CN103172542A

CN103172542A - 一种分离纯化l-瓜氨酸的方法

Info

Publication number: CN103172542A
Application number: CN2013100997754A
Authority: CN
Inventors: 董永胜
Original assignee: Shandong Institute of Light Industry
Current assignee: Shandong Institute of Light Industry
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: CN103172542B

Abstract

本发明涉及一种分离纯化L-瓜氨酸的方法，包括：（1）L-瓜氨酸发酵液离心、过滤，调节滤出液的pH值和离子强度；（2）配制反胶团体系溶液，配制反萃取水相溶液；（3）采用反胶团萃取体系进行萃取；（4）进行反萃取，得到L-瓜氨酸水溶液；（5）过滤，调节滤出液的pH值、冷却、结晶、离心、真空干燥，制得L-瓜氨酸产品。本发明可实现L-瓜氨酸分离的连续化、规模化，便于其工业化生产；可使L-瓜氨酸的分离纯化和浓缩同时进行，生产过程简便，L-瓜氨酸收得率高；并且分离纯化工艺简单、生产周期短、易于工程放大、萃取剂可循环使用、L-瓜氨酸的生产成本较低。

Description

一种分离纯化L-瓜氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化L-瓜氨酸的方法，特别涉及利用反胶团萃取体系分离纯化L-瓜氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-瓜氨酸（L-Citrulline）是一种非蛋白氨基酸，分子式C₆H₁₃N₃O₃、分子量175.19、熔点216～218℃，为无色柱状结晶，能溶于水，不溶于甲醇和乙醇。瓜氨酸最初是从西瓜中提取而来，所以命名为瓜氨酸。L-瓜氨酸具有很多重要的生理功能如清除自由基、异体排斥效应指示剂、血管舒张作用、稳定血压以及诊断类风湿关节炎、抗氧化等；此外，它还有着非常显著的恢复精力和提高人体免疫力的作用。近年来L-瓜氨酸在食品、化妆品和药物等领域越来越来受到重视，具有广泛的开发应用前景。

目前L-瓜氨酸的生产方法主要有植物提取法、酶转化法、发酵法和化学合成法。植物提取法由于植物中瓜氨酸的含量较低，并且受到季节、产地等因素的影响，提取瓜氨酸的成本较高，不利于大规模发展；化学合成法是在碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，产品中含有旋光对映体D-瓜氨酸，其影响产品质量，生产过程中产生大量废水，污染环境；发酵法是以葡萄糖为原料，利用微生物菌株发酵生产L-瓜氨酸，其具有原料来源广泛、生产成本低、产品纯度高的特点，但高产菌株的选育还需要进一步的研究；酶转化法是利用微生物菌体中的精氨酸脱亚胺酶催化L-精氨酸转化生成L-瓜氨酸，该方法生产工艺简单、产物浓度高，是一种生产瓜氨酸的最重要的方法。在L-瓜氨酸的生产成本构成中，分离纯化等下游工序的成本占有相当大的比例，因此，如何采用高效的分离技术是目前L-瓜氨酸生产中需要解决的技术问题。

目前L-瓜氨酸的分离纯化方法主要采用离子交换法和结晶沉淀法，如赵艳杰（北京化工大学硕士论文，2010）利用固定化粪链球菌生产L-瓜氨酸时，分离纯化瓜氨酸采用阳离子交换树脂交换吸附，用氨水洗脱，洗脱液减压蒸馏，乙醇洗涤结晶，得到的L-瓜氨酸纯度为98.4%、收率为86.4%。姚海峰（北京化工大学硕士论文，2008）利用微生物转化法生产瓜氨酸时，分离纯化瓜氨酸采用强碱性阴离子交换树脂吸附，用NaCl洗脱，蒸发浓缩后，用无水乙醇结晶，烘干，瓜氨酸的纯度为95.34%、收率为79.71%。中国专利文献CN200710120714.6A（申请号200710120714.6）和中国专利文献CN102220390A（申请号201010147697.7）采用阳离子交换树脂吸附，以氨水做洗脱剂，将洗脱液减压蒸馏脱氨，脱色，浓缩结晶，得L-瓜氨酸产品。上述L-瓜氨酸的分离纯化方法存在分离工艺复杂、生产周期较长、不能连续生产等问题，从而导致了L-瓜氨酸的生产成本较高。因此，为降低L-瓜氨酸的生产成本，改进现有生产技术以及开发新的生产技术势在必行。

反胶团萃取技术是一种新型的生物分离技术，是分离纯化生物活性物质的有效方法。反胶团是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的、内含微小水滴的、空间尺度仅为纳米级的集合型胶体，反胶团的微小界面和微小水相具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能和在疏水性环境中使亲水性大分子保持活性的功能。反胶团在生物分离过程中具有以下突出的优点：有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；分离和浓缩可同时进行，过程简便；能解决生物活性物质在非细胞环境中迅速失活的问题；易于放大和实现工业化生产；溶剂可反复使用，萃取成本低等。

在生化分离工程中形成反胶团体系常用的表面活性剂有阴离子型表面活性剂如AOT、阳离子型表面活性剂如CTAB以及非离子型表面活性剂，常用的非极性有机溶剂有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷等。琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）分子具有双链，形成反胶团时无需添加辅助表面活性剂且有较好的强度；且形成的反胶团空间较大，有利于生物大分子的进入。AOT与异辛烷等形成的反胶团体系在生化分离工程中应用较多，它们形成的反胶团体系结构简单而稳定，体积相对较大，适用于相对分子质量较小的蛋白质、核酸及氨基酸等的分离。因此，采用反胶团萃取技术可实现氨基酸的分离纯化，其生产成本较低，并能实现连续生产，具有很好的工业应用前景。目前还没有关于采用反胶团萃取技术分离纯化L-瓜氨酸的报道或专利。

发明内容

本发明针对目前L-瓜氨酸分离纯化方法的不足，提供一种工艺简单、生产成本低、便于规模化生产的L-瓜氨酸分离纯化的方法。

本发明的方法是利用反胶团萃取技术从发酵液中分离纯化L-瓜氨酸，从而达到降低生产成本、取得较好经济效果的目的。

为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

一种利用反胶团萃取体系分离纯化L-瓜氨酸的方法，包括以下步骤：

（1）将L-瓜氨酸发酵液离心去除杂质，制得离心液；在0.2～0.8MPa压力下，采用截留分子量为800～1200Dal的超滤膜将离心液过滤，用盐酸调滤出液的pH值为2.0～5.0，然后加入无机盐调节离子强度为0.10～0.30mol/L，制得含有L-瓜氨酸的溶液；

该步骤中离心可以去除菌体等杂质，超滤膜过滤可除去色素、蛋白、多糖等大分子杂质。

（2）在20～30℃下，将表面活性剂加入到有机溶剂中，配制表面活性剂浓度为50～70mmol/L的溶液，混合均匀，制得反胶团体系溶液；

取去离子水、氢氧化钠和无机盐配制pH值为8.0～11.0、离子强度为1.0～2.0mol/L的无机盐水溶液，制得反萃取水相溶液；

（3）将步骤（1）制得的含有L-瓜氨酸的溶液加入到步骤（2）制得的反胶团体系溶液中，反胶团体系溶液体积与含有L-瓜氨酸的溶液的体积比为1:（1～10），振荡5～15min混合均匀，萃取操作温度为15～30℃。在2000～3000r/min下离心3～6min进行分相，取有机相，制得含有L-瓜氨酸的反胶团有机溶液；

该步骤萃取过程中L-瓜氨酸进入到有机相溶液中的反胶团内部。

（4）向步骤（3）制得的含有L-瓜氨酸的反胶团溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液中，含有L-瓜氨酸的反胶团溶液与反萃取水相溶液的体积比为（1～10）:1，振荡5～30min混合均匀，萃取操作温度为20～35℃，在2000～3000r/min下离心3～6min进行分相，制得含有L-瓜氨酸的水溶液；

该步骤萃取过程中L-瓜氨酸由有机相溶液中的反胶团内部进入到水相溶液中。

（5）将步骤（4）制得的L-瓜氨酸的水溶液在0.2～0.8MPa压力下，经截留分子量为300～400Dal的纳米滤膜过滤，用盐酸调节滤出液的pH值为5.9～6.0，冷却至0～5℃结晶，离心分离结晶，60℃下真空干燥，制得L-瓜氨酸。

该步骤通过纳米滤膜将残留的表面活性剂去除，制得的L-瓜氨酸为白色粉末状产品。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的离心条件为：3000～5000r/min，离心10～20min。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的有机溶剂选自异辛烷、辛烷或环己烷之一。

根据本发明优选的，所述步骤（1）和步骤（2）中的无机盐选自氯化钾或溴化钾。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中表面活性剂为阴离子型表面活性剂，优选琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）。

有益效果

1、本发明的分离纯化方法相比于离子交换分离方法，可以实现L-瓜氨酸分离的连续化、规模化，便于L-瓜氨酸的工业化生产。

2、本发明采用反胶团萃取技术，可实现L-瓜氨酸的高效萃取和反萃取，并且其分离纯化和浓缩可同时进行，生产过程简便，L-瓜氨酸收得率高。

3、本发明的分离方法工艺简单，生产周期短，易于工程放大，萃取剂可循环使用，L-瓜氨酸的生产成本较低。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

本发明中L-瓜氨酸含量的测定采用分光光度法，步骤如下：

显色液的配制：向100mL丁二酮单肟溶液（丁二酮单肟含量为10g/L）中加入10mg氨基硫脲，然后加入200mL酸性含铁溶液，振荡摇匀。酸性含铁溶液由硫酸（浓度98wt%）、磷酸（浓度85wt%）和蒸馏水按体积比1：2：3混合成混合酸溶液，再向混合酸溶液中加入氯化铁（氯化铁含量为50mg/L）配制而成。

L-瓜氨酸标准溶液的配制：准确称取10mg L-瓜氨酸（纯度≥98%，购自Sigma公司），加蒸馏水配制成10mg/L的L-瓜氨酸液。准确吸取L-瓜氨酸液，加蒸馏水分别配制成0、50、100、150、200、250μg/L的L-瓜氨酸标准溶液。

标准曲线的制作：向25mL的加塞试管中依次加入6mL的L-瓜氨酸标准溶液和3mL显色液，振荡摇匀10s，在100℃的沸水浴中保持10min。在暗处冷却至室温，用752型分光光度计（购自上海光学仪器一厂）测定其在波长490nm处吸光度。空白对照用蒸馏水代替瓜氨酸溶液。以L-瓜氨酸（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，制作标准曲线。L-瓜氨酸含量的标准曲线的回归方程为：A=3.2042C+0.0016(R²=0.9988)其中：A为吸光度值，C为L-瓜氨酸浓度（mg/mL），R²为相关系数。

L-瓜氨酸含量测定：用蒸馏水将制得的L-瓜氨酸样品配成浓度为10mg/L的溶液，取6mL按标准曲线的制作步骤中的方法测定490nm的吸光度值，根据标准曲线计算L-瓜氨酸的质量。

L-瓜氨酸含量（%）=（L-瓜氨酸的质量/L-瓜氨酸样品的质量）×100%。

原料来源：琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）购自上海科兴商贸有限公司公司，异辛烷、辛烷、环己烷均购自天津市康科德科技有限公司。

实施例1

本实施例所用菌种为解烃棒杆菌（Corynebacterium hydrocarboclastus）ATCC21242，该菌种购自美国标准生物品收藏中心。

取菌种解烃棒杆菌（Corynebacterium hydrocarboclastus）ATCC21242接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中，32℃、150rpm摇床培养24h后，制得液体种子；然后按接种量10%接种于100mL发酵培养基中，在培养温度37℃、150rpm摇床培养36h，制得含有L-瓜氨酸的发酵液。

经检测L-瓜氨酸的含量为28.8g/L。

种子培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏5，蛋白胨5，精氨酸5，（NH₄）₂HPO₄2，KH₂PO₄2，MgSO₄1，MnSO₄1，pH值6.0。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖5，蛋白胨2，酵母膏2，精氨酸30，NaCl1，KH₂PO₄0.5，K₂SO₄0.5，MgSO₄0.2，MnSO₄0.1，pH值6.5。

（1）将L-瓜氨酸发酵液在4000r/min条件下离心15min，制得离心液；在0.3MPa压力下，采用截留分子量为1000Dal的超滤膜将离心液过滤，用盐酸调滤出液的pH值为2.0，使L-瓜氨酸滤出液的pH值小于其等电点（L-瓜氨酸的pI为5.92），此时L-瓜氨酸带正电荷，然后加入氯化钾调节离子强度为0.10mol/L，制得含有L-瓜氨酸的溶液；

（2）在25℃下，将琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）加入到200mL异辛烷中，配制AOT浓度为60mmol/L的溶液，混合均匀，使AOT均匀分布于异辛烷溶液中，制得澄清透明稳定的AOT-异辛烷反胶团体系溶液；

取去离子水、氢氧化钠和氯化钾配制pH值为11.0、离子强度为2.0mol/L的氯化钾水溶液200mL，制得反萃取水相溶液；

（3）将步骤（1）制得的含有L-瓜氨酸的溶液加入到步骤（2）制得的AOT-异辛烷反胶团体系溶液中，AOT-异辛烷反胶团体系溶液与含有L-瓜氨酸的溶液的体积比为1:1，振荡10min混匀，萃取操作温度为25℃，在2500r/min下离心5min进行分相，取有机相，制得含有L-瓜氨酸的反胶团有机溶液；

该步骤萃取过程中L-瓜氨酸进入到有机相溶液中的反胶团内部，因L-瓜氨酸在此条件下带正电荷，而AOT是阴离子型表面活性剂，其形成的反胶团内部带负电荷，由于静电引力作用，L-瓜氨酸能进入到AOT形成的反胶团内部的微小水池内。因异辛烷有机相溶液内反胶团中的微水相体积仅占有机相体积的百分之五，所以L-瓜氨酸也同时得到浓缩。

（4）向步骤（3）制得的含有L-瓜氨酸的反胶团溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液中，含有L-瓜氨酸的反胶团溶液与反萃取水相溶液的体积比为1:1，振荡10min混匀，萃取操作温度为30℃，在2500r/min下，离心5min进行分相，制得含有L-瓜氨酸的水溶液；

该步骤萃取过程中L-瓜氨酸由有机相溶液中的反胶团内部进入到水相溶液中，因反萃取水相溶液的pH大于L-瓜氨酸的等电点，L-瓜氨酸带负电荷，由于静电排斥作用，其不能溶解于反胶团中而释放到水溶液中，离子强度的增加也加强了反萃取作用。

（5）将步骤（4）制得的L-瓜氨酸的水溶液在0.2MPa压力下，经截留分子量为300Dal的纳米滤膜过滤，除去其中残留的AOT，收集滤出液。用盐酸调节滤出液的pH值为5.9，冷却至4℃结晶，离心分离结晶，在60℃下真空干燥，制得L-瓜氨酸2.56g。

经检测，L-瓜氨酸的纯度为98.2%。

实施例2

如实施例1所述的利用反胶团萃取体系分离纯化L-瓜氨酸的方法，不同之处在于：

步骤（1）中，向超滤膜过滤后的滤出液中加入盐酸，调节溶液的pH值为5.0；再加入氯化钾将溶液的离子强度调节为0.30mol/L，制得含有L-瓜氨酸的溶液。

步骤（2）中，AOT的浓度为50mmol/L。

步骤（2）中，用去离子水、氢氧化钠和氯化钾配制pH值为8.0、离子强度为1.0mol/L的氯化钾水溶液，制得反萃取水相溶液。

步骤（5）中，纳米滤膜过滤后，加入盐酸调节滤出液的pH值为6.0。

制得L-瓜氨酸2.45g，经检测，L-瓜氨酸的纯度为97.3%。

实施例3

步骤（3）中，将L-瓜氨酸溶液中加入到反胶团体系溶液，其混合液的体积比为：AOT-异辛烷反胶团溶液体积：L-瓜氨酸的溶液体积=1:2。

步骤（4）中，向含有L-瓜氨酸的反胶团溶液中加入反萃取水相溶液，混合液的体积比为：含有L-瓜氨酸的反胶团溶液的体积：反萃取水相溶液的体积=2:1。

制得L-瓜氨酸2.52g，经检测，L-瓜氨酸的纯度为98.1%。

实施例4

步骤（2）中，将琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）加入到环己烷溶液中，使AOT的浓度为60mmol/L。摇匀，得到澄清透明稳定的AOT-环己烷反胶团体系溶液。

制得L-瓜氨酸产品2.50g，经检测，L-瓜氨酸的纯度为97.6%。

实施例5

步骤（1）中，向L-瓜氨酸滤出液中加入溴化钾，将溶液的离子强度调节为0.10mol/L，制得含有L-瓜氨酸的溶液。

步骤（2）中，用去离子水、氢氧化钠和溴化钾配制pH值为11.0、离子强度为2.0mol/L的溴化钾水溶液，制得反萃取水相溶液

制得L-瓜氨酸产品2.54g，经检测，L-瓜氨酸的纯度为97.8%。

实施例6

如实施例2所述的利用反胶团萃取体系分离纯化L-瓜氨酸的方法，不同之处在于：

步骤（1）中，向L-瓜氨酸滤出液中加入溴化钾，将溶液的离子强度调节为0.30mol/L，制得含有L-瓜氨酸的溶液。

步骤（2）中，用去离子水、氢氧化钠和溴化钾配制pH值为8.0、离子强度为1.0mol/L的溴化钾水溶液，制得反萃取水相溶液

制得L-瓜氨酸产品2.46g，经检测，L-瓜氨酸的纯度为97.4%。

实施例7

步骤（2）中，将适量的琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）加入到辛烷溶液中，使AOT的浓度为60mmol/L。摇匀，得到澄清透明稳定的AOT-辛烷反胶团体系溶液。

制得L-瓜氨酸产品2.51g，经检测，L-瓜氨酸的纯度为98.1%。

Claims

1.一种利用反胶团萃取体系分离纯化L-瓜氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的离心条件为：3000～5000r/min，离心10～20min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的有机溶剂选自异辛烷、辛烷或环己烷之一。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中的无机盐选自氯化钾或溴化钾。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的表面活性剂为阴离子型表面活性剂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的表面活性剂为琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳。