CN103884763B - 三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，其包括分离胶和浓缩胶。该三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统在蛋白电泳时，尤其是小分子蛋白，如分子量在10kDa左右的蛋白分子，只需要在室温下就可操作，电泳时间短，一般在120～140V恒压下电泳2～3小时即可，且染色和脱色时间非常短，一般只需染色1分钟，脱色10分钟即可，节约时间，电泳效率大大提高，同时降低了成本。使用该三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统进行小分子蛋白电泳，方法简单，高效，且分辨率高，可清晰的检测小分子蛋白。此外，本发明还涉及一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法和应用。

Description

三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统及其制备方法和应用。

背景技术

在机体的生理调节过程中，许多调节因子不仅含量少，而且分子量也很小，在蛋白质的生化分析和基因表达产物的分离纯化中，难免会需要检测某种或某些小分子蛋白质成分，而小分子蛋白成分等的分离纯化一直是研究的难点。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是分离蛋白质的常用生化方法。蛋白质分子在热变性解聚后与SDS结合形成带负电的蛋白质-SDS复合物。复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小。当使用均匀浓度的SDS-PAGE来分析分子量在15-200kDa的蛋白质时，电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。但常规的Tris-甘氨酸-盐酸系统中电泳分离分子量小于10ka的多肽效果较差。

传统的用于分离小分子量蛋白分子的Tricine（N-三(羟甲基)甲基甘氨酸）-SDS-PAGE方法，可检测分子量在1-100kDa的蛋白质。但该方法需配制正负两极缓冲液和多种丙烯酰胺储存液，且需置于冰上电泳，电泳时间大于7个小时，染色3小时，脱色24小时，操作繁琐，耗时长。

发明内容

基于此，有必要提供一种操作简便的可用于小分子量蛋白分析的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统及其制备方法和应用。

一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，包括：

分离胶，所述分离胶的配制配方是每580μL的水中含有792μL的质量体积浓度为40%的丙烯酰胺、1.792mL的Tris-HCl缓冲液、32μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵以及2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺；以及

浓缩胶，位于所述分离胶上，所述浓缩胶的配制配方是每870μL的水中含有119μL的质量体积浓度为40%的丙烯酰胺、182μL的Tris-HCl缓冲液、24μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵以及1.2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺；

所述浓缩胶与所述分离胶的长度比为1:4；且所述Tris-HCl缓冲液的配制配方是每60mL水中含有30.2g三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至8.8，加水补至三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.302g/mL。

在其中一个实施例中，所述电泳系统还包括电泳液，所述电泳液的配方是每1L水中含有3.03g的三羟甲基氨基甲烷、4.5g的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.5g的十二烷基磺酸钠。

在其中一个实施例中，所述电泳系统还包括2×蛋白样品加样缓冲液，所述2×蛋白样品加样缓冲液的配制配方是每0.002g考马斯亮蓝G-250与2mL pH为6.8的4×Tris-Cl/SDS缓冲液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸钠以及0.31g的二硫苏糖醇溶解混合后用水定容至10mL。

在其中一个实施例中，所述电泳系统还包括染色液，所述染色液配制配方是每250mL分析纯甲醇与50mL分析纯乙醇及1g考马斯亮蓝G-250充分混合后用水定容至500mL。

一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法，包括如下步骤：

配制分离胶：对垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的侧板进行压条封边后，按照每580μL的水中含有792μL的质量体积浓度为40%的丙烯酰胺、1.792mL的Tris-HCl缓冲液、32μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵以及2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺的配方比例将各原料物质混合后加入至胶床中，至所述侧板的4/5高度处，立即用水封顶；

待水与胶出现分界线后，配制浓缩胶：弃去封顶的水，按照每870μL的水中含有119μL的质量体积浓度为40%的丙烯酰胺、182μL的Tris-HCl缓冲液、24μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵以及1.2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺的配方比例将各原料物质混合后加入至所述分离胶上，灌满至所述侧板的高度，插入电泳梳子，待所述电泳梳子与浓缩胶之间出现缝隙即完成制备；

其中，所述Tris-HCl缓冲液的配制配方是每60mL水中含有30.2g三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至8.8，加水补至三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.302g/mL。

在其中一个实施例中，所述电泳系统的制备方法还包括电泳液的配制步骤，具体是按照每3.03g的三羟甲基氨基甲烷与4.5g的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸及0.5g的十二烷基磺酸钠的配方比例将各原料物质溶解至1L的水中。

在其中一个实施例中，所述电泳系统的制备方法还包括2×蛋白样品加样缓冲液的配制步骤，具体是按照每0.002g考马斯亮蓝G-250与2mL pH为6.8的4×Tris-Cl/SDS缓冲液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸钠以及0.31g的二硫苏糖醇的配方比例将各原料物质混合后，用水定容至10mL。

在其中一个实施例中，所述电泳系统的制备方法还包括染色液的配制步骤，具体是按照每250mL分析纯甲醇与50mL分析纯乙醇及1g考马斯亮蓝G-250的配方比例将各原料物质充分混合后用水定容至500mL，过滤后收集滤液备用。

一种蛋白质电泳方法，包括如下步骤：

按照上述任一实施例所述的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法制备所述三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统；

采用电泳仪进行垂直板三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，将样品添加至加样槽中，在120～140V恒压电泳2～3小时，待指示蛋白的指示线刚刚超过凝胶电泳的标记位置后停止电泳；

用配制好的染色液微波染色1分钟，再在水中微波脱色10分钟。

上述三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统在蛋白电泳时，尤其是小分子蛋白，如分子量在10kDa左右的蛋白分子，只需要在室温下就可操作，电泳时间短，一般在120～140V恒压下电泳2～3小时即可，且染色和脱色时间非常短，一般只需染色1分钟，脱色10分钟即可，节约时间，电泳效率大大提高，同时降低了成本。使用该三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统进行小分子蛋白电泳，方法简单，高效，且分辨率高，可清晰的检测小分子蛋白。

附图说明

图1为实施例部分的小分子量标记蛋白的电泳结果图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对本发明三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统及其制备方法和应用作进一步详细的说明。

一实施方式的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统包括分离胶和浓缩胶。

其中，分离胶的配制配方是每580μL的水中含有792μL的质量体积浓度（本发明所述的质量体积浓度即溶质质量与溶液体积比）为40%的丙烯酰胺、1.792mL的Tris-HCl缓冲液、32μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵（AP）以及2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）。

浓缩胶位于分离胶一侧。浓缩胶的配制配方是每870μL的水中含有119μL的质量体积浓度为40%的丙烯酰胺、182μL的Tris-HCl缓冲液、24μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵以及1.2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺。

浓缩胶与分离胶的长度比为1:4。

Tris-HCl缓冲液的配制配方是每60mL水中含有30.2g三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至8.8，加水补至三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.302g/mL。

此外，在本实施方式中，该电泳系统还包括电泳液、2×蛋白样品加样缓冲液（本发明所述的“×”及前面的数字表示在使用时稀释相应的倍数）以及染色液。其中，电泳液的配方是每1L水中含有3.03g的三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、4.5g的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸（Tricine）和0.5g的十二烷基磺酸钠（SDS）。2×蛋白样品加样缓冲液的配制配方是每0.002g考马斯亮蓝G-250与2mL pH为6.8的4×Tris-Cl/SDS缓冲液（在300mL水中溶解91gTris-base(1.5mol/L)，用1mol/L的盐酸调节pH至6.8，补加水至体积500mL，用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2g质量体积浓度为0.4%的SDS，4℃保存备用，下同）、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸钠以及0.31g的二硫苏糖醇（DTT）溶解混合后用水定容至10mL。染色液配制配方是每250mL分析纯甲醇与50mL分析纯乙醇及1g考马斯亮蓝G-250充分混合后用水定容至500mL。

此外，本实施方式还提供了一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法，包括如下步骤：

配制分离胶：对垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的侧板进行压条封边后，按照每580μL的水中含有792μL的质量体积浓度为40%的丙烯酰胺、1.792mL的Tris-HCl缓冲液、32μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵以及2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺的配方比例将各原料物质混合后加入至胶床中，至侧板的4/5高度处，立即用水封顶；

待水与胶出现分界线后，配制浓缩胶：弃去封顶的水，按照每870μL的水中含有119μL的质量体积浓度为40%的丙烯酰胺、182μL的Tris-HCl缓冲液、24μL的质量体积浓度为10%的过硫酸铵以及1.2μL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺的配方比例将各原料物质混合后加入至分离胶上，灌满至侧板的高度，插入电泳梳子，待电泳梳子与浓缩胶之间出现缝隙即完成制备。

进一步，本实施方式的电泳系统的制备方法还包括电泳液、2×蛋白样品加样缓冲液及染色液的配制步骤。

其中，电泳液的配制是按照每3.03g的三羟甲基氨基甲烷与4.5g的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸及0.5g的十二烷基磺酸钠的配方比例将各原料物质溶解至1L的水中。

2×蛋白样品加样缓冲液的配制是按照每0.002g考马斯亮蓝G-250与2mLpH为6.8的4×Tris-Cl/SDS缓冲液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸钠以及0.31g的二硫苏糖醇的配方比例将各原料物质混合后，用水定容至10mL。

染色液的配制是按照每250mL分析纯甲醇与50mL分析纯乙醇及1g考马斯亮蓝G-250的配方比例将各原料物质充分混合后用水定容至500mL，过滤后（如用滤纸过滤）收集滤液备用。

进一步，本实施方式还提供了一种蛋白质电泳方法，包括如下步骤：

步骤一：按照上述三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法制备三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。

步骤二：采用电泳仪进行垂直板三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，将样品添加至加样槽中，在120～140V恒压电泳2～3小时，待指示蛋白的指示线刚刚超过凝胶电泳的标记位置后停止电泳。

步骤三：用配制好的染色液微波染色1分钟，再在水中微波脱色10分钟。

上述三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统在蛋白电泳时，尤其是小分子蛋白，如分子量在10kDa左右的蛋白分子，只需要在室温下就可操作，电泳时间短，一般在120～140V恒压下电泳2～3小时即可，且染色和脱色时间非常短，一般只需染色1分钟，脱色10分钟即可，节约时间，电泳效率大大提高，同时降低了成本。使用该三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统进行小分子蛋白电泳，方法简单，高效，且分辨率高，可清晰的检测小分子蛋白。

以下为具体实施例部分：

1、溶液配制

（1）2.5M Tris-HCl缓冲液：

称取30.2g三羟甲基氨基甲烷溶解到60mL的双蒸水中，用盐酸调节pH到8.8，用双蒸水补足溶液体积至100mL，4～8℃保存。

（2）电泳液：

称取3.03g三羟甲基氨基甲烷、4.5g Tricine及0.5g十二烷基磺酸钠溶解到1L的双蒸水水中配制溶液，4～8℃保存备用。

（3）2×蛋白样品加样缓冲液：

称取0.002g考马斯亮蓝G-250后，分别加入2mL pH为6.8的4×Tris-Cl/SDS缓冲液、2.4mL甘油、0.8g SDS及0.31g DTT，用双蒸水定容至10mL，均匀分装-20℃保存备用。

（4）10%过硫酸铵（AP）：

称取1g AP加入到10mL双蒸水中，于4～8℃保存备用。

（5）染色液：

称取250mL分析纯甲醇及50mL分析纯乙醇加到1g考马斯亮蓝G-250中，用双蒸水定容至500mL，充分混匀，滤纸过滤后室温保存备用。

2、改进的Tricine-SDS-PAGE胶的制备

（1）分离胶的制备：

对垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的玻璃板进行压条封边后，吸取580μL双蒸水、792μL质量体积浓度为40%丙烯酰胺、1.792mL Tris-HCl缓冲液、32μL上述配制的10%AP以及2μL TEMED于50ml烧杯中，立即混匀，用1mL枪缓缓加入至两玻璃板间的胶床中，至胶板的4/5处，立即用水封顶，20分钟后观测水与胶是否出现分界线，出现后配制浓缩胶。

（2）浓缩胶的制备：

弃去封顶的水，吸取870μL双蒸水、119μL质量体积浓度为40%丙烯酰胺、182μL Tris-HCl缓冲液、24μL上述配制的10%AP以及1.2μL TEMED于50ml烧杯中，立即混匀，用1ml枪缓缓加入两玻璃板间的胶床中，灌满胶板，插入十孔电泳梳子，20分钟后观察梳子与浓缩胶间出现缝隙即可。

3、低分子量蛋白Marker电泳

采用电泳仪（天能）进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，点5μL低分子量蛋白Marker样，用配制的电泳缓冲液电泳，120～140V恒压电泳2～3h，待指示线刚刚超过凝胶电泳系统的红色胶条即终止电泳。

3)染色脱色

用配好的染色液微波染色1min，清水微波脱色10min，结果如图1所示（图中数字单位kDa），可以清晰的检测到低分子量标记蛋白Marker条带。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，其特征在于，包括：

分离胶，所述分离胶的配制配方是每580μL的水中含有792μL的质量体积浓度为40％的丙烯酰胺、1.792mL的Tris-HCl缓冲液、32μL的质量体积浓度为10％的过硫酸铵以及2μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；以及

浓缩胶，所述浓缩胶的配制配方是每870μL的水中含有119μL的质量体积浓度为40％的丙烯酰胺、182μL的Tris-HCl缓冲液、24μL的质量体积浓度为10％的过硫酸铵以及1.2μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；

所述浓缩胶与所述分离胶的长度比为1:4；且所述Tris-HCl缓冲液的配制配方是每60mL水中含有30.2g三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至8.8，加水补至三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.302g/mL；

所述三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统还包括2×蛋白样品加样缓冲液，所述2×蛋白样品加样缓冲液的配制配方是每0.002g考马斯亮蓝G-250与2mL pH为6.8的4×Tris-Cl/SDS缓冲液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸钠以及0.31g的二硫苏糖醇溶解混合后用水定容至10mL。

2.如权利要求1所述的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，其特征在于，还包括电泳液，所述电泳液的配方是每1L水中含有3.03g的三羟甲基氨基甲烷、4.5g的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.5g的十二烷基磺酸钠。

3.如权利要求1所述的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，其特征在于，还包括染色液，所述染色液配制配方是每250mL分析纯甲醇与50mL分析纯乙醇及1g考马斯亮蓝G-250充分混合后用水定容至500mL。

4.一种三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

对垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的侧板进行压条封边后，按照每580μL的水中含有792μL的质量体积浓度为40％的丙烯酰胺、1.792mL的Tris-HCl缓冲液、32μL的质量体积浓度为10％的过硫酸铵以及2μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺的配方比例将各原料物质混合后加入至胶床中，至所述侧板的4/5高度处，立即用水封顶；

待水与胶出现分界线后，弃去封顶的水，按照每870μL的水中含有119μL的质量体积浓度为40％的丙烯酰胺、182μL的Tris-HCl缓冲液、24μL的质量体积浓度为10％的过硫酸铵以及1.2μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺的配方比例将各原料物质混合后加入至分离胶上，灌满至所述侧板的高度，插入电泳梳子，待所述电泳梳子与浓缩胶之间出现缝隙即完成制备；

其中，所述Tris-HCl缓冲液的配制配方是每60mL水中含有30.2g三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至8.8，加水补至三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.302g/mL；

还包括2×蛋白样品加样缓冲液的配制步骤，具体是按照每0.002g考马斯亮蓝G-250与2mL pH为6.8的4×Tris-Cl/SDS缓冲液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸钠以及0.31g的二硫苏糖醇的配方比例将各原料物质混合后，用水定容至10mL。

5.如权利要求4所述的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法，其特征在于，还包括电泳液的配制步骤，具体是按照每3.03g的三羟甲基氨基甲烷与4.5g的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸及0.5g的十二烷基磺酸钠的配方比例将各原料物质溶解至1L的水中。

6.如权利要求4所述的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法，其特征在于，还包括染色液的配制步骤，具体是按照每250mL分析纯甲醇与50mL分析纯乙醇及1g考马斯亮蓝G-250的配方比例将各原料物质充分混合后用水定容至500mL，过滤后收集滤液备用。

7.一种蛋白质电泳方法，其特征在于，包括如下步骤：

按照如权利要求4～6中任一项所述的三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的制备方法制备所述三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳系统；

采用电泳仪进行垂直板三甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，将样品添加至加样槽中，在120～140V恒压电泳2～3小时，待指示蛋白的指示线刚刚超过凝胶电泳的标记位置后停止电泳；

用配制好的染色液微波染色1分钟，再在水中微波脱色10分钟。