CN109520949A - 一种测定沼液中游离氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定沼液中游离氨基酸的方法，本发明通过简单高效的分析方法以及确定最佳的反应条件，使实验分析准确、灵敏、快速、重复性和稳定性好，以期为沼液中氨基酸组成的进一步研究以及沼液的开发与利用提供理论依据。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种测定沼液中游离氨基酸的方法，属于成分分析和环境资源再利用领域。
(二)背景技术
随着社会的高速发展，人民生活水平不断提高，对于肉制品的需求也也来越大，促使畜禽养殖业朝着集约化、规模化发展，而这势必会畜禽废水产生量激增，这类含有高浓度COD、氨氮的畜禽废水给传统的生物处理法提出了极大的挑战。其中较为典型的是养猪废水，一方面该类废水成分复杂、散发恶臭，如果不经处理直接排放，将带来一定的环境风险，另一方面这类废水中富含氮磷等植物生长所需要的多种元素及物质，因而对养猪废水进行无害化和资源化处理是当前水处理的难点和热点。因此，为了满足养猪废水无害化和资源化的要求，亟需要开发新的可靠性好、效应高、成本低的污水净化处理技术，借鉴国内外经验，厌氧消化是养猪废水目前最合理的无害化处理手段。
研究人员在这几十年来针对沼液利用已经开发出了农用肥料、饲料添加剂和复合杀虫剂等产品。然而原料不同、季节不同导致了产生的沼液成分相差很大，给沼液产品加工带来了较大的困难，因而对不同批次沼液成分的分析就显得尤为重要，而氨基酸作为沼液中主要的活性物质，确定其含量对于沼液产品的开发利用意义重大。目前，有关沼液中氨基酸含量的测定分析方法还未公开。因此，确定沼液中氨基酸含量的测定分析方法可为沼液成分分析和进一步开发利用提供理论支持。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种准确、灵敏、可重复性和稳定性俱佳的沼液中氨基酸的测定方法，从而为沼液成分分析和进一步开发利用提供理论支持。
本发明的技术方案如下：
一种测定沼液中游离氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)样品处理
取沼液，离心，将上清液用0.22μmPTFE滤膜过滤，再调节pH至10.0～10.4，之后加入到单口圆底烧瓶中旋蒸至干，用超纯水重新溶解，超声促溶，得到脱除氨和挥发性生物有机胺的沼液浓缩液，备用；
所述沼液与超纯水的质量比为1：0.1～0.5；
(2)配制茚三酮溶液、0.06585-0.32925g/L的异亮氨酸标准溶液、pH＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
所述茚三酮溶液的配制方法为：称取水合茚三酮(纯度≥99％)0.6g，用15mL正丙醇(分析纯)、30mL正丁醇(分析纯)、60mL乙二醇(分析纯)溶解，再加入9mL醋酸-醋酸钠缓冲液；
所述异亮氨酸标准溶液的配制方法为：首先取异亮氨酸(ACS级)溶于超纯水中，配制0.1317g/100mL的异亮氨酸母液，再用水稀释配制成0.06585-0.32925g/L的异亮氨酸标准溶液；
所述醋酸-醋酸钠缓冲液的配制方法为：取11.55mL冰醋酸(分析纯)用超纯水稀释至1000mL得0.2M醋酸溶液，取16.4g无水醋酸钠(分析纯)溶解到1000mL超纯水中得0.2M醋酸钠溶液，取所得醋酸溶液6.8mL和醋酸钠溶液43.2mL，混匀后用超纯水稀释至100mL，得到醋酸-醋酸钠缓冲溶液，pH＝5.5；
(3)标准溶液测定并建立标准曲线
取异亮氨酸标准溶液5mL于25mL具塞比色管中，加入0.5-1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液、0.5-1mL茚三酮溶液、0.5-1mL 0.1％抗坏血酸(分析纯)溶液，于100-120℃下水浴加热15-20min，取出用流动的自来水迅速冷却至室温(20～30℃)，然后用超纯水定容至25mL刻度线，上下颠倒混匀，静置10～15min，于570nm处测定其吸光度，以吸光度为横坐标、异亮氨酸标准溶液的浓度为纵坐标，绘制标准曲线；
(4)样品测定
取步骤(1)准备好的沼液浓缩液1mL于25mL具塞比色管中，加入0.5-1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液、0.5-1mL茚三酮溶液、0.5-1mL 0.1％抗坏血酸(分析纯)溶液，于100-120℃下水浴加热15-20min，取出用流动的自来水迅速冷却至室温(20～30℃)，然后用超纯水定容至25mL刻度线，上下颠倒混匀，静置10～15min，在570nm波长下测其吸光度，将所得吸光度值代入步骤(3)所得标准曲线，计算获得沼液样品中氨基酸的含量。
本发明中用到的茚三酮是一种用于检测氨或者一级胺和二级胺的试剂。当与这些游离氨基酸反应时，能够产生深蓝色或者紫色的物质，叫做Ruhemann紫。
反应式如下：
本发明的有益效果在于：本发明所提供的一种沼液中游离氨基酸的测定方法，通过简单高效的分析方法以及确定最佳的反应条件，使实验分析准确、灵敏、快速、重复性和稳定性好，以期为沼液中氨基酸组成的进一步研究以及沼液的开发与利用提供理论依据。
(四)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
(1)样品处理
取40mL沼液于50mL塑料离心管中，离心(8000rpm，4℃，15min，离心3次)，取上清液过滤(0.22μmPTFE滤膜)，再用1mol/L的NaOH溶液调节pH至10.2，之后加入到单口圆底烧瓶中，在40℃、80rmp下旋蒸至干，用5mL超纯水重新溶解，超声促溶5min，得到脱除高浓度氨和挥发性生物有机胺的沼液浓缩液5mL，备用；
(2)配制茚三酮溶液、异亮氨酸标准溶液、醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
所述茚三酮溶液的配制方法为：称取水合茚三酮(纯度≥99％)0.6g，用15mL分析纯正丙醇、30mL分析纯正丁醇、60mL分析纯乙二醇溶解，再加入9mL醋酸-醋酸钠缓冲液；
所述异亮氨酸标准溶液的配制方法为：首先取异亮氨酸溶于水中，配制0.1317g/100mL的异亮氨酸母液，再用水稀释配制成0.06585-0.32925g/L的异亮氨酸标准溶液；
所述醋酸-醋酸钠缓冲液的配制方法为：取11.55mL分析纯冰醋酸用超纯水稀释至1000mL得0.2M醋酸溶液，取16.4g分析纯无水醋酸钠溶解到1000mL超纯水中得0.2M醋酸钠溶液，取所得醋酸溶液6.8mL和醋酸钠溶液43.2mL，混匀后用超纯水稀释至100mL，得到醋酸-醋酸钠缓冲溶液，pH＝5.5；
(3)标准溶液测定并建立标准曲线
取异亮氨酸标准溶液5mL于25mL具塞比色管中，加入1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液、1mL茚三酮溶液、1mL 0.1％抗坏血酸(分析纯)溶液，用纱布包住比色管塞子，防止喷出，于100℃下水浴加热15min，取出后立即用流动的自来水迅速冷却2min至室温，然后用超纯水定容至25mL刻度线，上下颠倒混匀，静置10min，于570nm处测定其吸光度，以吸光度为横坐标、异亮氨酸标准溶液的浓度为纵坐标，绘制标准曲线；
得到标准曲线为：氨基酸浓度(mmol/L)＝0.0029*吸光度-2.90*10-4
(4)样品测定
取25mL洗净、干燥比色管6支，标号1，2，3，4，5，6，其中1，2，3号比色管各加入1mL超纯水作为空白对照组，4，5，6号比色管各加入沼液浓缩液1mL；每支比色管加入pH＝5.50醋酸-醋酸钠缓冲液1mL，新配制茚三酮试剂1mL，0.1％抗坏血酸溶液1mL，用纱布包住比色管塞子,防止喷出，放入100℃沸水中准确水浴15min，水浴结束后，迅速用流动的自来水冷却2min至室温(20℃)，加水至25mL刻度线，上下颠倒混匀，静置10min，在570nm波长下测其吸光度，将所得吸光度值代入步骤(3)所得标准曲线，计算获得沼液样品中氨基酸的含量。
(5)对所取的沼液样品进行氨基酸检测，进行10次平行试验，含量如下表：
平均值：0.42158mM，RSD％＝1.1786％
本申请实施例精密量取所述异亮氨酸对照品溶液，与待测品同法操作，以获得回收率。在此，对得到预处理的对照品的过程不作赘述。经测试，回收率为84.96％。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种测定沼液中游离氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)样品处理
取沼液，离心，将上清液用0.22μmPTFE滤膜过滤，再调节pH至10.0～10.4，之后旋蒸至干，用超纯水重新溶解，得到脱除氨和挥发性生物有机胺的沼液浓缩液，备用；
(2)配制茚三酮溶液、0.06585-0.32925g/L的异亮氨酸标准溶液、pH＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
(3)标准溶液测定并建立标准曲线
取异亮氨酸标准溶液5mL于25mL具塞比色管中，加入0.5-1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液、0.5-1mL茚三酮溶液、0.5-1mL 0.1％抗坏血酸溶液，于100-120℃下水浴加热15-20min，取出用流动的自来水迅速冷却至室温，然后用超纯水定容至25mL刻度线，上下颠倒混匀，静置10～15min，于570nm处测定其吸光度，以吸光度为横坐标、异亮氨酸标准溶液的浓度为纵坐标，绘制标准曲线；
(4)样品测定
取步骤(1)准备好的沼液浓缩液1mL于25mL具塞比色管中，加入0.5-1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液、0.5-1mL茚三酮溶液、0.5-1mL0.1％抗坏血酸溶液，于100-120℃下水浴加热15-20min，取出用流动的自来水迅速冷却至室温，然后用超纯水定容至25mL刻度线，上下颠倒混匀，静置10～15min，在570nm波长下测其吸光度，将所得吸光度值代入步骤(3)所得标准曲线，计算获得沼液样品中氨基酸的含量。
2.如权利要求1所述测定沼液中游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述沼液与超纯水的质量比为1：0.1～0.5。
3.如权利要求1所述测定沼液中游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述茚三酮溶液的配制方法为：称取水合茚三酮0.6g，用15mL正丙醇、30mL正丁醇、60mL乙二醇溶解，再加入9mL醋酸-醋酸钠缓冲液。
4.如权利要求1所述测定沼液中游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述异亮氨酸标准溶液的配制方法为：首先取异亮氨酸溶于超纯水中，配制0.1317g/100mL的异亮氨酸母液，再用水稀释配制成0.06585-0.32925g/L的异亮氨酸标准溶液。
5.如权利要求1所述测定沼液中游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的配制方法为：取11.55mL冰醋酸用超纯水稀释至1000mL得0.2M醋酸溶液，取16.4g无水醋酸钠溶解到1000mL超纯水中得0.2M醋酸钠溶液，取所得醋酸溶液6.8mL和醋酸钠溶液43.2mL，混匀后用超纯水稀释至100mL，得到醋酸-醋酸钠缓冲溶液，pH＝5.5。
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