CN101117357B - 一种水溶性β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法。该方法，包括下述步骤：1)氧化处理：将水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖悬浮于氧化剂溶液中，在2～8℃，于暗处静置氧化反应16～24h，离心收集沉淀；2)洗涤：将步骤1)中所得的沉淀用乙醇和丙酮分别重悬搅拌洗涤30分钟～1小时，离心收集沉淀；3)超声处理：将步骤2)所得沉淀重悬于体积百分浓度为0.05～0.2％的DMSO溶液中，将重悬液进行超声处理20分钟；离心收集上清液得到水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖溶液。本发明的方法制备的水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖经检测，得率可达到95％以上，蛋白含量和脂肪含量很小。

Description

一种水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法。

背景技术

酵母是一种单细胞真菌，是迄今为止人类使用最广泛、经济价值最高的微生物。国际FDA认可啤酒酵母为安全的微生物，已经在饮料和食品的生产中广泛应用。目前，我国年消耗酵母约2000吨，产生约3吨的废酵母泥。由于酵母细胞壁是啤酒制造产业的主要副产物，而且现今对其的主要处理方法就是作为粗饲料廉价售出或者直接排放，给环境造成很大的资源浪费和污染。

已经有多个研究结果表明，纯净的酵母细胞壁对动物具有明显的免疫促进作用，而且还表现出促进生长作用。进一步的证据表明，其主要机理是其中含有的β-1，3/1，6-葡聚糖和甘露聚糖具有相应的免疫和生长促进作用，已有大量试验研究结果表明，β-1，3/1，6-葡聚糖和甘露聚糖是效果显著的动物机体功能调节剂。而且，随着饲用抗生素的逐渐禁用，安全、可替代的生物饲料添加剂正逐渐成为行业主流。

β-1，3/1，6-葡聚糖是酵母β-葡聚糖的正式学名。其结构为：葡萄糖分子以β-1，3-糖苷键连接形成主链，以β-1，6-糖苷键连接形成支链。葡萄糖分子从主链上以β-1，6连接发出分枝。

-[-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-GlcpNAc-]-

   | 1，6

   β-D-Glcp-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

国际国内制备饲料用免疫调节剂β-1，3/1，6-葡聚糖的主要方法为化学提取法。但采用化学方法提取的β-1，3/1，6-葡聚糖的得率偏低(＜17％)、β-1，3/1，6-葡聚糖产品纯度不高(＜85％)以及成本较高。在美国，饲料用β-1，3/1，6-葡聚糖的价格大概为2000～5000美元/千克(视产品纯度而定，有些甚至可达到10000美元/千克)。甘露聚糖的主要生产方式则多为微生物发酵方法，费时、费力、结果不稳定(纯度＜75％，得率＜15％)且成本较高。

酵母细胞壁中直接提取的β-1，3/1，6-葡聚糖为水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖，其提取方法主要包括碱提取一步法、酸提取一步法和酸碱复合提取法等三类方法。

碱一步提取法以suphantharika等(2003)方法为代表，其旨在优化提取工艺，提高提取效率，综合考虑碱浓度、提取时间、提取温度以及碱溶液与底物酵母细胞壁的混合比例。该方法采用逐步确定参数法，分别考虑各个影响因素。得出各参数分别为：混合比例为1∶5(酵母细胞壁：碱液)、提取时间1h、温度为90℃、碱浓度为4％(NaOH)，得到产品的得率为19～22％。此方法工艺简单、提取物得率较高、产物中蛋白含量也较低，但提取物中β-1，3/1，6-葡聚糖的含量也较低。

酸一步提取法的方法范围较广，主要是所采用的酸的种类和浓度都变化很大。但酸提取的主要缺点就是提取产物中β-葡聚糖的含量也较低，原因是在提取过程中为酸所水解(降解)的β-葡聚糖较多。一般情况下不采用酸提取法。

近些年来各国主要采用的方法主要集中于酸碱复合方法的建立、改进和参数优化上。β-葡聚糖得率、纯度等随工艺流程变化有很大不同。比较有代表性的主要是Stefan等(2003)研究的结果，其工艺温和、pH无严格限制，旨在尽可能保持细胞壁中β-葡聚糖的结构，同时提高提取物得率。其提取物经检测可得，β-葡聚糖的含量为85％，甘露糖为6％，蛋白质含量为5％，含微量的脂类，该工艺得率可达细胞壁干重的26％。由于其在中试条件下的结果表明，葡聚糖含量还可进一步提高，甘露聚糖和蛋白含量进一步下降。

水溶性的β-葡聚糖的制备有部分实验室研究结果报道。Hunter(2002)将碱、酸复合提取得到的不溶性提取物采用超声波和喷雾干燥技术可制备出直径均一为1～2μM的颗粒，可水溶。该方法可制得较纯净且生物活性较好的水溶性β-葡聚糖，但得率较低(总糖含量85％)，几丁质、蛋白、脂肪及核酸等去除不够(几丁质4.5％、其余均处于1～5％之间)。

发明内容

本发明的目的是提供一种水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法。

本发明所提供的一种水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：

1)氧化剂降解处理：将水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖悬浮于氧化剂溶液中，在2～8℃，静置降解16～24h，离心收集沉淀；所述氧化剂溶液为含有体积百分浓度为5～15％的NaClO、质量百分浓度为0.05～0.2mol/L NaOH和体积百分浓度为0.05～0.2％的DMSO的溶液；

2)洗涤：将步骤1)中所得的沉淀用乙醇和丙酮分别重悬搅拌洗涤30分钟～1小时，离心收集沉淀；

3)超声处理：将步骤2)所得沉淀重悬于体积百分浓度为0.05～0.2％的DMSO溶液中，将重悬液进行超声处理20～30分钟；离心收集上清液得到水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖溶液。

所述方法中，所述步骤1)中，所述水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖悬浮于所述氧化剂溶液中的浓度为30～50g/L，优选为30g/L；所述氧化剂溶液优选为含有体积百分浓度为10％的NaClO、质量百分浓度0.1mol/L NaOH和体积百分浓度为0.1％的DMSO的溶液。

所述方法中，所述步骤1)中，所述氧化反应的温度为4℃，时间为24小时。

所述方法中，所述步骤2)中，所述乙醇或丙酮的用量为4-5ml/g沉淀干重；所述乙醇或丙酮洗涤时间分别优选为1小时。

所述方法中，所述步骤3)中，所述DMSO溶液的体积百分浓度优选为0.1％；所述超声处理的超声频率为20KHz，超声功率为50～150W，间隔时间为0.2～0.8s；超声功率优选为100W，间隔时间优选为0.5s。

所述方法中还包括将所述水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖溶液浓缩，冷冻干燥或减压蒸干得到水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖粉。

所述方法中，所述水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：

①酶解破壁处理：将酵母细胞壁的悬浮液中加入溶菌酶，在35～40℃下，酶解，离心收集沉淀；

②碱处理：将步骤①得到的酶解后的产物，在0.5～1.5mol/L的NaOH溶液中，在75～90℃下，进行搅拌处理2～3小时，然后离心收集沉淀；

③酸处理：将步骤②得到的沉淀在体积百分浓度为2～8％的乙酸溶液中，室温条件下，搅拌处理2～3小时，离心收集沉淀；

④脱脂、去除蛋白：将步骤③酸处理后离心得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚依次重悬搅拌洗涤30～60分钟，乙醚处理后再静置12～24小时，离心收集沉淀干燥得到水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

所述步骤①中，所述酶解温度为37℃；所述酶解温度优选为37℃。所述溶菌酶的添加量为0.5～3mg/g(10000～60000U/g)酵母细胞壁干重，优选为1mg/g(20000U/g)酵母细胞壁干重；所述溶菌酶在所述酵母细胞壁的悬浮液中的浓度为2000～12000U/ml，优选为4000U/ml。所述酶解时间为30～60分钟，优选为30分钟。

所述步骤②中，所述NaOH溶液的浓度为1mol/L；所述碱处理的温度为85℃，碱处理时间为3小时；所述酶解后的产物干重与所述NaOH溶液的质量/体积比为1g∶5～12ml，优选为1g∶5-6ml。

所述步骤③中，所述乙酸溶液的体积百分浓度为4％；所述酸处理温度为室温，酸处理时间为2小时；所述步骤②得到的沉淀干重与所述乙酸溶液的质量/体积比为1g∶5-12ml，优选为1g∶10-11ml；所述方法中，还包括将所述步骤②、②和③中收集的沉淀用水洗涤。

本发明将化学处理和超声波破碎结合起来，首先采用化学氧化的方法初步将大分子量葡聚糖破碎成较小分子量片段，在此基础上紧接着以超声波破碎成合适分子量大小的葡聚糖，并且以有机溶剂去除产物中的大多数非葡聚糖成分。其优点在于降低单纯化学处理的副产品的环境污染和单纯超声波处理的产品不均一性，以有机溶剂处理可以提高产品中水溶性葡聚糖的纯度和得率，并在一定程度上降低了提取的成本，总结出一套完整的提取、纯化工艺。

本发明的方法制备的水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖经检测，得率可达到95％以上，蛋白含量和脂肪含量很小。本发明的方法制备的水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖平均分子量为190KD，为水溶性多聚糖，经动物试验验证均为适合动物生产实践中应用的免疫调节剂。

附图说明

图1为水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法流程图。

图2为水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法流程图。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

一、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备操作流程如图1所示，具体步骤如下所述：

1、酵母细胞壁的酶解：将100g酵母细胞壁(产品购自湖北宜昌安琪酵母股份公司，“福邦”牌)、100mg(20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和500ml水混合(质量比为1000∶1∶5000)，37℃条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后以3000转/分钟(上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机，下同)离心20分钟去上清得到95.3g沉淀，即为酵母细胞壁酶解后的产物。

2、碱处理：将步骤1中所得母细胞壁酶解后的产物95.3g加入500ml 1M NaOH溶液中(即按照破壁后的产物干重与1M NaOH溶液的质量/体积比约为1g∶5ml的比例添加)，在85℃条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为3小时，然后以3600转/分钟离心20分钟，得到上清液(可继续用于提取甘露聚糖)，和29.5g沉淀。将沉淀用水洗涤三遍，得到28.7g沉淀。

3、酸处理：将步骤2中所得碱处理后的产物28.7g加入300ml体积百分浓度为4％乙酸溶液中(即按照碱处理后的产物干重与4％乙酸溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在室温条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为2小时，之后以3000转/分钟离心20分钟去上清。得到22.2g沉淀，将沉淀用水洗涤三遍。将沉淀用水洗涤三遍，得到21.5g沉淀。

4、乙醇洗涤：将步骤3中所得酸处理后的产物(21.5g)按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水乙醇中，室温(18～25℃，下同)条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为1小时，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

5、丙酮洗涤：将步骤4中所得乙醇洗涤后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水丙酮中，室温条件下用匀速搅拌器慢速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)，搅拌时间为1小时，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

6、乙醚洗涤：将步骤5中所得丙酮处理后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量于通风橱中加入到无水乙醚中，室温条件下用匀速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌，搅拌时间为1小时，之后将容器盖盖后室温静置12～24小时。然后，2400转/分钟离心20分钟去上清，干燥(气流吹干或减压蒸干或冷冻干燥)，得到20.1g水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

7、所得产物纯度采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，结果表明上述得到的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的纯度为91.5％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果为20.1％；分子量按照荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry，80(4)：485-490)测定，约为800～850KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-[-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-GlcpNAc-]-

  |1，6

  β-D-Glcp-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

产品中蛋白质、脂肪和粗灰分含量的测定采用国标方法，分别为：蛋白含量为1.15％、脂肪含量为0.43％。

二、水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备(操作流程如图2所示)

1、氧化处理：将步骤一制备的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖干粉20.00g，按照水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖∶NaClO(体积百分浓度为10％)∶NaOH(0.1mol/L)∶DMSO(体积百分浓度为0.1％)＝1∶10∶10∶10(g∶mL∶mL∶mL)配成悬浊液，在4℃，于暗处静置氧化反应24h，反应完全后，将反应混合物离心(离心速度3000转/分钟，上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机，下同)收集得到19.87g沉淀。

2、洗涤：将步骤1中所得氧化处理后的离心沉淀按照0.20-0.25g/ml(干物质基础)加入无水乙醇中重悬，室温条件下用均速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)混合，混合时间为1小时，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清。将获得的沉淀按照0.20-0.25g/ml(干物质基础)加入无水丙酮中，室温条件下用均速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌混合，搅拌混合时间1小时，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

3、超声处理：步骤2所得沉淀重悬于体积百分浓度为0.1％的DMSO溶液中，将重悬液进行超声波处理(超声时间20min，超声频率20KHz，超声功率100W，间隔时间0.5s)。

4、超声完毕后将混合物在3000rpm下离心去掉沉淀，浓缩上清液，冷冻干燥或减压蒸干得到19.19g水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

5、所得产物分子量按照荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry，80(4)：485-490)测定，平均分子量为190KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-[-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-]-

  | 1.6

  β-D-G-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

得率可达到95.95％。产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.15％、脂肪含量为0.43％。

实施例2、水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

一、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备操作流程如图1所示，具体步骤如下所述：

1、酵母细胞壁的酶解：将200g酵母细胞壁、400mg(20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和500ml水混合，35℃条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为60分钟，之后以3000转/分钟(上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机)离心25分钟去上清得到191.20g沉淀，即为酵母细胞壁酶解后的产物。

2、碱处理：将步骤1中所得酵母细胞壁酶解后的产物191.20g加入2000ml 0.5M NaOH溶液中(即按照破壁后的产物干重与NaOH溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在75℃条件下用匀速搅拌器中速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)，搅拌时间为3小时，然后以3600转/分钟离心20分钟，得到上清液2040ml继续用于提取甘露聚糖，和50.4g沉淀(用于提取水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖)。

3、酸处理：将步骤2中所得碱处理后的产物50.4g加入260ml体积百分含量为2％乙酸溶液中(即按照碱处理后的产物干重与乙酸溶液的质量/体积比约为1g∶5ml的比例添加)，在室温条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为2小时，之后以3000转/分钟离心20分钟去上清。得到36.12g沉淀，将沉淀用水洗涤三遍。将沉淀用水洗涤三遍，得到35.80g沉淀。

4、乙醇洗涤：将步骤3中所得酸处理后的产物(35.80g)按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水乙醇中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器中速搅拌，搅拌时间为30分钟，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

5、丙酮洗涤：将步骤4中所得乙醇洗涤后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水丙酮中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)，搅拌时间为30分钟，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

6、乙醚洗涤：将步骤5中所得丙酮处理后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量于通风橱中加入到无水乙醚中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后将容器盖盖后室温静置12～24小时。然后，2400转/分钟离心20分钟去上清，干燥(气流吹干或减压蒸干或冷冻干燥)，得到34.63g水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

7、所得产物纯度采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，为89.51％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果为17.31％；分子量按照改进荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecularweight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts.CerealChemistry，80(4)：485-490)测定，结果表明上述得到的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的分子量为800～850KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-[-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-GlcpNAc-]-

   |1，6

   β-D-Glcp-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.14％、脂肪含量为0.52％。

二、水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备(操作流程如图2所示)

1、氧化处理：将步骤一制备的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖干粉20.00g，按照水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖∶NaClO(体积百分浓度为5％)∶NaOH(0.05mol/L)∶DMSO(体积百分浓度为0.05％)＝1∶10∶10∶10(g∶mL∶mL∶mL)配成悬浊液，在4℃，于暗处静置氧化反应24h，反应完全后，将反应混合物离心(离心速度3000转/分钟，上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机，下同)收集得到19.88g沉淀。

2、洗涤：将步骤1中所得氧化处理后的离心沉淀按照0.20-0.25g/ml(干物质基础)加入无水乙醇中重悬，室温条件下用均速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)混合，混合时间为30小时，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清。将获得的沉淀按照0.20-0.25g/ml(干物质基础)加入无水丙酮中，室温条件下用均速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌混合，搅拌混合时间1小时，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

3、超声处理：步骤2所得沉淀重悬于体积百分浓度为0.05％的DMSO溶液中，将重悬液进行超声波处理(超声时间20min，超声频率20KHz，超声功率50W，间隔时间0.2s)。

4、超声完毕后将混合物在3000rpm下离心去掉沉淀，浓缩上清液，冷冻干燥或减压蒸干得到18.13g水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

5、所得产物分子量按照荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry，80(4)：485-490)测定，平均分子量为190KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-[-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-]-

  |1，6

  β-D-G-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

得率可达到90.2％。产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.17％、脂肪含量为0.42％。

实施例3、水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

一、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备操作流程如图1所示，具体步骤如下所述：

1、酵母细胞壁的酶解：将200g酵母细胞壁、600mg(20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和1000ml水混合，40℃条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后以3000转/分钟(上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机)离心20分钟去上清得到190.8g沉淀，即为酵母细胞壁酶解后的产物。

2、碱处理：将步骤1中所得酵母细胞壁酶解后的产物190.8g加入2000ml 1.0M NaOH溶液中(即按照破壁后的产物干重与NaOH溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在90℃条件下用匀速搅拌器中速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)，搅拌时间为2.5小时，然后以3600转/分钟离心20分钟，得到上清液2040ml继续用于提取甘露聚糖，和57.4g沉淀(用于提取水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖)。

3、酸处理：将步骤2中所得碱处理后的产物57.4g加入600ml体积百分含量为8％乙酸溶液中(即按照碱处理后的产物干重与乙酸溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在室温条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为2.5小时，之后以3000转/分钟离心20分钟去上清。得到40.2g沉淀，将沉淀用水洗涤三遍。将沉淀用水洗涤三遍，得到38.0g沉淀。

4、乙醇洗涤：将步骤3中所得酸处理后的产物(38.0g)按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水乙醇中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器中速搅拌，搅拌时间为50分钟，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

5、丙酮洗涤：将步骤4中所得乙醇洗涤后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水丙酮中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)，搅拌时间为40分钟，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

6、乙醚洗涤：将步骤5中所得丙酮处理后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量于通风橱中加入到无水乙醚中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后将容器盖盖后室温静置12～24小时。然后，2400转/分钟离心20分钟去上清，干燥(气流吹干或减压蒸干或冷冻干燥)，得到37.0g水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

7、所得产物纯度采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，为90.37％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果表明上述得到的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的得率为18.54％；分子量按照荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry，80(4)：485-490)测定，结果表明上述得到的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的分子量为800～850KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-[-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-GlcpNAc-]-

  | 1，6

  β-D-Glcp-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.04％、脂肪含量为0.40％。

二、水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备(操作流程如图2所示)

1、氧化处理：将步骤一制备的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖干粉20.00g，按照水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖∶NaClO(体积百分浓度为15％)∶NaOH(0.2mol/L)∶DMSO(体积百分浓度为0.2％)＝1∶10∶10∶10(g∶mL∶mL∶mL)配成悬浊液，在4℃，于暗处静置氧化反应24h，反应完全后，将反应混合物离心(离心速度3000转/分钟，上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机，下同)收集得到19.87g沉淀。

2、洗涤：将步骤1中所得氧化处理后的离心沉淀按照0.20-0.25g/ml(干物质基础)加入无水乙醇中重悬，室温条件下用均速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)混合，混合时间为30小时，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清。将获得的沉淀按照0.20-0.25g/ml(干物质基础)加入无水丙酮中，室温条件下用均速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌混合，搅拌混合时间1小时，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

3、超声处理：步骤2所得沉淀重悬于体积百分浓度为0.2％的DMSO溶液中，将重悬液进行超声波处理(超声时间20min，超声频率20KHz，超声功率150W，间隔时间0.8s)。

4、超声完毕后将混合物在3000rpm下离心去掉沉淀，浓缩上清液，冷冻干燥或减压蒸干得到18.45g水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

5、所得产物分子量按照荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry，80(4)：485-490)测定，平均分子量为190KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-[-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-]-

  | 1，6

  β-D-G-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

得率可达到92.25％。产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.19％、脂肪含量为0.47％。

Claims (13)

1.一种水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：

1)氧化处理：将水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖悬浮于氧化剂溶液中，在2～8℃，静置氧化反应16～24h，离心收集沉淀；所述氧化剂溶液为含有体积百分浓度为5～15％的NaClO、质量百分浓度为0.05～0.2mol/L NaOH和体积百分浓度为0.05～0.2％的DMSO的溶液；

2)洗涤：将步骤1)中所得的沉淀用乙醇和丙酮分别重悬搅拌洗涤30分钟～1小时，离心收集沉淀；

3)超声处理：将步骤2)所得沉淀重悬于体积百分浓度为0.05～0.2％的DMSO溶液中，将重悬液进行超声处理20～30分钟；离心收集上清液得到水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖溶液；

4)将步骤3)所得的水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖溶液浓缩，冷冻干燥或减压蒸干得到水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖悬浮于所述氧化剂溶液中的浓度为30～50g/L；所述氧化剂溶液为含有体积百分浓度为10％的NaClO、质量百分浓度0.1mol/L NaOH和体积百分浓度为0.1％的DMSO的溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖悬浮于所述氧化剂溶液中的浓度为30g/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述氧化反应的温度为4℃，时间为24小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述乙醇或丙酮的用量为4-5ml/g沉淀干重；所述乙醇或丙酮洗涤时间分别为1小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述DMSO溶液的体积百分浓度为0.1％；所述超声处理的条件为超声频率为20KHz，超声功率为50～150W，间隔时间为0.2～0.8s。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述超声功率为100W，所述间隔时间为0.5s。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于：所述水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：

①酶解破壁处理：将酵母细胞壁的悬浮液中加入溶菌酶，在35～40℃下，酶解，离心收集沉淀；

②碱处理：将步骤①得到的酶解后的产物，在0.5～1.5mol/L的NaOH溶液中，在75～90℃下，进行搅拌处理2～3小时，然后离心收集沉淀；

③酸处理：将步骤②得到的沉淀在体积百分浓度为2～8％的乙酸溶液中，室温条件下，搅拌处理2～3小时，离心收集沉淀；

④脱脂、去除蛋白：将步骤③酸处理后离心得到的沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚分别依次重悬搅拌洗涤30分钟～1小时，乙醚处理后再静置12～24小时，离心收集沉淀干燥得到水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤①中，所述酶解温度为37℃；所述溶菌酶的添加量为20000～60000U/g酵母细胞壁干重；所述溶菌酶在所述酵母细胞壁的悬浮液中的浓度为4000～12000U/ml；所述酶解时间为20～60分钟。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤①中，所述溶菌酶的添加量为20000U/g酵母细胞壁干重；所述溶菌酶在所述酵母细胞壁的悬浮液中的浓度为为4000U/ml；所述酶解时间为30分钟。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤②中，所述NaOH溶液的浓度为1mol/L；所述碱处理的温度为85℃，碱处理时间为3小时；所述酶解后的产物干重与所述NaOH溶液的质量/体积比为1g∶5～12ml。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述步骤②中，所述酶解后的产物干重与所述NaOH溶液的质量/体积比为1g∶5-6ml。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述步骤②得到的沉淀干重与所述乙酸溶液的质量/体积比为1g∶11ml。

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