JP2008292492A - 電気泳動分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】等電点電気泳動による巨大分子の改良された分離方法に関し、この方法は、チオールを実質的に含有しない還元剤、好ましくは三価リン化合物、さらに好ましくはトリブチルホスフィンを含有する等電点電気泳動媒質中で、巨大分子を電気泳動に付すことを包含する。巨大分子の溶解度およびフォーカシングにかかわる改良が、チオール含有還元剤を含有する類似の等電点電気泳動媒質中における同一巨大分子の等電点電気泳動に比較して増強される。
【選択図】なし
Description
(a)本発明の第一の態様による第一次元ゲルにおいて、等電点電気泳動により巨大分子を分離し;
(b)場合により、(a)により分離された巨大分子を含有する第一次元ゲルを、チオールを含有しない還元剤およびアルキル化剤の存在下に、全部の遊離チオールが除去され、そしてシステインとの混合付加物が実質的に形成されないように、平衡化し;次いで
(c)ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、巨大分子をさらに分離する;ことを包含する。
本発明の効果を証明するために、DTTの代わりに、TBPを使用すると、IEF操作中のタンパク質の溶解度が増加された。平衡化操作を簡単にするために、現在使用されている慣用の二工程平衡化の代わりに、TBPおよびアクリルアミドを用いる任意の一工程方法を使用した。種々の理由で、還元剤として、DTTを取り換えた。DTTなどのチオール含有還元剤によるジスルフィド結合の切断は、大量の遊離チオールを用いる平衡置換法(equilibrium displacement process)により達成される。ジスルフィド結合の切断に好ましい平衡の移動には、高濃度の遊離チオールが必要であることから、アルキル化において、大量のアルキル化剤がチオール還元剤と反応する。すなわち、このことは、モル過剰のアルキル化剤を得ることを困難にすることがある。チオール還元剤に比較して、ホスフィン族の還元剤は、平衡置換よりもむしろ、化学量論的な還元を生じさせる[9]。ホスフィン還元剤の機能の主要利点は、ホスフィン化合物がチオールを含有していないことから、これらがアルキル化されることができない点にあり、これは、単純な還元およびアルキル化操作方法を導く。
材料
トリブチルホスフィン(97%v/v)は、Flukaから入手し、ピペリジンジアクリルアミド(PDA)、アクリルアミド、尿素、トリス(Tris)、グリシン、過硫酸アンモニウム、TEMED、3−[(3−クロルアミドプロピル)ジメチル]アンモニオ]−1−プロパンスルホネート(CHAPS)、ジチオスレイトール(DTT)およびポリ−ビニリデンジフルオライド膜(PVDF)は、Bio−Rad(Herecules,CA)から入手した。「オンジナ」(Ondina)メディカルグレード(医療品質)パラフィン油は、Shellから入手した。エンドヌクレアーゼは、Sigmaから入手した。その他全部の化学物質は、BDHから入手した分析グレード(AnalaR grade)のものであった。イモビリン ドライストリップ(Immobiline DryStrips)およびファーマライト(Pharmalyte),pH3〜10両性電解質は、Pharmacia(Uppsala,Sweden)から入手した。
TBPは、無水イソプロパノール中の200mMストック溶液として調製した。TBP濃縮液および200mMストック溶液を、各使用後、窒素により浄化し、4℃で保存した。この処理は、ヒュームカップボード内で行わなければならず、またその他の適当な安全上の予防手段、例えば手袋および実験衣を着るべきである。濃縮されたTBPは、乾燥有機材料、例えば紙と接触すると、無毒性の煙を発生する。漏出は、湿った布で拭き取らなければならない。
IEF用の試料を溶解するために、2種の溶液を使用した。溶液Aは、8M尿素、4%CHAPS、100mM DTT、0.5%pH3〜10両性電解質および40mMトリス(pH約9.5、調整されていない)であった。マウス前足の場合、10mM DTTを含有する追加の修正溶液Aを使用した。溶液Bは、8M尿素、4%CHAPS、2mM TBP、0.5%pH3〜10両性電解質および40mMトリス(pH約9.5、調整されていない)であった。
ロムネイ種(Romney)羊からの羊毛を準備し、Herbert等の方法[10]に従い抽出した。抽出後に、上清を脱イオン水(5回交換)で透析し、次いで凍結乾燥させた。この抽出されたタンパク質は、アルキル化されなかった。IEF用の準備のために、この凍結乾燥させた乾燥した羊毛タンパク質1mgを、溶液A中に溶解し、およびまた1mgを溶液Bに溶解した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質の可溶化
CHO K1細胞(1×106細胞)を、1mlの溶液A中に溶解し、およびまた1×106細胞を、1mlの溶液B中に溶解した。DNAは、最終溶液にエンドヌクレアーゼ(150単位/ml)を添加することにより分離した。この溶液を、室温まで1時間放置し、次いでIPG再水和を開始した。
8対の前足(交尾後13.5日目)を、2mlの溶液A中に溶解し、およびまた8対を、2mlの溶液B中に溶解した。DNAは、最終溶液にエンドヌクレアーゼ(150単位/ml)を添加することにより分離した。この溶液を、室温まで1時間放置し、次いでIPG再水和を開始した。
分析用および分離用ゲルのために、各18cmのイモビリン ドライストリップ(pH4〜7または3.5〜10非線型)を、19cmの長さに切断した2mlプラスティック勾配付きピペット中のタンパク質溶液500μLで再水和した。各11cm(pH4〜7)IPGを、12cmの長さに切断した2mlプラスティック製勾配付きピペット中のタンパク質溶液250μLで再水和した。再水和は、室温で24時間、進行させた。ドライストリップ キットとともに、ファーマシア マルチホール(Pharmacia Multiphor)IIを用いて、IEFを行った;動力は、コンソート(Consort)5000V電力源を用いて供給し、そしてファーマシア マルチテンプ(Pharmacia Multitemp)IIIを用いて、20℃で冷却水を供給した。11cmおよび18cmIPGを用いるIEFに使用した操作条件は、300Vで2時間、1000Vで1時間、2500Vで1時間および5000Vの最終相で、最大80,000Vhまでであった。各試料にかかわる実際の総合Vhは、各図の説明文に示されている。IEFの後、これらのストリップは、第二次元用に必要とされるまで、−80℃で保存した。
DTTを含有する溶液Aを使用してフォーカシングされているIPGを、慣用の方法を用いて平衡化した。IPGは、6M尿素、20%グリセロール、2%SDSおよび2%DTT、0.375Mトリス(pH8.8)中で、10分間平衡化し、次いでDTTの代わりに、2.5%ヨウドアセトアミドを使用して、全部の遊離のDTTをアルキル化する以外は、同一溶液中でさらに10分間平衡化した。この平衡化用溶液のpHは、8.8であった。これは、Gorg等の方法[1]における場合のように、第二次元ゲルがpH6.8においてゲルへの粘着性を有していないためである。
TBPを含有する溶液Bを使用してフォーカシングされているIPGを、6M尿素、20%グリセロール、2%SDSおよび5mM TBP、0.375Mトリス(pH8.8)中で、20分間平衡化した。
第二次元ゲルは、Bio−Rad(Hercules,CA)からのプロテアン(Protean)IIxiを用いて行った。ゲルは、1.5mm厚さ、8〜18%T孔勾配を有し、また2.5%CでPDAにより架橋されている。ゲルおよびアノード緩衝液は、0.375Mトリス/HCl(pH8.8)であった。カソード緩衝液は、トリスを用いてpH8.3に調整された192mMグリシン、0.1%(w/v)SDSおよび0.001%(w/v)ブロモフェノールブルー(Bromophenol Blue)であった。平衡化されたIPGストリップを、カソード緩衝液中の溶解1%(w/v)アガロースを用いて、SDS−PAGEゲルの表面上に埋め込んだ。ゲルは、ブロモフェノールブルー前面がゲルを横切るまで、4mA/ゲルの一定電流で2時間、次いで18mA/ゲルで一夜にわたり行った。
IEF中のタンパク質の溶解度を増加させるTBPの能力を評価するために、羊毛タンパク質を用いて、標準DTT法を、TBP法と比較した。羊毛は2種のタンパク質、すなわち中間フィラメント状タンパク質(IFP)および中間フィラメント会合タンパク質(Intermediate Filament Associated Proteins)(IFAP)から構成されている。IFPには、2種の付属グループ、すなわちタイプIおよびタイプIIが存在し、分子生物学試験およびタンパク質化学試験は、各付属グループが、4種の構造的に相同のタンパク質を含有することを示す。IEPは、相当する試験の対象であり、グリコシル化およびホスホリル化により、翻訳後修飾されることが知られている。Herbert等は[10]、IEFにDTTを用いて、羊毛IFPの予備分離を行ったが、IFPの分割は貧弱であり、また各IFPイソフォームを分離することはできなかった。IEFにおいて、DTTの代わりに、TBPを使用することによって、分離が改善され、IFPを各スポットに分割することができる。図1は、同一条件下に分離された羊毛タンパク質150μgの銀染色された2−Dゲルを示しており、ただし図1aでは、100mM DTTを含有する溶液Aを使用する第一次元で分離されており、そして図1bでは、2mM TBPを含有する溶液Bを使用する第一次元で分離されている。図1aにおいて、IPG平衡化工程は、最初に2%DTTを使用し、二回目に2.5%ヨウドアセトアミドを使用する二工程法であり、そして図1bにおいて、IPG平衡化工程は、5mM TBPを使用する一工程法であった。IEFにDTTを使用し、そして平衡化した図1aの場合、IFPの分割は貧弱であり、特にタイプI IFPグループの分割は貧弱であった。IEFにDTTを使用し、そして平衡化した場合、IFPの分割は、5000Vで500,000Vhまで延長されたフォーカシング期間の後でさえも、IEPの分割は改善されない。IEFにTBPを使用し、そして平衡化した場合、フォーカシングが改良され、またIFPは、スポットの少なくとも4つの条線に良好に分割される(図1b)。このタンパク質は、30,000Vhで9時間のIEF操作期間の後に、定常状態に達した。これは、従来羊毛タンパク質に使用されていたほぼ100時間に優る格別の改善である。
図3は、同一条件下に分離された1×106CHO K1細胞の銀染色された2−Dゲルを示しており、ただし図3aでは、100mM DTTを含有する溶液Aを使用する第一次元で分離されており、そして図3bでは、2mM TBPを含有する溶液Bを使用する第一次元で分離されている。図3aにおいて、IPG平衡化工程は、最初に2%DTTを使用し、二回目に2.5%ヨウドアセトアミドを使用する二工程法であり、そして図3bにおいて、IPG平衡化工程は、5mM TBPを使用する一工程法であった。図3aに見出される水平方向の縞は、不完全なフォーカシングの結果を表わしている。これは、IEF操作中に、若干のタンパク質が不溶性になることを示している。図3bでは、水平方向の縞は消失しており、これは、IEF操作中に、タンパク質がTBPの使用によりさらに溶解性になり、また凝集傾向が低くなることを示している。この増加された溶解度は、IEF操作中、タンパク質が還元条件に維持され、内部鎖または外部鎖ジスルフィド結合が再形成されない結果であると言うことができる。スポットの或るグループ(図3aおよび3b上の矢印)は、図3bにおける相違する明白な塊の複数の条線に分割される。これに対して、図3aでは、これらはフォーカシングが貧弱であるか、または一本の条線に分割されるのみである。CHO細胞などの培養系では、増殖条件が、糖タンパク質中のオリゴ糖のマクロ異原性(macrohetrogeneity)およびミクロ異原性(microhetrogeneity)に影響することができる。研究を続けることによって、図3bに見出される複数の条線が、同一タンパク質の相違してグリコシル化された形態の結果であることができること、および或る種の糖形態が、DTTを用いるIEF操作中に、ほんの少しだけ可溶化され、正常に分割されないことが示唆された。
多くの発表されているIEF操作方法では、IPG再水和溶液に低濃度、例えば10mM〜20mMのDTTが使用されている。本発明者は、IEF試料溶液に100mMのDTTを用いて、CHO細胞で得られた多くの縞が存在するパターンが、IPGにおける高濃度の帯電したDTTから生じる電気浸透(electroendosmosis)によるものでありうるものと考えた。セルラインに比較してさらに複雑である哺乳動物の組織を用いて、この研究を拡大することを決定した。交尾後13.5日目の胎児マウスの前足を、モデルとして使用した。図4は、同一条件下に分離された2対の前足の銀染色した2−Dゲルを示しており、ただし図4aでは、10mM DTTを含有する溶液Aを使用する第一次元で分離されており、図4bでは、100mM DTTを含有する溶液Aを使用する第一次元で分離されており、そして図4cでは、2mM TBPを含有する溶液Bを使用する第一次元で分離されている。図4aおよび4bにおいて、IPG平衡化工程は、最初に2%DTTを使用し、二回目に2.5%ヨウドアセトアミドを使用する二工程法であり、そして図4cでは、IPG平衡化工程は、5mM TBPを使用する一工程法であった。TBPを使用して達成された分離は、10mMおよび100mMのDTTを使用して達成された両方の分離に比較して、優れている。図4cは、最小の水平方向および垂直方向の縞を有し、分割されたスポットの数は、図4aおよび4bよりも多い。フォーカシングは、DTT濃度が10mMのみである図4aにおいては、明らかに悪い。このことは、DTT濃度が各試料について最適化されるべきパラメーターであることを示唆している。従来、水平方向の縞形成による問題を招くことなく、65mMのジチオエリスリトール (DTE)がイースト菌および肝臓試料の微量予備分離用のIEF再水和溶液に使用されていた。典型的還元およびアルキル化実験は、タンパク質ジスルフィドの完全還元を行うためには、ほぼ50mM濃度のチオール還元剤、例えばDTTが必要であるものと述べられている。DTTなどのチオール還元剤が平衡置換により作用されると、IEF操作中における遊離チオールの生成に対して、全体的に平衡化を推し進めるために、10mMほどの低い濃度で充分であるものとは、ほとんど見做されない。
チオール還元剤DTTの代わりに、トリブチルホスフィンを用いることによる、2D−PAGEにおける改良された分離が証明された。TBPの主要利点は、IEF操作中に帯電せず、従って移動しない点にある。このことは、試料タンパク質が、全IEF操作期間にわたり還元条件下に維持され、これによりタンパク質の溶解度が増加され、また最終2D−PAGEゲル上に多くのタンパク質スポットをもたらすことを意味する。大部分の場合、IEF操作期間中にTEPを使用すると、水平方向の縞形成の格別の減少が生じる。
略語
IEF 等電点電気泳動
SDS−PAGE ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
2D−PAGE 二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
CA−IEF 担体両性電解質等電点電気泳動
IPG 固定化したpH勾配
MS マススペクトロメトリー
RP−HPLC 逆相高速液体クロマトグラフイ
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
TBP トリブチルホスフィン
DTT ジチオスレイトール
IAA ヨウドアセトアミド
5IAF 5−ヨウドアセトアミド蛍光剤
CHAPS 3−[(3−クロルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]
−1−プロパンスルホネート
Claims (32)
- 等電点電気泳動による巨大分子の分離方法であって、チオールを実質的に含有しない還元剤を含有する等電点電気泳動媒質中で、巨大分子を電気泳動に付すことを包含する方法。
- チオールを実質的に含有しない還元剤が、三価リン化合物である、請求項1に記載の方法。
- 三価リン化合物が、トリス(ペンタフルオロフェニル)ホスフィン、4−(ジメチルアミノ)フェニル−ジフェニル−ホスフィン、トリス(4−フルオロフェニル)ホスフィン、トリ(o−トリル)ホスフィン、ジフェニル(メトキシメチル)ホスフィンオキサイド、トリ(m−トリル)ホスフィン、トリ(p−トリル)ホスフィン、トリエチルホスフィン、トリス(ジエチルアミノ)ホスフィン、トリス(ジメチルアミノ)ホスフィン、トリブチルホスフィン、およびトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 三価リン化合物が、トリブチルホスフィンである、請求項3に記載の方法。
- チオールを含有しない還元剤の濃度が、0.1〜200mMである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- チオールを含有しない還元剤の濃度が、1〜10mMである、請求項5に記載の方法。
- 巨大分子の等電点電気泳動を、チオール含有還元剤が実質的に存在しない条件下に行う、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- チオールを含有しない還元剤が、固定化した形態である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D−PAGE)による巨大分子の分離方法であって、
(a)チオールを実質的に含有しない還元剤を含有する等電点電気泳動媒質中で巨大分子を電気泳動に付すことによって、第一次元ゲルにおける等電点電気泳動により巨大分子を分離し;
(b)場合により、(a)により第一次元ゲルにおいて分離された巨大分子を、チオールを含有しない還元剤およびアルキル化剤を存在させて、全部の遊離チオールが除去され、そしてシステインとの混合付加物が実質的に形成されないように、平衡化し;次いで
(c)ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、巨大分子をさらに分離する;ことを包含する方法。 - チオールを実質的に含有しない還元剤が、三価リン化合物である、請求項9に記載の方法。
- 三価リン化合物が、トリス(ペンタフルオロフェニル)ホスフィン、4−(ジメチルアミノ)フェニル−ジフェニル−ホスフィン、トリス(4−フルオロフェニル)ホスフィン、トリ(o−トリル)ホスフィン、ジフェニル(メトキシメチル)ホスフィンオキサイド、トリ(m−トリル)ホスフィン、トリ(p−トリル)ホスフィン、トリエチルホスフィン、トリス(ジエチルアミノ)ホスフィン、トリス(ジメチルアミノ)ホスフィン、トリブチルホスフィン、およびトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 三価リン化合物が、トリブチルホスフィンである、請求項11に記載の方法。
- チオールを含有しない還元剤の濃度が、0.1〜200mMである、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- チオールを含有しない還元剤の濃度が、1〜10mMである、請求項13に記載の方法。
- (a)における巨大分子の等電点電気泳動を、チオール含有還元剤が実質的に存在しない条件下に行う、請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
- チオールを含有しない還元剤が、固定化された形態である、請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法。
- アルキル化剤が、アクリルアミド、蛍光剤、N−アクリロイルアミノエトキシエタノール、アクリルアミド−N,N−ジエトキシエタノール、N−アクリロイル−トリス(ヒドロメチル)アミノメタン、アクリルアミド糖類、例えばN−アクリロイル(またはメタアクリロイル)−1−アミノ−デオキシ−D−グリシトールまたは対応するD−キシリトール誘導体、およびN,N−ジエチルアクリルアミドからなる群から選択される、請求項9〜16のいずれか一項に記載の方法。
- アルキル化剤が、アクリルアミドである、請求項17に記載の方法。
- アクリルアミドの濃度が、0.1〜5%(w/v)である、請求項18に記載の方法。
- アクリルアミドの濃度が、2.5%(w/v)である、請求項19に記載の方法。
- 蛍光剤が、ハロアセチル誘導体、マレイミド化合物およびミセル状スルフヒドリル試薬からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 蛍光剤が、マレイミド蛍光剤である、請求項21に記載の方法。
- 蛍光剤の濃度が、0.01〜20mMである、請求項21または22のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光剤の濃度が、0.25mMである、請求項23に記載の方法。
- (b)における任意の平衡化を、ヨウドアセトアミドが実質的に存在しない条件下に行う、請求項9〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 巨大分子の電気泳動分離における、チオールを含有しない還元剤の使用。
- チオールを含有しない還元剤が、三価リン化合物である、請求項26に記載の使用。
- 三価リン化合物が、トリス(ペンタフルオロフェニル)ホスフィン、4−(ジメチルアミノ)フェニル−ジフェニル−ホスフィン、トリス(4−フルオロフェニル)ホスフィン、トリ(o−トリル)ホスフィン、ジフェニル(メトキシメチル)ホスフィンオキサイド、トリ(m−トリル)ホスフィン、トリ(p−トリル)ホスフィン、トリエチルホスフィン、トリス(ジエチルアミノ)ホスフィン、トリス(ジメチルアミノ)ホスフィン、トリブチルホスフィン、およびトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンからなる群から選択される、請求項27に記載の使用。
- 三価リン化合物が、トリブチルホスフィンである、請求項28に記載の使用。
- チオールを含有しない還元剤が、固定化された形態である、請求項26〜29のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により分離された巨大分子。
- 請求項9〜25のいずれか一項に記載の方法により分離された巨大分子。
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