JP4434955B2 - 蛋白質結合膜上での蛋白質の電気泳動分離用システム及び方法 - Google Patents
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Description
ヒトプロテオーム(及び他のソース)からの蛋白質分析の基本的手段は電気泳動である。電気泳動は、通電により分子が多孔質支持体又は基板を通過して移動する方法である。この方法を使用して、荷電された分子の混合物は、それらの物理的性質(例えば、分子量又は「Mr」)及び/又はそれらの化学的性質(例えば、電荷又は等電点)を基礎として、電気分解用の導電性溶媒を通る荷電された種の移動により分離されることができる。
ろ紙等の分離基材上で小さな分子を分離するために水混和性有機溶媒を使用する1−D電気分離が開発された(参照米国特許番号第4146454;Haber N.PNAS USA、79:272-276、1982;及びHaber N.Biotechnic&Histochemistry、73:59-70、1998)。このシステムは「電子分子推進」又は「EMP」と称される。EMPでは、非極性又は非荷電の化合物(芳香族炭化水素等)は一旦しきい値電流レベルを超えると、分離基材を通過する泳動が誘起される。
EMP技術は染料化合物等の小さな非極性分子を分離するのに使用できることが明らかになった。しかし、EMPではアルブミン、ヘモグロビン、ミオグロビン、シトクロムC及びキモトリプシノーゲンがこの技術を使用してワットマンNo.3ろ紙上で分離されているが(Haber N.PNAS USA、1982、supra)、が蛋白質等の両性バイオポリマーの分析に適切であるかは明らかではない。同様に、EMPプロセスで使用されたろ紙及び他の基材は蛋白質を良く結合せず、EMPにより分離された蛋白質は電流中断後ほとんど即座に基材上で拡散し始める。蛋白質の拡散は、EMPプロセスの有効性を非常に制限し、ろ紙を使用する2−D蛋白質分離手順は報告されていない。
従って必要なのは、親水性、疎水性及び低分子量蛋白質と適合性のある有機溶媒バッファを使用する、高速度、高分解能電気泳動システムである。有機溶媒バッファは好ましくは蛋白質結合相互作用及び生物学的活性を保存するために非変性であり、電気泳動分離中熱発生を最小限にするために低導電性を有する。同様に必要なものは、電気泳動完了後分子の拡散を最小化し、ブロッティング膜上に分離マトリックスから分離された分子を移動することを不要とする分離基材である。
本発明では例えば、電気泳動システムの電気泳動ユニットはそれらに挟まれた膜及びウィックを有する一対の板により橋渡しされている2つの独立バッファ室を備える。バッファ室は独立しているため、電気泳動ユニットのサイズは膜及びウィックを保持する板のサイズに応じて変化できる。ウィックは板より長いため、電気泳動ユニットが組み込まれたときにウィックの端はバッファ室中へ延出する。
同様に本発明は蛋白質の電気泳動分離法を提供する。本発明の方法では、少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファ及び高い蛋白質結合能力を有し、有機溶媒バッファと適合性のある高分子膜が用意される。分離するべき蛋白質を含有するサンプルが次に膜へ適用され、蛋白質が電気泳動により分離される。
(1)第一pHを有する第一低導電性有機溶媒バッファ及び第二pHを有する第二低導電性有機溶媒バッファ;
(2)高い蛋白質結合能力を有し、第一及び第二有機溶媒バッファと適合性がある高分子膜;並びに
(3)第一及び第二有機溶媒バッファ及び膜を備えるための少なくとも1の電気泳動ユニットを含有する電気泳動装置。
分離される蛋白質を含有するサンプルは膜へ適用され、その膜は、第一方位方向に電気泳動ユニット中に配置される。第一有機溶媒バッファは電気泳動ユニットへ添加され、蛋白質が電気泳動ユニット中の電流の発生により一次元で分離される。一次元分離完了後、第一有機溶媒バッファは電気泳動ユニットから除去され、第二有機溶媒バッファで置き換えられる。第二有機溶媒バッファで平衡化された膜は、次に電気泳動ユニット中に第二方位方向に配置される。膜上で一次元方向に分離された蛋白質は、次に電気泳動ユニット中の電流の発生により二次元方向に分離された。
ここで使用される「蛋白質」は、ペプチド結合又は改質されたペプチド結合(例えば、ペプチド等(配)電子体)により共役的に結合された少なくとも2つのアミノ酸残基を含有する分子を言う。蛋白質に含有されるアミノ酸の最大数には限定はない。ここで蛋白質に含有されるアミノ酸は、D−又はL−アミノ酸のいずれでもよいが、L−アミノ酸が好ましい。更に、アミノ酸成分は、β−アミノ酸、目的用に合成されたアミノ酸若しくは、Friedinger γ−ラクタム、ペプトイド等の擬ペプチドフラグメント、又はこれら物質の混合物を言う。
本発明の蛋白質も同様に、1以上の他の蛋白質等の1以上の他の分子と、又は1以上の金属原子若しくはジンクフィンガー蛋白質等の金属複合体と関連(結合)する。例えば、蛋白質はホモ−若しくはヘテロ多重結合性蛋白質、抗体/抗原複合体、又はリガンド/レセプター複合体を含有してもよい。ここで使用される、蛋白質の別の蛋白質又は非−蛋白質分子との関連(結合)とは、「蛋白質結合相互作用」を言う。ここでいう蛋白質は、同様に酵素活性等の生物学的活性を示す。
ここでいう全ての割合は特記されない限り体積割合である。
膜電気泳動に使用する電気泳動バッファとして、低導電性を示すように配合された水混和性有機溶媒が挙げられる。ここで使用される有機溶媒バッファは、一定の電圧(例えば、3.5kV)が荷電された時に、そのバッファが約0.0001mA/cm2膜〜約0.2mA/cm2膜の電流を製造する場合、「低導電性」を有する。当業者は当分野で公知の技術を使用して有機溶媒バッファの導電性を容易に決定できる。バッファの導電性の測定用に本発明で使用できる有用な技術は、例えば下記実施例2に記載のとおり、3.5kVで、1cm×8cm膜上での蛋白質サンプルの電気泳動である。
ここで使用される「導電性強化剤」とは、ベース溶媒へ添加された時に、約0.1〜約0.15mm厚みの、予め湿らせた1cm×8cmPVDF膜ストリップを使用して一定の電圧(例えば、3.5kV)下で測定して電流の増加を生じる有機溶媒又は他の物質を言う(下記実施例1及び2参照)。低導電性有機溶媒バッファ中のそれぞれの導電性強化剤の終末濃度は、好ましくは約0.1%〜約50%、更に好ましくは約5%〜約30%である。適切な導電性強化剤として:ホルムアミド、アセトアミド、プロピオンアミド、ブチルアミド、トルアミド、ベンズアミド、ラクトアミド、ニコチンアミド、及びそれらの混合物等のアミド化合物;N−メチルホルムアミド、N−メチルアセトアミド、N−メチルプロピオンアミド、及びN−メチルブチルアミド等のアミド誘導体;2−フルアルデヒド;フルフリルアルコール;テトラヒドロフルフリルアルコール;サリチルアルデヒド;グアヤコール;フェノール;ホウ酸;フマル酸;ピペラジン;及びそれらの混合物が挙げられる。好ましい低導電性有機溶媒バッファは少なくとも2つの導電性強化剤を含有する。例えば、低導電性有機溶媒バッファは、ベース溶媒に加えて;サリチルアルデヒド及びフルフリルアルコール;ホルムアミド、2−フルアルデヒド及びベンズアミドの混合物;ホルムアミド及びフルフリルアルコールの混合物;ホルムアミド及びテトラヒドロフルフリルアルコールの混合物又はホルムアミド、2−フルアルデヒド及びホウ酸の混合物を含有してもよい。
ここで使用される「過度の熱発生」とは、下記現象が起こるのに充分な熱の発生が挙げられる:分離された蛋白質の変性又は変質;電気泳動バッファの沸騰又は膜からのバッファの完全な留去の発生;膜若しくは電気泳動装置の溶解、炭化若しくはそれ以外の損傷;又は電気泳動分離の他の妨害。
低導電性有機溶媒バッファのpHは、特定のバッファ成分と適合性のある範囲内で目的の通り調整できる。例えばpHは約pH3〜約pH10の範囲に調整できる。しかし、本発明の低導電性有機溶媒バッファがこの範囲外のpHを有してもよいことは当然である。
本発明で使用される分離基材は高分子膜を含有する。この膜分離基材は従来の電気泳動方法中のゲルマトリックスと類似する。
本発明で使用する膜は、上記記載の低導電性有機溶媒バッファと適合性がある必要がある。例えば、セルロース由来の膜(例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート又はDEAEセルロース)は、有機溶媒バッファにより破壊され、膜電気泳動用に使用できなくさせる。多くの他のタイプの市販されている高分子膜は、本発明の有機溶媒バッファによっては破壊されない。
本発明で使用できる膜は、疎水性又は親水性のいずれかでよく、好ましくは低い電荷又は純量中性電荷を有する。本発明の目的のため、「中性」として設計された高分子膜は一般的に電荷を有さず、純量で中性電荷又はわずかに正若しくは負の電荷のいずれかを有する。理論で本発明を限定するものではないが、蛋白質は疎水性相互作用を通して疎水性高分子膜へ結合し、イオン性相互作用を通して親水性膜へ結合すると考えられる。
疎水性膜は、同様に例えば当分野で公知の上記ポリマーの改質体でもよい。例えば、疎水性高分子膜は、Pluskalらの米国特許番号第5004543に記載のとおり(その全ての開示をここで資料として使用する)ポリアミン又はポリアミド−ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂の膜に接触させることにより固定された形式的に正の電荷基が含まれるように改質されることができる。
ナイロン膜上にある電荷は、ナイロンポリマー合成反応を終結させるために添加される化合物の種類により主に決定される。例えば、反応終結用化合物がカルボン酸基を有する場合には、得られるナイロンは負に荷電される。同様に、終結用化合物がアミノ基を有する場合には、得られるナイロンは正荷電を有する。
高度に正に荷電されたナイロンからなる膜は当分野で公知であり、通常、従来のナイロン膜を、ポリアミン又はポリアミノ−ポリアミンエピクロロヒドリンカチオン樹脂を含有する溶液と接触させて製造できる。これら高度に正に荷電されたナイロン膜は、本発明の電気泳動方法中での特定量の蛋白質泳動を可能とするが、一般的に充分なサンプル分解能を示さない(下記実施例2参照)。従って、高度に正に荷電されたナイロン膜は好ましくない。反対に、上記段落に記載されいわゆる「中性」ナイロン膜である、低く正に荷電されたナイロンからなる膜は、本発明の方法により良い蛋白質分解能を発生する。
本発明で使用される膜のサイズ(即ち、長さ及び幅)は一般的に特定の分離実施技術により決定される。多くの膜電気泳動法に適切な膜サイズは約7.5cm×8cmであるが、より大きな又は小さなサイズも使用できる。例えば、高処理能力スクリーニング用のために、膜は約1cm×8cmのストリップへ切断されてもよい。分離された蛋白質の非常に高い分解能又は多数の蛋白質の分離が必要な適用では、膜は20cm×20cm又はそれ以上に切断してもよい。当業者は、特定の分離技術用の適切な膜サイズを容易に決定できる。
本発明で使用できる電気泳動ユニットは、上記記載の低導電性有機溶媒バッファと適合性のあるどのような材料から構成されてもよい。一般的に、プラスチック又は「Plexi Glas」商標からなる従来の電気泳動ユニットは、これら材料は有機溶媒で損なわれるため本発明の使用には適切ではない。セラミックス、テフロン、ガラス又は有機溶媒に耐性のある他の材料から構成される電気泳動ユニット、又は、有機溶媒耐性材料(例えば、テフロン又はゴム)で被覆された従来の「Plexi Glas」商標又はプラスチック電気泳動ユニットも使用できる。
再度図1を引用すると、図2のサンドイッチユニット200は、ろ紙ウィックの末端はバッファ室110及び110’中へ延びるようにプラットフォーム130上に配置されてもよい。
板360及び370及びカバー380は、有機溶媒バッファに耐性のある適切な非電気的導電性材料;例えば、ガラス、セラミック、テフロン、又は有機溶媒バッファに耐性のある材料で被覆された「Plexi Glas」商標で構成されてもよい。好ましくは、板360及び370及びカバー380は、テフロン又はガラスからなる。
本発明の膜電気泳動法は、下記のとおり一般的に行なわれる。例として特定の膜電気泳動プロトコルを下記実施例に記載する。
本発明の膜電気泳動法中、蛋白質サンプルが蛋白質結合膜の表面上を泳動する更なる証拠が、実施例10a及び10b中に見られた。実施例10aでは、その上で蛋白質が本発明の方法で分離された蛋白質結合膜を断面で切断し、共焦点顕微鏡で観察した。サンプル中の蛋白質が膜の表面上のみに関連して観察される。実施例10bは、膜の全てのサンプルの側面がろ紙ウィックと直接接触した時の電気泳動中、蛋白質サンプルが蛋白質結合膜から失われるか、更に分散したことを示す。
低導電性電気泳動バッファの有機的性質に応じて、疎水性又は低分子量(例えばMr≦10000)蛋白質を含有するサンプル、並びに親水性蛋白質を含有するサンプルは本発明の方法により容易に分離できる。
同様に、膜上に載置する前に、沸騰又は変性、サンプルと会合しやすい(suspected)リガンドとの混合、免疫沈降、等の他の操作をサンプルへ行なってもよい。
一般的に、有機的バッファのpHが5pIユニット以内の蛋白質が分離できる。例えば下記実施例2に示すように、pH4.5の有機溶媒バッファは、約1〜9.6の範囲のpIを有する蛋白質の分離を可能とする。従って、pH8.5の有機溶媒バッファでは、約3.から12又は13の高さのpIを有する蛋白質の分離が期待できる。しかしそのpI及びバッファpH間の差が5ユニットを超える蛋白質も同様に、発明の方法により分離できる。
従って1−D膜電気泳動技術では、蛋白質は、電気泳動バッファのpHにより影響されるためそれらの等電点に基づいて、単一の次元のみで分離される。1−D膜電気泳動技術は広い範囲の種類に適用できる。特に、1−D膜電気泳動技術は、サンプルの蛋白質組成の素早い分析、又は、汚染物質及び劣化物質の存在のための治療用蛋白質製剤、ワクチン又は血液サンプルの素早い分析に有用である。1−D分析的な膜電気泳動技術の例示は下記実施例9に示される。
ウィックを使用する場合、第一ウィックは通常破棄し、第二ウィックを第二バッファ中で平衡化する。第一バッファも同様に電気泳動ユニットから除去し、バッファ室を第二バッファで充填する。平衡化した膜を次に電気泳動ユニット中に異なる方位で配置し、電流を再荷電する。第二バッファの異なるpHは、一次元で分離された蛋白質を異なる荷電状態とする。電流を適用すると、蛋白質は第二バッファのpHに基づいて二次元で泳動する。実施例4に示されるように、大量の蛋白質の高い分解能分離が、2−D膜電気泳動法で達成される。
2−D膜電気泳動に使用する第一及び第二バッファは同一の組成を有してもよいが、異なるpHを有する。例えば、第一及び第二バッファのpHは下記実施例1中に記載されたように調整できる。又、第一及び第二バッファは異なる組成及び異なるpHでもよい。
第二に、従来のIEFゲルは通常、蛋白質結合相互作用及び酵素活性を消滅させる、高い濃度の尿素(例えば9M)及び他の非イオン性洗浄剤を含有する。同様に、2−DPAGEによる二次元分離で使用されるゲルは蛋白質を分子量により分離し、通常SDS等のイオン性洗浄剤を含有する。反対に、本発明の2−D膜電気泳動は、尿素又は洗浄剤が存在しない水混和性有機溶媒を使用し、その結果生体の蛋白質結合相互作用及び生物学的活性が示される。
最後に、従来のIEF手順は終了迄に1〜2日必要である。一方、代表的な2−D膜電気泳動は30分以内に完了できる。特に多数の電気泳動ユニットを単一の電力供給源に結合した場合の本発明の2−D膜電気泳動法の速度は、非常に少ない時間枠内に非常に多数の蛋白質サンプルの分析を可能とする。
異なる進化段階中の蛋白質発現における変質は、通常、本発明の方法による分離後の、蛋白質結合膜上の蛋白質スポットの発生、消滅又は移動度シフトに示される。蛋白質スポットの発生、消滅又は移動度シフトは、別々に発現した蛋白質の検出において使用される。別々に発現した蛋白質の性質は、質量分析法、免疫検出、又は当分野の他の適切な技術により同定できる。
本発明の膜電気泳動法は同様に、当分野で公知の「パルスフィールド」電気泳動技術を使用できる。
理論で本発明を限定するものではないが、別の蛋白質へ結合されているサンプル中の蛋白質の移動度シフトは、サンプル中の、同一の結合されていない蛋白質と比較した結合されている蛋白質の等電点の変化に起因すると考えられる。
又、蛋白質特定リガンドは、膜電気泳動前にサンプルと混合できる。蛋白質特定リガンドは標識されないか、上記記載のように抗体で標識されてもよい。添加されたリガンドと相互作用するサンプル中の蛋白質も、上記記載の移動度シフトにより又は標識の検出により検出できる。
非変性条件下膜電気泳動は同様に、蛋白質−蛋白質複合体中の蛋白質要素の特定の単純な方法を提供する。蛋白質要素の性質は、手順当分野の手順に従い蛋白質特定抗体、酵素分析、質量分析分析、蛋白質配列決定等を使用して決定できる。
本発明は下記本発明を限定するものではない実施例により例示される。
本発明の低導電性有機溶媒バッファを下記のとおり配合した。
バッファA−導電性強化剤サリチルアルデヒド(5ml)及びフルフリルアルコール(3ml)をベース溶媒エチレンサイクリックカーボネート(7ml)へ添加した。使用前にエチレンサイクリックカーボネート(mp35〜37℃)を溶融することが必要である。サンプル蛋白質を3.5kVで実施例2の1cm×8cmストリップ上で電気泳動したところ、1.5mA以上の電流が直ちに発生し、過度の熱も発生した。導電性抑制剤1,3−ブタンジオール、ジメチルホルムアミド及びジメチルアセトアミドの混合物の添加は電流を0.1mAへ減少させ、蛋白質泳動速度の減少を最小にすると共に熱発生を排除した。
バッファAの最終的配合は下記の通り:
28%エチレンサイクリックカーボネート、
20%サリチルアルデヒド、
12%フルフリルアルコール、
8%1,3−ブタンジオール、
16%ジメチルホルムアミド、及び
16%ジメチルアセトアミド。
バッファAのpHを4.5へギ酸で調整したが、ギ酸添加量を変化させてpHの範囲を約3〜約6にすることもできる。更にバッファAのpHは、フルフリルアルコール中に溶解した0.5Mピペラジンを添加して約6〜約10の範囲に調整できる。
44%プロピレンカーボネート、
12%ホルムアミド、
12%フルフリルアルコール、
16%1,3−ブタンジオール、及び
16%N−メチルピロリジノン。
バッファのpHをプロピレンカーボネート中に溶解した0.5Mピペラジンで8.5へ調整したが、ピペラジン添加量を変化させてpHの範囲を約6〜約10にすることもできる。更にバッファBのpHは、ギ酸でpHを調整して酸性にできる。バッファBの有効なpH範囲である3〜6はこの調整により達成できる。
36%プロピレンカーボネート、
12%ホルムアミド、
20%テトラヒドロフルフリルアルコール、
16%1,3−ブタンジオール、及び
16%N−メチルピロリジノン。
バッファのpHをプロピレンカーボネート中に溶解した0.5Mピペラジンで8.5へ調整したが、ピペラジン添加量を変化させてpHの範囲を約6〜約10にすることもできる。更にバッファCのpHは、ギ酸でpHを調整して酸性にできる。バッファCの有効なpH範囲である3〜6はこの調整により達成できる。
44%プロピレンカーボネート、
12%ホルムアミド、
12%2−フルアルデヒド、
16%1,3−ブタンジオール、及び
16%N−メチルピロリジノン。
バッファのpHをプロピレンカーボネート中に溶解した0.5Mピペラジンで8.5へ調整したが、ピペラジン添加量を変化させてpHの範囲を約6〜約10にすることもできる。更にバッファDのpHは、ギ酸でpHを調整して酸性にできる。バッファDの有効なpH範囲である3〜6はこの調整により達成できる。
バッファへの膜適合性の決定;下記高分子膜をそれらの実施例1のバッファA又はバッファBとの適合性を試験した:ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、ニトロセルロース、サポーテッドニトロセルロース、セルロースアセテート、DEAE−セルロース、「Hybond」商標−N、「Hybond」商標−NX(両者は中性ナイロン膜であるが、上記記載のようにそれらは僅かに荷電されている)、「Hybond」商標−XL、及び「Hybond」商標−N+(両者は改質されて高度に正に荷電されたナイロン膜である)。それぞれの膜を1cm×8cmストリップへ切断し、バッファA又はバッファBのいずれかで湿潤した。試験された膜中で、セルロース由来の膜(例えばニトロセルロース、セルロースアセテート及びDEAEセルロース)は、接触直後バッファにより完全に破壊され、それらは膜電気泳動不可能となった。残りの膜は、バッファ中の有機溶媒へ耐性であり、膜電気泳動使用に対するそれらの適合性を更に試験した。
図からわかるように、最も良い蛋白質分離がPVDF膜により達成された(図4、レーンA)。両方の中性に荷電されたナイロン膜(「Hybond」商標−N及び「Hybond」商標−NX)は良い蛋白質分離を示した(図4、レーンB及びC)。しかし、「Hybond」商標−N+又は「Hybond」商標−XL(両方共、高度に正に荷電されたナイロン膜)のいずれかに適用した蛋白質サンプルは、非常に減少された泳動速度を示し、分解能は、中性ナイロン又はPVDF膜で示された分解能に比べて劣っていた(図4、レーンD及びE)。ろ紙標準ストリップは劣った分解能及び過度の帯拡散を示した(図4、レーンF)。これら結果は、膜電気泳動に有用な高分子膜のために、膜は、純量電荷を有さないかわずかである疎水性(例えばPVDF)又は親水性(例えば「Hybond」商標−N及び「Hybond」商標−NX)のいずれかが好ましいことを示す。ろ紙は、本発明の方法の使用には明らかに不適切である。
3.6〜9.6の範囲の等電点を有する6種の蛋白質を、7.5cm×8cmPVDF膜上で実施例2の通りにバッファA中3.5kVで5分間電気泳動した。電気泳動後、蛋白質を実施例2の通りに反応性茶色染色した。6種の蛋白質は:アミログルコシダーゼ(pI3.6);グルコースオキシダーゼ(pI4.2);β−ラクトグロブリンA(pI5.1);ミオグロビン(pI6.8及び7.2);ヒラマメレクチン(pI8.2、8.6及び8.8)及びシトクロムC(pI9.6)であった。図5に示されるように、蛋白質はそれらの等電点に基づき分離された。これら結果は、蛋白質分子上の電荷は、膜電気泳動中のそれらの泳動の重要因子であることを示す。
pI9.6を有するシトクロムCはpH4.5を有する有機溶媒バッファを使用して分離されため、有機溶媒バッファのpHと5ユニット異なるpIを有する蛋白質は本発明の方法で有効に分離できることを示す。
ヒト乳ガン細胞抽出物(テンプル大学、生物学部のGeorge Tuszynski博士から提供された)を2〜3秒、氷上で細胞の低出力音波粉砕により調製した。6μg合計蛋白質を含有する4マイクロリットルの抽出物を4μlのカプロラクトンと混合し、PVDFブロット膜(7.5cm×8cm)の中央にスポットした。電気泳動を実施例2に記載された「サンドイッチユニット」配置を有する水平型電気泳動装置上で行った。細胞抽出物を3.5kVで5分間一次元で(約0.1mA又は約0.0016mA/cm2の電流の発生)、バッファA(pH4.5)を使用して分離した。
2−D SDS−PAGE及び本発明の2−D膜電気泳動の結果をそれぞれ図6A及び6Bに示す。2−D膜電気泳動は、数百の明確で及び輪郭のはっきりした蛋白質スポットを示した(図6B)。反対に、2−D SDS−PAGEではかなり少ない蛋白質スポットしか視認できず、視認されたものは拡散してむらがあった(図6A)。2−D SDS−PAGE分離中に観察されるむらは、貧溶媒和された疎水性蛋白質のゲルマトリックスを通過する泳動のせいであると考えられる。これらの結果は、本発明の2−D膜電気泳動は従来の2−Dポリアクリルアミドゲル電気泳動方法に対して、分離完了に必要な時間、電気泳動実施に必要なサンプル量、及び得られる分解能の点で顕著な改良を示すことを示す。
膜電気泳動により分離された蛋白質は、目的の蛋白質特有の抗体で膜を直接プローブして同定できる。これは下記のとおりPVDF膜上で電気泳動されたチャバネゴキブリ蛋白質抽出物中の喘息発生アレルゲンを検出することにより示された。
2cm×8cmPVDF膜に、実施例2の通りに調製した単一の4μlサンプルのチャバネゴキブリ乾燥体部分蛋白質抽出物(5μg合計蛋白質)をスポットした。サンプルを実施例2の通りに、バッファB(pH8.5)を使用して3.5kVで5分間、一次元電気泳動した。下記電気泳動で、膜を完全に脱イオン水で数分間洗浄し、過剰の有機溶媒を除去した。次に膜を半分に切断し、2つの1cm×8cmとした。二分の一を反応性茶色染料で実施例2の通りに染色し、他の半分を下記のとおり免疫検出にかけた。
蛋白質−蛋白質複合体は、蛋白質サンプルが膜電気泳動により分離された後に検出できる。これを示すために、トリプシン−大豆トリプシンインヒビター複合体を含有するサンプル、及び線虫共生細菌(Photorhabdus luminescens Hp.)由来のプロテアーゼ−プロテアーゼインヒビター複合体を含有するサンプルをPVDF膜上で下記のとおり電気泳動した。
P.luminescens Hp蛋白質サンプルの調製;1リットルのLB媒体へP.luminescens Hpの単一のコロニーを接種し、7日間攪拌しながら28℃でインキュベートした。次に媒体を7500×g、1時間で遠心分離した。上澄みを採集し、80%w/v硫酸アンモニウムで沈殿して濃縮し、7000×gで遠心分離し、10mMリン酸ナトリウムバッファ、pH6.5中で再懸濁した。濃縮した培養物を一晩、水で透析した。プロテアーゼをベンズアミジン−アガロースアフィニティクロマトグラフィーで精製し、プロテアーゼインヒビターも同様にトリプシン−アガロースアフィニティクロマトグラフィーで精製した。5μl(1μg蛋白質)の個体蛋白質及び複合体(蛋白質をその複合相手と共に10分室温で混合して)をスポットとして3cm×8cmPVDF膜の中央へ適用した。トリプシン及びトリプシンインヒビターの両方をSigma Chemical社(St.Louis、MO)から入手した。トリプシン及びトリプシンインヒビターを分離して調製し、濃度1mg/mlの水溶液とした。トリプシン−トリプシンインヒビター複合体を得るために、蛋白質を組み合わせて15分間室温でインキュベートした。
1−D膜電気泳動を実施例2の通りに3.5kVでバッファB(pH8.5)中5分間、電流0.003mA/cm2で行なった。ブロット膜を水で洗浄後、蛋白質を実施例2の通りに反応性茶色染料方法により検出した。図8A及び8Bは個体蛋白質種及び蛋白質−蛋白質複合体の両方が検出できたことを示す。
蛋白質−蛋白質複合体の検出に加えて、蛋白質サンプルの膜電気泳動後、蛋白質−リガンド相互作用も同様に検出できる。これは、β−ラクトグロブリンA(脂肪酸結合蛋白質)とステアレート(脂肪酸)との相互作用がPVDF膜上でのサンプルの電気泳動後に示されることで明らかである。
1mg/mlβ−ラクトグロブリンAの脱イオン水H2Oの溶液を調製し、0.1mMステアリン酸亜鉛のフルフリルアルコール溶液も調製した。2つの溶液の1マイクロリットルアリコートを混合し、5分間室温でインキュベートし、蛋白質−リガンド複合体を形成した。β−ラクトグロブリンA(フリー蛋白質)、ステアリン酸亜鉛(フリーリガンド)及び蛋白質−リガンド複合体を含有するサンプルを3cm×8cmPVDF膜上にスポットした。1−D膜電気泳動を実施例2の通りに3.5kVで5分間バッファB(pH8.5)中で行った。電気泳動後、膜を反応性茶色染料で実施例2の通りに染色した。図9に示す結果は、複合体を形成したβ−ラクトグロブリンA及びステアレートが容易に検出される(レーン2)ことを明らかに示す。上記複合体上の膜に見られるスポットは、蛋白質サンプルがスポットされた原点を示す。
通常はゲルがアニオン性変性剤(例えばSDS)を含有するために、普通のポリアクリルアミドゲル電気泳動による酵素活性の検出は困難である。同様に、アニオン性洗浄剤の除去に必要な非常に長い洗浄は蛋白質帯をこれらゲル中に拡散させてしまう。そして、蛋白質帯の拡散は目的の酵素の精密な検出を不可能にする。
反対に、膜電気泳動は蛋白質生物学的活性を保存し、酵素活性の検出前の再生ステップは不要である。従って電気泳動後、酵素は素早く精密に膜上で検出される。これは、エステラーゼ活性が3cm×8cmPVDF膜上で実施例2の通りに、3.5kVで5分間バッファB(pH8.5)中で電気泳動されたチャバネゴキブリ蛋白質抽出物中に検出されたことで明らかである。
多くの治療用薬又はワクチン製剤は蛋白質であるか、蛋白質分子を含有する。運搬及び貯蔵中、これら蛋白質含有製剤は劣化又は汚染されることがある。製剤中の蛋白質は劣化するために、製剤の純度の評価及び、可能な汚染物質の同定に使用するための用法指示プロファイルが作成されている。
SDS−PAGEは現在、蛋白質含有製剤の蛋白質分解プロファイルの分析・選別方法として採用されている。しかし、SDS−PAGEは時間がかかり、大量のサンプルを必要とし、及びしばしば分離された蛋白質の低い分解能しか提供できない。下記試験で示されるように、これら欠点は本発明の蛋白質含有製剤の劣化分析用膜電気泳動を使用することにより避けられる。
図11より、5時間室温への曝露後BSAの劣化が発生し、残りの12時間中進行することが観察された。本発明特有の高い分解能分解プロファイルが5〜6時間時点、7〜9時間時点、及び10〜12時間時点で明らかである。これら結果は蛋白質製剤中の蛋白質劣化が膜電気泳動により素早く精密に検出できることを示し、この方法は多量の蛋白質製剤の高い処理能力スクリーニングに容易に適用できることを示唆した。
実施例10a;蛋白質結合膜の共焦点顕微鏡断面:
6マイクログラムの血清蛋白質サンプルを7.5cm×8cmPVDF片上に上記実施例2に記載のとおり適用した。次に蛋白質サンプルを本質的に上記実施例4に記載のとおり二次元で分離した。一次元分離をバッファA中(参照実施例1)5分間3.5kVで行なった。二次元をバッファB(参照実施例1)を使用して3.5kVで5分間行なった。次に膜を30分間水を2回交換して洗浄した。分離した蛋白質を、Houston、B.,&Peddie、D.Anal.Biochem.177、263−267(1989)に記載のとおり(その全ての開示をここで資料として使用する。)フルオレセイン−イソチオシアナート(FITC)で共有的に標識した。共有標識手順に続いて、膜を洗浄して不必要なバックグラウンド蛍光発光を生じる過剰のFITCを除去した。分離された蛋白質はUV照明下で黄色蛍光スポットとして視認できる。
2つの同一にスポットされたPVDF膜を別々に、バッファAを使用して(参照実施例1)1D膜電気泳動にかけた。一方の膜を上記実施例3のように、頭頂部ガラス板に面しているサンプル側面(即ち、ろ紙ウィックと接触していない側面)で電気泳動した。他方の膜は、頭頂部ガラス板に面するのではなくろ紙ウィックに面して下向きのサンプル側面を有した。前者の配置では、膜は「表を上にした」と言う。後者の配置では、膜は「逆さま」であると言う。
「逆さま」膜上では、「表を上にした」膜上に視認できる軽く染色した蛋白質帯は存在しない。同様に、より濃密に染色した帯は「逆さま」膜上に「表を上にした」膜上よりも更に拡散した。これらの結果は膜電気泳動中、蛋白質は膜の表面上にあることを示す。より豊富でない蛋白質はその結果ろ紙ウィックから失われ、より豊富な蛋白質は膜表面及びろ紙ウィック間の競合により拡散した。より豊富な蛋白質の完全な喪失は、ろ紙よりも蛋白質がよりしっかりとPVDFの表面へ結合しているために、確認されなかった。
新しく開発された2−D膜電気泳動は親水性だけでなく疎水性蛋白質も同様に分離できることを示すために、ヒト血清蛋白質をBordierの手順に従い(J.Biol.Chem.256.1604−1607、1981、その全ての開示をここで資料として使用する。)「TritonX−114」商標を使用して親水性及び疎水性フラクションの両方を分取した。血清の5μlアリコートを、1%TritonX−114、10mMトリス−HCl(pH8.0)及び100mMNaClを含有する200μlの溶液と4℃で処理した。次に溶液を25℃で10分インキュベートした。得られた濁った溶液を10000×gで25℃、10分間スパンした。水性の上相及び底部洗浄剤小滴を分離した。上記プロセスを2つの蛋白質フラクションの完全な分離を確保するために繰り返した。下記2−D膜電気泳動による分析の前にバイオゲルP−6ミクロスピンカラムを通してフラクションをスピンして、過剰の洗浄剤を両方の相から除去した。
Claims (9)
- (i)少なくとも1のベース溶媒及び少なくとも1の導電性強化剤を含有する少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファ;
(ii)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する高分子膜であり、該膜は少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファと適合性がある膜;並びに
(iii)前記低導電性有機溶媒バッファ及び膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する前記高分子膜を備えるための少なくとも1の電気泳動ユニット、並びに上記少なくとも1の電気泳動ユニット中の電流を発生可能な電力供給源を有する電気泳動装置、
ここで、前記少なくとも1のベース溶媒はエチレンサイクリックカーボネートであるか、又はプロピレンカーボネート及びエチレンサイクリックカーボネートの混合物であり、前記低導電性有機溶媒バッファは3.5kVの一定電圧をかけた時に、0.0001mA/cm 2 膜〜0.2mA/cm 2 膜の電流を生じる、
を備えた蛋白質の分離用電気泳動システム。 - 上記少なくとも1の導電性強化剤はホルムアミド;アセトアミド;プロピオンアミド;ブチルアミド;N−メチルホルムアミド;N−メチルアセトアミド;N−メチルプロピオンアミド;N−メチルブチルアミド;ベンズアミド;トルアミド;ラクトアミド;ニコチンアミド;2−フルアルデヒド;フルフリルアルコール;テトラヒドロフルフリルアルコール;サリチルアルデヒド;グアヤコール;フェノール;ホウ酸;フマル酸;ピペラジン;及びそれらの混合物の群から選ばれた請求項1の電気泳動システム。
- 前記少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファは更に、ホルムアミド及びアセトアミドのジメチル誘導体;1,3−ブタンジオール;N−メチルピロリジノン;ソルビトール;グリセロール;カプロラクトン;メトキシエタノール;及びそれらの混合物の群から選ばれた少なくとも1の導電性抑制剤を含有する請求項1又は2の電気泳動システム。
- 前記高分子膜はポリビニリデンジフルオライド(PVDF)である請求項1の電気泳動システム。
- 下記ステップを有する蛋白質の電気泳動分離法:
(1)少なくとも1のベース溶媒、少なくとも1の導電性強化剤、及び少なくとも1の導電性抑制剤を含有する少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファを用意するステップ、ここで、前記低導電性有機溶媒バッファは3.5kVの一定電圧をかけた時に、0.0001mA/cm 2 膜〜0.2mA/cm 2 膜の電流を生じる;
(2)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する高分子膜であり、該膜は少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファと適合性がある膜を用意するステップ;
(3)膜で分離される蛋白質を含有する少なくとも1のサンプルを適用するステップ;並びに
(4)電気泳動による蛋白質の分離ステップ。 - 下記ステップを有する蛋白質の二次元電気泳動分離方法:
(1)下記を含む電気泳動システム調製ステップ:
(i)第一pHを有する第一低導電性有機溶媒バッファ及び第二pHを有する第二低導電性有機溶媒バッファ;
ここで、第一及び第二の低導電性有機溶媒バッファは3.5kVの一定電圧をかけた時に、0.0001mA/cm 2 膜〜0.2mA/cm 2 膜の電流をそれぞれ生じる、
(ii)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有し、第一及び第二の低導電性有機溶媒バッファと適合性がある高分子膜;並びに
(iii)第一及び第二の低導電性有機溶媒バッファ及び膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する前記高分子膜を備えるための少なくとも1の電気泳動ユニットを含有する電気泳動装置;
(2)分離される蛋白質を有する少なくとも1のサンプルを膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する前記膜へ適用するステップ;
(3)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する前記膜及び第一の低導電性有機溶媒バッファを少なくとも1の電気泳動ユニット中に配置するステップ、但し、該膜は第一方位方向に配置される;
(4)少なくとも1の電気泳動ユニット中で電流を発生することにより一次元方向に蛋白質を分離するステップ;
(5)少なくとも1の電気泳動ユニット中の第一の低導電性有機溶媒バッファの第二の低導電性有機溶媒バッファで交換するステップ;
(6)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する前記膜を少なくとも1の電気泳動ユニット中に第二方位方向に配置するステップ;並びに
(7)少なくとも1の電気泳動ユニット中で電流の発生により二次元方向に蛋白質を分離するステップ。 - (i)少なくとも1のベース溶媒及び少なくとも1の導電性強化剤を含有する少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファ;
(ii)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する高分子膜であり、該膜は少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファと適合性がある膜;並びに
(iii)前記低導電性有機溶媒バッファ及び前記高分子膜を備えるための少なくとも1の電気泳動ユニット、並びに上記少なくとも1の電気泳動ユニット中の電流を発生可能な電力供給源を有する電気泳動装置、
ここで、前記低導電性有機溶媒バッファは3.5kVの一定電圧をかけた時に、0.0001mA/cm 2 膜〜0.2mA/cm 2 膜の電流を生じ、
前記少なくとも1の導電性強化剤は、サリチルアルデヒド及びフルフリルアルコールの混合物、ホルムアミド及び2−フルアルデヒドの混合物、ホルムアミド及びフルフリルアルコールの混合物、又はホルムアミド及びテトラヒドロフルフリルアルコールの混合物である、
を備えた蛋白質の分離用電気泳動システム。 - (i)少なくとも1のベース溶媒、少なくとも1の導電性強化剤及び少なくとも1の導電性抑制剤を含有する少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファ;
ここで、少なくとも1の導電性抑制剤はホルムアミド及びアセトアミドのジメチル誘導体;1,3−ブタンジオール;N−メチルピロリジノン;ソルビトール;グリセロール;カプロラクトン;メトキシエタノール;及びそれらの混合物の群から選ばれ、
前記低導電性有機溶媒バッファは3.5kVの一定電圧をかけた時に、0.0001mA/cm 2 膜〜0.2mA/cm 2 膜の電流を生じる、
(ii)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する高分子膜であり、該膜は少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファと適合性がある膜;並びに
(iii)前記バッファ及び前記高分子膜を備えるための少なくとも1の電気泳動ユニット、並びに上記少なくとも1の電気泳動ユニット中の電流を発生可能な電力供給源を有する電気泳動装置、
を備えた蛋白質の分離用電気泳動システム。 - (i)少なくとも1のベース溶媒、少なくとも1の導電性強化剤及び少なくとも1の導電性抑制剤を含有する少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファ;
ここで、前記低導電性有機溶媒バッファは3.5kVの一定電圧をかけた時に、0.0001mA/cm 2 膜〜0.2mA/cm 2 膜の電流を生じる、
(ii)膜厚みが0.15mmのときに室温で少なくとも20μg蛋白質/cm 2 の蛋白質結合能力を有する高分子膜であり、該膜は少なくとも1の低導電性有機溶媒バッファと適合性がある膜;並びに
(iii)前記低導電性有機溶媒バッファ及び前記高分子膜を備えるための少なくとも1の水平型電気泳動ユニット、並びに上記少なくとも1の水平型電気泳動ユニット中の電流を発生可能な電力供給源を有する電気泳動装置、
ここで、前記低導電性有機溶媒バッファは3.5kVの一定電圧をかけた時に、0.0001mA/cm 2 膜〜0.2mA/cm 2 膜の電流を生じ、
前記少なくとも1の水平型電気泳動ユニットは下記を備えている:
(i)第一及び第二独立バッファ室;
(ii)第一及び第二独立バッファ室にまたがる実質的に同じ長さ及び幅の上板及び底板、但し前記高分子膜は上板及び底板の間にサンドイッチされており;並びに
(iii)底板及び前記高分子膜の間に配置され、第一及び第二末端を有するウィック、ここで、第一及び第二ウィック末端は延長してそれぞれ第一及び第二独立バッファ室内へ達するほど上板及び底板よりも長い、
を備えた蛋白質の分離用電気泳動システム。
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WO2007058893A2 (en) * | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Perkinelmer Life And Analytical Sciences | Planar electrochromatography/thin layer chromatography separations systems |
US20070161030A1 (en) * | 2005-12-08 | 2007-07-12 | Perkinelmer Las, Inc. | Micelle-and microemulsion-assisted planar separations platform for proteomics |
US20070251824A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-11-01 | Perkinelmer Las, Inc. | Multiplexed analyte quantitation by two-dimensional planar electrochromatography |
US20080296158A1 (en) | 2007-05-31 | 2008-12-04 | Sharp Kabushiki Kaisha | Device for electrophoresis, device for transfer, device for electrophoresis and transfer, chip for electrophoresis and transfer, and method for electrophoresis, method for transfer, and method for electrophoresis and transfer |
CA2694349C (en) * | 2007-07-26 | 2013-07-09 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Method for detecting disease markers |
US8507218B2 (en) | 2008-02-08 | 2013-08-13 | The Regents Of The University Of California | Detection of degradative enzymes in bodily fluids |
JP5152862B2 (ja) * | 2008-04-04 | 2013-02-27 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 疎水性ポリマー膜を有する電気泳動用媒体及びそれを用いた泳動分離方法 |
US8105844B2 (en) * | 2008-05-20 | 2012-01-31 | Honeywell International Inc. | Apparatus and method of using porous material for antigen separation, identification, and quantification with electrophoresis techniques |
CA2767860C (en) | 2009-07-14 | 2018-06-12 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Serum markers associated with early and other stages of breast cancer |
US8420333B2 (en) | 2009-07-14 | 2013-04-16 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | G-protein coupled receptor-associated sorting protein 1 as a cancer biomarker |
US8980269B2 (en) | 2009-07-14 | 2015-03-17 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | G-protein coupled receptor-associated sorting protein 1 as a cancer biomarker |
CN102713635A (zh) * | 2010-01-25 | 2012-10-03 | 雅培制药有限公司 | 在复杂生物液中的蛋白质的快速表征 |
US9475709B2 (en) | 2010-08-25 | 2016-10-25 | Lockheed Martin Corporation | Perforated graphene deionization or desalination |
EP3415157B1 (en) | 2011-10-28 | 2020-09-16 | NeoStrata Company, Inc. | N-acyldipeptide derivatives and their uses |
US9028663B2 (en) * | 2012-03-21 | 2015-05-12 | Lockheed Martin Corporation | Molecular separation device |
US10118130B2 (en) | 2016-04-14 | 2018-11-06 | Lockheed Martin Corporation | Two-dimensional membrane structures having flow passages |
US9744617B2 (en) | 2014-01-31 | 2017-08-29 | Lockheed Martin Corporation | Methods for perforating multi-layer graphene through ion bombardment |
US9610546B2 (en) | 2014-03-12 | 2017-04-04 | Lockheed Martin Corporation | Separation membranes formed from perforated graphene and methods for use thereof |
US9834809B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-12-05 | Lockheed Martin Corporation | Syringe for obtaining nano-sized materials for selective assays and related methods of use |
US10653824B2 (en) | 2012-05-25 | 2020-05-19 | Lockheed Martin Corporation | Two-dimensional materials and uses thereof |
US10980919B2 (en) | 2016-04-14 | 2021-04-20 | Lockheed Martin Corporation | Methods for in vivo and in vitro use of graphene and other two-dimensional materials |
US10376845B2 (en) | 2016-04-14 | 2019-08-13 | Lockheed Martin Corporation | Membranes with tunable selectivity |
TW201504140A (zh) | 2013-03-12 | 2015-02-01 | Lockheed Corp | 形成具有均勻孔尺寸之多孔石墨烯之方法 |
US9572918B2 (en) | 2013-06-21 | 2017-02-21 | Lockheed Martin Corporation | Graphene-based filter for isolating a substance from blood |
WO2015116946A1 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Lockheed Martin Corporation | Perforating two-dimensional materials using broad ion field |
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CA2942496A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Lockheed Martin Corporation | Separation membranes formed from perforated graphene |
WO2016011143A1 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-21 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Stabilized peptide fragments from redoxin proteins as cancer biomarkers |
JP2017534311A (ja) | 2014-09-02 | 2017-11-24 | ロッキード・マーチン・コーポレーション | 二次元膜材料をベースとする血液透析膜および血液濾過膜、ならびにそれを用いた方法 |
AU2016303048A1 (en) | 2015-08-05 | 2018-03-01 | Lockheed Martin Corporation | Perforatable sheets of graphene-based material |
MX2018001559A (es) | 2015-08-06 | 2018-09-27 | Lockheed Corp | Modificacion de nanoparticula y perforacion de grafeno. |
RU2616906C1 (ru) * | 2016-04-07 | 2017-04-18 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Орловский государственный аграрный университет" | Способ электрофоретического разделения белков сыворотки крови и молока в полиакриламидном геле |
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CA3020686A1 (en) | 2016-04-14 | 2017-10-19 | Lockheed Martin Corporation | Method for treating graphene sheets for large-scale transfer using free-float method |
WO2017180133A1 (en) | 2016-04-14 | 2017-10-19 | Lockheed Martin Corporation | Methods for in situ monitoring and control of defect formation or healing |
CN110753839B (zh) * | 2017-06-13 | 2022-09-09 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 快速印迹装置及其应用 |
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Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3984298A (en) | 1970-12-28 | 1976-10-05 | Haber Instruments, Incorporated | Electromolecular propulsion in semiconductive media |
US3930973A (en) * | 1972-03-10 | 1976-01-06 | Nerenberg Samuel T | Electrophoretic process |
US4128470A (en) * | 1975-08-29 | 1978-12-05 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Supports for electrophoresis and process for the production of the same |
JPS63262550A (ja) * | 1987-04-20 | 1988-10-28 | Fuji Photo Film Co Ltd | 電気泳動用支持体 |
US4857163A (en) * | 1987-07-17 | 1989-08-15 | Beckman Instruments, Inc. | High resolution electrophoretic gel and method for separating serum proteins |
US4909918A (en) * | 1988-09-06 | 1990-03-20 | Bambeck Gregory S | Disposable comb for electrophoresis device |
US5068019A (en) * | 1989-05-19 | 1991-11-26 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Electrophoresis film support |
BE1005220A3 (fr) * | 1991-01-15 | 1993-06-01 | Analis Sa | Procede de separation, d'identification et de quantification d'isoenzymes et d'isoformes de la phosphatase alcaline. |
US5137609A (en) * | 1992-01-31 | 1992-08-11 | Biometric Imaging Inc. | Differential separation assay |
US5314595A (en) | 1992-04-03 | 1994-05-24 | United States Biochemical Corporation | Electrophoresis of nucleic acid fragments |
US5364098A (en) * | 1993-09-08 | 1994-11-15 | Data East Pinball, Inc. | Rolling ball game with auxiliary control |
US5637202A (en) * | 1993-10-27 | 1997-06-10 | California Institute Of Technology | Porous electrophoresis sponges |
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