CN113121714B - 一种具有益生活性的灵芝寡糖及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及灵芝寡糖制备技术领域，具体涉及一种具有益生活性的灵芝寡糖及制备方法和应用，灵芝寡糖以灵芝子实体热水提取后的喷雾干燥粉的料液为原料，并经超滤膜超滤后收集分子量≤3000Da的成分，然后干燥制成。本发明的灵芝寡糖具有益生活性，能够调节人体肠道菌群活动，可以被嗜酸乳杆菌作为碳源利用，而且制备方法温和、耗时短，灵芝寡糖得率高，使用的原料和试剂来源广泛且成本低廉，容易实现工业大规模生产。同时本发明的灵芝寡糖可与葡萄糖协同使用，促进嗜酸乳杆菌的增殖。

Description

一种具有益生活性的灵芝寡糖及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及灵芝寡糖制备技术领域，具体涉及一种具有益生活性的灵芝寡糖及制备方法和应用。
背景技术
灵芝为多孔菌菌科真菌赤芝或紫芝，具有补气安神、止咳平喘的功效，早在《神农本草经》和《本草纲目》中就记载其功效。野生灵芝主要分布在中国长江以南地带，常生长于植物的根际和枯木桩上，人工栽培主要采用瓶(袋)栽或段木栽培。灵芝中含有多糖、核苷、三萜、生物碱、氨基酸、蛋白质等多种活性成分。目前关于灵芝的大量研究集中在灵芝多糖、三萜等活性物质上，其中灵芝多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等作用，灵芝三萜具有净化血液，保护肝功能等作用。灵芝寡糖作为活性物质的一种由于其含量较低，目前相关的研究还较少。
寡糖又名低聚糖，是一种新型的功能性糖原，指含有2～10个糖苷键结合而成的化合物，现在已经广泛应用于食品、保健品、医药、添加剂等领域。发明人团队前期对以灵芝孢子粉为原料制备的灵芝寡糖的研究(灵芝孢子粉低聚糖的制备及调节肠道菌群功能研究[J]，食品与发酵工业，2020(9):37～42)中发现，源于灵芝孢子粉的灵芝寡糖对于人体肠道菌群有显著的益生调节功能。但是灵芝寡糖的制备主要采用热水浸提后乙醇醇沉，并经树脂脱色、透析等过程，不仅提取过程上稍微繁琐，而且灵芝寡糖的提取率也并突出。中国发明专利CN108003199B公开了一种具有降血糖功能的浒苔低聚糖，该浒苔低聚糖主要通过木瓜蛋白酶酶解后喷雾干燥制成。但是由于浒苔和灵芝具有不同的特性，因此浒苔低聚糖的制备方法并不一定适用于灵芝寡糖的制备。因此开发工艺简洁且寡糖提取率高的灵芝寡糖的提取方法对于灵芝寡糖的实际应用将具有重要意义。
发明内容
针对灵芝寡糖的研究较少的现状，本发明的目的在于提供一种具有益生活性的灵芝寡糖，分子量分布≤3000Da，对人体肠道菌群具有益生调节功能。
针对灵芝寡糖的提取过程繁琐，提取率不高的问题，本发明的另一目的还在于提供制备灵芝寡糖并且制备效率更高的灵芝寡糖的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种促进嗜酸乳杆菌增殖的方法，利用制备的灵芝寡糖和葡萄糖作为混合碳源培养嗜酸乳杆菌，达到协同增效的结果。
一种具有益生活性的灵芝寡糖，所述灵芝寡糖以灵芝子实体热水提取后的喷雾干燥粉的料液为原料，并经超滤膜超滤后收集分子量≤3000Da的成分，然后干燥制成。
本发明的灵芝寡糖的分子量分布≤3000Da，以灵芝子实体为原料，具有调节人体肠道菌群的功能，益生活性高，而且灵芝子实体相对发明人前期研究所用的孢子粉更加容易获得。
作为本发明的优选，所述喷雾干燥粉经以下过程制成：将灵芝子实体与水按质量比1：20～25混合后80～85℃浸提3～5次，然后分离水提液后喷雾干燥。以热水浸提后的原料进行下一步的制备分离，鉴于蛋白质、灵芝酸、皂苷、麦角甾醇等在水溶解度低甚至不溶解，因此制备的灵芝寡糖的纯度高，灵芝酸等小分子杂质含量低。
上述具有益生活性的灵芝寡糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将灵芝热水提取后的喷雾干燥粉分散到水中制成料液；
(2)向料液中加入纤维素酶解，然后灭活处理得到酶解液；
(3)将酶解液经超滤膜超滤，收集分子量≤3000Da的渗透液，然后干燥得到灵芝寡糖。
本发明的灵芝寡糖的制备方法以灵芝热水提取后的喷雾干燥粉为原料进行纤维素酶解，然后超滤膜超滤处理。灵芝子实体与灵芝孢子粉具有不同的形态结构，因此寡糖的提取方法也发生明显的差异。喷雾干燥粉是灵芝子实体的水提产物，主要成分为灵芝多糖等成分，基本不含细胞结构，并且灵芝酸等不溶性小分子杂质含量低，因此纤维素酶的作用对象主要是多糖以及极少量的纤维素，这与传统使用纤维素酶破坏细胞壁结构等促进细胞内物质溶出有很大的不同。通过本发明的制备方法与直接将步骤(1)中的料液超滤膜超滤相比，由于多糖等经纤维素酶作用，可以提升寡糖的得率，且制备条件也比较温和。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中所用纤维素酶的酶活力为50～60u/mg；纤维素酶的用量为800～1100u/g底物；酶解的温度为30～60℃；酶解的pH值为3～7；酶解的时间为6～9小时。纤维素酶的使用效果受到多种因素的综合影响，其中纤维素酶的用量、酶解温度、酶解的pH值、酶解的时间等影响较大，必须将上述各因素置于合适的条件下才能获得较佳得率和性能的灵芝寡糖，经研究发现，更优的酶解温度为30～50℃、酶解的pH值4～6、酶用量1000～1100u/g底物。
作为本发明方法的优选，步骤(3)中超滤膜的超滤过程为：将酶解液稀释后送入超滤膜组中收集超滤渗透液，所用超滤膜为截留分子量3000Da的超滤膜，保持隔氧、无菌环境，超滤压力为1.0～1.5MPa，当料液浓缩至超滤前体积的1/4后，加水稀释1～2倍后继续收集渗透液。超滤膜的超滤操作在高压平板膜机上进行，利用高压实现超滤过程，所用超滤膜为PES超滤膜，以收集渗过超滤膜的渗透液为目标，该渗透液中组分的分子量分布≤3000Da。
作为本发明方法的优选，所述制备方法还包括在步骤(2)后对所得酶解液超声处理，超声功率为240～480W，超声时间为20～60min。在本发明的技术方案中，超声处理酶解液和常见的超声辅助酶解过程明显不同，这是因为常见的超声辅助酶解原理在于利用超声促进细胞壁等的破碎，强化酶解过程，超声和酶解过程一般同步进行或者超声在前、酶解在后。但是在本发明的技术方案中，因为酶解的原料为热水浸提灵芝孢子实体后所得上清液的喷雾干燥粉，基本不含细胞结构，显然失去了超声作用的支点。而发明人的研究发现，尽管本申请的酶解料液中基本不含细胞结构，但是对酶解后的酶解液引入一定条件的超声可以提高灵芝寡糖的得率，发明人推测这可能是因为，一方面超声促进酶解后未完全断裂的糖链断开，另一方面酶解后的料液相较为粘稠导致部分寡糖被包覆，而超声有助于打破这种包覆作用，具体还需要通过进一步的深入研究确定。同时研究还发现必选保持一定的超声条件才能达到提高寡糖得率的效果，超声功率过大或者超声时间过长有可能引起寡糖结构的破坏，从而生成单糖。
一种促进嗜酸乳杆菌增殖的方法，使用上述灵芝寡糖和葡萄糖的混合物作为碳源添加到培养基中培养嗜酸乳杆菌。采用本发明的灵芝寡糖培养嗜酸乳杆菌的研究发现，嗜酸乳杆菌能够利用灵芝寡糖作为碳源进行增殖。但是进一步的研究揭示，以灵芝寡糖为碳源的嗜酸乳杆菌的增殖效果从增殖速率和最终增殖程度上看都不如葡萄糖，但是将灵芝寡糖配合葡萄糖使用时，灵芝寡糖与葡萄糖可以形成协同强化效果，提升嗜酸乳杆菌的增殖效果。
作为本发明方法的优选，混合物中灵芝寡糖和葡萄糖的质量比为0.3～3：1；添加到培养基中的质量百分含量为2～5％。发明人团队的研究发现，灵芝寡糖和葡萄糖的这种协同作用的大小依赖于两者的含量组成，当两者的质量比为1：1时效果最好，较佳的配比范围为灵芝寡糖：葡萄糖＝0.3～3：1，超出该范围后相对葡萄糖单独使用的提升效果不明显。
本发明的有益效果如下：
本发明的灵芝寡糖具有益生活性，能够调节人体肠道菌群活动，可以被嗜酸乳杆菌作为碳源利用，而且制备方法温和、耗时短，灵芝寡糖得率高，使用的原料和试剂来源广泛且成本低廉，容易实现工业大规模生产。同时本发明的灵芝寡糖可与葡萄糖协同使用，促进嗜酸乳杆菌的增殖。
附图说明
图1是实施例1～3超滤稀释前的酶解液中还原糖的浓度曲线。
图2是实施例1、4～5超滤稀释前的酶解液中还原糖的浓度曲线。
图3是实施例6～10超滤稀释前的酶解液中还原糖的浓度曲线。
图4是实施例6、11～14超滤稀释前的酶解液中还原糖的浓度曲线。
图5是实施例6、15～17超滤稀释前的酶解液中还原糖的浓度曲线。
图6是实施例6、18～19超滤稀释前的酶解液中还原糖的浓度曲线。
图7是实施例1的灵芝寡糖对嗜酸乳杆菌增殖的OD600nm曲线。
图8是实施例1的灵芝寡糖对嗜酸乳杆菌增殖的pH曲线。
图9是实施例1的灵芝寡糖和葡萄糖不同配比时嗜酸乳杆菌增殖的OD600nm曲线。
图10是实施例1的灵芝寡糖和葡萄糖不同配比时嗜酸乳杆菌增殖的pH曲线。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
本发明所用的喷雾干燥粉经由以下过程制成：将灵芝子实体与水按质量比1：20～25混合后80～85℃浸提3～5次，然后分离水提液后喷雾干燥。
具体到下述各实施例和对比例所用喷雾干燥粉为：灵芝子实体与水质量比为1：20、80℃浸提3次。
实施例1
一种具有益生活性的灵芝寡糖，以灵芝子实体热水提取后的喷雾干燥粉的料液为原料，并经超滤膜超滤后收集分子量≤3000Da的成分，然后干燥制成。
上述灵芝寡糖的具体制备过程如下：
(1)将20g的灵芝热水提取后的喷雾干燥粉以质量比1：10分散到水中制成料液；
(2)向料液中加入纤维素酶解，纤维素酶的酶活力为50u/mg，纤维素酶的用量为1000u/g底物，酶解温度为50℃，酶解的pH值为5，经酶解8小时后加热灭活处理得到酶解液；
(3)将酶解液置于超声槽中施加超声功率480W处理40min；
(4)将超声处理后的酶解液稀释至2000mL，加入到高压平板机的料液罐中，在平板机中放入3000Da的PES超滤膜，容器密封隔氧，保证容器内部处于无菌状态下，在压力1MPa，转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原来的1/4后，加水稀释1倍，反复超滤4次，收集分子量≤3000Da的渗透液，然后干燥得到灵芝寡糖。
实施例2
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例1的不同之处在于，制备的步骤(3)中所用超声功率为240W。
实施例3
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例1的不同之处在于，制备的步骤(3)中所用超声功率为360W。
实施例4
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例1的不同之处在于，制备的步骤(3)中处理的超声时间为20min。
实施例5
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例1的不同之处在于，制备的步骤(3)中处理的超声时间为60min。
实施例6
一种具有益生活性的灵芝寡糖，以灵芝子实体热水提取后的喷雾干燥粉的料液为原料，并经超滤膜超滤后收集分子量≤3000Da的成分，然后干燥制成。
上述灵芝寡糖的具体制备过程如下：
(1)将20g的灵芝热水提取后的喷雾干燥粉以质量比1：10分散到水中制成料液；
(2)向料液中加入纤维素酶解，纤维素酶的酶活力为50u/mg，纤维素酶的用量为1000u/g底物，酶解温度为50℃，酶解的pH值为5，经酶解8小时后加热灭活处理得到酶解液；
(3)酶解液稀释至2000mL，加入到高压平板机的料液罐中，在平板机中放入3000Da的PES超滤膜，容器密封隔氧，保证容器内部处于无菌状态下，在压力1MPa，转速600r/min下超滤，当原料液经超滤后被浓缩至原来的1/4后，加水稀释1倍，反复超滤4次，收集分子量≤3000Da的渗透液，然后干燥得到灵芝寡糖。
实施例7
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解温度为30℃。
实施例8
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解温度为40℃。
实施例9
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解温度为60℃。
实施例10
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解温度为70℃。
实施例11
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解pH值为3。
实施例12
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解pH值为4。
实施例13
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解pH值为6。
实施例14
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的酶解pH值为7。
实施例15
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的纤维素酶的用量为800u/g底物。
实施例16
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的纤维素酶的用量为900u/g底物。
实施例17
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)的纤维素酶的用量为1100u/g底物。
实施例18
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)酶解时间为9小时。
实施例19
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例6的不同之处在于，步骤(2)酶解时间为10小时。
实施例20
一种具有益生活性的灵芝寡糖，与实施例1的不同之处在于，直接将步骤(1)的料液经步骤(4)超滤膜处理，收集分子量≤3000Da的渗透液，然后干燥制成。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，以β-葡聚糖酶替代纤维素酶制备灵芝寡糖。
对比例2
与实施例1的不同之处在于，以β-葡萄糖苷酶替代纤维素酶制备灵芝寡糖。
1、上述各实施例中所制备的酶解液中灵芝寡糖的含量测定
1)测定方法：以各实施例中超滤前未稀释的酶解液为对象，以DNS法测定各实施例中对应酶解液中的还原糖含量，利用还原糖含量表征各实施例对应的酶解液中灵芝寡糖含量的高低，测试条件如下：取1mL样品于25mL的具塞试管中，然后加入3mL的DNS试剂，混匀后沸水浴5min，迅速冷却至室温，定容至25mL，摇匀。于540nm处测定吸光值，以蒸馏水作为空白对照，采用葡萄糖标准品建立标准曲线，计算还原糖含量。
2)各实施例的测定结果及分析如下
(1)实施例1～3中各对应酶解液的还原糖含量见图1所示。从图中可以看出，测试条件下，随超声功率的增大，还原糖浓度升高，但是更高的超声功率下的还原糖浓度增长缓慢，而且更破坏寡糖的结构，生成单糖；
(2)实施例1、4和5中各对应酶解液的还原糖含量见图2所示。从图中可以看出，随着超声时间的增加，还原糖浓度升高，但是超声时间过长时增长缓慢；
(3)实施例6～10中各对应酶解液的还原糖含量见图3所示。从图中可以看出，测试范围内，30～50℃范围内还原糖浓度随温度升高而升高，但是温度更高还原糖浓度下降明显，因此存在更优的温度范围为30～50℃；
(4)实施例6、11～14中各对应酶解液的还原糖含量见图4所示。从图中可以看出，pH在3～5时还原糖浓度随pH值升高而升高，pH值更高还原糖浓度下降，因此存在更优的pH值范围为4～6℃；
(5)实施例6、15～17中各对应酶解液的还原糖含量见图5所示。从图中可以看出，从图中可以看出，随着酶用量的增加，还原糖浓度升高，但是过高的酶用量带来的还原糖浓度升高不明显；
(6)实施例6、18～19中各对应酶解液的还原糖含量见图6所示。从图中可以看出，随时间的增加，还原糖浓度升高，但是过高的酶解时间带来的还原糖浓度升高不明显；
(7)通过图1和图2的对比可知，引入超声处理酶解后的酶解液可以明显的提升酶解液中还原糖的浓度。
2、不同种类的酶的处理效果对比
实施例1 5和对比例1、对比例2中酶解液中还原糖含量见下表所示。
表1各实施例和对比例中对应酶解液内还原糖含量
项目 实施例1 对比例1 对比例2
还原糖浓度 1.27mg/mL 0.63mg/ml 0.78mg/ml
从表中可以看出，尽管β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶相比纤维素酶更专业于糖链的分解，但是在本申请的技术方案中，所用纤维素酶的效果反而更好。
3、实施例1和实施例20的灵芝寡糖的得率对比
采用苯酚硫酸法测定收集的渗透液中总糖浓度，以总糖含量表征渗透液中的灵芝寡糖的含量(由于分子量分布均≤3000Da，因此可以采用总糖含量表征灵芝寡糖含量)，并计算灵芝寡糖的得率，测定方法如下：
取1mL样品于25mL具塞试管中，然后加入蒸馏水1mL，6％苯酚1mL、浓硫酸5mL，摇匀后沸水浴中反应15min，取出后迅速冷却至室温，在波长490nm处，测定样品的吸管值。共进行3次实验，以蒸馏水作为空白对照。采用葡萄糖标准品建立标准曲线，计算总糖含量。
灵芝寡糖得率的计算公式如下：
得率＝渗透液中总糖质量/喷雾干粉质量*100％。
经计算，实施例1中灵芝寡糖得率为1.76％，实施例20中灵芝寡糖得率为1.09％，因此采用实施例1的方法制备的灵芝寡糖得率相对实施例20提升61.46％。
4、本发明的灵芝寡糖的益生活性
(1)配置MRS培养基：蛋白胨10g、酵母浸渍粉4.0g、牛肉提取物5.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml、PH范围(6.2±0.2)、37℃；
(2)将实施例1制备的灵芝寡糖替代碳源以2wt％的比例添加到不含碳源的MRS培养基制成变形MRS培养基；
(4)灭菌：在高压蒸汽灭菌锅中121℃，灭菌20min；
(5)活化：将嗜酸乳酸杆菌在MRS培养基中进行活化，厌氧培养24h后4000r/min，离心20分钟后收集沉淀，用无菌的生理盐水制备菌悬液稀释到OD600nm为1时进行接种；
(6)培养：将活化后的嗜酸乳酸杆菌分别接种到变形MRS培养基和不添加碳源的MRS培养基中，在厌氧箱中进行厌氧培养，每6h测量OD600值和pH值，结果见图7和图8所述。
从图7和图8中OD600nm和PH的变化曲线可以看出，以实施例1制备的灵芝寡糖作为替代碳源可以用于培养嗜酸乳酸杆菌，嗜酸乳酸杆菌的增殖效果相对不添加碳源得到明显提升。
5、本发明的灵芝寡糖和葡萄糖协同促进嗜酸乳酸杆菌增殖
(1)配置MRS培养基：蛋白胨10g、酵母浸渍粉4.0g、牛肉提取物5.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml、PH范围(6.2±0.2)、37℃；
(2)将实施例1制备的灵芝寡糖和葡萄糖按照不同的配比(4:0、3:1、2:2、1:3、0:4)制成混合物，然后分别以2wt％的比例添加到不含碳源的MRS培养基中制成变形MRS培养基；
(4)灭菌：在高压蒸汽灭菌锅中121℃，灭菌20min；
(5)活化：将嗜酸乳酸杆菌在MRS培养基中进行活化，厌氧培养24h后4000r/min，离心20分钟后收集沉淀，用无菌的生理盐水制备菌悬液稀释到OD600nm为1时进行接种；
(6)培养：将活化后的嗜酸乳酸杆菌分别接种到不同的碳源的变形MRS培养基中，在厌氧箱中进行厌氧培养，每6h测量OD600值和pH值，结果见图9和图10所述。
从图9和图10中OD600nm和PH的变化曲线可以看出：首先，嗜酸乳酸杆菌对本发明的灵芝寡糖的利用效果低于葡萄糖；其次，当将灵芝寡糖和葡萄糖复配使用时，相对单独使用葡萄糖和灵芝寡糖，嗜酸乳酸杆菌的增殖效果得到提升，尤以灵芝寡糖和葡萄糖按质量比1：1时效果最佳，较佳的灵芝寡糖和葡萄糖的质量配比为0.3～3：1，超出该范围后相对葡萄糖单独使用的提升效果不明显。

Claims (2)

1.一种促进嗜酸乳杆菌增殖的方法，其特征在于，使用灵芝寡糖和葡萄糖的混合物作为碳源添加到培养基中培养嗜酸乳杆菌；
混合物中灵芝寡糖和葡萄糖的质量比为0.3～3：1；
添加到培养基中的质量百分含量为2～5%；
所述灵芝寡糖的制备方法包括以下步骤：
（1）将灵芝热水提取后的喷雾干燥粉分散到水中制成料液；
（2）向料液中加入纤维素酶酶 解，然后灭活处理得到酶解液；
（3）将酶解液经超滤膜超滤，收集分子量≤3000Da的渗透液，然后干燥得到灵芝寡糖；
所述喷雾干燥粉经以下过程制成：将灵芝子实体与水按质量比1：20～25混合后80～85℃浸提3～5次，然后分离水提液后喷雾干燥；
步骤（2）中所用纤维素酶的酶活力为50～60u/mg；纤维素酶的用量为800～1100u/g底物；酶解的温度为30～60℃；酶解的pH值为3～7；酶解的时间为6～9小时；
所述制备方法还包括步骤（2）后对所得酶解液超声处理，超声功率为240～480W，超声时间为20～60min。
2.根据权利要求1所述的促进嗜酸乳杆菌增殖的方法，其特征在于，步骤（3）中超滤膜的超滤过程为：将酶解液稀释后送入超滤膜组中收集超滤渗透液，所用超滤膜为截留分子量3000Da的超滤膜，保持隔氧、无菌环境，超滤压力为1.0～1.5MPa，当料液浓缩至超滤前体积的1/4后，加水稀释1～2倍后继续收集渗透液。
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