CN111474337A - 一种快速蛋白印迹缓冲液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由一种或多种缓冲剂、肽类生化试剂以及一到两种有机溶剂组成的蛋白印迹缓冲系统，不但能够适用于湿转体系，也可以应用于半干转膜系统，其特点是具有快速、高效的蛋白转印效果。能够适用于各种分子量的蛋白样品的转印实验，有效的提高蛋白印迹的实验效率。

Description

一种快速蛋白印迹缓冲液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高效蛋白印迹缓冲液及其制备方法，可广泛适用于各种聚丙烯酰胺凝胶与各种印迹膜之间蛋白质的转印，属于生物学技术领域。
背景技术
印迹技术(blotting)是现代分子生物学实验中常用的检测和分析方法。通常会涉及到生物大分子在两种介质之间的转移，并在转移后的新介质上显示特定的结果。自Southern blot应用于DNA分析开始，用于RNA分析的Northern blot和蛋白质研究的Westernblot先后建立，迄今已经发展出了一系列的blotting技术。最常见的转印技术包括：简单扩散、真空负压吸引和电泳转印(electrophoretic blotting)。其中电泳转印技术自1979年Harry Towbin创造性的发明以来，就成了40年来最经典的蛋白印迹技术。尽管现在还存在着湿转和半干转两种形式的争议，但这也只是施加电场的机械装置的区别。其基本原理依然是在电场力作用下使凝胶电泳分离的蛋白质区带转移到特定的固相介质上的过程。因此蛋白的转印实质上也是一个电化学的过程。而蛋白印迹缓冲液的作用就在于给蛋白质提供一个更利于泳动的液体环境。虽然从理论上讲，各种电泳缓冲液都能够实现蛋白转印的效果。但与电泳不同的是，除了所需要的液体环境，蛋白转印还需要促进蛋白质与印迹膜的结合，因此，又具有一定的特殊性。目前已经公开的转印buffer有很多种，最主要最普遍使用的转膜液配方有towbin缓冲液(25mM Tris，192mM glycine，20％甲醇pH8.3)；Bjerrum Schafer-Nielsen缓冲液(48mM Tris，39mM glycine，20％甲醇pH9.2)；Timmons缓冲液(250mM Tris，192mM glycine，pH8.9)；CAPS缓冲液(10mM CAPS，10％甲醇)；DunnCarbonate缓冲液(10mM NaHCO3，3mM Na2CO3，20％甲醇pH9.9)；Takaratransfer缓冲液(48mM Tris，39mM glycine，0.037％SDS,20％甲醇)。
尽管上述的缓冲液系统适用于大多数蛋白转印，但是其使用均受到实验的目的、转印仪器的种类、蛋白分子量的大小、电压或电流的选择等多种条件的限制。比如towbin缓冲液虽然具有广泛的适用性，但是其转膜的速度和转膜效率明显较低。Bjerrum Schafer-Nielsen缓冲液和Timmons缓冲液则多用于半干式转印操作时，其转印速度较快，但是不适用于于大分子蛋白的转膜。CAPS缓冲液(pH11)通常应用在蛋白测序应用中，而在常规blotting实验中多用于50kd以上蛋白的blotting实验。Dunn Carbonate缓冲液有助于提高抗体的识别效率，但是一般多应用于碱性蛋白质的检测。Takaratransfer缓冲液通过加入SDS改善了Bjerrum Schafer-Nielsen缓冲液对大分子蛋白的转印效率，但是其转印速度依然较慢，同时由于SDS的加入，缓冲液具有较高的产热能力，有可能引起大分子蛋白与小分子蛋白的泳动速度两极分化，导致蛋白质整体转膜效果的不一致。
近年来不同的研究者为了获得更好转膜效率，对转膜缓冲液进行了较多的研究。比如
美国专利US2010 0212060公开了一种电转移缓冲液，通过增加转移缓冲液的离子强度，例如300mM tris、300mM甘氨酸、0.1％SDS和20％乙醇，可实现更快速的半干电印迹转移。这种高离子强度的转移缓冲液可在转移过程中产生高电流，能够在10分钟或更短时间内实现蛋白质的转印。为了避免在蛋白转印过程中因为高电流产生过多的热量，美国专利US.Pat.No.8075755公开了利用多层聚酯或聚酯/纤维素混合物替代传统蛋白转印过程中使用的滤纸，在半干式蛋白印迹实验操作中能够更好的与蛋白转印缓冲液相结合，明显降低转印过程中的电流强度，从而降低产热，提高蛋白转印的效率。但是由于多层聚酯或聚酯/纤维素混合物昂贵的价格限制了其在实验室中的应用。随后美国专利US20160266065也公开了一种基于N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)的蛋白转印缓冲液，Tricine的使用能够改善高离子强度缓冲液导致的高电流现象，从而明显降低转印过程中热量过高的问题。但是上述技术改进都是建立在半干式转印设备的基础上的，对于设备和经济的要求均较高。国内专利CN105866220A公开了一种基于牛磺酸的转膜缓冲液，通过使用具有较强缓冲能力的牛磺酸替代了常用的甘氨酸，从而缩短了蛋白转印的时间，降低了缓冲液的产热能力。但是在实验中还需要使用甲醇等有毒试剂。而专利CN110118872A改用了毒性较低的异丙醇替代了甲醇，不但能够有效地激活PVDF膜，而且对于小分子量蛋白的转膜效率有了很大的提高。但是遗憾的是该方法仅适用于小分子了蛋白的转膜，对于大分子蛋白的转膜效果明显降低。
因此有必要在上述研究的基础上，建立一种全新的具有更好适用性的蛋白印迹缓冲液，不但具有快速的转印速度，而且适用于各种不同大小分子量的蛋白转印的需要，同时还要尽可能的减少有毒试剂的使用。
发明内容
本发明的目的是建立一种具有良好兼容性的蛋白转印缓冲体系，能够改善现有蛋白转印缓冲液中小分子蛋白快速泳动，而大分子蛋白难以从凝胶中溶出的缺点，整体提高蛋白的泳动速度，增强蛋白质分子与硝酸纤维素膜(NC膜)或聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)的结合效率，并在此基础上替换常用的甲醇等有毒试剂，实现高效、快速、安全的蛋白转印。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
本发明涉及由一种或多种缓冲剂、肽类生化试剂以及一到两种有机溶剂组成的基本体系的缓冲系统，其特点是具有快速、高效的蛋白转印效果。能够适用于各种分子量的蛋白样品的转印实验，有效的提高蛋白印迹的实验效率。
本发明所涉及到的凝胶缓冲体系其原料均可通过工业化生产或采购获得，具有良好的经济性，可以满足大规模生产的需要。
在本发明所提及到的一种或多种缓冲剂的应用目的是保持蛋白转印的液体环境中pH的稳定性。它包括无机盐类缓冲剂和有机缓冲剂。在本发明中主要涉及的是有机缓冲剂，包括：三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸等试剂的一种或者几种，其中优选为三羟甲基氨基甲烷、三(羟甲基)甲基甘氨酸以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸。其中最优选为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
本发明所涉及到的肽类生化试剂主要是指由2个氨基酸构成的肽类制剂。其作用在于改善常规转印体系中的慢离子甘氨酸的缓冲能力，并提高转印缓冲体系中蛋白质分子的泳动速度。本发明所涉及到的肽类生化试剂通常是由两种相同的氨基酸构成的小肽，其中最优选的为两个甘氨酸构成的双甘肽。
本发明所涉及的有机溶剂包含一种或者两种由甲醇，乙醇，异丙醇以及DMSO等试剂构成的有机试剂。其作用是促进蛋白质分子与转印膜的结合，另一方面则是提高大分子量蛋白质从凝胶中的溶出效率。本发明所涉及的有机溶剂可以由单独的甲醇、乙醇、异丙醇或者DMSO构成，也可以由其中两种有机溶剂组合而成，例如：甲醇+DMSO；乙醇+DMSO；异丙醇+DMSO，或者甲醇+异丙醇；乙醇+异丙醇等组合方式。其中优选组合为乙醇+DMSO。
本发明中所涉及到的组成物的中缓冲剂的比例为1-200mM其中优选比例为5-50mM，进一步最优选比例为10-20mM。
本发明中所涉及的肽类生化试剂的比例为10-500mM，其中优选比例为50-200mM，进一步最优选为100-150mM。
本发明中所涉及的转印缓冲液中单独加入醇类有机溶剂的比例为1％-30％，其中优选比例为1％-20％，进一步最优选为1-10％。
本发明中所涉及的转印缓冲液中单独加入DMSO的比例为1％-10％，其中优选比例为1％-5％，进一步最优选为1-3％。
附图说明
图1：蛋白印迹“转膜三明治”示意图
图2：本发明转膜效果图
具体实施方式
实施例1：转印缓冲体系的制备
分别称量4-羟乙基哌嗪乙磺酸5g，双甘肽15g溶解到800ml去离子水后，NaOH调整pH到8.5，随后加入100ml的乙醇和10ml DMSO,搅拌充分混匀后，定溶至1000ml。
实施例2：蛋白电泳及转印实验
按照下表分别取SDS-PAGE凝胶制备试剂首先制备分离胶混合液，待混合均匀后灌入蛋白电泳制胶模具中，去离子水封上边后，室温放置30min待分离胶凝固。然后按下表继续配制浓缩胶，混合均匀后灌入分离胶上层并插入制胶梳。室温放置30-60min。
Figure BDA0002420901750000061
观察凝胶凝固后将其转移至电泳槽中，拔去制胶梳并加入TGS电泳缓冲液后加入蛋白样品并接通电源。约90min后完成电泳。拆卸凝胶，用去离子水漂洗3min后，将蛋白凝胶浸泡在实施例1制备的转印缓冲液中平衡15min。随后按照滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸的顺序制作转膜三明治(图1)，并连接转印装置，同时保证印迹膜的方向为正极，凝胶的方向为负极。接通电源400Mm条件下转膜10min。完成转膜后取出印迹膜与丽春红染色液中染色，并拍照。

Claims (11)

1.一种快速蛋白印迹缓冲液，其特征在于，所述的电泳缓冲液含有一种或多种缓冲剂，一种肽类生化制剂以及一到两种有机溶剂所构成。
2.根据权利要求1所述的缓冲剂，其特征在于，包含三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸等试剂的一种或者几种。
3.根据权利要求1所述的缓冲剂的应用，其特征在于，可以单独使用一种缓冲试剂，也可以两种或者三种缓冲试剂相互组合。
4.根据权利要求1所述的缓冲剂的浓度，其特征在于，缓冲剂在水溶液中的浓度在1-200mM之间。
5.根据权利要求1所述的肽类生化制剂，其特征在于，包含由2个相同氨基酸构成的肽类制剂，例如由两个甘氨酸构成的双甘肽。
6.根据权利要求1所述的有机溶剂，其特征在于，包含甲醇，乙醇，异丙醇以及DMSO的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的快速蛋白印迹缓冲液，其特征在于，由其制备的快速蛋白印迹缓冲液的pH范围在7.5-9.5之间。
8.根据权利要求5所述的肽类生化制剂的浓度范围，其特征在于，肽类生化制剂在水溶液中的浓度在1％-30％之间。
9.根据权利要求6所述的有机溶剂的存在形式，其特征在于，可以提前制备混合溶液的形式也可以在临用前加入。
10.根据权利要求6所述的醇类有机溶剂的浓度范围，其特征在于，醇类制剂在水溶液中的浓度在1％-30％之间。
11.根据权利要求6所述的DMSO有机溶剂的浓度范围，其特征在于，DMSO在水溶液中的浓度在1％-10％之间。
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