能防止Hp的再感染；4、抗生素治疗易产生耐药性而导致治疗失败；5、对发展中国家病人而言，药物疗法在经济上也较困难。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于Hp感染的高发病率及其与慢行胃炎、消化性溃疡以及胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种通过有效地调动机体的免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用，并且对耐药细菌仍然有效，因此研究幽门螺杆菌疫苗具有重要的意义。

动物实验研究表明，疫苗接种可以减少Hp在胃粘模定植，并减轻胃粘膜的炎症反应，起到预防和治疗Hp感染的作用。目前关于Hp的疫苗研究多是采用全菌疫苗或重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与Hp自然感染时的免疫应答相似。Hp自然感染时体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至终身感染，说明机体已经对Hp存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除Hp就必须在抗原选择以及表位水平对抗原进行改造，激发更有效的免疫应答。表位疫苗是近年随分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗形式，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，并且其副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用于病毒、肿瘤、及慢性感染性疾病的免疫预防和治疗。借鉴表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，以Hp表位为基础设计的疫苗有可能打破机体的免疫耐受，达到预防和治疗Hp感染的目的。

细胞免疫尤其是CD4⁺T淋巴细胞(也称为辅助性T淋巴细胞，Th细胞)在抗Hp感染中起到了重要的作用。CD4⁺T淋巴细胞识别的抗原是外来抗原经抗原提呈细胞(APC)处理后与MHC□类分子结合并提呈到细胞表面的短肽，即Th表位。被Th表位激活的CD4⁺T淋巴细胞可以辅助B细胞及CTL细胞发挥免疫效应。在Hp感染中CD4⁺T除了发挥辅助功能外还直接发挥免疫效应并且介导免疫保护：应用MHC I类分子敲除小鼠和MHC II类分子敲除小鼠的研究模型发现，MHC II类分子敲除的小鼠不能够对Hp的感染起到保护作用，CD4⁺T淋巴细胞识别的是结合到MHC□类分子上的短肽(即Th表位)，而CD8⁺T淋巴细胞识别的是结合到MHC□类分子上的短肽(即CTL表位)，因此提示CD4⁺T淋巴细胞而非CD8⁺T淋巴细胞对Hp感染起到了免疫保护作用。因而要激发对Hp的保护性免疫应答，必须激发机体的CD4⁺T淋巴细胞免疫应答。

尿素酶(Urease)是Hp的主要致病因子，对Hp在人胃粘膜定居起着重要作用，在胃部的酸性环境中，一般细菌很难存活，但是Hp的尿素酶能够水解尿素而释放氨，在菌体周围形成一层“氨云”保护Hp抵抗胃酸而在胃粘膜定植，并且释放的氨能直接损害胃粘膜。尿素酶在Hp菌体中的含量高，占可溶性蛋白的6％，由A和B两个亚单位组成，其中B亚单位(UreB)为尿素酶活性亚基，在各菌株中相对保守，研究证实UreB具有很强的抗原性，是较好的Hp疫苗的候选抗原。目前关于Hp的表位研究主要是针对尿素酶的B细胞表位开展的，研究发现针对尿素酶B亚单位(UreB)不同表位的单抗有的抑制尿素酶的活性，有的则增强尿素酶的活性，有学者尝试用UreB上部分片段来制备疫苗，产生抑制尿素酶活性的中和抗体。而目前研究表明抗Hp感染的免疫保护是由CD4⁺T淋巴细胞介导的，因此采用免疫手段预防和治疗Hp感染必须激发机体的CD4⁺T淋巴细胞免疫应答，但遗憾的是目前还未有人鉴定出Hp的Th细胞表位，因此本发明从鉴定Hp的尿素酶B亚单位的Th表位入手，研究预防和治疗Hp感染的方法。

本发明的思路如下：最初的研究以BALB/c(H-2^d)小鼠为动物模型，在BALB/c(H-2^d)小鼠的动物模型上研究Hp的表位疫苗，采用生物软件预测了UreB可能H-2^d限制性的Th表位，并以CD4⁺T淋巴细胞增殖试验进行筛选和鉴定，获得了3个UreB的Th表位肽。根据表位研究的理论，存在杂合性T细胞表位(promiscuous T cell epitope)或通用T细胞表位(universalT cell epitope)的概念，即一些辅助性T细胞表位能够与多种MHC-II类分子结合，可以较少的受MHC分子的限制。后来又提出超型和超基序的概念，超型(HLA Supertype)是指能与一种表位肽结合的多种HLA分子(人的MHC分子)，与之相对应的能与多种HLA结合的表位肽称为“超基序”(Supermotif)，用这种超基序表位制备疫苗可以克服MHC限制性的问题，获得广泛的保护性。而在小鼠的遗传背景下鉴定出的表位是否也具有这种特性，本发明人又收集了Hp感染患者的外周血淋巴细胞(PBMC)作为效应细胞，观察了此3个表位肽对人的PBMC的作用，发现这3个表位肽也可以刺激人的PBMC增殖。因此本发明的表位肽可以用来研制人或小鼠用的Hp表位疫苗，并可以用来开发预防或治疗Hp感染的多肽药物。

此外本发明在鉴定Hp的UreB的Th表位基础上发明了一种基于表位肽的疫苗并提供了表位疫苗的设计方法和制备方法，动物实验表明此疫苗具有良好的免疫原性。

发明内容：

本发明经过深入而广泛的研究，对Hp的UreB蛋白进行计算机软件分析的基础上，选择性的合成了7条可能诱导机体产生Th细胞免疫应答的多肽，通过CD4⁺T淋巴细胞增殖试验，筛选出3个Th表位肽，并对其免疫特性进行评价，发现此3个表位肽可以在BALB/c小鼠体内引发针对UreB的特异性的应答，并且此3个表位肽能够刺激Hp感染者的外周血淋巴细胞增殖，可以用于人用的疫苗及药物的开发。此外获得一种基于3个表位肽的表位疫苗，动物实验中显示了良好的免疫原性。具体内容如下：

一、本发明第一个方面，提供了3个来自幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位的辅助性T细胞表位肽(即Th表位肽)、其编码DNA及应用。

1、本发明涉及7个来自Hp的UreB蛋白的多肽。这些肽选自下组：具有序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7氨基酸序列的多肽，其特征为经软件预测可能为Th表位。

2、本发明提供了3个Hp的UreB蛋白的辅助性T细胞表位肽，它具有下述特征：

1)具有序列表中序列2、序列3、序列7的氨基酸序列。

2)将序列表中的序列2、序列3、序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而成的衍生多肽，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行替换时，通常不会改变蛋白质的功能。

3、本发明提供了编码3个Hp的UreB蛋白辅助性T细胞表位肽的核苷酸序列，其特征为：

1)具有序列表中序列8、序列9、序列10的核苷酸序列。

2)与序列表中序列8、序列9、序列10具有相同编码产物的核苷酸序列。

4、本发明多肽可以用常规方法人工合成，也可以用基因工程重组方法获得。

5、本发明多肽可以诱导机体产生特异性的Th细胞免疫应答，并且具有清除Hp的作用。

6、含有本发明多肽编码核苷酸序列的载体，包括裸DNA，及转入包含该核苷酸序列载体的原核或真核表达宿主均属于本发明内容。

7、本发明多肽可以用于预防或(和)治疗性的疫苗组合物，其特征在于：

1)由序列表中序列2、序列3、序列7中描述的多肽及其衍生多肽组成的组。

2)此疫苗除了包含序列表中序列2、序列3、序列7中描述的多肽及其衍生多肽组成的组，还可以包含至少一个引起机体免疫应答的抗原或额外的B细胞或毒性T淋巴细胞表位(CTL表位)，或者免疫佐剂。

8、本发明还涉及预防和治疗幽门螺杆菌感染多肽药物，具有以下特征：

1)活性成分为本发明的UreB的表位肽，由序列表中序列2、序列3、序列7的多肽组成的组；

2)药物组合物还可含有药学上可接受的载体，所谓的载体包含药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等，此外免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。。

3)本发明药物可以制成注射液、片剂、粉剂、胶囊、口服液等多种形式。

4)本发明药物可以与抗生素等联合使用。

5)一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象，待预防或治疗的对象可以是动物，尤其是人。

9、本发明的含本发明表位肽的治疗或预防性药物组合物包括疫苗，可以经口服，皮下，静脉注射等方式应用，治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

二、本发明的第二个方面，提供了一种基于表位肽及包含额外的一个B细胞表位(SIKEDVQF)的表位疫苗及其制备方法。

1、本发明的疫苗为基因工程重组表位疫苗，该重组表位疫苗蛋白有氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3、氨基酸序列4，其中氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3、为Hp的UreB蛋白的Th表位，氨基酸序列4为Hp的UreB蛋白的B细胞表位。

2、上述氨基酸序列1为具有序列表中序列2的氨基酸序列或其衍生序列，氨基酸序列2为具有序列表中序列3的氨基酸序列或其衍生序列，氨基酸序列3为具有序列表中序列7的氨基酸序列或其衍生序列，氨基酸序列4的序列为SIKEDVQF或其衍生序列。

3、本发明中的疫苗，其特征在与氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3、氨基酸序列4之间的连接次序为：氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列4，氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列4-氨基酸序列3，氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列2-氨基酸序列4，氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列2，氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列2-氨基酸序列3，氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列3-氨基酸序列2，氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4，氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列3，氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列1-氨基酸序列4，氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列1，氨基酸序列2-氨基酸序列4-氨基酸序列1-氨基酸序列3，氨基酸序列2-氨基酸序列4-氨基酸序列3-氨基酸序列1，氨基酸序列3-氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列4，氨基酸序列3-氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列2，氨基酸序列3-氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列4，氨基酸序列3-氨基酸序列2-氨基酸序列4-氨基酸序列1，氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列1-氨基酸序列2，氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列2-氨基酸序列1，氨基酸序列4-氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3，氨基酸序列4-氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列2，氨基酸序列4-氨基酸序列2、氨基酸序列1-氨基酸序列3，氨基酸序列4-氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列1，氨基酸序列4-氨基酸序列3-氨基酸序列1-氨基酸序列2，氨基酸序列4-氨基酸序列3-氨基酸序列2-氨基酸序列1。

4、本发明表位疫苗，其特征在于采用间隔序列作为表位之间的连接，有利于各个表位独自的发挥各自的功能。其中优选的间隔序列为两个赖氨酸(KK)。

5、表位疫苗中包含的表位的数目的增减及额外的表位的添加等都属于本专利保护的范围。

6、表位疫苗中包含的每个表位的串联拷贝数的增加也属于本发明保护的范围。

7、本发明提供了表位疫苗的氨基酸序列。

8、本发明提供了编码表位疫苗的核苷酸序列。

9、本发明的表位疫苗采用基因工程的方法获得。

1)人工合成编码表位疫苗的核苷酸序列，以下用epi表示此表位疫苗的核苷酸序列；

2)构建pET22b(+)-epi表达载体；

3)将表达载体转化到BL21(DE3)工程菌中，IPTG诱导表达重组蛋白，获得表达目的蛋白的工程菌BL21-pET22b(+)-epi；

4)纯化表达的重组蛋白，得到纯化抗原；

5)此工程菌BL21-pET22b(+)-epi表达的重组抗原即为Hp表位疫苗。

10、本发明的表位肽及表位疫苗可以以合成或重组表达的多肽的形式获得，也可以是裸DNA疫苗，或者是将表位肽及其表位疫苗通过重组到其他载体上获得，如减毒沙门氏菌，痘病毒载体，病毒样颗粒。

11、本发明的表位疫苗具有良好的免疫原性，在小鼠动物模型中可以诱导产生针对Th表位肽特异性的Th细胞应答以及针对B细胞表位的体液免疫应答，即产生针对B细胞表位的抗体。

本发明的主要优点在于：用生物信息学预测加实验鉴定的方法快速，准确，经济。获得的3个表位肽是Hp UreB来源的Th表位肽，可安全有效地引起针对Hp的CD4⁺T淋巴细胞免疫应答。获得此Th细胞表位肽不仅对Hp发病机制的研究，而且对疫苗以及治疗制剂的研制均有重要的意义。此外获得一种基于3个表位肽的表位疫苗，动物实验中显示了良好的免疫原性，特异性好，具有良好的应用前景。

附图说明：

图1显示了3个表位肽能够刺激rUreB致敏的小鼠的CD4⁺T淋巴细胞增殖(刺激指数SI＞2)。

图2显示表位肽刺激淋巴细胞分泌细胞因子的情况。

图3表位肽免疫BALB/c小鼠的脾淋巴细胞对相应免疫多肽及rUreB的增殖效应。

图4表位疫苗构建的质粒图，图中红色标出的部分为插入的目的片断。

图5pET22b(+)-epi/BL21筛选酶切鉴定结果。

图6pET22b(+)-epi/BL21工程菌表达重组蛋白：

泳道1：蛋白Marker；

泳道2：22b空质粒菌诱导前样品；

泳道3：22b空质粒菌诱导后6h样品；

泳道4：重组蛋白诱导前样品；

泳道5-9：分别为重组蛋白诱导后2h-6h样品(箭头所示为重组蛋白)。

图7重组蛋白的表达形式鉴定：

泳道1：蛋白Marker；

泳道2、3：培养基上清；

泳道4-6：诱导表达后细菌的超声上清；

泳道7-9：细菌超声后的沉淀。

图8重组蛋白纯化结果：

泳道1：22b空质粒菌；

泳道2：纯化前样品；

泳道3-5：为纯化后的样品。

图9重组表位疫苗蛋白N端测序结果。

图10表位疫苗免疫小鼠的细胞免疫应答。

图11表位疫苗免疫小鼠诱导抗体产生。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，及对本发明表位肽的利用都属于本发明要求保护的范围。

材料的准备

1、重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB)蛋白为本发明单位重组构建。

2、实验动物：BALB/c小鼠：6-8周龄，SPF级，雌性，体重18-22g，购自第三军医大学实验动物中心。

3、合成多肽：用二甲亚砜(DMSO)溶解成5mg/ml的浓度，-70℃保存，临用时用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成0.5mg/ml。

4、RPMI-1640不完全培养基：RPMI-1640粉：10.4g(1包)，Hepes：2.4g，NaHCO₃：2g加去离子水至1000ml搅匀过滤除菌，分装冻存

5、RPMI-1640完全培养基：RPMI-1640不完全培养基：800ml，小牛血清200ml，青霉素和链霉素双抗(终浓度1万单位/ml)：10ml

6、弗氏佐剂：弗氏完全佐剂：石蜡油(1份)+羊毛脂(1份)+灭活卡介苗1支，弗氏不完全佐剂：石蜡油(1份)+羊毛脂(1份)

7、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl₂ 10g加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。

8、LB固体培养基：1.5g琼脂粉加入100ml LB培养液中，高压蒸气灭菌后(15磅20min)倾倒平板。

9、DNA电泳缓冲液(50×TAE)：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g，加水至1000ml即可，应用浓度为1×TAE。

10、EB溶液：EB贮存液(10mg/ml)，0.2g EB溶解于20ml H₂O中，混匀后于4□避光保存。

11、EB染色液：10μl EB贮存液，100ml 1×TAE缓冲液

12、PBS缓冲液(pH7.2)：Na₂HPO₄ 14mmol，NaH₂PO₄6mmol，NaCl₂ 9g，加蒸馏水到1L

13、NcoI、HindIII  中国大连Takara公司

14、DNA maker  中国鼎国公司

15、质粒抽提试剂盒  Omega公司

16、考马斯亮兰R-250快速染色系统(参考《精编分子生物学实验指南》)。染色液：0.29g考马斯亮兰R-250溶于250ml下述脱色液中。脱色液：250ml 95％乙醇和80ml冰乙酸，加双蒸水至1000ml。

17、TE buffer(pH 8.0)：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA

18、PVDF膜转移缓冲液(蛋白测序用)：CAPS：2.21g，DTT：0.5g，甲醇：150ml，加双蒸水至1000ml，用NaOH调校至pH10.5。

19、ELISA试剂的配制

1)包被液：0.05mmol/L碳酸盐缓冲液pH9.6：Na₂CO₃ 1.6g，NaHCO₃ 2.9g，NaN₃0.2g，加蒸馏水至1000ml

2)抗体稀释液：10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05％Tween-20；0.5％BSA

3)封闭液：10mmol/L PBS(pH7.3)；2.0％BSA

4)洗涤液：10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05％Tween-20

5)底物液：0.1mmol/L Na₂HPO₄ 5.12ml；0.05mmol/L柠檬酸4.86ml；OPD 4mg；30％H₂O₂ 5μl；加水至100ml。

实施例1、Th表位的筛选鉴定：

1.1表位肽的预测及合成

首先在NCBI的蛋白质数据库检索Hp的UreB序列，UreB在各菌株保守，选用其中一株Helicobacter pylori 26695(编号NP_206872)的UreB氨基酸序列进行预测，UreB全序列共有569个氨基酸。采用网上的在线软件RANKPEP软件分析Hp的UreB的氨基酸序列，筛选了7条可能的Th表位肽，用常规的肽全人工合成法(由北京中科亚光公司协助合成)，制备了7条有可能诱导机体产生Th应答的多肽，纯度均在85％以上。合成肽的信息见表1。

NCBI的蛋白质数据库检索网址：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db＝Protein&itool＝toolbar

RANKPEP预测软件可在互联网上如下网址获得：

http://mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html

表1  预测获得的UreB Th表位的基本信息

1.2动物免疫：

6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，用重组尿素酶B亚单位(rUreB)加完全福氏佐剂(CFA)皮下多点注射免疫，每只小鼠100μg/0.5ml，三周后用同样剂量的rUreB加不完全弗氏佐剂(IFA)加强免疫一次。对照组小鼠用PBS替代rUreB进行免疫，免疫方法及程序相同。

1.3CD4⁺T淋巴细胞增殖实验鉴定表位肽

小鼠末次免疫后10-15天脱臼处死，无菌取出小鼠脾脏，钢网上碾磨制备脾单细胞悬液，用小鼠淋巴细胞分离液(天津TBD公司)分离小鼠的单个核细胞，然后再用免疫磁珠阴性选择的方法(Dynal公司的试剂盒)分离小鼠脾细胞中CD4⁺T淋巴细胞，操作按照试剂盒说明书进行。分离后的CD4⁺T淋巴细胞用PE标记的抗小鼠CD4单抗、FITC标记的抗小鼠CD3单抗进行染色，流式细胞计数鉴定纯度大于95％。用RPMI-1640完全培养基悬浮细胞，于96孔平底培养板，每孔加入CD4⁺T淋巴细胞2×10⁵，Co⁶⁰照射(射线剂量：20Gy)的脾单个核细胞(作为抗原提呈细胞)4×10⁵，同时加入稀释好的合成多肽(终浓度为：1.25μg/ml)，阴性对照孔不加合成多肽，阳性对照孔加入rUreB(终浓度为：15μg/ml)，同时设立CD4⁺T淋巴细胞加合成多肽及APC加ConA的对照孔，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。37□、5％CO₂孵箱培养5天，于结束培养前12-16小时加入氚标记脱氧嘧啶核苷酸(³H-TdR)，1μCi/孔，继续培养12-16小时后用多头细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，烘干后用Beckman液闪计数仪测定每分钟脉冲数(cpm)，计算3个复孔的均值(x±s)，结果以刺激指数(SI)表示(SI＝实验组cpm均值/阴性对照组cpm均值，阴性对照指不加抗原肽刺激的孔)，SI≥2为阳性。

结果：采用免疫磁珠阴性分选试剂盒进行CD4⁺T淋巴细胞的分离，分离后的CD4⁺T淋巴细胞经流式鉴定纯度达到95％以上。分离的CD4⁺T淋巴细胞与Co⁶⁰照射脾单个核细胞及合成多肽共同培养，发现P2(U_546-561)、P3(U_229-244)、P7(U_237-251)能够刺激rUreB致敏的BALB/c小鼠脾脏的CD4⁺T淋巴细胞增殖(SI＞2)。CD4⁺T淋巴细胞活化增殖需要时别的是抗原提呈细胞表面的MHC II与表位肽的复合物，脾单个核细胞在此作为抗原提呈细胞(APC)辅助多肽刺激CD4⁺T淋巴细胞增殖，Co⁶⁰照射可以抑制细胞的增殖，用ConA刺激Co⁶⁰照射的APC，不能使其增殖，说明培养体系中增殖的为CD4⁺T淋巴细胞。在CD4⁺T淋巴细胞增殖试验时同时还设立了CD4⁺T淋巴细胞加抗原的对照，发现缺乏APC的情况下CD4⁺T淋巴细胞也不能增殖。说明此3个多肽刺激淋巴细胞增殖不是非特异性反应，而是UreB抗原特异性的。在免疫小鼠时设立了佐剂免疫的对照组，同时进行了CD4⁺T淋巴细胞增殖试验，发现P2(U_546-561)、P3(U_229-244)、P7(U_237-251)能够刺激rUreB免疫的小鼠淋巴细胞增殖，而不能刺激佐剂免疫小鼠的淋巴细胞增殖(SI＜2)，见图1。此结果说明此三个多肽能刺激CD4⁺T淋巴细胞增殖，并且是UreB特异性的。

实施例2：ELISA方法检测表位肽诱导Th细胞极化方向：

取rUreB免疫小鼠的脾细胞，分离脾CD4⁺T淋巴细胞，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞，于24孔平底培养板，每孔加入CD4⁺T淋巴细胞5×10⁵，Co⁶⁰照射(20Gy)的脾单个核细胞(作为抗原提呈细胞)5×10⁵，同时加入稀释好的合成多肽(终浓度1.25μg/ml)，阴性对照孔不加合成多肽，终体积为0.5ml/孔，每组做3个平行孔。于合成表位肽刺激的小鼠脾淋巴细胞后72小时收集培养上清400ul、置于-70℃备用。采用eBIOSCIENCE公司的Th1/Th2分型试剂盒检测细胞因子。具体步骤如下：用伽马干扰素(IFN-γ)、白介素4(IL-4)、白介素2(IL-2)、白介素10(IL-10)捕获单抗包被酶标板，4℃过夜，洗涤液洗涤3次，用封闭液封闭，室温1h，洗涤3次，备用。检测时，每孔加入100μl待测培养上清及倍比稀释的标准品，于37℃孵育2h，洗板5次，加入100μl的生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h，洗板5次，再加入100μl HRP标记的亲和素，37℃孵育30min洗板7次，加入100μl TMB底物，室温放置15min，最后加入50μl终止液，在波长450nm及570nm处分别测吸光度值(A)，结果用A₄₅₀-A₅₇₀表示。

结果：P2(U_546-561)、P3(U_229-244)分泌的IL-4和IL-10均显著高于阴性对照组(P＜0.05)，为Th2型表位，P7(U_237-251)分泌IFN-γ显著高于阴性对照组，(P＜0.05)，为Th1型表位。(见图2)。目前关于Hp的致病机理公认的是Th1细胞在致病过程中起主要作用，对于免疫保护机制目前还不清楚，有的认为是Th1型免疫应答起主要作用，有的认为是Th2应答起主要作用，但目前多倾向于两者的协同作用，引发Th1/Th2平衡的免疫应答有利于Hp感染的免疫保护。因此鉴定出Th1/Th2表位对于研究致病机理及免疫保护机制，及疫苗的设计有重要的指导作用。

实施例3：表位肽协同刺激效应

具体操作同实施例1，不同点为除采用单独的合成表位肽刺激淋巴细胞外，还用筛选出的3个表位肽两两平均混合及全部混合作为刺激原刺激淋巴细胞增殖，表位肽最终的总浓度为1.25μg/ml，其余步骤相同，比较表位肽组合后的刺激效应与单独的表位肽的刺激效应是否有差别。

结果：三个表位肽两两组合及三个混合的刺激效果均高于单独的表位肽刺激(见表2)，提示在后续的疫苗设计中可以将此三个表位进行组合。

表2.表位肽的协同刺激效应

实施例4：表位肽免疫BALB/c小鼠的免疫效应

主要观察机体针对表位肽产生的免疫应答是否能够识别Hp的UreB，进一步确证此三个肽是否为UreB的表位肽。

4.1表位肽免疫：

用合成的表位肽加不完全弗氏佐剂(IFA)尾根部及足掌多点皮下免疫BALB/c小鼠，间隔14天加强免疫一次，共免疫三次。同时设立PBS对照免疫组，每组10只小鼠。

4.2、免疫效应检测：

表位肽末次免疫后10天取小鼠脾脏，用小鼠淋巴细胞分离液分离小鼠的淋巴细胞，用RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为4×10⁶/ml，于96孔板每孔加入100μl，再加入100μl稀释好的多肽(终浓度为1.25μg/ml)及rUreB(终浓度为15μg/ml)，阴性对照孔不加合成多肽，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。37□、5％CO2孵箱培养5天，于结束培养前12-16小时加入³H-TdR，1μCi/孔，继续培养12-16小时后用多头细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，烘干后用Beckman液闪计数仪测定每分钟脉冲数(cpm)，计算3个复孔的均值(x±s)，结果以刺激指数(SI)表示(SI＝实验组cpm均值/阴性对照组cpm均值，阴性对照指不加抗原肽刺激的孔)，SI≥2为阳性。

结果：3个表位肽均能刺激小鼠产生针对各自免疫多肽及rUreB的细胞免疫应答(SI＞2)，见图3。

实施例5：表位肽免疫小鼠后细胞免疫应答的类型

常规无菌取脾细胞后，2000转离心，弃上清，于细胞沉淀中加入5ml红细胞裂解液(0.83％的氯化铵)，吹打混匀后室温放置2分钟去除红细胞，用含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤2遍，调整细胞浓度为10⁷/ml，分别取100μl细胞悬液置于两个EP管中，试验管加入PE标记的抗小鼠CD4抗体、FITC标记的抗小鼠CD3抗体，对照管加入PE及FITC标记的同型抗体，冰上避光孵育30min染色，洗涤2次，最后用500μl含2％BSA的PBS重悬，流式细胞仪检测。

结果：表位肽免疫组小鼠，其CD4⁺T淋巴细胞的比例均显著高于PBS对照组的CD4⁺T淋巴细胞比例，提示表位肽免疫后能够促进CD4⁺T淋巴细胞增殖。结果见表3。

表3表位肽免疫小鼠后细胞免疫应答的类型

^＊表示与对照组相比，差异显著，P＜0.05

实施例6：表位肽口服免疫BALB/c小鼠免疫保护效力

6.1表位肽口服免疫

6-8周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成两组，每组30只，免疫组将3个表位肽等量混合后，加霍乱毒素B亚单位(CT-B)佐剂免疫，对照组用PBS免疫，剂量为150μg/只/次。

6.2免疫程序：小鼠免疫前禁食、水24小时，饲喂针灌喂胃酸中和液0.3ml，20分钟后，按各组要求灌喂总体积0.3ml、PBS溶解的抗原和佐剂，免疫时间为0、1、2、4周。

6.3Hp的液体培养：混配SS1菌株接种到脑心浸液血琼脂平板，通过抽气换气建立微需氧环境(10％CO2，5％O2，85％N2)37℃培养2天，从平板上刮取菌苔，混悬于无菌生理盐水，以麦氏标准比浊管第一管为标准配成浓度为3×10⁸个/ml的菌悬液，迅速取2ml接种于200ml无菌Hp培养肉汤，微需氧环境及37℃振荡(120转/分钟)培养，培养24h后，取出培养液，每分钟3000转的速度离心5分钟，保留上清20ml，充分混悬细菌，立即饲喂针灌喂小鼠。

6.4Hp攻毒：于末次免疫后2周，免疫组与对照组均用Hp SS1株菌液进行灌喂，所有小鼠提前24h断食、断水，每只灌胃0.3ml、约10⁸CFU菌液，上下午各一次，间隔6小时，末次灌胃后2小时进食水。

6.5取样：在末次攻毒后的第4周，宰杀免疫及对照小鼠各15只，处死前24小时断食水，眼球放血，分离血清；取出鼠胃，沿胃大弯剖开，用生理盐水轻轻冲掉胃内残留物，将一半胃粘膜组织涂布Hp培养基，三线法划线接种，微需氧培养3-7天，每天开罐检查，如有可疑菌落生长，通过菌落特点、细菌形态及染色性、快速脲酶试验进行Hp鉴定，将另一半胃粘膜分别进行尿素酶试验和直接涂片，革兰式染色镜检。

6.6结果判定及免疫保护率的计算：

若培养的平板上出现圆形、半透明、湿润的可疑菌落，经涂片、革兰氏染色镜检，见革兰氏阴性螺杆状细菌，且尿素酶试验阳性，判定该只小鼠有Hp感染定植；若胃粘膜直接涂片染色镜检，见革兰氏阴性螺杆状细菌，且尿素酶试验阳性，亦判定该只小鼠有Hp感染定植。判定本实验结果有效的前提条件为：未免疫接种对照组感染率达到80％以上，且每组小鼠的存活数在12只以上。

感染率(％)＝(每组感染小鼠数/每组存活小鼠数)×100％

保护率(％)＝(每组未感染小鼠数/每组存活小鼠数)×100％

结果：PBS对照组，感染率达到90％以上，表位肽口服免疫组，Hp SS1标准菌株攻毒后，4周免疫保护率菌为70％，免疫组与对照组相比差异显著，结果提示，表位肽口服免疫小鼠对Hp感染有一定的保护作用。但是由于多肽单独分子量小，在体内易降解，而致免疫原性差，导致在本实验中保护率仅为70％，但是仍然可以说明本发明表位肽对于抗Hp感染具有保护作用，可以通过后续的疫苗设计，使其恢复大分子特性，增加免疫原性等方法，可以达到更好的保护效果。

表4：表位肽免疫的保护效果

实施例7：表位肽诱导Hp感染患者外周血淋巴细胞增殖

5例Hp感染病人外周血收集自重庆西南医院，均经过胃镜检确诊为Hp感染。5例健康献血者的外周血作为对照，均为无菌采集，用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)在液氮中保存备用。

淋巴细胞增殖试验：

5例Hp感染者及5例健康者PBMC用RPMI-1640完全培养基(含10％小牛血清、2mML-谷氨酰胺、50μM二巯基乙醇及链霉素、青霉素双抗)调整细胞浓度为4×10⁶/ml，于96孔板每孔加入100μl，再加入100μl稀释好的多肽(终浓度为1.25μg/ml)及rUreB(终浓度为15μg/ml)，阴性对照孔不加合成多肽，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。37□、5％CO2孵箱培养5天，于结束培养前12-16小时加入³H-TdR，1μCi/孔，继续培养12-16小时后用多头细胞收集将细胞器收集于玻璃纤维滤纸上，烘干后用Beckman液闪计数仪测定每分钟脉冲数(cpm)，计算3个复孔的均值(x±s)，结果以刺激指数(SI)表示(SI＝实验组cpm均值/阴性对照组cpm均值，阴性对照指不加抗原肽刺激的孔)，SI≥2为阳性。

结果：在收集的5例Hp感染患者的PBMC的淋巴细胞增殖试验中，P2、P7能够刺激3例患者的PBMC发生增殖反应，P3能刺激2例患者的PBMC发生增殖反应，而P2、P3、P7均不能刺激健康者的PBMC发生增殖(SI＜2)，见表5。提示我们的表位肽具有开发人用疫苗的潜能。

表位功能要受到MHC限制性，人的MHC分子又称为HLA，具有很多型别，我们的表位多肽不能完全刺激5例患者的PBMC的淋巴细胞增殖试验，可能是由于HLA型别不匹配，进一步研究5例患者的HLA型别，可以了解3个表位肽的HLA限制性特征，在人用疫苗的研制过程中可以将其合理组合，使疫苗具有广泛的HLA限制性，能够在多数人群中起到保护作用。

表5表位肽刺激人外周血淋巴细胞增殖

实施例8：表位疫苗的设计、构建、表达

1、表位疫苗的设计

将3个优选的Th细胞表位肽与文献报道的一个来自UreB的B细胞表位SIKEDVQF(参见文献：Hirota K.；Nagata K.；Norose Y.；Futagami S.；Nakagawa Y.；Senpuku H.；Kobayashi M.；Takahashi H.(2001).鉴定幽门螺杆菌的尿素酶的一个可以诱导产生中和抗体的抗原表位感染与免疫69，6597-6603.)串联连接起来，表位之间以两个赖氨酸(KK)间隔，KK是组织蛋白酶B的切割位点，在各表位之间加入KK间隔序列有利于Th表位肽的体内切割，以使各个表位单独发挥效应，并且避免在表位的连接处产生新的结合表位。(参见文献：Yano A.；Onozuka A.；Asahi-Ozaki Y.；Imai S.；Hanada N.；Miwa Y.；Nisizawa T.一种肽疫苗的巧妙的设计方法疫苗学23(2005)2322-2326)

构建的疫苗形式如下：

Th细胞表位(P7-P3-P2)-B细胞表位(SIKEDVQF)

氨基酸序列如下：

VADKYDVQVAIHTDTKKSAINHALDVADKYDVQKKFVDGKEVTSKPANKVSKKSIKEDVQF

2、表位疫苗基因(epigen，简称epi)的合成：

采用大肠杆菌的优势密码子，将上述构建的疫苗的氨基酸序列转化为核酸序列，两端分别加入酶切位点NcoI和Hind□，并对核酸序列进行酶切位点分析，核酸序列自身并无NcoI和Hind□酶切位点，共195个bp表达蛋白部分186个bp，序列如下(其中划线部分为酶切位点)：

NcoI

CCATGGTGGCGGATAAATATGATGTGCAGGTGGCGATCCACACCGATACCAAAAAAAGC

GCGATTAACCACGCGCTGGATGTGGCGGATAAATATGATGTGCAGAAAAAATTTGTGGAT

GGCAAAGAAGTGACCAGCAAACCGGCGAACAAAGTGAGCAAAAAGAGCATTAAAGAA

GATGTGCAGTTT TAAGCTT

Hind□

采用NcoI和Hind□两个酶切位点将全基因连接至pET22b(+)载体上，可以利用此载体上的信号肽，以期望目的蛋白以可溶形式表达，有利于保持蛋白的活性和抗原性。插入的DNA片段带有终止密码子(TAA)插入在载体His标签前可以去除His标签。全基因序列合成委托(Genray)公司完成。构建图见图4，合成全基因以质粒形式提供，质粒名称命名为：

pET22b(+)-epi。

3.感受态菌的制备(CaCl₂法)：

[1]无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。

[2]挑取单个菌落接种于5ml LB培养液中，37℃摇床过夜培养。

[3]将过夜培养的BL21按1％比例转种至10ml LB培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，取4ml菌液转移到5ml离心管中，冰浴10min，

[4]5000转离心10min，弃上清。

[5]加入1mL冰预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴1h。5000转离心10min，弃上清。加入100μl冰预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1h，备用。

4.质粒pET22b(+)-epi的转化(热休克法)

[1]取感受态菌液100μl，转化管加入质粒pET22b(+)-epi 10μl；对照管不加质粒。冰水浴45min，42℃水浴热休克90s，迅速放置冰水浴2min。

[2]加100μl LB培养液，37℃摇床培养复苏1h。

[3]各取50μl涂布Amp⁺-LB平板，37℃孵箱培养过夜。

5 Amp⁺-LB平板筛选转化成功的细菌

LB平板上BL21布满细菌，Amp⁺-LB平板BL21阴性对照无菌落生长；挑取转化平板上分隔良好的单个菌落接种于7mlAmp⁺-LB培养液中，37℃摇床培养过夜。取4ml抽提质粒。

6、质粒DNA抽提(使用美国Omega公司质粒抽提试剂盒)

[1]取4ml菌液于5mL离心管中，12000g离心2min，留取沉淀。

[2]每管加250μl Solution I悬浮，充分混匀。

[3]加入250μlSolution II，轻柔颠倒混匀4-6次。

[4]加入350μl SolutionIII，轻柔颠倒混匀4-6次。

[5]4℃、12000g离心10min，将上清移至分离柱中。

[6]12000g离心1min，倾倒收集管中的废液。

[7]加入500μl Hb buffer于分离柱中，12000g离心1min，倾倒收集管中的废液。

[8]加入750μl DNA wash buffer(加入无水乙醇)，12000g离心1min，重复一次。空柱离心12000g，2min。

[9]室温放置5-10min，使乙醇完全挥发。

[10]将分离柱置于另一干净1.5ml的Ep管中并加入50μl的ddH₂O(55℃预温)，12000g离心1min。收集洗脱液即为抽提的质粒，置于-20℃保存备用。

7、质粒双酶切鉴定：

用NcoI和Hind□双酶切鉴定，酶切体系如下：

质粒          7μl，

NcoI          0.5μl，

Hind□        0.5μl，

10×buffer(K) 1μl，

1％BSA        1μl，

混匀，37℃水浴2h，2％的琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

质粒大小和切下的片段在大约200bp处，大小与预期值(195bp)相符，见图5。

8、IPTG诱导重组工程菌BL21(DE3)表达：

取鉴定无误的重组菌接种于3mL含Amp的LB培养液中，37□摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于10mL含Amp的LB培养液中，37□摇床培养，待OD₆₀₀约0.6-1.0时，加入IPTG诱导，终浓度为0.5mM，分别留取诱导前和诱导后2、3、4、5、6h的菌液标本，并测定OD₆₀₀值；同时诱导空载体pET22b/BL21(DE3)，并留取诱导前后标本作为对照。

10、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)检测重组蛋白的表达

样本处理：按公式：菌液量(ml)＝1/OD₆₀₀取样离心，弃上清，收集细菌沉淀加入100μl ddH₂O和100μl 2×上样buffer，重悬混匀，煮沸10min，1000g离心3min后取上清备用。

配置16％Tricine-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，配方如表6。待凝胶完全聚合后，拔出上样梳，用阴极电泳缓冲液清洗上样孔并用滤纸吸干孔内液体。将待测样本与蛋白Marker上样，60V电泳1h，100V 3h，凝胶于考马斯亮蓝R250染色液中染色1h，脱色液脱色至背景无色。

表6、16％Tricine-SDS-PAGE胶配方

重组工程菌BL21-pET22b(+)-epi经IPTG诱导后，进行电泳观察蛋白表达情况，与对照相比目的蛋白有表达，见图6。

11、重组蛋白表达形式鉴定：

超声破菌：超声波裂解菌体，功率300W，超声10s，间歇10s，工作90次。取样染色后于显微镜下观察破菌效果，未破细菌＜2个/油镜视野为裂菌完全。750g×30min离心去掉未破细菌，上清经12000g×30min高速离心，分离上清和沉淀。分别取沉淀及上清做Tricine-SDS-PAGE电泳。电泳结果显示重组蛋白要是在超声上清中以可溶形式表达。见图7。

12、重组蛋白的纯化：

经DNASIS软件预测分析，重组蛋白等电点为9.53，采用阴离子层析与阳离子层析相结合的方法纯化

[1]阴离子柱纯化：选择阴离子柱HiTrap Q进行纯化，A液使用10mmol/L NaHCO₃，PH10B液采用10mmol/L NaHCO₃+1MNaCl。

[2]离子柱纯化：采用Sepharose SP阳离子柱，A液使用10mmol/L PB，pH6.0，B液采用10mmol/L PB+1MNaCl。

[3]纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度

结果；纯化的蛋白纯度在95％以上，见附图8。

13、目的蛋白的N端测序

1)16％的Tricine-SDS-PAGE分离纯化的目的蛋白。

2)取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒，然后放入CAPS电转移缓冲液中。

3)取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。

4)将用于电转移的滤纸和海绵放入CAPS缓冲液中浸泡，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将转印夹层装好。

5)将转印夹层插入转移装置，PVDF膜靠近阳极。用CAPS转移缓冲液充满转移槽，在50V恒压下电转移3h。

6)小心取下PVDF膜，用去离子水漂洗后，用甲醇浸泡数秒钟，然后用含0.1％考马斯亮蓝R-250的50％甲醇染色1min，用含10％乙酸的50％甲醇脱色至背景清晰为止，用去离子水充分漂洗。

⑥用刀片将目标蛋白条带切下，送中国医学科学院基础医学研究所中心实验室测序N端的5个氨基酸。

结果：测序报告见图9，如图所示每个循环都有两个氨基酸同时发生反应，提示样品中存在两种不同N末端的肽链。分析表明，这两种肽链是一种蛋白质，其中一部分的N末端第一个残基M消失，并未观察到其他蛋白质肽链的存在。结论：测序结果N端6个氨基酸为MVADKY，与重组表位疫苗蛋白的N端序列完全一致。

实施例9：表位疫苗的免疫效应观察

1、福林(folin)-酚试剂法(也称Lowry法)测定纯化蛋白浓度：

1)Lowry蛋白浓度检测试剂(由本校生化教研室提供)，

2)样品准备：首先将纯化的蛋白样品2倍、5倍、10倍稀释，于试管中每管加入500μl；标准管加入标准品(牛血清白蛋白：250μg/ml)500μl，空白管加双蒸水500μl；均做复管；

3)加入甲试剂(有甲试剂A与甲试剂B 50∶1的比例混合而成)每管2.5ml，混匀室温放置10min；

4)加入乙试剂，每管250μl，室温放置30min；

5)紫外分光光度计检测波长650nm处的吸光度，以空白管调零。

6)结果绘制标准曲线，获得标准曲线的回归方程，将样品值待入公式计算样品，取复管的均值为最后浓度。

结果：标准曲线方程：Y＝0.0021X+0.0056

纯化蛋白浓度为1.45mg/ml。

2、动物免疫

2.1分组：分为三组，具体见表7。

表7动物分组

2.2免疫程序

首次采用抗原加完全福氏佐剂免疫，间隔2周采用相同抗原加不完全福氏佐剂加强免疫，于第二次免疫后十天剖杀15只小鼠，检测细胞免疫应答。于免疫四次后第七天取剩下小鼠的血液上清检测抗体水平。

3、细胞免疫应答检测：具体操作同实施例中4.2，在本实施例中采用P2、P3、P7及表位疫苗蛋白及重组UreB蛋白作为刺激原，观察淋巴细胞的增殖反应。

结果：P2、P3、P7、表位疫苗重组蛋白及重组UreB蛋白均能刺激表位疫苗免疫的小鼠的淋巴细胞增殖(SI＞2)，见图10。表明本发明构建表达的表位疫苗重组蛋白免疫小鼠可以引发针对P2、P3、P7三个Th表位肽的细胞免疫应答，表明本发明构建的表位疫苗的方法可以使包含的表位各自发挥效应。并且本发明的表位疫苗可以识别UreB蛋白。

4、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测抗体的产生：

采用rUreB、Hp全菌蛋白、重组表位疫苗蛋白包被的ELISA板检测表位疫苗免疫的血清中的抗体。步骤如下：

1)酶标板的预处理：将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用。

2)用包被液将抗原稀释为合适的浓度：rUreB为2μg/ml，Hp全菌蛋白及重组表位疫苗蛋白为5μg/ml，

3)包被：酶标板加100μl/孔上述抗原液，4℃过夜，洗涤液洗涤5遍，空干。

4)封闭：加封闭液300μl/孔，4℃过夜，洗涤5遍，空干，密封4℃保存备用。

5)采血及稀释：小鼠眼眶取血，离心取上清用抗体稀释1∶1000倍稀释。

6)取包被好的酶标板，加入依次稀释血清100μl/孔，37℃水浴30min，洗涤4遍，空干。

7)加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶20000稀释)100μl/孔，37℃水浴30min，洗涤4遍，空干。

8)加底物显色液100μl/孔，室温避光反应5～10min。

9)加终止液50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值

10)结果判断：OD值大于或等于阴性对照(小鼠免疫前血清1∶10倍稀释)的2.1倍时视为抗体阳性。

结果：如图11，表位疫苗免疫组的血清能够与表位重组蛋白及重组UreB蛋白及Hp全菌蛋白反应，而空载体免疫对照组及PBS对照组不能与上述抗原反应。说明本发明构建的表位疫苗诱导小鼠产生的抗体能够特异性的识别表位重组蛋白、重组UreB蛋白及Hp全菌蛋白。

根据以上实验可证明，本发明中的Th表位多肽具有诱导BALB/c小鼠脾淋巴细胞及人的外周血淋巴细胞增殖的能力，并且能够对Hp的感染起到保护作用。本发明的表位疫苗利用了本发明的Th表位多肽及一个额外的UreB的B细胞表位肽，实验验证具有良好免疫原性，能够诱导机体的细胞与体液免疫应答，表明本发明的表位疫苗的构建策略是成功的。

本发明的表位疫苗是本发明的多肽在疫苗研制中的一种应用的实施举例，而不是本发明多肽在疫苗研制领域应用的限制，其它利用了本发明多肽的氨基酸序列或DNA序列的疫苗也属于本发明的保护范围；本发明的多肽具有抗Hp感染的作用，用来研制预防性或治疗性多肽药物或免疫制剂。

此外，这里提供的实施方案应看作是举例说明而非限制性的，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员在不违反前面充分阐述的本发明的实质或范围条件下，可对本发明的实施方案做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

序列1：

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th表位肽、其编码DNA、疫苗及其应用

<130>

<160>12

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的多肽

<400>1

Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn

1                   5                   10                     15

序列2：

<210>2

<211>16

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th表位肽

<400>2

Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val Ser

1                 5                        10                    15

序列3：

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>(幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th表位肽

<400>3

Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln

1           5                             10                     15

序列4：

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的多肽

<400>4

 Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr

 1                 5                       10                     15

序列5：

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的多肽

<400>5

Ile Ser Pro Gln Gln Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr

1                   5                       10                   15

Met Ile

序列6：

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的多肽

<400>6

Tyr Thr Gly Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys

1                   5                        10                  15

序列7：

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th表位肽

<400>7

Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr

1                  5                        10                15

序列8：

<210>8

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>根据大肠杆菌的优势密码子合成的编码表位肽的核苷酸序列

<400>8

ttt gtg gat ggc aaa gaa gtg acc agc aaa ccg gcg aac aaa gtg agc

Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val Ser

1                 5                        10                   15

序列9：

<210>9

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>根据大肠杆菌的优势密码子合成的编码表位肽的核苷酸序列

<400>9

agc gcg att aac cac gcg ctg gat gtg gcg gat aaa tat gat gtg cag

Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln

1                   5                      10                   15

序列10：

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>根据大肠杆菌的优势密码子合成的编码表位肽的核苷酸序列

<400>10

gtg gcg gat aaa tat gat gtg cag gtg gcg atc cac acc gat acc

Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr

1                   5                       10                 15

序列11：

<210>11

<211>186

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>根据大肠杆菌的优势密码子合成的编码表位疫苗的核苷酸序列

<400>11

atg gtg gcg gat aaa tat gat gtg cag gtg gcg atc cac acc gat acc aaa aaa agc gcg60

Met Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Lys Lys Ser Ala

1               5                    10                 15                   20

att aac cac gcg ctg gat gtg gcg gat aaa tat gat gtg cag aaa aaa ttt gtg gat ggc 120

Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Lys Lys Phe Val Asp Gly

                25                  30                  35                 40

aaa gaa gtg acc agc aaa ccg gcg aac aaa gtg agc aaa aag agc att aaa gaa gat gtg 180

Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val Ser Lys Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val

                45                  50                  55                   60

cag ttt                                                                     186

Gln Phe

    62

序列12：

<210>12

<211>62

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>用两个赖氨酸(Lys Lys)接头将4个来自幽门螺杆菌(helicobacter pylori)的表位连接成的表位疫苗

<400>12

Met Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr

1               5                   10                  15

Lys Lys Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp

            20                  25                  30

Val Gln Lys Lys Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala

        35                  40                  45

Asn Lys Val Ser Lys Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe

    50                  55                  60

Claims (8)

1.来自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的Th表位肽，其特征是序列表中的序列2、序列3、序列7的氨基酸序列之一。

2.编码权利要求1所述的Th表位肽的核苷酸序列，其特征是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列8、序列9、序列10的核苷酸序列；

2)与序列表中序列8、序列9、序列10具有相同编码产物的核苷酸序列。

3.包含权利要求2所述的核苷酸序列的表达载体。

4.一种疫苗，它的活性成分为权利要求1所述的Th表位肽与一个来自UreB的B细胞表位SIKEDVQF串联起来，各表位之间用两个赖氨酸间隔。

5.权利要求4所述的疫苗，其特征是序列表中序列11的氨基酸序列。

6.编码权利要求5所述的疫苗的核苷酸序列，其特征是序列表中序列12的核苷酸序列。

7.构建权利要求5所述的疫苗的方法，其特征在于用两个赖氨酸作为表位肽之间的间隔序列。

8.包含权利要求1中所述的Th表位肽的组合物，其特征是用作预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物组合物。

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