CN104497157A - 一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银耳多糖的提取及纯化方法，包括：将银耳粉碎，加水浸泡，打浆，加混合酶进行酶解，然后将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；固液分离，浓缩；乙醇静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；银耳胞内多糖沉淀物加水,超声波辅助溶解，上D101树脂进行层析；最后将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，合并洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。本发明可以实现银耳多糖提取的连续化、规模化生产；极大提高了银耳多糖的产率及纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，属于生化工程技术领域。
背景技术
银耳（Tremella）, 生于温带和亚热带地区, 是有隔担子菌亚纲银耳科银耳的子实体, 又称白木耳。作为一种珍贵的食用菌和重要药材, 银耳平甘无毒, 滋阴、润肺、养胃、生津,治疗肺热咳嗽、胃炎、大便下血、痢疾、面部面斑、癌症肿瘤等病症。
银耳多糖具有广泛的药理学作用。调节机体免疫功能是许多多糖的主要药理学作用之一, 是多糖的共性。
人体肠胃道非免疫系统主要为内源微生物群。这些正常微生物是人体胃肠道中不可缺少的组成部分, 通常又分为有益微生物(如双歧杆菌属、乳酸杆菌属)和有害微生物群(如产气荚膜梭菌属、葡萄球菌属)。有益微生物菌群通常覆盖在胃肠道黏膜上皮表面, 阻止病原微生物在肠道黏膜组织上的定植。据目前的研究结果来看银耳多糖可能具有果寡糖、甘露寡糖、木糖的类似作用, 能直接到达后肠作为双歧杆菌和乳酸杆菌特异性的营养物质, 促进肠道理想微生物菌群的形成, 增强人体对外源性病原菌的抵抗能力, 改善肠道的健康状况, 起到提高人体非免疫防御系统的作用。研究表明, 银耳多糖能增强小鼠机体体液免疫。银耳多糖可增强正常小鼠及改善免疫功能低下小鼠的体液免疫功能。银耳多糖-Fe (Ⅲ)配合物能减缓膜的脂质过氧化反应和抑制邻苯三酚自氧化产生的氧自由基对红细胞膜的损伤, 起到对细胞膜的保护作用。银耳多糖可明显促进正常小鼠和部分肝切除小鼠的肝脏蛋白质及核酸合成, 且银耳多糖可优先促进损伤肝脏的修复。银耳多糖亦可通过促进核酸及蛋白质的合成、增加肝微粒体细胞色素P-450 含量、增强机体免疫功能而发挥抗衰老作用。银耳多糖可明显降低高脂血症大鼠血清游离胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、β-脂蛋白含量, 降低高胆固醇血症小鼠总胆固醇含量, 并可预防小鼠高胆固醇血症的形成。银耳多糖具有明显的抗血栓形成作用。银耳多糖可对抗环磷酰胺引起的小鼠骨髓微核率增加, 同时还可防止受照射动物的淋巴细胞染色体发生畸变。银耳多糖对中枢神经系统、呼吸系统、血液系统及心、肝、肾等均无毒性作用, 不影响小鼠的生殖能力和幼仔的成活率。银耳多糖亦不会引起急、慢性中毒, 无三致作用, 属无毒性物质。
目前银耳多糖的提取方法常用的有热水浸提法、酸提取法、碱浸提法等。酸、碱的添加对提取过程中已溶银耳多糖的结构有一定的破坏。银耳多糖提取液黏度的大小与其浓度的大小成正比, 即提取液的浓度越大, 其黏度也越大;热力对银耳多糖的结构有一定的破坏作用, 提取液的温度越高, 其黏度越小;酸碱性的改变会导致提取液中银耳多糖的分解, 使其提取液的黏度下降。
银耳多糖无甜味, 易溶于热水。银耳多糖的种类较多, 其中大多数是以α-(1 , 3)连接的甘露糖为主链, 目前分为五大类, 分别为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类。最具代表性的是银耳酸性杂多糖，其结构是以α-甘露聚糖为主链, 以β-(1 , 2)L-木糖、β-(1 , 2)葡萄糖醛酸和少量的岩藻为侧链, 其分子中有典型的乙酰基结构。
银耳多糖属于大分子物质，其分子量较大，而且它的理化性质及生物活性较为复杂。目前对于银耳多糖的研究的一个非常重要的方面就是银耳多糖的分子量及其分布，而银耳多糖的分子量又与其理化性质及活性存在着一定的关系，且它也是多糖类药物的一个重要参数。由于分子量较大的多糖活性、结构较为复杂，所以银耳多糖的提取及纯化至关重要，提取不当或纯化不当，银耳多糖很容易失去活性。
发明目的
本发明提供一种高效提取分离银耳多糖的方法，既提高银耳多糖的得率同时保持多糖的生物活性。
发明内容
一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，包括以下步骤：
（1）将银耳粉碎至40～60目，加20～40倍水浸泡1～2h，打浆；向打浆液中加入混合酶，30～40℃条件下搅拌酶解1.5～2.5 h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩倍数为提取液体积的1/6～1/8，优选1/7；提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加10～15倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为20～30min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。
步骤(1)中所述的混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为200-500u/ml, 蛋白酶的酶活为5-10 万u/g。
进一步地：
步骤（1）中所述的银耳与水的比例为1:30~1:35，优选1:32。
步骤（1）中所述的循环超声提取条件为：温度30~35℃，优选35℃；超声功率为500~1000W，优选900W；循环搅拌转速500~1000 rpm，优选800rpm；占空比1:2; 超声提取时间2.5~3.5h，优选3h。
步骤（2）中浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩。
步骤（4）中所述的DEAE纤维素树脂为DE52或DE32中的一种，优选DE52。
步骤（5）中所述的洗脱液的干燥方式为冷冻干燥或喷雾干燥。银耳多糖的干燥方式为喷雾干燥的最优条件为：进风温度160~200℃，优选180℃；出风温度为70~100℃，优选90℃；进料固形物含量为50~80%，优选60%。银耳多糖的干燥方式为冷冻干燥的最优条件为：冷冻温度-20 ~ -80℃, 优选 -40℃； 固形物含量为70~90%，优选80%。
本发明的优点在于：
1. 酶解过程将银耳细胞壁进行消化，细胞壁变薄，银耳多糖在超声波的作用下可以很快进入提取液中。
2. 循环超声提取较普通热水提取银耳多糖具有效率高，能耗低，多糖纯度高等优点。
3. 经过优化筛选，D101树脂最适宜对银耳多糖进行纯化，经过超声波的提取联合D101树脂纯化，银耳多糖纯度可达95%以上。
附图说明
图 1 为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
（1）将银耳粉碎至40目，加40倍水浸泡1h，打浆；向打浆液中加入混合酶，混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为500u/ml, 蛋白酶的酶活为5u/g； 40℃条件下搅拌酶解1.5h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；循环超声提取条件为：温度35℃；超声功率为500W，循环搅拌转速1000 rpm，占空比1:2; 超声提取时间2.5h。
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩，浓缩倍数为提取液体积的1/6，提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加15倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为20min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。DEAE纤维素树脂为DE52。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。银耳多糖的干燥方式为喷雾干燥的最优条件为：进风温度200℃，出风温度为100℃；进料固形物含量为50%。
银耳多糖的得率为11.23%，多糖纯度为95.2%。
实施例2
（1）将银耳粉碎至60目，加20倍水浸泡2h，打浆；向打浆液中加入混合酶，混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为500u/ml, 蛋白酶的酶活为5u/g； 40℃条件下搅拌酶解1.5h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；循环超声提取条件为：温度35℃；超声功率为500W，循环搅拌转速800rpm；占空比1:2; 超声提取时间2.5h。
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩，浓缩倍数为提取液体积的1/8，提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加10倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为30min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。DEAE纤维素树脂为DE32。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。银耳多糖的干燥方式为喷雾干燥的最优条件为：进风温度160℃，出风温度为70℃，进料固形物含量为50%。
银耳多糖的得率为12.51%，多糖纯度为96.3%。
实施例3
（1）将银耳粉碎至30目，加35倍水浸泡1.5h，打浆；向打浆液中加入混合酶，混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为300u/ml, 蛋白酶的酶活为7 万u/g；35℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；循环超声提取条件为：温度32℃，超声功率为600W，循环搅拌转速800 rpm；占空比1:2; 超声提取时间3h。
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩，浓缩倍数为提取液体积的1/7；提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加14倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为25min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。DEAE纤维素树脂为DE52。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。银耳多糖的干燥方式为喷雾干燥的最优条件为：进风温度180℃，出风温度为90℃；进料固形物含量为60%。
银耳多糖的得率为13.51%，多糖纯度为95.6%。
实施例4
（1）将银耳粉碎至60目，加28倍水浸泡1h，打浆；向打浆液中加入混合酶，混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为400u/ml, 蛋白酶的酶活为8 万u/g； 40℃条件下搅拌酶解2.5 h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；循环超声提取条件为：温度35℃；超声功率为900W；循环搅拌转速700 rpm；占空比1:2; 超声提取时间3h。
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩，浓缩倍数为提取液体积的1/7；提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加10倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为20min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。DEAE纤维素树脂为DE52。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。银耳多糖的干燥方式为喷雾干燥的最优条件为：进风温度170℃；出风温度为95℃，进料固形物含量为60%。
银耳多糖的得率为12.98%，多糖纯度为96.1%。
实施例5
（1）将银耳粉碎至55目，加35倍水浸泡2h，打浆；向打浆液中加入混合酶，混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为400u/ml, 蛋白酶的酶活为7 万u/g；35℃条件下搅拌酶解 2.4h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；循环超声提取条件为：温度 35℃；超声功率为670W；循环搅拌转速850 rpm，占空比1:2; 超声提取时间3.5h。
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩，浓缩倍数为提取液体积的1/7；提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加10倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为25min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。DEAE纤维素树脂为DE52。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。银耳多糖的干燥方式为冷冻干燥的最优条件为：冷冻温度-20℃； 固形物含量为80%。
银耳多糖的得率为13.56%，多糖纯度为96.7%。
实施例6
（1）将银耳粉碎至55目，加35倍水浸泡1h，打浆；向打浆液中加入混合酶，混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为400u/ml, 蛋白酶的酶活为6 万u/g；35℃条件下搅拌酶解1.5 h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；循环超声提取条件为：温度30℃，超声功率为700W，循环搅拌转速600 rpm，占空比1:2; 超声提取时间3.4h。
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩，浓缩倍数为提取液体积的1/6；提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加10倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为30min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。DEAE纤维素树脂为DE52。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。银耳多糖的干燥方式为冷冻干燥的最优条件为：冷冻温度-80℃, 固形物含量为90%。
银耳多糖的得率为12.31%，多糖纯度为95.7%。
实施例7
（1）将银耳粉碎至33目，加32倍水浸泡2h，打浆；向打浆液中加入混合酶，混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为400u/ml, 蛋白酶的酶活为6 万u/g； 40℃条件下搅拌酶解1.5 h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；循环超声提取条件为：温度30 ℃， 超声功率为600W， 循环搅拌转速 1000 rpm， 占空比1:2; 超声提取时间2.7h。
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩，浓缩倍数为提取液体积的1/7；提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加10倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为30min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液。DEAE纤维素树脂为DE32。
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖。银耳多糖的干燥方式为冷冻干燥的最优条件为：冷冻温度-20， 固形物含量为60%。
银耳多糖的得率为11.23%，多糖纯度为95.5%。
实施例8 采用热水提取银耳多糖的对比试验
按照实施例1的步骤进行，所不同的是步骤（1）提取步骤不同。将银耳粉碎至40目，加40倍水浸泡1h， 80℃条件下搅拌提取1.5h。其与步骤相同。
银耳多糖的得率为8.27%，多糖纯度为62.8%。
实施例9采用热水提取银耳多糖的对比试验
按照实施例2的步骤进行，所不同的是步骤（1）提取步骤不同。将银耳粉碎至60目，加20倍水浸泡1h， 90℃条件下搅拌提取2.5h。其与步骤相同。
银耳多糖的得率为7.42%，多糖纯度为72.5%。
银耳多糖的抗氧化实验效果：
（1）银耳多糖清除羟自由基效果实验
利用H2O2与Fe2+混合产生OH在体系内加入水杨酸捕捉OH并产生有色物质， 该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol/L H2O2 1ml，9mmol /LFeSO4 1mL，9mmol/L水杨酸-乙醇1ml，不同浓度的多糖溶液1ml最后加H2O2启动反应，37℃反应0.5小时， 以蒸馏水为参比，在510nm 下测量各浓度的吸光度。考虑到多糖本身的吸收光值，以9 mmol /L FeSO4 1ml，9mmol/L 水杨酸-乙醇1ml，不同浓度的多糖溶液1ml和1ml蒸馏水作为多糖的本底吸收值。清除率计算公式为:
清除率(%) =[ (A0 -(AX -AXO )) /A0 ] ×100%
式中:A0为空白对照液的吸光度;AX为加入多糖溶液后的吸光度;AXO为不加显色剂H2O2多糖溶液本底的吸光度。
（2 ）银耳多糖清除超氧阴离子自由基(O2- ) 效果实验
取4.5mL，pH8.2，50mmol/L Tris-HCl缓冲液，4.2m l蒸馏水. 混匀后在25℃水浴中保温20m in， 取出后立即加入在25℃预热过的3mmol邻苯三酚0.3ml(以10mmol/LHCl配制， 空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液)， 迅速摇匀后倒入比色杯， 325nm 下每隔10s测定吸光度， 计算线性范围内每分钟吸光度的增加。
抑制率(%)=[ (△AO -△A) /△AO ] ×100%
式中:△AO 为邻苯三酚的自氧化速率;△A 为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率。
表1实施例1制备所得银耳多糖清除自由基的测定
表2实施例2-7制备所得银耳多糖清除自由基的效果平均值
表3实施例8制备所得银耳多糖清除自由基的测定
表4实施例9制备所得银耳多糖清除自由基的测定
从表1-表4实验效果可以看出，按照本发明制备的银耳多糖具有较强的抗氧化作用，而一般热水提取制备的银耳多糖抗氧化效果远低于本发明制备的多糖。
以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将银耳粉碎至40～60目，加20～40倍水浸泡1～2h，打浆；向打浆液中加入混合酶，30～40℃条件下搅拌酶解1.5～2.5 h，酶解结束后，将混合渣液置于循环超声提取机中进行提取；
（2）循环超声提取结束后，固液分离，上清液进行浓缩；浓缩倍数为提取液体积的1/6～1/8，优选1/7；提取液浓缩后加85%乙醇进行静置沉淀，得银耳胞内多糖沉淀物；
（3）银耳胞内多糖沉淀物加10～15倍去离子水,采用超声波辅助溶解，超声波功率为100W,超声时间为20～30min，溶解液上D101树脂，采用去离子水进行层析；
（4）将层析液过DEAE纤维素树脂进行分离，洗脱至流出液检测不到多糖停止洗脱，合并洗脱液；
（5）将洗脱液进行浓缩干燥，得纯化后的银耳多糖，
步骤(1)中所述的混合酶为纤维素酶与蛋白酶的混合物,二者比例为纤维素酶:蛋白酶=2:1, 纤维素酶的酶活为200-500u/ml, 蛋白酶的酶活为5-10 万u/g。
2. 如权利要求1所述的一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的银耳与水的比例为1:30~1:35，优选1:32。
3. 如权利要求1所述的一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的循环超声提取条件为：温度30~35℃，优选35℃；超声功率为500~1000W，优选900W；循环搅拌转速500~1000 rpm，优选800rpm；占空比1:2; 超声提取时间2.5~3.5h，优选3h。
4. 如权利要求1所述的一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于：步骤（2）中浓缩方式可采用真空减压浓缩或膜浓缩。
5. 如权利要求1所述的一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的DEAE纤维素树脂为DE52或DE32中的一种，优选DE52。
6. 如权利要求1所述的一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的洗脱液的干燥方式为冷冻干燥或喷雾干燥。
7. 如权利要求6所述的一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于：银耳多糖的干燥方式为喷雾干燥的最优条件为：进风温度160~200℃，优选180℃；出风温度为70~100℃，优选90℃；进料固形物含量为50~80%，优选60%。
8. 如权利要求6所述的一种银耳胞内多糖分离、纯化的方法，其特征在于：银耳多糖的干燥方式为冷冻干燥的最优条件为：冷冻温度-20 ~ -80℃, 优选 -40℃； 固形物含量为70~90%，优选80%。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |