CN1583802A - 一种提取β-1,3-葡聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取β-1,3-葡聚糖的方法。本发明所提供的提取β-1,3-葡聚糖的方法,包括如下步骤:1)碱处理:向酵母细胞壁中加入NaOH,使溶液中NaOH浓度为2-3%,升温到85-95℃,反应2-3h,过滤收集沉淀物;2)酸处理:向沉淀物中加入酸溶液,调节pH到4.5,升温到70-80℃,反应1-2h,过滤收集沉淀物;(3)有机溶剂浸提:将沉淀物洗涤后,用有机溶剂浸提,冷冻干燥得到β-1,3-葡聚糖。本发明制备工艺简单,工艺参数易于操作控制,产物β-1,3-葡聚糖的得率和纯度都比较高。所得到的β-1,3-葡聚糖能够显著提高肉仔鸡的生长和免疫功能,可广泛用于畜禽养殖业,调节畜禽的免疫机能。
Description
技术领域
本发明涉及酵母多糖的提取方法,特别是涉及一种提取β-1,3-葡聚糖的方法。
背景技术
β-1,3-葡聚糖普遍存在于多种细菌、真菌、植物和酵母细胞壁中。近来发现真菌细胞壁中β-1,3-葡聚糖作为免疫佐剂、抗癌药等使用时,对机体免疫系统表现出非特异性免疫调节作用。在机体感染疾病时,β-1,3-葡聚糖通过增强机体免疫功能,表现出较强的保护作用。有研究发现,酵母β-1,3-葡聚糖能提高小鼠对细菌、真菌、病毒和寄生虫的抵抗能力(Reynold J A,Kastello M D,Harrington D G,et al.Glucan-induced enhancement of host resistance to selected infections diseases.Infect Immun,1980,30:51~57;Di Luzio N R.Immunopharmacology of glucan:abroad spectrum enhancer of host defense mechanisms.Thends Pharmacol Sci,1983,4:344~347;Chihar G.Immunopharmacology of lentinan as the glucan.Immunol Immunopharmacol,1984,4:85~96;Buddle B M,Pul ford H D,Ralston M.Protect effect of glucan against experimentally induced staphylococcalmastitis in ewes.Vet Microbiol,1988,16:67~76;Benkova M,Boroskova Z,SoltysJ,et al.Effect of glucan preparation on immunocompetent cells and phagocyticability of blood leucocytes in experimental ascariosis of pigs.Vet Parasitol,1992,41:157~166.)。
酵母细胞壁中有3种高分子多糖聚合物,占细胞壁干重40%,β-1,3-葡聚糖占多糖的50~60%(Jesus Ortuno,Alberto Cuesta,Alejandro Rodriguez,M.AngelesEsteban,and Jose Meseguer.Oral administration of yeast,Saccharomycescerevisiae,enhances the cellular innate immune response of giltheadseabream(Sparus aurata L.).Vet.Immunol.Immunopathol.2002,85:41-50),β-1,3-葡聚糖的含量约为细胞壁干重的22%左右,表明酵母细胞壁是较好的提取材料。我国的酵母年产量很高,1980年产量为10,000吨(以干物质计),20年来酵母产量增长近10倍。酵母细胞壁是食品和啤酒生产的主要副产物,目前尚未有效利用。
Manners等(Manners,D.J.,A.J.Masson,J.A.Patterson,H.Bjorndal,andB.Lindberg.1973.The structure of aβ-1,6-glucan from yeast cellwalls.Biochem.J.1973,135:31-36.)、Fleet(Fleet G.H.,and D.J.Manners.1976.Isolation and composition of an alkali-soluble glucan from the cell wallsof Saccharomyces cerevisiae.J.Gen.Microbiol.1976,94:180-192.)根据酵母细胞壁化学成分和相似相溶原理,采用碱、酸处理的化学方法从酵母中提取β-1,3-葡聚糖,但工艺耗时长,得率低,仅为2.4%。Suphantharika等(Suphantharika,M.,P.Khunrae,P.Thanardkit,and C.Verduyn.2003.Preparation of spent brewer’syeast β-glucans with a potential application as an immunostimulant for blacktiger shrimp,Penaeus momodon.Bioresource Technology.2003,88:55-60.)采用碱提取一步法提取β-1,3-葡聚糖,此工艺比较简单,提取物得率可高达19~22%,产物中蛋白质含量也较低,但所得β-1,3-葡聚糖纯度低,仅为51%。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺较简单、产率较高的提取β-1,3-葡聚糖的方法。
本发明所提供的提取β-1,3-葡聚糖的方法,包括如下步骤:
1)碱处理:向酵母中加入NaOH,使溶液中NaOH浓度为2-3%,升温到85-95℃,反应2-3-h,过滤收集沉淀物;
2)酸处理:向沉淀物中加入酸溶液,调节pH到4.5,升温到70-80℃,反应1-2h,过滤收集沉淀物;
3)有机溶剂浸提:将沉淀物洗涤后用有机溶剂浸提,冷冻干燥得到β-1,3-葡聚糖。
在提取过程中,常用的酸有盐酸、硫酸等;常用的抽提有机溶剂有异丙醇和丙酮等。
提取过程的优选条件为:步骤1)所述NaOH浓度为3%;温度为90℃;反应时间为2h。步骤2)反应温度为75℃;反应时间为1h。产物纯度和总糖得率最高,分别可以达到91.7%和17.31%。
本发明的工艺流程如图1所示,所获得的β-1,3-葡聚糖分子量比较高,在水中不溶。在静脉注射或腹腔注射使用时,需要降低其分子量,使其能溶解于水。降解过程包括甲酸水解、超滤、退火过程等过程,其工艺流程如图2所示。
其中,所述甲酸水解温度为75-80℃;水解时间为1h。所述超滤为以截留分子量为100KD的超滤膜和以截留分子量为10KD的超滤膜的两次超滤。所述退火温度为70℃;退火时间为20min。
本发明所提供的提取β-1,3-葡聚糖的方法制备工艺简单,工艺参数易于操作控制,产物β-1,3-葡聚糖的得率和纯度都比较高。所得到的β-1,3-葡聚糖能够显著提高肉仔鸡的生长和免疫功能,可广泛用于畜禽养殖业,调节畜禽的免疫机能。
附图说明
图1为提取β-1,3-葡聚糖的工艺流程图
图2为降解β-1,3-葡聚糖的工艺流程图
具体实施方式
实施例1、β-1,3-葡聚糖的制备
取1kg啤酒干酵母加入5L水,混合均匀后,加入NaOH,使NaOH终浓度为3%,加热到90℃,搅拌反应2h后过滤,水洗涤,保留沉淀物;向沉淀物中加水1L,用盐酸调节pH到4.5,加热到75℃,搅拌反应1h,过滤、洗涤得到沉淀。将沉淀用有机溶剂异丙醇浸提4次,丙酮浸提2次,将浸提物冷冻干燥,得到173gβ-1,3-葡聚糖,得率为17.31%。
β-1,3-葡聚糖的化学结构鉴定采用苯酚-硫酸法,3,5-二硝基水杨酸法显色反应及红外光谱法,结果表明其为D-葡萄糖聚合成的多糖,红外光谱提示多糖糖苷键是β-型,连接方式为1→3连接。
采用薄层层析(TLC)来鉴定所得产物的纯度,层析结果仅有1个斑点,其Rf值与D-葡萄糖相同,表明产物的单糖组成仅有葡萄糖,产物纯度为91.17%。
通过测定β-葡聚糖聚合度(DPn)的方法测定产物分子量,其方法是用硼氢化钠还原葡聚糖,将其末端醛糖基还原为糖醇基。还原产物完全酸水解,此末端糖醇基即生成为山梨糖醇,葡聚糖末端外的葡萄糖残基水解产物为葡萄糖。因为山梨糖醇在山梨糖醇脱氢酶催化时存在以下可逆反应:山梨糖醇+NAD+D-果糖+NADH+H+。当pH9~10,并存在过量的NAD+时,此反应中山梨糖醇的氧化情况可通过测定NAD+的还原情况定量测定。在340nm处采用连续监测法测定10mins,每隔1min读数1次,求出平均每分钟吸光度的变化值(ΔA/min)。因为NADH在340nm处的摩尔吸光系数是6.22×106cm2/mol,测定时反应液的总体积是3mL,山梨糖醇含量计算公式为ΔA/min×3/6.22(μmol)。用葡萄糖氧化酶法测定还原产物中葡萄糖含量(μmol)。聚合度DPn=(D-葡萄糖含量/D-山梨糖醇含量)+1(Manners.D.J.,A.J.Masson andR.J.Sturgeon.An enzyme method for the determination of the degree ofpolymerization of glucans.Carbohyd.Res.,1971,17:109-114)。所得β-1,3-葡聚糖平均分子量为820000。
实施例2、β-1,3-葡聚糖的制备
取10kg啤酒干酵母加入50L水,混合均匀后,加入NaOH,使NaOH终浓度为2%,加热到85℃,搅拌反应3h后过滤,水洗涤,保留沉淀物;向沉淀物中加水5L,用硫酸调节pH到4.5,加热到75℃,搅拌反应1h,过滤、洗涤得到沉淀。将沉淀用有机溶剂异丙醇浸提4次,丙酮浸提2次,得到1628g β-1,3-葡聚糖,得率为16.28%。产品纯度为91.89%,平均分子量为885000。
实施例3、β-1,3-葡聚糖作为饲料添加剂的应用
以基础日粮为对照组,在肉仔鸡日粮中添加12.5,25.0mg·kg-1β-1,3-葡聚糖,试验测定了肉仔鸡的生产性能,免疫器官重量,淋巴细胞转换率,绵羊红细胞(SRBC)和新城疫疫苗(NDV)抗体水平。
结果是,β-葡聚糖能提高21日龄肉鸡法氏囊相对重量达2.98(P<0.05),42日龄外周血淋巴细胞(PBL)对脂多糖(LPS)的反应达3.40(P<0.05)。添加β-葡聚糖,使SRBC抗体水平和IgG含量在长时间内维持较高水平,一免11d后差异显著,分别达到5.8和4.2个滴度(P<0.05)。β-葡聚糖提高了肉仔鸡新城疫疫苗(NDV)的抗体水平,同时还增强了肉仔鸡对NDV的免疫应答,二免9d后达4.3个抗体滴度,差异显著(P<0.05)。
以上试验结果表明,β-1,3-葡聚糖能提高肉仔鸡的体液免疫和细胞免疫功能。
实施例4、β-1,3-葡聚糖作为饲料添加剂的应用
以基础日粮和林肯霉素为两个对照,在肉仔鸡日粮中添加12.5,25,50,100mg·kg-1β-1,3-葡聚糖,测定指标包括生产性能,免疫器官重量,淋巴细胞的增殖反应、吞噬中性红能力,血清中抗SRBC、BSA、BA和NDV抗体水平。
结果表明,与基础对照相比,肉仔鸡摄食添加β-1,3-葡聚糖配合饲料后,出栏重提高15%,饲料转化效率提高3%,肉仔鸡法氏囊相对重量提高到3.04,B淋巴细胞刺激指数增加至4.41,绵羊红细胞(SRBC)抗体提高1个滴度、牛血清白蛋白(BSA)抗体为0.414(吸光值),新城疫疫苗(NDV)抗体提高1个滴度。与抗生素相比,β-1,3-葡聚糖能使肉仔鸡出栏重提高6%,饲料转化效率提高3%,法氏囊相对重量提高26%,吞噬细胞吞噬能力显著提高至0.226(吸光值)。BA抗体水平提高1个滴度,BSA抗体水平提高37%,新城疫疫苗抗体提高1个滴度。
以上试验结果表明,β-1,3-葡聚糖能提高肉仔鸡生产性能和免疫功能。
实施例5、β-1,3-葡聚糖作为免疫佐剂的应用
β-1,3-葡聚糖作为免疫佐剂应用时,需要降低其分子量,成为可溶性的β-1,3-葡聚糖。降解步骤可按如下过程进行:甲酸水解(甲酸与高分子β-1,3-葡聚糖稀释比例为1g∶15ml,降解温度为75-80℃,降解时间为1h)→加热,挥发除去甲酸→调节pH至11~12→用100KDa超滤膜超滤收集超滤液,除去分子量大于100000的β-1,3-葡聚糖→用10KDa超滤膜超滤所得超滤液收集浓缩液,除去分子量小于10000的水溶性β-1,3-葡聚糖→将所得超滤浓缩液调节pH至7,加热到70℃,退火20mins即可。
采用实施例1的方法对产品进行化学鉴定,所得水溶性β-1,3-葡聚糖分子量为10KDa-100KDa,并能保持β-1,3-葡聚糖的构型,含量达10mg/mL。
本发明通过不同途径,在肉仔鸡体内使用小分子水溶性β-葡聚糖,研究其对肉仔鸡体液免疫功能的影响。试验采用4×3因子安排的完全随机设计(4个β-葡聚糖使用剂量,3种β-葡聚糖使用途径),研究不同剂量的水溶性β-葡聚糖通过不同使用途径(静脉注射途径,肌肉途径以及与新城疫疫苗免疫的相同途径)时,测定肉仔鸡体内新城疫抗体水平的变化。采用单因子完全随机设计,研究肌肉注射BSA(浓度为5mg/mL)同时注射不同剂量水溶性β-葡聚糖后,测定肉仔鸡BSA抗体总量。
从试验结果得知,水溶性β-1,3-葡聚糖与使用途径存在显著的交互效应。通过佐剂途径与新城疫疫苗同时使用,能提高新城疫抗体1个滴度;肌肉注射BSA同时注射水溶性β-1,3-葡聚糖,能显著提高肉仔鸡抗BSA抗体水平(吸光值提高50%)。
结果表明,水溶性β-1,3-葡聚糖可作为佐剂使用,增强特异性抗体水平。
Claims (9)
1、一种提取β-1,3-葡聚糖的方法,包括如下步骤:
1)碱处理:向酵母细胞壁中加入NaOH,使溶液中NaOH浓度为2-3%,升温到85-95℃,反应2-3h,过滤收集沉淀物;
2)酸处理:向沉淀物中加入酸溶液,调节pH到4.5,升温到70-80℃,反应1-2h,过滤收集沉淀物;
3)有机溶剂浸提:将沉淀物洗涤后,用有机溶剂浸提,冷冻干燥得到β-1,3-葡聚糖。
2、根据权利要求1所述的提取β-1,3-葡聚糖的方法,其特征在于:步骤1)所述NaOH浓度为3%;温度为90℃;反应时间为2h。
3、根据权利要求1或2所述的提取β-1,3-葡聚糖的方法,其特征在于:步骤2)所述酸溶液为盐酸或硫酸。
4、根据权利要求3所述的提取β-1,3-葡聚糖的方法,其特征在于:步骤2)反应温度为75℃;反应时间为1h。
5、根据权利要求1或2所述的提取β-1,3-葡聚糖的方法,其特征在于:步骤3)所述有机溶剂为异丙醇或丙酮。
6、根据权利要求1所述的提取β-1,3-葡聚糖的方法,其特征在于:所述β-1,3-葡聚糖经过甲酸水解、超滤、退火过程降解为水溶性β-1,3-葡聚糖。
7、根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述甲酸水解温度为75-80℃;水解时间为1h。
8、根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于:所述超滤为以截留分子量为100KD的超滤膜和截留分子量为10KD的超滤膜的两次超滤。
9、根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于:所述退火温度为70℃;退火时间为20min。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |