CN101619098A - 反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，该方法工艺简单，蛋白质变性程度大大减小，蛋白提取率高，表面活性剂的损失显著降低；节约水资源，并降低工业生产中的能耗。所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法为：用反胶束溶液提取菜籽蛋白，得到前萃液，前萃液经真空浓缩，除去反胶束溶液中的有机溶剂后加入缓冲溶液，萃取分离，得到菜籽蛋白的水溶液。用反胶束溶液提取菜籽蛋白的方法如下：将菜籽粕粉加入反胶束溶液中，在超声波作用下进行萃取，然后经固液分离得到前萃液。所述所述真空浓缩的方法为旋转蒸发，水浴温度控制在50～70℃。本发明工艺简单，节约资源，生产成本低，操作条件温和，蛋白质提取率高。

Description

反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法

技术领域

本发明涉及一种反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法。

背景技术

油菜是我国大面积生产的一种油料作物，产量居世界第一位。菜籽油加工过程中产生的副产品量巨大，仅菜籽粕产量，每年就超过1000万吨。菜籽粕中含有35％～42％的粗蛋白质，并且菜籽蛋白中赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高，氨基酸平衡优于大豆蛋白，是一种植物蛋白来源。

目前以菜籽或菜籽粕为原料，生产菜籽蛋白的方法主要有水相法，水相酶解法，有机溶剂萃取，超滤、渗滤法等方法。水相法在工业生产中往往蛋白提取率较低，还有废水不易处理，易造成环境污染等问题；水相酶解法虽然提高了菜籽蛋白的提取率，但降低某些蛋白功能性质和营养价值；用醇、酮等有机溶剂制备菜籽蛋白的方法，因工艺复杂、成本高以及溶剂对蛋白质营养价值的影响等问题；而超滤、渗滤法生产的料液中含有蛋白质、果胶等大分子物质，超滤膜膜面或膜孔很容易被污染，导致超滤膜的处理能力下降甚至不能工作，而且污染后的清洗工作也相当繁杂，致使超滤技术在工业上的推广和应用受到极大的限制。

国内外研究者在不段地探索新的蛋白分离技术。反胶束萃取就是在这一背景下发展起来的新型高效分离技术【李祥村，贺高红，反胶束萃取蛋白技术的新进展[J].水处理技术，2005.31(1)7-12.】。许多研究表明反胶束萃取技术作为一项新型的分离技术，在分离提纯生物活性物质方面有很大的优势。反胶束是表面活性剂在有机溶剂中自发形成的纳米尺度的一种聚集体，在反胶束中，表面活性剂的极性基团部分围成一个极性核心，称为水池，这个水池包括表面活性剂的极性基团内表面和其中的水分，以及溶解于水中的离子等，具有亲水性的生物大分子就可以溶解于水池中的水分而被以胶束的形式萃取出来。反胶束的一个重要参数是它的含水量W₀，即水池中溶入的水与表面活性剂的摩尔比，它决定反胶束的尺寸。据报道生物活性物进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有生物活性物的反胶束，此反胶束扩散进入有机相，从而实现了萃取分离，此过程称为前萃。

对于反胶束法提取方法而言，通过前萃工艺得到前萃液固然重要，然而从前萃液中将目标产物分离出来同样重要，这个过程通常称之为后萃。以往的后萃方法一般是将反胶束溶液和缓冲溶液接触，调节溶液的pH值、离子强度等因素，使蛋白质转入水相，实现后萃。

但是采用传统的后萃方法，一般是用缓冲溶液消耗量大，浪费大量水资源，使反胶束提取蛋白质的显著优势被掩盖，在后期还要蒸发大量水分，耗费电能；而且，在传统的后萃过程中，两相界面上会产生一种白色复合物。这是因为在后萃过程中，蛋白质会与表面活性剂作用，变性失活，沉淀在两相的界面上。这样，不仅导致蛋白质提取率低，同时也造成表面活性剂的大量损失。

发明内容

本发明提供一种反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，该方法工艺简单，蛋白质变性程度大大减小，蛋白提取率高，表面活性剂的损失显著降低；节约水资源，并降低工业生产中的能耗。

所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法为：用反胶束溶液提取菜籽蛋白，得到前萃液，前萃液经真空浓缩，除去反胶束溶液中的有机溶剂后加入缓冲溶液，萃取分离，得到菜籽蛋白的水溶液。

由于先采用真空浓缩的方式除去前萃液中的绝大部分有机溶剂，然后加入缓冲溶液得到后萃液，进行后萃，采用该方法，后萃过程中蛋白质变性程度大大减小，表面活性剂的损失显著降低；由于预先除去了绝大部分有机溶剂，只需加入少量的缓冲溶液即可实现后萃过程，不仅蛋白质后萃率高，而且节约水资源，降低后续蛋白质浓缩环节中的能耗，生产成本大大降低。

用反胶束溶液提取菜籽蛋白的方法如下：将菜籽粕粉加入反胶束溶液中，在超声波作用下进行萃取，然后经固液分离得到前萃液。

作为优选方案，所述反胶束溶液由丁二酸二异辛酯磺酸钠(CAS登记号：577-11-7，以下简称气溶胶OT)、有机溶剂和含K⁺的缓冲溶液混合而成，有机溶剂为异辛烷，所述反胶束溶液中，气溶胶OT的用量为0.01～0.20g/mL，优选为0.01～0.10g/mL，W₀为10～35，优选为15～35，缓冲溶液pH值为5～11，K⁺浓度不大于0.3mol·L^-1，优选不大于0.2mol·L^-1。所述缓冲溶液优选为KCl的缓冲溶液，更优选为KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液。

菜籽粕粉的加入量优选为0.001～0.20g/mL异辛烷。菜籽粕粉的菜籽原料可以是普通油菜籽也可以是双低油菜籽)。可以将工业上通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得菜籽粕粉；也可以将菜籽脱壳、风选后粉碎，再脱油、干燥后得到菜籽粕粉。

作为优选方案，在20～70℃下，在超声波作用下进行萃取40～150min。优选超声波的频率20KHz，功率100KW，更优选超声波的频率20-50KHz，功率90-200KW。

超声波作用后的萃取、固液分离均为现有技术，本领域的普通技术人员可经实验确定具体的工艺条件。

作为优选方案，所述所述真空浓缩的方法为旋转蒸发，水浴温度控制在50～70℃。常见的旋转蒸发的转速为50～100r/s，真空度为0.1Mpa。

最后加入缓冲溶液，萃取分离，得到菜籽蛋白的水溶液为传统的后萃步骤，具体工艺条件可由本领域的普通技术人员经实验确定。其中，加入的缓冲溶液优选为KCl的缓冲溶液，更优选为KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液。优选pH值6～11，K⁺浓度为0～1.25mol·L^-1。KCl缓冲溶液使用量优选为0.05～0.6mL/mL前萃液。作为优选，萃取温度控制在20～40℃，萃取的具体方法可以为：置于恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，得到后萃液，接着离心一定时间，分液漏斗分层后取下层水相。

作为本发明的改进，前萃液经旋转蒸发后加入缓冲溶液后，还加入体积浓度为8％～10％的乙醇水溶液。所述乙醇水溶液的用量优选为0～0.2mL/mL前萃液。更优选的，采用体积浓度为10％的乙醇水溶液，用量为0～0.1mL/mL前萃液。经研究发现，加入乙醇可以保护蛋白质，进一步减少蛋白质变性失活的比例，提高蛋白质后萃率。

如图1所示，本发明的具体步骤如下：

(1)首先将菜籽原料于砻谷机上进行脱壳处理，处理后进行风选。将脱壳后的菜籽于锤式旋风磨上进行粉碎，粉碎后过筛，粉碎粒径为100～600μm。于索式抽提器上用石油醚(30-60℃沸程)在50℃对粉碎后菜籽进行脱油处理，处理后放置在通风处进行脱溶，使石油醚挥发完全。再通风干燥，所得即为试验所需低温菜籽粕。该步骤为现有技术。

(2)反胶束溶液的配制：

称取一定量的表面活性剂气溶胶OT，加入异辛烷。磁力搅拌使表面活性剂OT完全溶解，待溶液透明后，加入一定pH值的KCl缓冲溶液。然后置于恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着离心一定时间，若透明则为反胶束溶液，反之则不是(底层少量水对体系影响不大)。恒温振荡器温度控制在20～40℃；离心分离的相对离心力为1800×g～5000×g，离心时间10～30min。该步骤为现有技术。

(3)反胶束溶液提取菜籽蛋白，获得前萃液：

取上述反胶束溶液，加入菜籽粕粉，置于超声波清洗器中，以一定温度萃取。经过一段时间后，以一定离心力离心一定时间，所得上清液即为前萃液。所得固形物经处理得到纤维等副产品。

(4)真空浓缩：

将所得前萃液进行旋转蒸发，水浴温度控制在50～70℃，转速为50～100r/s，真空度为0.1Mpa，回收有机溶剂异辛烷，同时得到含菜籽蛋白的固形物。

(5)加入缓冲溶液，得到后萃液，萃取分离

向含菜籽蛋白的固形物中加入KCl缓冲溶液，使固形物完全溶解后，加入乙醇，然后置于恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，得到后萃液，接着离心一定时间，分液漏斗分层后取下层水相，测其中的蛋白质含量。其中，恒温振荡器温度控制在20～40℃；离心分离的相对离心力为1800×g～5000×g，离心时间10～30min。蛋白质后萃取率按如下公式计算：

(6)浓缩干燥、得到菜籽蛋白

下层水相经真空浓缩、冷冻干燥，得到菜籽蛋白粉。上层的有机相可以经处理回收气溶胶OT和有机溶剂。

本发明根据菜籽蛋白的特性选择合适的工艺条件，采用反胶束提取前萃、后萃工艺，结合超声波技术明显提高了蛋白质的提取率，是菜籽粕蛋白质资源的高效开发利用的新途径。由于菜籽蛋白被表面活性剂和水分子保护，不与有机溶剂接触，因此不会失活。固液分离后所得固相经处理可以得到纤维等副产品，充分利用菜籽粕。采用独特的后萃工艺，蛋白质变性程度大大减小，表面活性剂的损失显著降低；不仅蛋白质后萃率高，而且节约水资源，降低后续蛋白质浓缩环节中的能耗，生产成本大大降低。总之，本发明工艺简单，节约资源，生产成本低，操作条件温和，蛋白质提取率高。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。

实施例1：

(1)菜籽粕粉的制备：

选用2008年产优质双低油菜籽，于砻谷机上进行脱壳处理，处理后进行风选。将脱壳后的菜籽于锤式旋风磨上进行粉碎，粉碎后过100目筛。于索式抽提器上用石油醚(30-60℃沸程)在50℃对粉碎后菜籽进行脱油处理，处理后放置在通风处进行脱溶，使石油醚挥发完全。再通风干燥，所得即为试验所需菜籽粕粉，测其蛋白质(N×6.25干基)含量为50.1％。

(2)反胶束溶液的配置

KCl缓冲溶液配制：称取110.8g二水合磷酸氢二钠，9.07g磷酸二氢钾，均配制成1L的溶液，分别取190mL和10mL混合均匀，再取0.596g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解，得到pH为9，K⁺浓度为0.04mol·L^-1的KCl缓冲溶液。

称取3g表面活性剂气溶胶OT，置于250mL的锥形瓶中，加入50mL异辛烷，磁力搅拌使表面活性剂完全溶解，待溶液透明后，加入KCl缓冲溶液，使反胶束溶液的W₀值为25。然后置于40℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以1800×g的相对离心力离心20min，若透明则为反胶束溶液，反之则不是(底层少量水对体系影响不大)。所得反胶束溶液的密度为0.06g/mL。

(3)反胶束溶液提取菜籽蛋白，获得前萃液：

取上述反胶束溶液50mL，加入0.050g菜籽粕粉于锥形瓶，置于超声波清洗器中，频率20KHz，功率100KW，以60℃提取80min。以3200×g的相对离心力进行离心分离15min，所得上清液即为前萃液。

按GB/T-500915-2003测得其蛋白质(N×6.25)含量为0.0203g，菜籽蛋白的提取率为81.17％。

(4)真空浓缩：

将上述前萃液在旋转蒸发器上蒸发，回收异辛烷，得到固形物。旋转蒸发的温度、真空度和转速分别控制为50℃、0.1Mpa和100r/s。

(5)加入缓冲溶液，得到后萃液，萃取分离：

KCl缓冲溶液配制：称取110.8g十二水合磷酸氢二钠，9.07g磷酸二氢钾，均配制成1L的溶液，分别取190mL和10mL混合均匀，再取11.133g KCl加入上述混合液中，使其完全溶解，得到pH为9，K⁺浓度为0.75mol·L^-1的KCl缓冲溶液。

向固形物中加入25mL上述K⁺浓度为0.75mol·L^-1的KCl缓冲溶液，磁力搅拌使剩余的固形物完全溶解。加入浓度为10％(v/v)的乙醇1mL，然后置于30℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以1800×g的相对离心力离心20min。

分液漏斗分层后取下层水相，以GB/T-5009.5-2003凯氏定氮法测其中的蛋白质(N×6.25)含量为0.0112g，计算蛋白质后萃取率为55.2％。

实施例2：

(1)菜籽粕粉的制备：

选用2008年产优质双低油菜籽，于砻谷机上进行脱壳处理，处理后进行风选。将脱壳后的菜籽于锤式旋风磨上进行粉碎，粉碎后过80目筛。于索式抽提器上用石油醚(30-60℃沸程)在50℃对粉碎后菜籽进行脱油处理，处理后放置在通风处进行脱溶，使石油醚挥发完全。再通风干燥，所得即为试验所需菜籽粕粉，测其蛋白质(N×6.25，干基)含量为45.6％。

(2)反胶束溶液的配制

KCl缓冲溶液配制：制备0.2mol·L^-1的磷酸氢二钠溶液和0.1mol·L^-1的柠檬酸溶液各1L，分别取10.30mL和9.70mL混合均匀。再取0.1193g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解，得到pH为5，K⁺浓度为0.08mol·L^-1的KCl缓冲溶液。

称取3g表面活性剂气溶胶OT，置于250mL的锥形瓶中，加入50mL异辛烷，磁力搅拌使表面活性剂完全溶解，待溶液透明后，加入上述KCl缓冲溶液，使反胶束溶液的W₀值为33。然后置于30℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以2000×g的相对离心力离心15min，若透明则为反胶束溶液，反之则不是(底层少量水对体系影响不大)。

(3)反胶束溶液提取菜籽蛋白，获得前萃液：

取上述反胶束溶液50mL，加入0.501g菜籽粕粉于锥形瓶，置于超声波清洗器中，频率40KHz，功率90KW，以20℃提取120min。以3600×g的相对离心力进行离心分离10min，所得上清液即为前萃液。按GB/T-5009.5-2003测得其蛋白质(N×6.25)含量为0.1874g。菜籽蛋白的提取率为82.01％。

(4)真空浓缩：

将上述前萃液在旋转蒸发器上蒸发，回收异辛烷，得到固形物。旋转蒸发的温度、真空度和转速分别控制为55℃、0.1Mpa和90r/s。

(5)加入缓冲溶液，得到后萃液，萃取分离：

KCl缓冲溶液配制：制备0.2mol·L^-1的磷酸氢二钠溶液和0.1mol·L^-1的柠檬酸溶液各1L，分别取19.45mL和0.55mL混合均匀。再取1.86g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解，得到pH为8.0，K⁺浓度为1.25mol·L^-1的KCl缓冲溶液。

向固形物中加入5mL KCl缓冲溶液，其中钾离子浓度为1.25mol·L^-1，pH为8.0，磁力搅拌使剩余的固形物完全溶解。加入浓度为10％(v/v)的乙醇2mL，然后置于25℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以2400×g的相对离心力离心20min。

分液漏斗分层后取下层水相，以GB/T-5009.5-2003凯氏定氮法测其中的蛋白质(N×6.25)含量为0.095g，计算蛋白质后萃取率为50.69％。

实施例3：

(1)菜籽粕粉的制备：

选用2008年产优质普通油菜籽，于砻谷机上进行脱壳处理，处理后进行风选。将脱壳后的菜籽于锤式旋风磨上进行粉碎，粉碎后过80目筛。于索式抽提器上用石油醚(30-60℃沸程)在50℃对粉碎后菜籽进行脱油处理，处理后放置在通风处进行脱溶，使石油醚挥发完全。再通风干燥，所得即为试验所需菜籽粕粉，测其蛋白质(N×6.25，干基)含量为43.21％。

(2)反胶束溶液的配制：

KCl缓冲溶液配制：分别制备50mL 0.05mol·L^-1的磷酸氢二钠溶液和4.1mL 0.1mol·L^-1氢氧化钠，混合均匀，再加水稀释到100mL，并取1.118g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解。得到pH为11，K⁺浓度为0.15mol·L^-1的KCl缓冲溶液。

称取1g表面活性剂气溶胶OT，置于250mL的锥形瓶中，加入50mL异辛烷，磁力搅拌使表面活性剂完全溶解，待溶液透明后，加入上述KCl缓冲溶液，使反胶束溶液的W₀值为33。然后置于40℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以2400×g的相对离心力离心15min，若透明则为反胶束溶液，反之则不是(底层少量水对体系影响不大)。

(3)反胶束溶液提取菜籽蛋白，获得前萃液：

取上述反胶束溶液50mL，加入1.000g菜籽粕粉于锥形瓶，置于超声波清洗器中，频率30KHz，功率120KW，以40℃提取80min。以3200×g的相对离心力进行离心分离20min，所得上清液即为前萃液。

按GB/T-5009.5-2003测得其蛋白质(N×6.25)含量为0.3285g，菜籽蛋白的提取率为76.02％。

(4)真空浓缩：

将上述前萃液在旋转蒸发器上蒸发，回收异辛烷，得到固形物。旋转蒸发的温度、真空度和转速分别控制为70℃、0.1Mpa和95r/s。

(5)加入缓冲溶液，得到后萃液，萃取分离：

KCl缓冲溶液配制：分别制备5mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液和2.96mL 0.2mol/L氢氧化钠，混合均匀，再加水稀释到20mL，并取2.584g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解。得到pH为7，钾离子浓度为1.00mol/L的KCl缓冲溶液。

向浓缩液中加入15mLKCl缓冲溶液，其中钾离子浓度为1.00mol/L，pH为7，磁力搅拌使剩余的固形物完全溶解。加入浓度为10％(v/v)的乙醇5mL，然后置于30℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以1800×g的相对离心力离心25min。

分液漏斗分层后取下层水相，以GB/T-5009.5-2003凯氏定氮法测其中的蛋白质(N×6.25)含量为0.1925g，计算蛋白质后萃取率为58.60％。

实施例4：

(1)菜籽粕粉的制备：

选用2008年产优质普通油菜籽，于砻谷机上进行脱壳处理，处理后进行风选。将脱壳后的菜籽于锤式旋风磨上进行粉碎，粉碎后过100目筛。于索式抽提器上用石油醚(30-60℃沸程)在50℃对粉碎后菜籽进行脱油处理，处理后放置在通风处进行脱溶，使石油醚挥发完全。再通风干燥，所得即为试验所需菜籽粕粉，测其蛋白质(N×6.25，干基)含量为43.6％。

(2)反胶束溶液的配制：

KCl缓冲溶液配制：制备1/15mol·L^-1的磷酸氢二钠溶液和1/15mol·L^-1的磷酸二氢钾溶液各1L，分别取6.00mL和4.00mL混合均匀。再取0.03976g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解，得到pH为6.98，K⁺浓度为0.08mol·L^-1的KCl缓冲溶液。

称取5g表面活性剂气溶胶OT，置于250mL的锥形瓶中，加入50mL异辛烷，磁力搅拌使表面活性剂完全溶解，待溶液透明后，加入上述KCl缓冲溶液，使反胶束溶液的W₀值为15。然后置于30℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以1800×g的相对离心力离心20min，若透明则为反胶束溶液，反之则不是(底层少量水对体系影响不大)。

(3)反胶束溶液提取菜籽蛋白，获得前萃液：

取上述反胶束溶液50mL，加入10g菜籽粕粉于锥形瓶，置于超声波清洗器中，频率20KHz，功率200KW，以40℃提取150min。以5000×g的相对离心力进行离心分离30min，所得上清液即为前萃液。

按GB/T-5009.5-2003测得前萃液中蛋白质(N×6.25)含量为2.62g，菜籽蛋白的提取率为60.09％。

(4)真空浓缩：

将上述前萃液在旋转蒸发器上蒸发，回收异辛烷，得到固形物。旋转蒸发的温度、真空度和转速分别控制为50℃、0.1Mpa和50r/s。

(5)加入缓冲溶液，得到后萃液，萃取分离：

KCl缓冲溶液配制：分别制备5mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液和4.68mL 0.2mol/L氢氧化钠，混合均匀，再加水稀释到20mL，并取3.264g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解，钾离子浓度为1.25mol/L。并用0.2mol/L氢氧化钠滴定得到pH为9.5的KCl缓冲溶液。

向浓缩液中加入25mLKCl缓冲溶液，其中钾离子浓度为1.25mol·L-1，pH为9.5，磁力搅拌使剩余的固形物完全溶解。加入浓度为10％(v/v)的乙醇2mL，然后置于35℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以3200×g的相对离心力离心20min。

分液漏斗分层后取下层水相，以GB/T-5009.5-2003凯氏定氮法测其中的蛋白质(N×6.25)含量为1.54g，计算蛋白质后萃取率为58.8％。

实施例5：

(1)菜籽粕粉的制备：

选用2008年产优质双低油菜籽，于砻谷机上进行脱壳处理，处理后进行风选。将脱壳后的菜籽于锤式旋风磨上进行粉碎，粉碎后过80目筛。于索式抽提器上用石油醚(30-60℃沸程)在50℃对粉碎后菜籽进行脱油处理，处理后放置在通风处进行脱溶，使石油醚挥发完全。再通风干燥，所得即为试验所需菜籽粕粉，测其蛋白质(N×6.25，干基)含量为49.67％。

(2)反胶束溶液的配制

KCl缓冲溶液配制：制备0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液各1L，分别取10.30mL和9.70mL混合均匀。再取0.1193g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解，得到pH为5，K⁺浓度为0.08mol/L的KCl缓冲溶液。

称取3g表面活性剂气溶胶OT，置于250mL的锥形瓶中，加入50mL异辛烷，磁力搅拌使表面活性剂完全溶解，待溶液透明后，加入上述KCl缓冲溶液，使反胶束溶液的W₀值为33。然后置于30℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以2000(×g)离心15min，若透明则为反胶束溶液，反之则不是(底层少量水对体系影响不大)。

(3)反胶束溶液提取菜籽蛋白，获得前萃液：

取上述反胶束溶液50mL，加入10g双低菜籽粕粉于锥形瓶，在20℃下提取120min。以3600(×g)进行离心分离10min，所得上清液即为前萃液。

按GB/T-5009.5-2003测得其蛋白质(N×6.25)含量为1.801g，菜籽蛋白的提取率为36.26％。

(4)真空浓缩：

将上述前萃液在旋转蒸发器上蒸发，回收异辛烷，得到浓缩液。旋转蒸发的温度、真空度和转速分别控制为55℃、0.1Mpa和85r/s。

(5)加入缓冲溶液，得到后萃液，萃取分离：

KCl缓冲溶液配制：分别制备5mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液和4.68mL 0.2mol/L氢氧化钠，混合均匀，再加水稀释到20mL，并取0.544g氯化钾加入上述混合液中，使其完全溶解，钾离子浓度为0.25mol/L。并用0.2mol/L氢氧化钠滴定得到pH为9.5的KCl缓冲溶液。

向浓缩液中加入10mLKCl缓冲溶液，其中钾离子浓度为0.25mol·L-1，pH为9.5，磁力搅拌使剩余的固形物完全溶解。然后置于35℃恒温振荡器中振荡至溶液充分混匀，接着以3200×g的相对离心力离心30min。

分液漏斗分层后取下层水相，以GB/T-5009.5-2003凯氏定氮法测其中的蛋白质(N×6.25)含量为0.881g，计算蛋白质后萃取率为48.91％。

Claims (15)

1.一种反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于包括以下步骤：用反胶束溶液提取菜籽蛋白，得到前萃液，前萃液经真空浓缩，除去反胶束溶液中的有机溶剂后加入缓冲溶液，萃取分离，得到菜籽蛋白的水溶液。

2.如权利要求1所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于用反胶束溶液提取菜籽蛋白的方法如下：将菜籽粕粉加入反胶束溶液中，在超声波作用下进行萃取，然后经固液分离得到前萃液。

3.如权利要求2所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于在20～70℃下，在超声波作用下进行萃取40～150min。

4.如权利要求2所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于超声波的频率20-120KHz，功率50-200KW。

5.如权利要求1所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于前萃液经真空浓缩后加入缓冲溶液后，还加入体积浓度为8％～10％的乙醇水溶液。

6.如权利要求5所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的用量为0～0.2mL/mL前萃液。

7.如权利要求1-6中任一项所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于所述真空浓缩的方法为旋转蒸发，水浴温度控制在50～70℃。

8.如权利要求1-6中任一项所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于所述反胶束溶液由丁二酸二异辛酯磺酸钠、有机溶剂和含K⁺的缓冲溶液混合而成，有机溶剂为异辛烷，所述反胶束溶液中，丁二酸二异辛酯磺酸钠的用量为0.01～0.20g/mL，W₀为10～35，缓冲溶液pH值为5～11，K⁺浓度不大于0.3mol·L^-1。

9.如权利要求8所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于所述反胶束溶液中的缓冲溶液为KCl的缓冲溶液。

10.如权利要求9所述的反胶束提取菜籽蛋白的方法，其特征在于所述缓冲溶液为KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液。

11.如权利要求8所述的反胶束提取菜籽蛋白的方法，其特征在于菜籽粕粉的加入量为0.001～0.20g/mL异辛烷。

12.如权利要求1-6中任一项所述的反胶束提取菜籽蛋白的后萃方法，其特征在于旋转蒸发后加入的缓冲溶液为KCl的缓冲溶液。

13.如权利要求12所述的反胶束提取菜籽蛋白的方法，其特征在于旋转蒸发后加入的KCl的缓冲溶液pH值6～11，K⁺浓度为0～1.25mol·L^-1。

14.如权利要求13所述的反胶束提取菜籽蛋白的方法，其特征在于旋转蒸发后加入的KCl的缓冲溶液为KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲溶液，KCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液。

15.如权利要求13所述的反胶束提取菜籽蛋白的方法，其特征在于旋转蒸发后加入的KCl的缓冲溶液的加入量为0.05～0.6mL/mL前萃液。

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