CN101787085A - 一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，将双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；热水浸提粗多糖：加入蒸馏水，大火煮沸，文火维持，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水继续加热致沸腾，文火维持，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液用蒸馏水定容备用；双水相萃取操作：精确称取聚乙二醇(PEG)6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，得到的双孢蘑菇多糖被分配在PEG相中。利用双水相体系萃取双孢蘑菇多糖最大收率为80.1％，得率可以达到17.45mg/g。
Description
技术领域
本发明属于生物多糖的提取，特别涉及一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法。
背景技术
目前，提取食用菌多糖常用的方法有：热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法和酸碱浸提法，这些方法均有一定的不足之处。其中，热水浸提法需要温度在80-100℃，处理时间在60-180min，处理温度比较高、时间比较长，容易使多糖发生变性失活；微波辅助法是利用微波的吸收性、穿透性和反射性使极性物质，如水等选择性吸收，从而被加热，增加物料的通透性，使得多糖等活性物质从组织中释放出来，其实质也是利用加热提取多糖，所以容易使多糖发生变性失活；超声波辅助法是利用其在溶剂中产生的空化作用，导致溶液内空穴的形成、增长和爆破压缩，从而是固体样品破碎，增大样品与萃取剂之间的接触面积，提高目标产物从固相转移到液相的传质速率，其实质是破碎细胞壁，溶出目标产物，但是在实际操作的过程中，利用超声波破碎食用菌细胞壁，效率非常低，致使多糖的提取率也比较低；酸碱浸提法虽然可以缩短提取时间，但由于酸、碱在浓度因子难以控制的情况下，容易使部分多糖发生水解，从而破坏多糖的活性结构，降低多糖得率。经查阅文献，以上提取方法的多糖提取率在9-15mg/g。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法。
本发明的技术方案是：
一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于：
使用原料：鲜双孢蘑菇；
使用试剂：苯酚、浓硫酸、葡萄糖、硫酸铵(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水；
使用仪器设备：10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机；
分离方法及步骤
(1)材料预处理：将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；
(2)热水浸提粗多糖：将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用；
(3)双水相萃取操作：精确称取聚乙二醇(PEG)6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL；
得到的双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。
本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，最佳的条件为：PEG6000的质量百分数为13.3％，(NH4)2SO4的质量百分数为21.4％，pH值为7，温度为25℃，在一个大气压条件下操作。
本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的测定方法，其特征在于：
使用仪器：UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平；
(1)苯酚-硫酸法测定多糖含量：分相后上下相各取1mL加9mL水稀释10倍，再取1mL稀释液加0.5mL 6％苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值；上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06；
(2)标准曲线的制作：准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液0.1mL放入1号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6％苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀；静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图；
数据如表1
表1标准曲线吸光度值
(3)数据计算
计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.0mg/mL。
相关的计算公式
R＝Vt/Vb
K＝Ct/Cb
Y＝1/(1+1/(R×K))
R＝0.655
K＝6.15
Y＝0.801
R双水相体系上下相的体积比
Vt双水相体系上相体积，mL
Vb双水相体系下相体积，mL
K双孢菇多糖双水相体系分配系数
Ct双水相系统上相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL
Cb双水相系统下相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL
Y双孢菇多糖在上相中的收率。
本发明效果是：
双水相萃取(Aqueous two-phase extraction，ATPE)技术始于20世纪60年代，由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前已成功的应用于蛋白、核酸等生物产品的分离和纯化。其主要优势有以下几点：
(1)易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低，现已证明双水相萃取的分配系数仅与分离体积有关，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用尤为有利；
(2)由于双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速，因此相对于某些分离过程来说，能耗较小，而且可以实现快速分离；
(3)由于双水相的相间张力大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，相分离过程温和，使生化分子如酶不易受到破坏，而且可以直接在双水相系统中进行生化转化以消除产物抑制；
(4)整个操作过程可以在室温下进行操作条件温和。
基于以上双水相萃取的优势，我们可以在温和的条件下，利用两种水溶液的萃取操作提取双孢蘑菇多糖，不仅可以提高产品的提取率和得率，而且可以将实验室操作的结果直接放大到生产规模，省去了中试过程，为生物产品的研发和生产找到了一条捷径。
利用PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取双孢蘑菇多糖最大收率为80.1％，得率可以达到17.45mg/g；
附图说明
图1葡萄糖标准曲线图
具体实施方式
一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法本发明创造的具体方案
1实验材料、试剂和仪器设备
鲜双孢蘑菇、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水。
10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机、UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平。
2实验方法及步骤
(1)实验材料预处理：将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h。
(2)热水浸提粗多糖：将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液。重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用。
(3)双水相萃取操作：精确称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL。
(4)苯酚-硫酸法测定多糖含量：分相后上下相各取1mL加9mL水稀释10倍，再取1mL稀释液加0.5mL 6％苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值。上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06。
(5)标准曲线的制作：准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液0.1mL放入1号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6％苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀。静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图。数据如表1，图如图1。
表1标准曲线吸光度值
图1为葡萄糖标准曲线
(6)数据计算
计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.0mg/mL。
相关的计算公式
R＝Vt/Vb
K＝Ct/Cb
Y＝1/(1+1/(R×K))
R＝0.655
K＝6.15
Y＝0.801
R双水相体系上下相的体积比
Vt双水相体系上相体积，mL
Vb双水相体系下相体积，mL
K双孢菇多糖双水相体系分配系数
Ct双水相系统上相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL
Cb双水相系统下相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL
Y双孢菇多糖在上相中的收率
利用PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取双孢蘑菇多糖最大收率为80.1％，得率可以达到17.45mg/g。双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。最佳的条件为：PEG6000的质量百分数为13.3％，(NH4)2SO4的质量百分数为21.4％，pH值为7，温度为25℃，在一个大气压条件下操作。
Claims (3)
1.一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于：
使用材料：鲜双孢蘑菇；
使用试剂：苯酚、浓硫酸、葡萄糖、硫酸铵(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水；
使用仪器设备：10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机；
分离方法及步骤
(1)材料预处理：将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；
(2)热水浸提粗多糖：将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用；
(3)双水相萃取操作：精确称取聚乙二醇(PEG)6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL；
得到的双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。
2.根据权利要求1所述的一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于：
最佳的条件为：PEG6000的质量百分数为13.3％，(NH4)2SO4的质量百分数为21.4％，pH值为7，温度为25℃，在一个大气压条件下操作。
3.根据权利要求1所述的一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的测定方法，其特征在于：
使用仪器：UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平；
(1)苯酚-硫酸法测定多糖含量：分相后上下相各取1mL加9mL水稀释10倍，再取1mL稀释液加0.5mL 6％苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值；上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06；
(2)标准曲线的制作：准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液0.1mL放入1号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6％苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀；静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图；
数据如表1
表1 标准曲线吸光度值
(3)数据计算
计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.0mg/mL。
相关的计算公式
R＝Vt/Vb
K＝Ct/Cb
Y＝1/(1+1/(R×K))
R＝0.655
K＝6.15
Y＝0.801
R双水相体系上下相的体积比
Vt双水相体系上相体积，mL
Vb双水相体系下相体积，mL
K双孢菇多糖双水相体系分配系数
Ct双水相系统上相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL
Cb双水相系统下相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL
Y双孢菇多糖在上相中的收率。
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