CN105021820B - 一种聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用。该聚丙烯酰胺凝胶包括独立配制的浓缩胶和分离胶；每份所述浓缩胶原料组成如下：2.67mL水、0.33mL丙烯酰胺‑甲叉双丙烯酰胺溶液、1mL凝胶缓冲液、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；每份所述分离胶原料组成为如下1)或2)：1)2.20mL水、1.2mL丙烯酰胺‑甲叉双丙烯酰胺溶液、2mL凝胶缓冲液、0.6mL丙三醇、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；2)0.88mL水、2.23mL丙烯酰胺‑甲叉双丙烯酰胺溶液、2.23mL凝胶缓冲液、0.66mL丙三醇、22μL过硫酸铵水溶液和2.2μL四甲基乙二胺。所用电极缓冲液为三羟甲基氨基甲烷‑三羟甲基甘氨酸缓冲体系。本发明易于推广、操作简单、分辨率高、与免疫印迹等兼容性好。

Description

一种聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用

技术领域

本发明涉及一种聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用，属于生物化学技术领域。

背景技术

电泳技术是生物化学领域分离鉴定蛋白和核酸必不可少的实验方法，几乎任何一个科研单位都会运用的电泳技术有聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、琼脂糖凝胶电泳等。前者常用来分离蛋白质，后者常用来分离核酸。

SDS-PAGE因缓冲体系不同，可分为Glycine-SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE，前者采用“三羟甲基氨基甲烷(Tris)-甘氨酸(Glycine)缓冲体系”，后者采用“三羟甲基氨基甲烷(Tris)-三羟甲基甘氨酸(Tricine)缓冲体系”。Glycine-SDS-PAGE的分辨率为20-200kD，对20kD以下的蛋白质分辨率较低，小分子条带弥散，常无着色带。Tricine-SDS-PAGE分辨率为1-100kD，小分子条带清晰，着色明显。这也就决定了Tricine-SDS-PAGE是分离100kD以下，尤其是分子量在20kDa以下小分子蛋白的最佳选择。

蛋白的SDS-PAGE电泳技术有两种操作系统，即迷你胶(10.1cm×7.3cm×0.1cm)操作系统和大胶(19cm×16.9cm×0.1cm)操作系统。Glycine-SDS-PAGE在两种系统中均有应用，其中迷你胶中应用更为广泛且操作简便，但分辨率较低；Tricine-SDS-PAGE技术目前的应用多见于大胶操作系统，分辨率高，但操作繁琐。

如果想分离得到20kDa以下的蛋白质，就必须采用Tricine-SDS-PAGE，同时使用大板胶，这会带来两个弊端：一是操作繁琐，工作量大；二是大板胶正在逐渐被迷你胶取代，Tricine-SDS-PAGE难以推广。因此提供一种在迷你胶操作系统中进行Tricine-SDS-PAGE的聚丙烯酰胺凝胶具有重要意义，既操作简便，又可较好地分离小分子蛋白或多肽。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用。本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶适用于迷你胶操作系统，操作简单，通过调整聚丙烯酰胺凝胶的配方，同时引入“三羟甲基氨基甲烷(Tris)-三羟甲基甘氨酸(Tricine)缓冲体系”，可有效分离20kDa以下的小分子蛋白，分辨率高。

本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶，它包括独立配制的浓缩胶和分离胶；

每份所述浓缩胶的原料组成如下：

2.67mL水、0.33mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、1mL凝胶缓冲液、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；

每份所述分离胶的原料组成为如下1)或2)：

1)2.20mL水、1.2mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2mL凝胶缓冲液、0.6mL丙三醇、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；

2)0.88mL水、2.23mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2.23mL凝胶缓冲液、0.66mL丙三醇、22μL过硫酸铵水溶液和2.2μL四甲基乙二胺；

所述丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液为丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液；

所述凝胶缓冲液由三羟甲基氨基甲烷和盐酸溶于水后得到；

所述过硫酸铵水溶液的质量体积浓度为0.1g/mL。

上述聚丙烯酰胺凝胶中，每100mL所述丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液的原料组成如下：

48g丙烯酰胺、1.5g甲叉双丙烯酰胺和余量的水；

上述聚丙烯酰胺凝胶中，每300mL所述凝胶缓冲液的原料组成如下：

36.3g三羟甲基氨基甲烷、1.2mL质量百分含量为36％～38％的盐酸水溶液、0.3g十二烷基磺酸钠和余量的水；

在实验过程中，先配制100mL所述凝胶缓冲液(36.3g三羟甲基氨基甲烷、1.2mL质量百分含量为36％～38％的盐酸水溶液、0.3g十二烷基磺酸钠和余量的水)的储备液，使用时稀释3倍。

上述聚丙烯酰胺凝胶中，所述盐酸水溶液可为盐酸(分析纯)，密度为1.19g/mL，摩尔浓度为12mol/L。

上述聚丙烯酰胺凝胶中，所述丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液中的单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在加速剂过硫酸铵(APS)和催化剂四甲基乙二胺(TEMED)的作用下聚合交联形成三维网状的凝胶，凝胶的孔径大小可以通过所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度和交联度控制。

上述聚丙烯酰胺凝胶中，所述浓缩胶的浓度(T)为4％，交联度(C)为3％，浓度较低，可以使蛋白快速迁移且聚集成带；所述分离胶的原料1)经聚合反应之后得到的分离胶的浓度(T)为10％，交联度为(C)3％；所述分离胶的原料2)经聚合反应之后得到的分离胶的浓度为(T)18％，交联度(C)为3％，浓度较高，根据分子筛效应，可使不同分子量的蛋白得以分离。其中，浓度T和交联度C的计算公式如下：

T％＝{[丙烯酰胺(g)+甲叉双丙烯酰胺(g)]/总体积(mL)}×100％；

C％＝{甲叉双丙烯酰胺(g)/[丙烯酰胺(g)+甲叉双丙烯酰胺(g)]}×100％。

上述聚丙烯酰胺凝胶中，所述浓缩胶与所述分离胶的体积比为2：3。

本发明也提供了一种电泳套装，所述电泳套装包括上述聚丙烯酰胺凝胶和三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系；

本发明电极缓冲液采用的是所述三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系，每1L阳极缓冲液(储备液)的原料组成如下：

121g三羟甲基氨基甲烷、2.7mL盐酸和余量的水；

所述盐酸具体可为分析纯，密度为1.20g/mL、质量分数为36％、摩尔浓度为12mol/L；

每1L阴极缓冲液(储备液)的原料组成如下：

121g三羟甲基氨基甲烷、179g三羟甲基甘氨酸、10g十二烷基磺酸钠和余量的水；

所述阳极缓冲液和所述阴极缓冲液在使用时，将上述储备液稀释10倍。

本发明进一步提供了一种上述聚丙烯酰胺凝胶和上述电泳套装在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用。

上述应用中，在电泳分离之前，将所述分离胶和所述浓缩胶依次灌注至灌胶模块中。

迷你胶操作系统中，所述灌胶模块包括短板和长板；所述短板的长度为10.1cm，宽度为7.3cm；所述长板的长度为10.1cm，宽度为8.2cm；所述短板与所述长板之间的间距为0.1cm，所述短板和所述长板具体均可采购于Bio-Rad，货号分别为1653308和1653311；

分离胶和浓缩胶的灌注量分别为6mL和4mL。

上述应用中，由于迷你胶操作系统的电源提供的电压远低于大板系统，因此电压的选择需通过实验摸索，所述电泳分离时的电压设置如下：

当待分离样品流经所述浓缩胶时，电压为60V，时间为25～35分钟；当待分离样品流经所述分离胶时，电压升高至120V或140V，时间为40min～80min。具体可为当分离胶的浓度为10％时，电压升高至120V；分离胶浓度为18％时，电压升高至140V。电泳的具体时间依据所需要的目的蛋白分子量而定。

本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用，具有如下优点：

1)本发明采用迷你胶操作系统，相对于操作繁琐的大板操作系统易于推广，操作简单，从制胶到电泳再到染色和脱色工作量都大大减小，且与其他技术，如免疫组化免疫印迹和质谱鉴定等兼容性较好；

2)与现有技术中迷你胶操作系统采用的Glycine-SDS-PAGE相比，本发明方法采用Tricine-SDS-PAGE，分辨率明显提高，在未添加尿素的情况下能够亦可识别20kDa以下的蛋白质；不使用甘氨酸和脲，可以为后来的氨基酸测序测定免除干扰。

附图说明

图1为利用本发明聚丙烯酰胺凝胶对小分子蛋白进行电泳分离，在迷你胶操作系统中分别使用Glycine-SDS-PAGE技术和Tricine-SDS-PAGE技术的电泳对比图，其中左图为Glycine-SDS-PAGE电泳图，右图为本发明Tricine-SDS-PAGE电泳图。

图2为利用本发明中聚丙烯酰胺凝胶对小分子蛋白进行电泳分离，分别采用非预染标记蛋白和预染标记蛋白的电泳结果对比图，其中左图采用非预染标记蛋白，右图采用预染标记蛋白。

图3为利用本发明对小分子蛋白进行电泳后Western Blot实验结果：图片上部为持家基因β-acin表达的蛋白质，分子量42kDa；图片下半部分为目的基因表达的蛋白，分子量14kDa。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、聚丙烯酰胺凝胶的制备及其在分离小分子蛋白中的应用

1)聚丙烯酰胺凝胶的制备

分别按照下述表1和表2中的配方配制聚丙烯酰胺储备液(AB-3)和电极缓冲液，其中聚丙烯酰胺储液在7～10℃下保存，电极缓冲液配好后20℃～25℃(室温)下保存。

表1 丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储液配方

表中AB-3表示交联度为3％的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储液。

表2 电极缓冲液及凝胶缓冲液的配方

表中Tris表示三羟甲基氨基甲烷，Tricine表示三羟甲基甘氨酸，HCl表示盐酸(密度1.20g/mL，质量分数36％，12mol/L)，SDS表示十二烷基磺酸钠。

利用表3中配方分别配制4％的浓缩胶和10％的分离胶，添加好相关固体药品之后静置24h再用盐酸调整pH，不同浓度的盐酸体积可能不同，能将pH调整至所需范围内均可，其中凝胶缓冲液过滤后方可使用。其中，凝胶缓冲液的配方见表2。采用迷你胶操作系统，在玻璃板组成的灌胶模块中，首先灌注6mL分离胶，液封(采用水)后放置1小时，其次灌注4mL浓缩胶，放置40分钟，使其充分凝结，形成上层为浓缩胶下层为分离胶的聚丙烯酰胺凝胶。

表3 Tricine-SDS-PAGE中一板10.1cm(W)×7.3cm(L)不连续胶的配方

表中AB-3的配制见表1；凝胶缓冲液的配制见表2；APS表示过硫酸铵，其质量体积浓度为0.1g/mL，现用现配；TEMED表示四甲基乙二胺。

2)电泳

将上述制备得到的聚丙烯酰胺凝胶(不连续胶)，去掉支架，转移至电泳槽(Bio-Rad，mini-PROTEAN Tetra电泳槽，货号：552BR089245)中，电源为PowerPacBasic(Bio-Rad，货号：041BR69536)。根据表2中的配方配制电极缓冲液，阴极缓冲液加到电泳槽内侧，阳极缓冲液加到电泳槽外侧，使阴阳极电解液独立工作。

将超低分子量蛋白质Marker II(北京汇天东方科技有限公司，货号：HT412)95℃预热5min后上样进行Tricine-SDS-PAGE电泳。按照表4设置电压，浓缩胶(4％)中为60V，样品即在浓缩胶中不断迁移，待样品压成一条细线即将进入分离胶时，再将电压升高，分离胶(10％)电压为100V，待溴酚蓝跑到分离胶底端时停止电泳。

表4 迷你胶Tricine-SDS-PAGE的电压选择

卸掉玻璃板，首先将分离胶置于蒸馏水中清洗，之后放置于固定液中固定0.5小时，再之后用考马斯亮蓝染色1.5小时，最后脱色1小时(每20分钟换一次脱色液)。固定液、考马斯亮蓝染色液、脱色液的配制见表5。将洗脱后的凝胶包入保鲜袋，置于Umax扫描仪中扫描拍照。

表5 考马斯亮蓝染色试剂

为对比试验结果，采用Glycine-SDS-PAGE进行电泳，首先按照表6所示配方，分别制备浓缩胶和分离胶，浓缩胶和分离胶的交联度和浓度与上述Tricine-SDS-PAGE中的相同(分离胶C＝3％，T＝10％；浓缩胶C＝3％，T＝4％)。

表6 Glycine-SDS-PAGE中一板10.1cm(W)×7.3cm(L)不连续胶的配方

表中AB-3的配制见表1；Tris-HCl表示三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；SDS表示十二烷基磺酸钠，10％SDS由10g SDS溶于100mL水制得；APS表示过硫酸铵，10％APS由0.1g APS溶于1mL水制得；TEMED表示四甲基乙二胺。

对超低分子量蛋白质Marker II(北京汇天东方科技有限公司，货号：HT412)进行电泳分离，电极缓冲液采用三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲体系，阴阳极电解液相同，配方如下：

10×蛋白电泳缓冲液：pH 8.3(25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS)：即将30.3g Tris、188.0g甘氨酸和10g SDS用蒸馏水定溶至1L。使用时稀释10倍：100mL的10×蛋白电泳缓冲液加水至1L。

实验结果如图1中所示，左侧为现有技术中采用Glycine-SDS-PAGE，即电泳缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲体系得到的胶图，右侧为Tricine-SDS-PAGE，即本发明使用的三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系进行电泳得到的胶图。由图可知，在迷你胶操作系统中，以本发明聚丙烯酰胺凝胶进行Tricine-SDS-PAGE电泳对小分子蛋白进行分离的效果优于现有技术。

实施例2、小分子量蛋白的电泳

按照表3中的配比分别配制4％的浓缩胶和18％的分离胶，灌注不连续胶。分别将超低分子量蛋白质Marker II(北京汇天东方科技有限公司，货号：HT412)(95℃，5min变性)和彩虹预染超低分子量蛋白质Marker(北京汇天东方科技有限公司，货号：RTD6110)(不需要变性)上样后进行电泳分离，按照表4设置电压，浓缩胶(4％)中60V，分离胶(18％)中140V，其它操作与实施例1中的操作相同，实验结果如图2所示。

实施例3、本发明聚丙烯酰胺凝胶与Western Blot的兼容性测试

裂解3T3-L1细胞样品(采购于美国模式培养物集存库，货号：CL-173)，提取蛋白(总蛋白)经BCA定量后，将蛋白提取液稀释并以10μg(蛋白质总质量)和15μg(蛋白质总质量)上样进行电泳分离。上样之前对蛋白进行变性处理，即将蛋白4×上样缓冲液(北京汇天东方科技有限公司生产，货号：P1015)与所提取的蛋白样品混合，置于99℃，10min。电泳后进行转膜、一抗杂交(持家基因β-Actin的一抗采购于Abmart公司，货号：P30002；目的基因的一抗采购于圣克鲁斯生物技术公司，货号：sc-30223)、二抗杂交(二抗采购于Abmart公司，货号：M21003)等操作，最后对PVDF膜显色、曝光(转膜、一抗杂交、二抗杂交均无特异性，按常规的WesternBlot均可)。最终实验结果如图3所示，图片上部为持家基因(β-Actin基因)表达的蛋白质，分子量42kDa；图片下部为目的基因表达的蛋白质，对应分子量为14kDa。

图3中，左侧三个条带上样量为10μg(总蛋白)，右侧三个条带的上样量为15μg(总蛋白)，由此可知本发明中聚丙烯酰胺凝胶与Western Blot的下游技术能良好兼容。

Claims (7)

1.一种电泳套装，由聚丙烯酰胺凝胶和三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系组成；

所述聚丙烯酰胺凝胶由独立配制的浓缩胶和分离胶组成；

每份所述浓缩胶的原料组成如下：

2.67mL水、0.33mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、1mL凝胶缓冲液、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；

每份所述分离胶的原料组成为如下1)或2)：

1)2.20mL水、1.2mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2mL凝胶缓冲液、0.6mL丙三醇、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；

2)0.88mL水、2.23mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2.23mL凝胶缓冲液、0.66mL丙三醇、22μL过硫酸铵水溶液和2.2μL四甲基乙二胺；

所述丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液为丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液；

所述凝胶缓冲液由三羟甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸钠和盐酸溶于水后得到；

所述过硫酸铵水溶液的质量体积浓度为0.1g/mL。

2.根据权利要求1所述的电泳套装，其特征在于：每100mL所述丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液的原料组成如下：

48g丙烯酰胺、1.5g甲叉双丙烯酰胺和余量的水。

3.根据权利要求1或2所述的电泳套装，其特征在于：每300mL所述凝胶缓冲液的原料组成如下：

36.3g三羟甲基氨基甲烷、2mL质量百分含量为36％～38％的盐酸水溶液、0.3g十二烷基磺酸钠和余量的水。

4.根据权利要求1或2所述的电泳套装，其特征在于：所述浓缩胶与所述分离胶的体积比为2：3。

5.权利要求1-4中任一项所述的电泳套装在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在电泳分离之前，将所述分离胶和所述浓缩胶依次灌注至灌胶模块中。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述电泳分离时的电压设置如下：

当待分离样品流经所述浓缩胶时，电压为60V，时间为25～35分钟；当待分离样品流经所述分离胶时，电压升高至100V或140V，时间为40～80min。