CN104387443A

CN104387443A - 一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法

Info

Publication number: CN104387443A
Application number: CN201410689053.9A
Authority: CN
Inventors: 张彩猛; 华欲飞; 孔令知; 孔祥珍; 陈业明; 应玉桑
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-11-26
Also published as: CN104387443B

Abstract

一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，属于分离纯化技术领域。本发明利用复凝聚和离子交换原理，将带有相反电荷的蛋白质和聚电解质通过静电作用力形成电中性、不溶性的复合物；并用阳离子交换树脂吸附分离游离氨基酸。以所述废水为原料，选择天然阴离子多糖卡拉胶配制成溶液，并按一定比例加入到废水中；沉淀经过复溶、干燥处理得到马铃薯蛋白产品；上清液通过离子交换树脂分离得到高纯度的氨基酸液。本发明用卡拉胶回收了马铃薯蛋白质，避免了工业上的酸热处理，保留了回收蛋白质的功能性质。此外，游离氨基酸的回收率及氨基酸纯度较高，使含氮物质充分回收，具有较大的实用价值。

Description

一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及分离纯化技术领域，特别是一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法。

背景技术

随着我国马铃薯淀粉市场的需求不断增大，其产业发展的同时伴随着环境污染的问题。马铃薯淀粉加工废水中富含蛋白质，其必需氨基酸达总氨基酸含量的33%，蛋白氮含量约占总氮的1/3；非蛋白氮约占总氮的2/3，其中游离氨基酸含量约占75%。淀粉加工中产生的大量含氮废水会促使水体中杂菌的生长繁殖，进而导致水产养殖动物缺氧和死亡。因此，对马铃薯淀粉废水进行有效利用，具有很高的社会、经济和环保效益。

按分子量的不同可以将马铃薯蛋白质分为三大类：马铃薯糖蛋白，分子量为39-45kDa，等电点为4.5-5.2，占总蛋白的30%-40%；蛋白酶抑制剂，分子量为4-25kDa，，等电点在5.1-9.0，约占总蛋白的50%；其它高分子量蛋白约占10%-20%。马铃薯糖蛋白含有5%的中性糖和1%的氨基己糖，马铃薯糖蛋白是磷酸酶A₂，β-1,3-葡聚糖酶，β-1,2木糖苷酶，脂酰基水解酶和酰基转移酶等一系列蛋白质的总称。目前已知该蛋白具有预防心血管系统的脂肪沉积，保持动脉血管的弹性，还可以防止肝脏中结缔组织的萎缩，保持呼吸道和消化道的润滑等多种生理功能。蛋白酶抑制剂包括PI-2，PI-1，天冬氨酸蛋白酶抑制剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制剂，库尼兹型蛋白酶抑制剂和羧肽酶抑制剂七大类。其中PI-2含量最为丰富，由两个分子量为16.1kDa和4.1kDa的亚基通过二硫键连接。蛋白酶抑制剂具有抗癌，抗肿瘤和抗菌的作用，并具有胰蛋白酶抑制剂活性和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，还可以释放具有高度饱腹感的肠促胰酶肽，作为饥饿抑制剂用于减肥产品的开发。因此，马铃薯蛋白质在食品、医药和生物技术方面具有非常可观的应用前景。

马铃薯淀粉加工废水中游离氨基酸以天冬酰胺和谷氨酰胺所占含量最高，达到47%，两者很有希望应用于医学开发。初始氨基酸液中必需氨基酸含量约为22%，浓缩的混合氨基酸液具有潜在的药用价值，还可以作为营养增强剂，食品风味剂和工业发酵上的营养素。

卡拉胶由硫酸基化的或非硫酸基化的半乳糖和3，6-脱水半乳糖通过α-1，3糖苷键和β-1，4键交替连接而成。在环境pH低于马铃薯蛋白等电点的条件下，作为天然的阴离子型聚电解质，卡拉胶可与带正电的蛋白质通过静电作用力形成不溶性的复合物快速沉降，可用于处理含大量可回收蛋白质的废水。从而，卡拉胶复凝聚提供了一种沉淀马铃薯蛋白质的方法，此外，复凝聚回收条件温和，避免了工业上的酸热处理，保留了马铃薯蛋白的初始性质，为实现高附加值产品生产提供了有利的条件。

离子交换分离是利用离子交换树脂与溶液中的离子之间所发生的交换反应进行分离的方法。001×7苯乙烯树脂属于强酸性阳离子交换树脂，是在苯乙烯-二乙烯苯共聚基体上带有磺酸基（SO₃H）的离子交换树脂。将氨基酸液的pH调至强酸性范围，使得低于氨基酸的等电点，带正电的氨基酸吸附于离子交换树脂上，再用带相同电荷的离子进行交换而洗脱下来，苯乙烯树脂吸附容量大，氨基酸回收率高，所得到的洗脱液经浓缩脱氨即为高纯度的氨基酸液。

发明内容

本发明的目的是提供一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法。选用复凝聚法，利用天然多糖回收马铃薯淀粉废水中的蛋白质，避免了工业上的酸热处理，最大程度保留了蛋白质的功能性质，并选用离子交换树脂分离得到高纯度的氨基酸液。实现废水蛋白和游离氨基酸的回收利用，并减少了废水对环境造成的污染。

本发明的技术方案：一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，以马铃薯淀粉加工过程中产生的蛋白质废水为原料，选择天然阴离子多糖卡拉胶配制成一定浓度的溶液，按一定的蛋白/卡拉胶比例加入到废水中进行复凝聚，调节pH值，离心过滤，沉淀经过复溶、干燥处理，得到马铃薯蛋白产品；上清液以穿透体积过阳离子交换树脂，并用氨水洗脱，洗脱液经浓缩脱氨处理，得到高纯度的氨基酸液。

具体步骤如下：

（1）预处理：取马铃薯淀粉加工废水，0.45μm微孔滤膜过滤；备用；

（2）复凝聚：取卡拉胶，溶解于去离子水中，得到质量浓度为1%的卡拉胶溶液；取步骤（1）中预处理后的废水，在搅拌条件下按照蛋白︰卡拉胶质量比为5-2.5︰1添加卡拉胶溶液，用pH调节剂调节pH至3-4；搅拌10min，静置30min， 25℃下以2500-4000g的速度离心10-15min，过滤；所得沉淀为蛋白-卡拉胶复合物；

（3）氨基酸纯化：取步骤（2）中所得的上清液；调节pH至2.0-2.5，以穿透体积通过苯乙烯离子交换树脂，流速为1-3mL/min，待上样完全，用去离子水冲洗，至无紫外检测信号，带负点的剩余糖不被吸附而冲洗下来；用浓度0.5-2mol/L的氨水进行洗脱，出现氨基酸紫外检测信号开始收集洗脱液，至紫外检测信号低于最高峰85%-90%停止洗脱，有效减少洗脱体积和洗脱时间；所得洗脱液经过旋转蒸发（浓缩脱氨）处理后即得回收的氨基酸液；

（4）蛋白质干燥：取步骤（2）所得蛋白-卡拉胶复合物经复溶，在10-25Pa、-50~-65℃条件下真空冷冻干燥48-60h，即得回收的马铃薯蛋白产品。

采用Bradford法测定蛋白含量。

pH调节剂为0.1-4mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液。

采用茚三酮比色法测定游离氨基酸含量。

马铃薯废水中的蛋白回收率为97%-100%；马铃薯蛋白产品的纯度达到67%-75%，pH 7.0条件下溶解度为95%-98%，乳化活性为120-140m²/g，乳化稳定性为30-35min。

游离氨基酸的回收率为82%-92%，回收氨基酸液中天冬酰胺和谷氨酰胺含量达40%-43%，天冬氨酸和谷氨酸含量达21%-25%，氨基酸干基含量达到80%-90%，灰分含量3%-7%。

Tricine-SDS-PAGE蛋白组分分析法：

浓缩胶和分离胶的浓度分别为4%和16%，取一定量溶液与蛋白溶解液混合，加入1.5%体积的溴酚蓝，2%体积的巯基乙醇溶液，加热煮沸5min，待冷却后上样10-15μL，浓缩胶时电压设定在30mV，至分离胶界面时调至100mV，电泳跑完后，进行固定，染色，脱色并拍照。所得电泳图如图2所示。

蛋白完全回收后上清液组分分析：高效液相色谱法，柱子选用TSK Gel G2000，0.02%叠代钠溶液冲洗，流动相配置为乙腈︰水︰三氟乙酸=45︰55︰0.1，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，时间设定30min，进样量为20μL。所得分子量标准曲线为（R²=0.996），蛋白完全回收后上清液色谱图如图3所示，结果显示上清液中已无蛋白质，含有大量的氨基酸。

茚三酮比色游离氨基酸含量测定法：

a、0-0.3mmol/L的标准曲线的绘制：分别取0.3mmol/L的标准氨基酸（谷氨酸）溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4、2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD_570nm。空白对照为第1号试管，绘制得到的标准曲线如图4所示。

b、样品游离氨基酸含量测定：取稀释好的样品1mL，加入 1mL pH5.4、2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD_570nm。

游离氨基酸回收率的测定：初始氨基酸液按1:1体积加入15% TCA（w/v）沉淀，高速离心，通过茚三酮比色法测定初始清液的游离氨基酸含量C₀，调节初始溶液pH至2.0，穿透体积V₀进行上样，用氨水洗脱后得到的洗脱液进行浓缩脱氨处理，待脱氨完全，定容到体积V₁，测定氨基酸含量为C₁，则回收率w可以计算为

W（%）= C₀×V₀×100/（C₁×V₁）。

游离氨基酸回收的离子交换色谱如图5所示。

溶解性质测定：制备0.2%（w/v）浓度的蛋白溶液，称取定量蛋白溶于去离子水，充分搅拌，调节溶液pH至9.0，至沉淀完全溶解。将溶解好的蛋白溶液等量取8份，分别用0.1mol/L和1mol/L的盐酸调节pH为2，3，4，5，6，7，8，9。分别于3000 g离心15min，测定上清蛋白含量，计算出各个pH值下的蛋白溶解度，绘制溶解度随pH的变化曲线。

乳化性质测定：用分光光度法测定，包括乳化活性和乳化稳定性。先制备0.1%（w/v）、pH 7.0的蛋白溶液，0.1%（w/v）SDS溶液，乳化活性测定为取30mL蛋白溶液，加入10mL大豆油，28000 rpm高速剪切1 min，立即从底部取50μL于试管中，并开始计时，取5mL SDS溶液于试管，漩涡混匀后立即测定500nm下的吸光值，以SDS溶液为空白。乳化活性计算公式为EAI(m²/g)=2×2.303×A₀×D/(Ø×C×10000)。均质后0min测定的吸光值记为A₀，D为稀释因子（100），Ø为油部分体积含量（0.25），C为蛋白液初始浓度。

乳化稳定性测定选取记时开始后10min，从底部吸取50μL于试管中，取5mL SDS溶液于试管，漩涡混匀后立即测定500nm下的吸光值A₁，乳化稳定性计算公式为ESI(min)= A₀×10/(A₀- A₁)。

本发明的有益效果：

（1）完全回收了马铃薯淀粉废水中的蛋白质，大幅度减少了资源的浪费和污染。

（2）有效的保留了回收蛋白质的功能性质，获得高品质蛋白产品。

（3）所用试剂和方法相对简单，经济，实用性强。

（4）游离氨基酸回收率高，所得氨基酸液纯度较高，具有良好的实用价值。

附图说明

图1实施例工艺流程图。

图2不同比例下回收蛋白后上清液电泳图。

图3 蛋白质完全回收后上清液组分分析高效液相色谱图。

图4 0-0.3mmol/L的茚三酮比色法标准曲线图。

图5 游离氨基酸回收的离子交换色谱图。

具体实施方式

实施例1 对照例

（1）马铃薯淀粉加工废水的模拟：马铃薯彻底清洗，去皮，切块，称取600g，迅速加入到400mL，0.1%（w/v）的亚硫酸氢钠中防止褐变，在组织捣碎机中搅拌2min成泥浆状，所得的浑浊的废水静置30min。经3000g、30min、25℃离心收集上清液，废渣加入200mL上述溶液重新提取15min，离心，收集两次上清混合，得到马铃薯淀粉废水。Bradford法测定废水蛋白含量为1.60mg/mL。

（2）蛋白质分离：调节废水pH值为2.5，3000g、25℃离心15min，分离出上清液，测定蛋白含量为0.41mg/mL，得出蛋白质回收率为74.3%。

（3）蛋白质干燥：将沉淀物加水复溶，并持续搅拌，调节pH至7.0，采用真空冷冻干燥的方法进行干燥。

对照组酸沉所得干燥产品蛋白纯度为75.7%，pH 7.0的溶解度为85%，乳化活性为80m²/g，乳化稳定性为18min。

实施例2

（1）马铃薯淀粉加工废水的模拟：马铃薯彻底清洗，去皮，切块，称取900g，迅速加入到600mL，0.1%（w/v）的亚硫酸氢钠溶液中防止褐变，在组织捣碎机中搅拌2min成泥浆状，所得的浑浊的废水静置30min。经3000g、30min、25℃离心收集上清液，废渣加入300mL上述溶液重新提取15min，离心，收集两次上清混合，得到马铃薯淀粉废水。Bradford法测定废水蛋白含量为1.57mg/mL。

（2）复凝聚：向得到的废水取600mL按蛋白︰卡拉胶比例为5:1（w/w）加入一定体积1%（w/v）卡拉胶溶液，调节混合液pH至3.5，搅拌10min，静置30min，于3000g、15min、25℃离心过滤，上清测定蛋白含量为0.03mg/mL，计算得蛋白回收率为97.6%。

（3）氨基酸纯化：上清液测定游离氨基酸含量21.52mmol/L，调节pH至2.0，取5mL通过苯乙烯离子交换树脂，流速为2mL/min，待上样完全，用去离子水冲洗至无氨基酸检测信号，用2mol/L的氨水进行洗脱，待出现氨基酸检测信号开始收集洗脱液，所得洗脱液经过浓缩脱氨处理，得到回收的氨基酸液，定容至100mL，测定氨基酸含量为0.93mmol/L，计算得氨基酸回收率为86.4%。回收氨基酸液中天冬酰胺和谷氨酰胺含量达42.6%，天冬氨酸和谷氨酸含量达23.4%，氨基酸干基含量达到86.2%，灰分含量5.7%。

（4）蛋白质干燥：采用真空冷冻干燥的方法对所得样品溶液进行干燥，得到马铃薯蛋白质产品。

其中蛋白质纯度为74.3%，pH 7.0下溶解度为97%，乳化活性为122m²/g，乳化稳定性为30.5min。

实施例3

（1）马铃薯淀粉加工废水的模拟：马铃薯彻底清洗，去皮，切块，称取600g，迅速加入到400mL，0.1%（w/v）的亚硫酸氢钠中防止褐变，在组织捣碎机中搅拌2min成泥浆状，所得的浑浊的废水静置30min。经3000g、30min、25℃离心收集上清液，废渣加入200mL上述溶液重新提取15min，离心，收集两次上清混合，得到马铃薯淀粉废水。Bradford法测定废水蛋白含量为1.54mg/mL。

（2）复凝聚：向得到的废水取600mL按蛋白︰卡拉胶比例为2.5:1（w/w）加入一定体积1%（w/v）卡拉胶溶液，调节混合液pH至3.0，搅拌10min，静置30min，于3000g、15min、25℃离心过滤，上清测定蛋白含量为0mg/mL，计算得蛋白回收率为100%。

（3）氨基酸纯化：上清液测定游离氨基酸含量21.43mmol/L，调节pH至2.0，取5mL通过苯乙烯离子交换树脂，流速为2ml/min，待上样完全，用去离子水冲洗至无氨基酸检测信号，用2mol/L的氨水进行洗脱，待出现氨基酸检测信号开始收集洗脱液，所得洗脱液经过浓缩脱氨处理，得到回收的氨基酸液，定容至100mL，测定氨基酸含量为0.91mmol/L，计算得氨基酸回收率为84.9%。回收氨基酸液中天冬酰胺和谷氨酰胺含量达42.1%，天冬氨酸和谷氨酸含量达24.0%，氨基酸干基含量达到87.2%，灰分含量6.1%。

其中蛋白质纯度为68.1%，pH 7.0下溶解度为97%，乳化活性为124m²/g，乳化稳定性为31.3min。

Claims

1.一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，其特征在于：以马铃薯淀粉加工过程中产生的蛋白质废水为原料，选择天然阴离子多糖卡拉胶配制成一定浓度的溶液，按一定的蛋白/卡拉胶比例加入到废水中进行复凝聚；复凝聚所得的蛋白-卡拉胶复合物经过复溶、干燥，得到马铃薯蛋白产品；上清液通过阳离子交换树脂分离得到高纯度的氨基酸液；

具体步骤如下：

（3）氨基酸纯化：取步骤（2）中所得的上清液；调节pH至2.0-2.5，以穿透体积通过苯乙烯离子交换树脂，流速为1-3mL/min，待上样完全，用去离子水冲洗，至无紫外检测信号，带负电的剩余糖不被吸附而冲洗下来；用浓度0.5-2mol/L的氨水进行洗脱，出现氨基酸紫外检测信号开始收集洗脱液，至紫外检测信号低于最高峰85%-90%停止洗脱，有效减少洗脱体积和洗脱时间；所得洗脱液经过旋转蒸发浓缩脱氨处理后即得回收的氨基酸液；

2.根据权利要求1所述一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，其特征在于：采用Bradford法测定蛋白含量。

3.根据权利要求1所述一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，其特征在于：pH调节剂为0.1-4mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液。

4.根据权利要求1所述一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，其特征在于：采用茚三酮比色法测定游离氨基酸含量。

5.根据权利要求1所述一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，其特征在于：马铃薯废水中的蛋白回收率为97%-100%；马铃薯蛋白产品的纯度达到67%-75%，pH 7.0条件下溶解度为95%-98%，乳化活性为120-140m²/g，乳化稳定性为30-35min。

6.根据权利要求1所述的一种从马铃薯淀粉加工废水中高效回收蛋白质和游离氨基酸的方法，其特征在于：游离氨基酸的回收率为82%-92%，回收氨基酸液中天冬酰胺和谷氨酰胺含量达40%-43%，天冬氨酸和谷氨酸含量达21%-25%，氨基酸干基含量达到80%-90%，灰分含量3%-7%。