CN103113487A - 一种同时高效制备金针菇多糖和蛋白的方法 - Google Patents

一种同时高效制备金针菇多糖和蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时高效制备金针菇多糖和蛋白的方法，该方法将金针菇子实体粉碎，纤维素酶预处理，微波辅助萃取，离心后醇沉得金针菇粗多糖；将粗多糖溶于水后，加入离子液体/盐双水相体系，混匀，离心，分为上下两相；取出富含多糖的下层，用截留量为6000的超滤膜除盐，浓缩，冷冻干燥得金针菇多糖；富含蛋白的上层，加入二氯甲烷进行萃取，然后旋转干燥去除二氯甲烷，得金针菇蛋白。本发明能同时制备金针菇多糖和蛋白，而且提高了多糖和蛋白的提取率，工艺简单，对设备要求低，适合于规模化生产。

Description

一种同时高效制备金针菇多糖和蛋白的方法
技术领域
本发明属于食用菌有效成份提取分离技术领域，具体而言，涉及一种同时高效制备金针菇多糖和蛋白的方法。
背景技术
金针菇(Flammulina velutipes)又名朴菇，冬菇，隶属真菌门，担子菌纲，伞菌目，口蘑科，金针菌属。金针菇营养极为丰富，有增智菇和“一休菇”等美称，是世界上著名的食用菌，目前已发展成为第三大食用菌。金针菇清嫩爽口，鲜美味香，营养丰富，是一道极为高档的佳肴，具有较高的营养价值。文献报道，金针菇中含较高的蛋白质、碳水化合物和粗纤维，而脂肪含量较低，是一种不可多得的高营养食品。
目前，在金针菇所含的生物活性成份中，国内外对金针菇多糖的研究报到比较多，开发利用也比较深入，而对其他活性成分的研究开发比较少。对金针菇多糖的制备主要是水提，醇沉，然后利用Sevage 法，三氯醋酸沉淀蛋白或蛋白酶水解的方法来去除蛋白，在制备金针菇多糖这种单一成份时，金针菇蛋白都白白的丢弃，不仅导致提取成本的提高，而且浪费了大量的金针菇资源。
双水相萃取技术始于20世纪60年代，由于双水相萃取条件温和，容易放大，可连续操作，因此该技术已成功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，也有抗生素，中药有效成份等小分子分离方面的尝试(食品工业科技，2012，33: 191-194；食品科学，2009，30:110-113；沈阳药科大学学报，2012，4: 302-305；中药材，2009，11: 1754-1757)。离子液体是一类室温或相近温度下完全由离子组成的有机液体化合物，离子液体一般由有机阳离子和无机或有机阴离子组成。离子液体与目前广泛应用的有机熔剂相比，具有以下独特优点：蒸汽压低，不易挥发；具有较强的化学稳定性；具有较大的结构可调性；具有介质和催化双重功能；具有较好的导电性、热稳定性和抗氧化性等。离子液体可与多种物质如盐、糖、表面活性剂等形成双水相体系，其在萃取分离生物物质方面表现出优异的性能，这无疑会开拓一种新的绿色分离技术。现有技术对双水相体系用于活性成分提取分离的报道比较多，但是利用离子液体/盐双水相的报道比较少。公开号为CN101164905A的专利文献利用离子液体-盐双水相体系萃取回收水溶液中的芳香类化合物；公开号为CN102267933A的专利文献利用离子液体-双水相体系萃取氨基酸；公开号为CN102796163A的专利文献利用离子液体提取分离豆粕中的蛋白质；以上技术都取得了较好的提取分离效果。然而，利用离子液体/盐双水相来同时制备金针菇多糖和蛋白的技术却没有文献报道。
发明内容
针对现有技术提取金针菇多糖时的提取率低及不能同时制备蛋白成份导致浪费的缺陷，本发明目的在于提供一种能从金针菇中同时高效、绿色、低成本地制备多糖和蛋白的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种同时高效制备金针菇多糖和蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
（1）原料预处理：干燥金针菇子实体经粉碎后，与蒸馏水按1：30-50的重量比混合成混合液后，备用；
（2）酶解处理：取占混合液重量0.05-0.2％的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至4-6，振荡或搅拌下于45-55℃酶解30-90分钟；
（3）微波辅助萃取：将步骤（2）所得酶解液进行微波处理5-20分钟后，离心，得上清液和沉淀物；
（4）醇沉多糖：将步骤（3）所得上清液减压浓缩，加入2-4倍体积的无水乙醇进行醇沉后，离心，冷冻高燥后得金针菇粗多糖；
（5）双水相萃取：将金针菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入离子液体/盐双水相体系中，在温度30-50℃、pH 4-7的条件下震荡30-50分钟，震荡速度为100-200r·min-1，然后静置20-40分钟分层；
（6）金针菇多糖的制备：取出富含无机盐的下层，用截留量为6000的超滤膜除盐，浓缩，冷冻干燥得金针菇多糖；
（7）金针菇蛋白的制备：取出富含离子液体的上层，加入二氯甲烷进行萃取，取有机相真空旋转干燥去除二氯甲烷，得金针菇蛋白。
优选地，上述方法的步骤（2）中微波处理的条件为50-100HZ，300-800W。
优选地，上述方法的步骤（3）、（4）的离心步骤均在6000rpm离心10分钟。
优选地，上述方法的步骤（5）所述的离子液体/盐双水相体系，其中离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，盐为NaH2PO4和NaCl。
进一步优选地，上述方法的步骤（5）中粗多糖溶液加入离子液体/盐双水相体系后，使得离子液体的质量分数为10%-25%， NaH2PO4的质量分数为15%-28%，粗多糖浓度为0.2mg/ml，NaCl的质量分数为2%-6%。
优选地，上述方法的步骤（7）萃取后的水相被回收离子液体循环使用。
进一步优选地，上述方法的步骤（2）所采用的纤维素酶的活性为160000U/g。
与现有技术相比，本发明涉及的提取分离工艺将酶解、微波辅助萃取、离子液体、双水相有机结合后一次性制备获得了金针菇多糖和蛋白，具体的进步性表现如下：
（1）纤维素酶的预处理能够改变金针菇的结构，破坏了纤维素的阻碍，同时通过水解使部分纤维素降解成可溶性的多糖，从而使多糖和蛋白的提取更为有效；
（2）微波萃取能够在很大程度上破坏金针菇的结构，使多糖和蛋白的提取更为有效；
（3）双水相体系中NaCl的添加，不仅改变了离子液体在水中的溶解度和乳化性，而且改变了水相的密度，利于萃取的完成，提高了萃取效率；
（4）离子液体几乎没有蒸汽压，同时具有不挥发、不易燃烧和爆炸等许多优点，所以在蒸馏分离过程中不会因为挥发造成损失以及对环境造成污染和损害，并且在工艺上实现了离子液体的再生和回收；
（5）通过本发明的工艺可获得产量高、纯度高的金针菇多糖和蛋白，并且操作简单，对于挖掘金针菇的潜在价值具有非常重要的经济意义。
附图说明
图1为从金针菇中同时高效制备多糖和蛋白的工艺流程图。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明实施例1-4所涉及的材料说明如下：
纤维素酶：160000U/g，湖州礼来生物科技有限公司
1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[Bmin]BF4，上海成捷化学有限公司。
离子液体/盐双水相体系：离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，盐为NaH2PO4和NaCl。
实施例1 (从金针菇中同时高效制备多糖和蛋白的方法一)
（1）原料预处理：干燥金针菇子实体10g经粉碎后，将其与蒸馏水按1：30的重量比例混合成混合液后，备用；
（2）酶解处理：将占混合液重量0.05％的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至4，置振荡器上在45℃下酶解30分钟；
（3）微波辅助萃取：步骤（2）酶解液进行微波处理（80HZ，500W）5分钟后，在6000转/分钟下离心10分钟，得上清液和沉淀物；
（4）醇沉多糖，将步骤（3）的上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积得五分之一后，在加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉后，在6000转/分下离心10分钟，冷冻高燥后得金针菇粗多糖0.92g；
（5）双水相萃取：将金针菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入适量离子液体/盐双水相体系中，使离子液体的质量分数为10%，磷酸二氢钠的质量分数为28%，粗多糖浓度为0.2mg/ml，NaCl的质量分数为2%，在温度30℃，pH4的条件下震荡30分钟，震荡速度为150 r·min-1，然后静置30分钟；
（6）金针菇多糖制备：取出富含无机盐的下层，用截留量为6000的超滤膜除盐，浓缩，冷冻干燥得金针菇多糖0.47 g；
（7）金针菇蛋白得制备：取出富含离子液体的上层，加入二氯甲烷进行萃取，然后真空旋转干燥去除二氯甲烷，得金针菇蛋白0.16 g。萃取后的水相被回收离子液体循环使用。
 
实施例2(从金针菇中同时高效制备多糖和蛋白的方法二)
（1）原料预处理：干燥金针菇子实体10g经粉碎后，将其与蒸馏水按1：40的重量比混合成混合液后，备用；
（2）酶解处理：将占混合液重量0.1％的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至4.5，置振荡器上在48℃下酶解50分钟；
（3）微波辅助萃取：步骤（2）酶解液进行微波处理（80HZ，800W）10分钟后，在6000转/分钟下离心10分钟，得上清液和沉淀物；
（4）醇沉多糖，将步骤（3）的上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积得五分之一后，在加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉后，在6000转/分下离心10分钟，冷冻高燥后得金针菇粗多糖1.04g；
（5）双水相萃取：将金针菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入适量离子液体/盐双水相体系中，使离子液体的质量分数为15%，磷酸二氢钠的质量分数为25%，粗多糖浓度为0.2mg/ml，NaCl的质量分数为3%，在温度35℃，pH=5的条件下震荡40分钟，震荡速度为150r·min-1，然后静置30分钟；
（6）金针菇多糖制备：取出富含无机盐的下层，用截留量为6000的超滤膜除盐，浓缩，冷冻干燥得金针菇多糖0.52 g；
（7）金针菇蛋白得制备：取出富含离子液体的上层，加入二氯甲烷进行萃取，然后真空旋转干燥去除二氯甲烷，得金针菇蛋白0.29 g。萃取后的水相被回收离子液体循环使用。
 
实施例3(从金针菇中同时高效制备多糖和蛋白的方法三)
（1）原料预处理：干燥金针菇子实体10g经粉碎后，将其与蒸馏水按1：45的重量比混合成混合液后，备用；
（2）酶解处理：将占混合液重量0.15％的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至5.5，置振荡器上在50℃下酶解70分钟；
（3）微波辅助萃取:步骤（2）酶解液进行微波处理（50HZ，500W）15分钟后，在6000转/分钟下离心10分钟，得上清液和沉淀物；
（4）醇沉多糖，将步骤（3）的上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积得五分之一后，在加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉后，在6000转/分下离心10分钟，冷冻高燥后得金针菇粗多糖1.11 g；
（5）双水相萃取：将金针菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入适量离子液体/盐双水相体系中，使离子液体的质量分数为20%，磷酸二氢钠的质量分数为18%，粗多糖浓度为0.2mg/ml，NaCl的质量分数为4%，在温度42℃，pH=6的条件下震荡45分钟，震荡速度为150r·min-1，然后静置30分钟；
（6）金针菇多糖制备： 取出富含无机盐的下层，用截留量为6000的超滤膜除盐，浓缩，冷冻干燥得金针菇多糖0.57 g；
（7）金针菇蛋白得制备：取出富含离子液体的上层，加入二氯甲烷进行萃取，然后真空旋转干燥去除二氯甲烷，得金针菇蛋白0.24 g。萃取后的水相被回收离子液体循环使用。
 
实施例4(从金针菇中同时高效制备多糖和蛋白的方法四)
（1）原料预处理：干燥金针菇子实体10g经粉碎后，将其与蒸馏水按1：50的重量比混合成混合液后，备用；
（2）酶解处理：将占混合液重量0.2％的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至6，置振荡器上在55℃下酶解90分钟；
（3）微波辅助萃取:步骤（2）酶解液进行微波处理（100HZ，500W）20分钟后，在6000转/分钟下离心10分钟，得上清液和沉淀物；
（4）醇沉多糖，将步骤（3）的上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积得五分之一后，在加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉后，在6000转/分下离心10分钟，冷冻高燥后得金针菇粗多糖1.09g；
（5）双水相萃取：将金针菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入适量离子液体/盐双水相体系中，使离子液体的质量分数为25%，磷酸二氢钠的质量分数为15%，粗多糖浓度为0.2mg/ml，NaCl的质量分数为6%，在温度50℃，pH=7的条件下震荡50分钟，震荡速度为150r·min-1，然后静置30分钟；
（6）金针菇多糖制备： 取出富含无机盐的下层，用截留量为6000的超滤膜除盐，浓缩，冷冻干燥得金针菇多糖0.61 g；
（7）金针菇蛋白得制备：取出富含离子液体的上层，加入二氯甲烷进行萃取，然后真空旋转干燥去除二氯甲烷，得金针菇蛋白0.20 g。萃取后的水相被回收离子液体循环使用。

Claims (7)

1. 一种同时高效制备金针菇多糖和蛋白的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）原料预处理：干燥金针菇子实体经粉碎后，与蒸馏水按1：30-50的重量比混合成混合液后，备用；
（2）酶解处理：取占混合液重量0.05-0.2％的纤维素酶加入混合液中，调解pH值至4-6，振荡或搅拌下于45-55℃酶解30-90分钟；
（3）微波辅助萃取：将步骤（2）所得酶解液进行微波处理5-20分钟后，离心，得上清液和沉淀物；
（4）醇沉多糖：将步骤（3）所得上清液减压浓缩，加入2-4倍体积的无水乙醇进行醇沉后，离心，冷冻高燥后得金针菇粗多糖；
（5）双水相萃取：将金针菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入离子液体/盐双水相体系中，在温度30-50℃、pH 4-7的条件下震荡30-50分钟，震荡速度为100-200r·min-1，然后静置20-40分钟分层；
（6）金针菇多糖的制备：取出富含无机盐的下层，用截留量为6000的超滤膜除盐，浓缩，冷冻干燥得金针菇多糖；
（7）金针菇蛋白的制备：取出富含离子液体的上层，加入二氯甲烷进行萃取，取有机相真空旋转干燥去除二氯甲烷，得金针菇蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中微波处理的条件为50-100HZ，300-800W。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）的离心步骤均在6000rpm离心10分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述的离子液体/盐双水相体系，其中离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，盐为NaH2PO4和NaCl。
5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于：步骤（5）中粗多糖溶液加入离子液体/盐双水相体系后，使得离子液体的质量分数为10%-25%， NaH2PO4的质量分数为15%-28%，粗多糖浓度为0.2mg/ml，NaCl的质量分数为2%-6%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）萃取后的水相被回收离子液体循环使用。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述纤维素酶的活性为160000U/g。
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