CN108195785A - 一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，包括以下步骤：（1）制备还原性茚三酮；（2）配置显色剂：利用茚三酮和还原性茚三酮配制显色剂；（3）制作标准曲线：取氨基酸标准溶液加入具塞试管中，分别补加水至2.0mL，然后分别加入显色剂3.0mL、缓冲溶液2.5mL，在沸水浴中反应20min，取出后在冰水浴中冷却10min，用85%乙醇溶液定容至10mL，用分光光度计检测在570nm处的吸光度，以氨基酸浓度为X值，吸光度为Y值，制作标准曲线；（4）样品检测：将待测样品用水稀释，取2.0mL，按照标准曲线的制作方法，测定吸光度。本发明提供的方法，操作简单，准确度高，重复性好，回收率在100%左右。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸检测技术领域，具体涉及一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法。
背景技术
氨基酸是一种动植物体内非常重要的组成部分，我国作为农业大国，这几年新型肥料大规模研制销售，氨基酸肥料作为一种高效，高利用率的肥料每年生产几百万吨，用于国内农业生产以及出口欧美等国。氨基酸水溶肥料中氨基酸具有改善土壤环境，增强植物果实口感、促进植物对营养元素吸收的优点，国家对于氨基酸水溶肥料的产品有明确标准（NY 1429-2010），因此检测氨基酸含量的多少是评价氨基酸水溶肥料的重要指标。
传统的实验室测定氨基酸含量方法主要为两种，一种是氨基酸自动分析仪，一种为柱前衍生-液相色谱仪法测定氨基酸含量，这两种方法具备测定所有氨基酸种类和含量的特点，但是这两种方法都具备测定样品前处理时间长，衍生物稳定性差，所需仪器昂贵的特点，检测人员技术能力要求较高，检测成本高，对于大部分氨基酸生产厂家来说，往往不具备这样的条件。
现有在实验室中，经常使用紫外法检测氨基酸含量，紫外检测氨基酸含量具有简单快捷的特点。比如，中国专利CN 103989733 A公开了鸡骨草中游离氨基酸的提取方法，并对其进行了检测，使用紫外分光光度计，以茚三酮溶液为显色剂进行氨基酸检测，但是标准曲线的相关系数较小，一般只能达到0.95左右，影响检测结果的准确性。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种紫外法检测游离氨基酸的方法，结果可靠，准确性高。
氨基酸肥料厂家基本上都以酱油发酵液作为肥料氨基酸的主要来，发酵液中的游离氨基酸主要包括谷氨酸，甘氨酸等八种氨基酸，其中以谷氨酸和甘氨酸比例最高，所以，本发明以谷氨酸与甘氨酸的混合物作为标准，来衡量氨基酸肥料中的总游离氨基酸。
一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，包括以下步骤：
（1）制备还原性茚三酮：将按照料液比1:25将茚三酮加入水中，在100℃下加热溶解，得到黄色溶液A；按照料液比1:50将维生素C溶于50℃的水中，得到维生素溶液；按照体积比2:1将所述维生素C溶液滴加至所述黄色溶液A中，边滴加边搅拌，持续15min，冷却至4℃后静置0.5h，用水洗涤3次后过滤，烘干，即得到还原性茚三酮；
（2）配置显色剂：按照质量比4:1将茚三酮和还原性茚三酮混合，加入95%的乙醇溶液中，得到质量浓度为2%的溶液，然后在4℃下静置12h，得到显色剂；
（3）制作标准曲线：分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0mL的0.5mg/mL的氨基酸标准溶液，加入具塞试管中，分别补加水至2.0mL，然后分别加入显色剂3.0mL、缓冲溶液2.5mL，在沸水浴中反应20min，取出后在冰水浴中冷却10min，用85%乙醇溶液定容至10mL，然后用分光光度计检测在570nm处的吸光度，并在20min内完成检测；以氨基酸浓度为X值，吸光度为Y值，制作标准曲线；
（4）样品检测：将待测样品用水稀释，取2.0mL，然后按照标准曲线的制作方法，测定其在570nm处的吸光度，然后对照标准曲线查出对应的氨基酸浓度；
其中，所述缓冲溶液为pH=6.5的磷酸二氢钾缓冲液。
优选地，步骤（3）中氨基酸标准溶液为谷氨酸和甘氨酸的标准品混合溶液，其中，谷氨酸和甘氨酸的质量比为7:3。
优选地，步骤（1）中所述烘干干燥的条件为在110℃下烘干干燥。
4. 根据权利要求1所述的一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾缓冲液的制备方法如下：取磷酸二氢钾0.68g，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即可。
步骤（2）配置的显色剂的有效保存期限为1周。
所述待测样品为氨基酸水溶肥料。
本发明的优点：
本发明提供的方法，操作简单，准确度高，重复性好，回收率在100%左右，适合实验室检测。
附图说明
图1 实施例1的标准曲线。
图2 对比例1的标准曲线。
具体实施方式
氨基酸标准品谷氨酸和甘氨酸均来自中国计量科学研究研究院国家标准物质中心，含量 100%；待测样品氨基酸水溶肥料来自陕西上格之路生物科学有限公司；紫外可见分光光度计型号为 Lamb6500（PerkinElmer 公司）。
实施例1
一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，包括以下步骤：
（1）制备还原性茚三酮：将按照料液比1:25将茚三酮加入水中，在100℃下加热溶解，得到黄色溶液A；按照料液比1:50将维生素C溶于50℃的水中，得到维生素溶液；按照体积比2:1将所述维生素C溶液滴加至所述黄色溶液A中，边滴加边搅拌，持续15min，冷却至4℃后静置0.5h，用水洗涤3次后过滤，在110℃下烘干干燥，即得到还原性茚三酮；
（2）配置显色剂：按照质量比4:1将茚三酮和还原性茚三酮混合，加入95%的乙醇溶液中，得到质量浓度为2%的溶液，然后在4℃下静置12h，得到显色剂；
（3）制作标准曲线：氨基酸标准溶液为谷氨酸和甘氨酸的标准品混合溶液，谷氨酸和甘氨酸的质量比为7:3，分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0mL的0.5mg/mL的氨基酸标准溶液，分别补加水至2.0mL，然后分别加入显色剂3.0mL、缓冲溶液2.5mL，在沸水浴中反应20min，取出后在冰水浴中冷却10min，用85%乙醇溶液定容至10mL，然后用分光光度计检测在570nm处的吸光度，并在20min内完成检测；以氨基酸浓度为X值，吸光度为Y值，制作标准曲线，如图1；
（4）样品检测：将待测样品氨基酸水溶肥料用水稀释，取2.0mL，然后按照标准曲线的制作方法，测定其在570nm处的吸光度，然后对照标准曲线查出对应的氨基酸浓度，然后按照稀释倍数计算出氨基酸含量；
其中，所述缓冲溶液为pH=6.5的磷酸二氢钾缓冲液，制备方法如下：取磷酸二氢钾0.68g，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液15.2mL，用水稀释至100mL，即可。
制作标准曲线时，各浓度对应的吸光度值如下：
利用EXCELL将表中数据进行线性拟合，拟合后所得标准曲线为：Y=0.3485X+0.0129，相关系数 R2=0.9991。
根据 GB/T 27404-2008 实验室规范中，对于测定样品室所筛选的标准曲线相关系数应不低于 0.98，所测试方法数据才具有参考性。
对比例1
显色剂为质量浓度为2%的茚三酮乙醇溶液，制备方法为：将2.0克茚三酮加入100mL95%乙醇溶液中，得到得到质量浓度为2%的溶液，然后在4℃下静置12h，得到显色剂；
其他步骤同实施例1。
数据如下：
利用 EXCELL将表中数据进行线性拟合，拟合后所得标准曲线为： Y=0.3124X-0.024，其中线性相关系数为 R2=0.9556，见图2。
一．准确性检测
1.准确性
待测样品，氨基酸水溶肥料；
按照 NY/T 1429-2010 测得游离氨基酸的含量为11.1%。
按照实施例1和对比例1的方法进行检测，结果见表1。
表1 待测样品的检测结果
由表1可知，实施例1中，实验结果显示其平均值为 11.0，各项数据相对标准偏差为1.2%；而对比例1中，实验结果显示平均值仅为9.9相对偏差3.5%。相比于实施例1，对比例1中由于所使用茚三酮溶液，没有加还原性茚三酮，导致茚三酮与氨基酸反应过程中，一部分具有还原性中间体在高温条件下被氧化，导致中间体无法与茚三酮完全反应，致使检测含量偏低，同时中间体的不稳定性导致相对偏差较大。
2. 回收率：
精密称取水溶肥料样品，溶解稀释至0.40mg/mL，分别取 9份稀释后的待测样品2mL放置于 10mL 的具塞试管中，分别加入 2mg/mL的标准溶液 0.1mL、0.2mL、0.3mL，每个体积重复进行3次，按实施例1和对比例1的方法进行检测吸光度，计算实际检测量和回收率。
实际标准品检出量是指扣除样品自身所含游离氨基酸浓度，稀释后样品本身浓度为 0.4mg/mL。
回收率实验结果如表2。
表2 回收率实验结果
由表2可知，实施例1中，平均回收率为101.3%，实验结果具有较好的重现性，该实验结果能满足日常生产的需求；
而对比例1中，平均回收率为84.3%，实验结果显示回收率偏低，检测结果不能完全反应样品情况。
3. 对不同批次的待测样品进行检测
分别取2各不同批次的氨基酸水溶肥料，按照实施例1和对比例1的方法分别进行检测5次，结果见表3。
待测样品的实际值分别为10.70、11.07。
表3 不同批次的待测样品的检测结果
由表3可知，采用实施例1的方法，两个不同批次平均值分别为：10.62、10.95，样品对标准偏差分别为：1.1%，1.2%；绝对差值为0.29、0.33 ，满足一般实验室测定的误差不超过0.5%的要求；而对比例1中，两个不同批次的含量分别为9.31、9.62，样品标准偏差分别为4.4、3.8， 不同实验数据绝对差值分别为0.94、0.87。实施例1中测试结果与实际值相对误差分别为：0.74%、1.1%，对比例1中两个不同批次的相对误差分别为：12.99%、10.40%，对比例1中数据准确度严重偏大。
Claims (4)
1.一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备还原性茚三酮：将按照料液比1:25将茚三酮加入水中，在100℃下加热溶解，得到黄色溶液A；按照料液比1:50将维生素C溶于50℃的水中，得到维生素溶液；按照体积比2:1将所述维生素C溶液滴加至所述黄色溶液A中，边滴加边搅拌，持续15min，冷却至4℃后静置0.5h，用水洗涤3次后过滤，烘干，即得到还原性茚三酮；
（2）配置显色剂：按照质量比4:1将茚三酮和还原性茚三酮混合，加入95%的乙醇溶液中，得到质量浓度为2%的溶液，然后在4℃下静置12h，得到显色剂；
（3）制作标准曲线：分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0mL的0.5mg/mL的氨基酸标准溶液，加入具塞试管中，分别补加水至2.0mL，然后分别加入显色剂3.0mL、缓冲溶液2.5mL，在沸水浴中反应20min，取出后在冰水浴中冷却10min，用85%乙醇溶液定容至10mL，然后用分光光度计检测在570nm处的吸光度，并在20min内完成检测；以氨基酸浓度为X值，吸光度为Y值，制作标准曲线；
（4）样品检测：将待测样品用水稀释，取2.0mL，然后按照标准曲线的制作方法，测定其在570nm处的吸光度，然后对照标准曲线查出对应的氨基酸浓度；
其中，所述缓冲溶液为pH=6.5的磷酸二氢钾缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：步骤（3）中氨基酸标准溶液为谷氨酸和甘氨酸的标准品混合溶液，其中，谷氨酸和甘氨酸的质量比为7:3。
3.根据权利要求1所述的一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述烘干干燥的条件为在110℃下烘干干燥。
4.根据权利要求1所述的一种水溶肥料中游离氨基酸的检测方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾缓冲液的制备方法如下：取磷酸二氢钾0.68g，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液15.2mL，用水稀释至100mL，即可。
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| CN114184607A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-15 | 中国科学院青海盐湖研究所 | 一种基于茚三酮的十八胺含量的测定体系、方法和应用 |
| CN114384033A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-04-22 | 苏州西热节能环保技术有限公司 | 一种测量锅炉飞灰中氨基含量的方法 |
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2017
- 2017-12-28 CN CN201711454997.8A patent/CN108195785A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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