CN105399641A - 一种l-亮氨酸的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种L-亮氨酸的分离纯化方法，属于生物技术领域。本发明中的分离纯化方法包括如下步骤，将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤，调整超滤液的PH值和离子强度；将表面活性剂加入到有机溶剂中形成反胶团体系溶液，表面活性剂为AOT和DTDPA的混合液，浓度为0.03-0.06mol/L；将超滤液加入到反胶团体系溶液中进行错流萃取，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行逆流反萃取，反萃取后取水相进行纳滤、结晶、冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。本发明采用混合反胶团体系对L-亮氨酸进行萃取，萃取能力和分离效率高，反萃更加容易，所得L-亮氨酸的活性和纯度高，在萃取和反萃取时添加相应的助剂，提高萃取效率，萃取较完全，高效，节能，所得产品的活性和纯度高，水溶性好，易保存。

Description

一种L-亮氨酸的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及L-亮氨酸的分离纯化方法。

背景技术

L-亮氨酸(L-leucine)为人体和动物的必需氨基酸之一，同时也是三大支链氨基酸之一，是一种极其重要的生物化工产品，在医药、营养、化工、农药、化妆品等方面有着广泛的应用。L-亮氨酸的工业生产主要采用发酵法，这决定了分离纯化技术在其工业生产中的重要地位。L-亮氨酸现有的主要分离纯化技术包括:沉淀法、离子交换法和乳状液膜法。沉淀法沉淀剂回收困难，废液排放污染严重，残留沉淀剂可能存在毒性等等。离子交换法则会产生过量的再生废液，操作周期较长，耗盐量大。此外，有机物的存在会污染离子交换树脂，大量含盐废水的排出易引起管道腐蚀等等。液膜分离技术的研究开发尚处于试验阶段，要实现工业化，还必须解决诸如液膜溶胀、液膜稳定性和破乳工艺等关键问题。

反向微胶团萃取是从胶体或叫胶团萃取发展而来的。早期的关于反向微胶团的研究是针对水在反向微胶团的溶解,主要用于二次采油。进入80年代以后,研究的重点转向应用于蛋白质和其他生物大分子的分离。反向微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体,表面活性剂的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触,而极性头则排列在内形成极性核,极性核溶于水后就形成了“水池”。当含有氨基酸的水溶液与含反向微胶团的有机溶剂相混合时,氨基酸以带电离子状态进入反向微胶团的“水池”内或微胶团球粒的界面分子膜层内而被分离。如丁玉等在《反胶团法萃取分离L-亮氨酸的研究》(日用化学工业，2010年第40卷第5期)中使用AOT/异辛烷/H₂O反胶团体系萃取分离L-亮氨酸，优化了反应条件，但其萃取方法还有待改进，萃取效果还有待提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了分离效率高，产品纯度高的L-亮氨酸的分离纯化方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种L-亮氨酸的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括如下步骤：

将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤得超滤液，调整超滤液的PH值和离子强度；

将表面活性剂加入到有机溶剂中形成反胶团体系溶液，其中，表面活性剂在有机溶剂中的浓度为0.03-0.06mol/L，所述表面活性剂为AOT和DTDPA的混合液；

将调整后的超滤液加入到反胶团体系溶液中进行错流萃取，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行逆流反萃取，反萃取后取水相进行纳滤、结晶、冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。

本发明在进行分离纯化时先进行离心和超滤去除发酵液中的细胞碎片和蛋白质、核酸聚合物等大分子物质，这些物质不进入反胶团，使得反胶团能够循环利用，可以回收有机溶剂和表面活性剂

采用表面活性剂AOT和DTDPA与有机溶剂形成AOT/DTDPA混合反胶团体系对L-亮氨酸进行萃取，萃取能力优于传统单纯使用AOT反胶团体系进行提取，具有更高的分离效率，并且反萃时也更加容易。

决定L-亮氨酸萃取率的一个关键因素是表面活性剂的结构。阴离子表面活性剂AOT容易获得，具有双链，形成反胶团时可不用添加辅助表面活性剂且具有较好的强度；AOT的极性基团较小，所形成的反胶团空间较大，有利于L-亮氨酸分子的进入。但是AOT在使用时往往会在两相界面上形成不溶性凝胶物质，影响萃取效果。DTDPA为双子表面活性剂，具有独特的结构和优异的表面活性，其CMC值比传统的表面活性剂低1-3个数量级，形成反胶团的能力强，其疏水尾能紧密堆积在L-亮氨酸表面，与AOT配合使用可显著提高L-亮氨酸萃取率。并且DTDPA增加了萃取体系的抗无机盐能力，使L-亮氨酸在较高的离子强度下也能被萃取。适当的无机盐浓度有利于DTDPA的CMC值的降低，这可能是因为无机盐电解出的正电离子在溶液中不断趋近DTDPA带负电的亲水头基，使其负电作用范围和强度大卫缩小和减弱，导致DTDPA分子间的静电斥力大大减小，在分子热运动状态下更易缔合成胶团。AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液的浓度控制在上述范围内，是因为低于该浓度范围则不能形成反胶团，随着AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液浓度的增加，反胶团数目增加，能够增溶更多的L-亮氨酸，当浓度增加的上述范围的上限时，有机相达到饱和不能容解更多的AOT/DTDPA。萃取时采用错流萃取的方式进行，每级增加新鲜溶剂，萃取比较完全。反萃取时采用三级逆流萃取，有机相和水相的走向相反，只在最后一级加入水相，无需大量的水，所得L-亮氨酸的萃取液浓度较高，收率较高。所得L-亮氨酸萃取液通过纳滤、结晶、冷冻干燥的方式，制成纯化L-亮氨酸，整个过程安全、高效、节能，对L-亮氨酸的截留率搞，冷冻干燥方式所得产品的活性和纯度高，品相好，水溶性好。

作为优选，所述超滤液采用盐酸调节PH值至4.5-5.8，加入KCl或NaCl调节离子强度至0.35-0.75mol/L。

在表面活性剂AOT和DTDPA和有机溶剂异辛烷形成的混合反胶团体系中，表面活性剂AOT和DTDPA的极性头朝向反胶团的内部，反胶团的内壁带负电荷。L-亮氨酸是一种两性电解质，水相的PH值决定了L-亮氨酸的离子化程度。在PH值小于L-亮氨酸的等电点时，L-亮氨酸带正电荷，与AOT/DTDPA反胶团内所带负电荷的性质相反，由于静电引力，可使超滤液中的L-亮氨酸转移到反胶团中。另一方面，在酸性条件下，L-亮氨酸在水中的溶解度会增加，从而在AOT/DTDPA反胶团内部水环境里的溶解度也会增加。因此，PH值的降低有利于L-亮氨酸的反胶团萃取，但同时随着PH值的降低，H⁺浓度增大，必然导致H⁺与L-亮氨酸阳离子竞争结合AOT/DTDPA阴离子，从而不利于L-亮氨酸的萃取。另外，也为了提高萃取的L-亮氨酸的纯度，避免与L-亮氨酸等电点接近的其它氨基酸被同时萃取，将超滤液的PH值控制在上述范围内。

如前所述，DTDPA增加了萃取体系的抗无机盐能力，使L-亮氨酸在较高的离子强度下也能被萃取，但是离子强度不能无限增加。其原因在于，较高的离子强度会影响反胶团内壁的静电屏蔽的程度，降低L-亮氨酸分子与反胶团内壁的静电作用力。减小表面活性剂极性头之间的相互斥力，减小反胶团的W0值和反胶团尺寸，使立体性相互(排除)作用增大，从而降低L-亮氨酸在反胶团中的溶解性，甚至使已溶解的L-亮氨酸从反胶团中反萃取出来。另一方面，较多的K⁺、Na⁺与L-亮氨酸存在竞争效应，不利于L-亮氨酸进入到反胶团内部与AOT/DTDPA阴离子结合。

作为优选，所述反胶团体系溶液中表面活性剂AOT和DTDPA的摩尔比为(3-7)：2，所述有机溶剂为异辛烷。AOT和DTDPA的摩尔比在该比例范围内时，AOT和DTDPA的配合性好，分离效果好，萃取效率高。相比其他有机溶剂，AOT和DTDPA在异辛烷中能形成质量较好的反胶团。

作为优选，所述反胶团体系溶液中还含有占体系溶液8-13％v/v的助剂，所述助剂为乙醇、丙醇、异丙醇或异丁醇的一种或几种。

在AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液中添加上述助剂可以改变反胶团的大小，增加L-亮氨酸的溶解度，并且使反萃更加完全。

作为优选，所述反胶团体系溶液中还含有占体系溶液0.01-0.03％w/v的辛基-β-D-吡喃葡糖苷。

在反胶团体系溶液中引入了与L-亮氨酸具有亲和性的助剂辛基-β-D-吡喃葡糖苷，辛基-β-D-吡喃葡糖苷的极性头与L-亮氨酸具有较好的结合性，可大大提高L-亮氨酸的萃取率和选择性，而且扩宽了萃取时的PH值范围和离子强度范围。

作为优选，所述反胶团体系溶液中还含有占体系溶液0.08-0.22％v/v的THF。

在AOT/DTDPA混合反胶团体系中由于反胶团的数量和浓度都很大，相互之间容易发生聚积，影响L-亮氨酸进入反胶团内部，从而降低了L-亮氨酸的萃取率。因此，本发明在AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液内添加了适量的THF用以分散反胶团，并促进L-亮氨酸进入反胶团内部，加快L-亮氨酸的萃取，提高L-亮氨酸的萃取率。

作为优选，所述反萃取水相溶液为PH值为9.0-10.5，离子强度为1.5-2.3mol/L的KCl或NaCl的缓冲溶液。

当水相PH值大于等电点时，L-亮氨酸带负电荷，与AOT/DTDPA混合反胶团内部阴离子所带的负电荷产生静电斥力，溶入反胶团的L-亮氨酸反向萃取出来，实现L-亮氨酸的反萃取。较高的离子强度有助于降低L-亮氨酸分子与反胶团内壁的静电作用力，并且可替代L-亮氨酸与反胶团内部阴离子结合，从而促进反萃取的进行。

作为优选，KCl或NaCl的缓冲溶液中的缓冲剂选自磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠或乙酸-乙酸钠之一。

作为优选，反萃取水相溶液还含有0.01-0.03％w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷中的一种，

在反萃取水相溶液在水相中引入葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷等亲和性糖类作为自由配基，自由配基能与L-亮氨酸结合，减少L-亮氨酸与亲和助剂辛基-β-D-吡喃葡糖苷的复合物，使L-亮氨酸在有机相中的含量下降，增加L-亮氨酸在反萃取水相溶液中的配比，从而加快反萃取的速度和提高反萃取效率。

作为优选，所述错流萃取为三级错流萃取，错流萃取时超滤液和反胶团体系溶液的体积比为(4-11)：3。

萃取时采用三级错流萃取的方式进行，每级增加新鲜溶剂，萃取比较完全。

作为优选，所述逆流反萃取为三级逆流反萃取，逆流反萃取时有机相和反萃取水相溶液的体积比为7：(2-5)。

反萃取时采用三级逆流反萃取，有机相和反萃取水相溶液的走向相反，只在最后一级加入水相，无需大量的水，所得L-亮氨酸的萃取液浓度较高，收率较高。

作为优选，所述超滤的截留分子量为1000-2000，所述纳滤的截留分子量为200-300。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

采用AOT/DTDPA混合反胶团体系对发酵液中的L-亮氨酸进行萃取，有较高的萃取能力和分离效率，并且反萃取时也更加容易，所得L-亮氨酸的活性和纯度高。

在萃取和反萃取时添加相应的亲和助剂，提高萃取效率。在反胶团体系溶液中添加了THF能促进L-亮氨酸进入反胶团内部，加快L-亮氨酸的萃取，提高L-亮氨酸的萃取率。

采用错流萃取和逆流萃取相结合的方式，萃取较完全，采用纳滤的方式对萃取液进行浓缩，高效、节能，对L-亮氨酸的截留率高，所得产品的活性和纯度高，采用冷冻干燥方式进行干燥，所得产品含水量低，活性高，水溶性好，品相好，易保存。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

本发明中L-亮氨酸的分离纯化方法包括如下步骤，

将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤得超滤液，超滤的截留分子量为1000-2000，添加盐酸调整超滤液的PH值至4.5，加入KCl调节离子强度至0.35mol/L。

在异辛烷中加入表面活性剂AOT和DTDPA的混合液，AOT和DTDPA的摩尔比为3：2，并加入0.01％w/v的辛基-β-D-吡喃葡糖苷、0.08％v/v的THF和8％v/v的乙醇，制得表面活性剂浓度为0.03mol/L的AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液。

将NaCl、缓冲剂磷酸氢二钠-柠檬酸、0.01％w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷加入到纯水中制成PH值为9.0、离子强度为1.5mol/L的缓冲溶液，即反萃取水相溶液。

将超滤液加入到反胶团体系溶液进行三级错流萃取，超滤液和反胶团体系溶液的体积比为4：3，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行三级逆流反萃取，有机相和反萃取水相溶液的体积比为7：2，反萃取后取水相进行纳滤，纳滤截留分子量为200-300，结晶，冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。

实施例2

本发明中L-亮氨酸的分离纯化方法包括如下步骤，

将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤得超滤液，超滤的截留分子量为1000-2000，添加盐酸调整超滤液的PH值至4.8，加入NaCl调节离子强度至0.40mol/L。

在异辛烷中加入表面活性剂AOT和DTDPA的混合液，AOT和DTDPA的摩尔比为4：2，并加入0.02％w/v的辛基-β-D-吡喃葡糖苷、0.10％v/v的THF和10％v/v的丙醇，制得表面活性剂浓度为0.04mol/L的AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液。

将KCl、缓冲剂柠檬酸-柠檬酸钠、0.02％w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷加入到纯水中制成PH值为9.5、离子强度为1.8mol/L的缓冲溶液，即反萃取水相溶液。

将超滤液加入到反胶团体系溶液进行三级错流萃取，超滤液和反胶团体系溶液的体积比为6：3，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行三级逆流反萃取，有机相和反萃取水相溶液的体积比为7：3，反萃取后取水相进行纳滤，纳滤截留分子量为200-300，结晶，冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。

实施例3

本发明中L-亮氨酸的分离纯化方法包括如下步骤，

将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤得超滤液，超滤的截留分子量为1000-2000，添加盐酸调整超滤液的PH值至5.0，加入KCl调节离子强度至0.50mol/L。

在异辛烷中加入表面活性剂AOT和DTDPA的混合液，AOT和DTDPA的摩尔比为5：2，并加入0.03％w/v的辛基-β-D-吡喃葡糖苷、0.15％v/v的THF和11％v/v的异丙醇的一种或几种，制得表面活性剂浓度为0.05mol/L的AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液。

将NaCl、缓冲剂乙酸-乙酸钠、0.03％w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷加入到纯水中制成PH值为1.0、离子强度为2.0mol/L的缓冲溶液，即反萃取水相溶液。

将超滤液加入到反胶团体系溶液进行三级错流萃取，超滤液和反胶团体系溶液的体积比为8：3，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行三级逆流反萃取，有机相和反萃取水相溶液的体积比为7：4，反萃取后取水相进行纳滤，纳滤截留分子量为200-300，结晶，冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。

实施例4

本发明中L-亮氨酸的分离纯化方法包括如下步骤，

将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤得超滤液，超滤的截留分子量为1000-2000，添加盐酸调整超滤液的PH值至5.5，加入NaCl调节离子强度至0.60mol/L。

在异辛烷中加入表面活性剂AOT和DTDPA的混合液，AOT和DTDPA的摩尔比为6：2，并加入0.02％w/v的辛基-β-D-吡喃葡糖苷、0.20％v/v的THF和12％v/v的异丁醇，制得表面活性剂浓度为0.06mol/L的AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液。

将KCl、缓冲剂磷酸氢二钠-柠檬酸、0.02％w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷加入到纯水中制成PH值为10.0、离子强度为2.2mol/L的缓冲溶液，即反萃取水相溶液。

将超滤液加入到反胶团体系溶液进行三级错流萃取，超滤液和反胶团体系溶液的体积比为10：3，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行三级逆流反萃取，有机相和反萃取水相溶液的体积比为7：4，反萃取后取水相进行纳滤，纳滤截留分子量为200-300，结晶，冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。

实施例5

本发明中L-亮氨酸的分离纯化方法包括如下步骤，

将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤得超滤液，超滤的截留分子量为1000-2000，添加盐酸调整超滤液的PH值至5.8，加入NaCl调节离子强度至0.75mol/L。

在异辛烷中加入表面活性剂AOT和DTDPA的混合液，AOT和DTDPA的摩尔比为7：2，并加入0.03％w/v的辛基-β-D-吡喃葡糖苷、0.22％v/v的THF和13％v/v的异丁醇的一种，制得表面活性剂浓度为0.06mol/L的AOT/DTDPA混合反胶团体系溶液。

将NaCl、缓冲剂乙酸-乙酸钠、0.03％w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷加入到纯水中制成PH值为10.5、离子强度为2.3mol/L的缓冲溶液，即反萃取水相溶液。

将超滤液加入到反胶团体系溶液进行三级错流萃取，超滤液和反胶团体系溶液的体积比为11：3，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行三级逆流反萃取，有机相和反萃取水相溶液的体积比为7：5，反萃取后取水相进行纳滤，纳滤截留分子量为200-300，结晶，冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。

对比例1

分离纯化过程中的反胶团体系溶液中的表面活性剂为AOT，有机溶剂为异辛烷，AOT的浓度为0.03mol/L，其余均与实施例1相同。

对比例2

分离纯化过程中的反胶团体系溶液中未添加助剂辛基-β-D-吡喃葡糖苷和THF，其余均与实施例1相同。

对比例3

萃取和反萃取使用普通的液液萃取方法，浓缩干燥方法采用普通的浓缩干燥方法。

将本发明实施例1-5中的与对比例1-3中纯化L-亮氨酸进行比较，比较结果如表1所示。

表1实施例1-7中与比例1-3中纯化L-亮氨酸的比较

综上所述，本发明的分离纯化方法具有较高的萃取能力和分离效率，萃取效率和萃取率高，并且反萃取时也更加容易，所得L-亮氨酸的活性和纯度高，品相好，水溶性好，含水量低，易保存。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

将L-亮氨酸发酵液进行离心、超滤得超滤液，调整超滤液的PH值和离子强度；

将表面活性剂加入到有机溶剂中形成反胶团体系溶液，其中，表面活性剂在有机溶剂中的浓度为0.03-0.06mol/L，所述的表面活性剂为AOT和DTDPA的混合液；

将调整后的超滤液加入到反胶团体系溶液中进行错流萃取，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行逆流反萃取，反萃取后取水相进行纳滤、结晶、冷冻干燥，制得纯化L-亮氨酸。

2.根据权利要求1所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述超滤液采用盐酸调节PH值至4.5-5.8，加入KCl或NaCl调节离子强度至0.35-0.75mol/L。

3.根据权利要求1所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述表面活性剂中AOT和DTDPA的摩尔比为(3-7)：2，所述的有机溶剂为异辛烷。

4.根据权利要求1所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述反胶团体系溶液中还含有占体系溶液8-13％v/v的助剂，所述助剂为乙醇、丙醇、异丙醇或异丁醇的一种或几种。

5.根据权利要求1或4所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述反胶团体系溶液中还含有占体系溶液0.01-0.03％w/v的辛基-β-D-吡喃葡糖苷。

6.根据权利要求5所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述反胶团体系溶液中还含有占体系溶液0.08-0.22％v/v的THF。

7.根据权利要求1所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述反萃取水相溶液为PH值为9.0-10.5，离子强度为1.5-2.3mol/L的KCl或NaCl的缓冲溶液。

8.根据权利要求7所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述反萃取水相溶液还含有0.01-0.03％w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷中的一种。

9.根据权利要求1所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述错流萃取为三级错流萃取，错流萃取时超滤液和反胶团体系溶液的体积比为(4-11)：3。

10.根据权利要求1所述的L-亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述逆流反萃取为三级逆流反萃取，逆流反萃取时有机相和反萃取水相溶液的体积比为7：(2-5)。