CN112778436A - 茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及茯苓中提取β‑1,3‑D‑葡聚糖的方法，利用酶‑碱联合提取方法获得茯苓中的葡聚糖；首先，用果胶酶去除茯苓粉中的果胶类物质；其次，用氢氧化钾溶液提取酶分解产物中可溶于碱液的成分；最后，利用目的产物只溶于碱液的特性，用盐酸中和氢氧化钾溶液提取物，使碱溶性的葡聚糖析出，即得终产物。本发明的有益效果是：在提取过程通过果胶酶进行处理，有效的减少了碱提取时出现的胶状物质；另外利用葡聚糖的溶解性特点，用析出的方式进行纯化，有效地去除了蛋白质、糖类等物质的干扰，但保留了葡聚糖的活性；本提取方法β‑1,3‑D‑葡聚糖的产量大，纯度高，操作的过程简单，且所用试剂危害少。
Description
技术领域
本发明属于多糖提取技术领域，尤其是涉及一种茯苓中提取β-1，3-D-葡聚糖的方法。
背景技术
β-1，3-D-葡聚糖是真菌，酵母细胞或海藻细胞壁的结构成分，属于一种具备多种生理活性的化合物。β-1，3-D-葡聚糖能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，刺激机体的免疫系统，调节机体免疫机能，使机体更有效地抵抗由微生物引起的疾病；另外，β-1，3-D-葡聚糖也是真菌鲎试剂检测中的标志性物质。从茯苓粉中提取β-1，3-D-葡聚糖时，由于果胶类物质的存在，在碱提取时会出现大量的胶状物质，从碱提取液中提取β-1，3-D-葡聚糖时会严重影响产量和纯度。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种茯苓中提取β-1，3-D-葡聚糖的方法。
本发明采用的技术方案是：茯苓中提取β-1，3-D-葡聚糖的方法，先通过果胶酶去除茯苓粉中的果胶类物质，再用碱液提取得到β-1，3-D-葡聚糖。
具体步骤如下：
步骤一 将茯苓块打碎成粉，使用无水乙醇脱除茯苓粉中的脂类；
步骤二 使用果胶酶去除果胶类物质；
步骤三 使用碱液浸提，再用酸液进行中和，析出β-1，3-D-葡聚糖。
优选地，步骤二具体为向步骤一所得产物中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入终浓度为0.2％的果胶酶，水浴反应后，分离烘干得到固体粉末。
优选地，水浴温度为45-50℃，时长为5-6h。
优选地，水浴完成后，沸水孵育10-15min使果胶酶失活。
优选地，步骤二执行2-3次后再执行步骤三。
优选地，步骤三具体为向步骤二产物中加入氢氧化钾溶液，水浴反应后得到浸提液；向浸提液中滴加盐酸溶液，当溶液pH值为7-8时，分离出沉淀物，洗涤后获得β-1，3-D-葡聚糖。
优选地，浸提过程为在55-60℃水浴1.5-2h。
优选地，步骤一具体为向茯苓粉中加入无水乙醇，70-80℃水浴回流3-4h，再将抽滤得到的固体物质烘干。
优选地，茯苓中提取β-1，3-D-葡聚糖的方法提取所得的β-1，3-D-葡聚糖用于鲎试剂检测。
本发明具有的优点和积极效果是：在提取过程通过果胶酶进行处理，有效的减少了碱提取时出现的胶状物质；另外利用葡聚糖的溶解性特点，用析出的方式进行纯化，有效地去除了蛋白质、糖类等物质的干扰，但保留了葡聚糖的活性；本提取方法β-1，3-D-葡聚糖的产量大，纯度高，操作的过程简单，且所用试剂危害少；所提取的β-1，3-D-葡聚糖组分均匀，纯度不低于95％，能够用于鲎试剂检测，其检测活性较高。
附图说明
图1提纯所得β-1，3-D-葡聚糖单糖组分分析结果；
图2提纯所得β-1，3-D-葡聚糖红外光谱分析；
图3提纯所得β-1，3-D-葡聚糖凝胶渗透色谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的一个实施例做出说明。
如图1所示，本发明涉及茯苓中提取β-1，3-D-葡聚糖的方法，利用酶-碱联合提取方法获得茯苓中的葡聚糖；首先，用果胶酶去除茯苓粉中的果胶类物质；其次，用氢氧化钾溶液提取酶分解产物中可溶于碱液的成分；最后，利用目的产物只溶于碱液的特性，用盐酸中和氢氧化钾溶液提取物，使碱溶性的葡聚糖析出，即得终产物。根据目的产物的性质，再通过薄层色谱层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、凝胶渗透色谱(GPC)、红外光谱分析(ISA)、鲎试剂法(G试验) 对终产物的纯度、结构和活性进行了测定。
提取步骤如下：
步骤一 将茯苓块打碎成粉，使用无水乙醇脱除茯苓粉中的脂类；
步骤二 使用果胶酶去除果胶类物质；
步骤三 使用碱液浸提，再用酸液进行中和，析出β-1，3-D-葡聚糖。
具体如下：
步骤1将茯苓块打碎成粉，向茯苓粉中加入无水乙醇，70-80℃水浴回流3-4h 脱除茯苓粉中的脂类，冷却至室温后抽滤提取固体物，再将抽滤得到的固体物质烘干呈粉状；
步骤2向步骤1获得粉状产物中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入终浓度为0.2％的果胶酶，45-50℃水浴5-6h，水浴完成后，沸水孵育10-15min使果胶酶失活，冷却至室温后抽滤提取固体物，再将抽滤得到的固体物质烘干；将上述步骤重复2-3次，尽量除尽茯苓粉中的果胶类物质；
步骤3向上述粉状产物中加入1M氢氧化钾溶液，在55-60℃水浴1.5-2h得到浸提液，冷却到室温后，离心取上清，将上清液稀释并透析，获得淡棕色澄清液体；向透析后的浸提液中滴加1M盐酸溶液，当溶液pH值为7-8时，分离出沉淀物，洗涤后获得β-1，3-D-葡聚糖
通过本方法在提取过程通过果胶酶进行处理，有效的减少了碱提取时出现的胶状物质；另外利用葡聚糖的溶解性特点，用析出的方式进行纯化，有效地去除了蛋白质、糖类等物质的干扰；本提取方法β-1，3-D-葡聚糖的产量大，纯度高，操作的过程简单，且所用试剂危害少。
一 提取与纯化
1.原料脱脂
称取20g茯苓块，用打粉机粉碎成茯苓粉，装入圆底烧瓶内，加入300mL 无水乙醇后，安装冷凝管，于80℃水浴中回流提取3h脱除茯苓中的脂类，反应结束后自然冷却至室温；产物用抽滤法进行固液分离，将得到的固形物置于50℃烘箱中烘干，产物成粉状。
2.果胶的去除
将上述产物倒入烧杯中，加入200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.5)，添加果胶酶使之终浓度为0.2％，置于50℃水浴锅中反应5h后，于沸水浴中孵育 10min使酶失活；产物用抽滤法进行固液分离，将得到的固形物置于50℃烘箱中烘干。
3.再纯化
将烘干后的产物按步骤2再进行一次除果胶试验。
4.碱液浸提
将上述产物倒入烧杯中，加入800mL 1M氢氧化钾溶液，置于60℃水浴锅中反应1.5h后自然冷却至室温，得到浸提产物；此浸提产物用离心法(8000g 10min)去除粘稠的沉淀物，得到上清液；将上清液稀释10倍后，装入14kD透析袋内，用0.1M氢氧化钾溶液透析完全，去除小分子物质，产物呈淡棕色澄清液体。
5.析出纯化
由于目的产物具有易溶于碱、不易溶于酸和水的特点，向上述产物中缓慢滴加1M盐酸溶液进行中和，并不断搅拌混匀，可使葡聚糖因溶液酸碱度变化而析出，但其余可溶性提取物依然溶于提取液内，当出现大量析出物且pH值约7～8 时，停止滴加盐酸溶液；用离心法(8000g 10min)分离出白色沉淀物；将此沉淀物用蒸馏水浸泡并搅拌5min，离心法(8000g 10min)洗涤，重复操作3-5次。
6.冷冻干燥
将上述产物用蒸馏水重悬，分装后进行冷冻干燥，得到白色粉末状终产物。
二 鉴定与分析
1单糖组分的初步分析
1.1 TFA水解
取10mg提取物(简称DA-1)，加入5mL2M TFA溶液，置于110℃油浴锅内加热水解4h。取出后自然冷却至室温。
1.2 薄层色谱层析(TLC)
(1)配制展开剂∶正丁醇∶乙酸∶水＝6∶4∶3。
(2)配制苯胺-二苯胺显色剂：苯胺4mL+二苯胺4g+85％磷酸20mL+丙酮200mL。
(3)用50μL蒸馏水溶解酸水解产物，在硅胶薄层板上上样，用4种浓度为2mg/mL的单糖标准品(葡萄糖，鼠李糖，半乳糖，甘露糖)作为对照，置于层析缸内，展开时间为3h。
(4)展开后，自然晾干，喷洒显色剂，晾干后置于80℃烘箱中显色10min。
1.3 结果与分析
如图1表1所示，从TLC结果来看，提取物为单一色斑，推测提取物水解后的主要成分是葡萄糖。
表1
2 红外光谱分析(ISA)
2.1 将10mg提取物送至瀚盟生物技术(天津)有限公司进行红外光谱检测。
2.2 结果与分析
如图2所示，图中横坐标为波长数值，单位为cm-1；纵坐标为透光率，单位为％；
(1)3429.6cm-1处的吸收峰是-OH的伸缩振动吸收峰，说明提取物是具有多羟基的糖类；(2)2919cm-1处的吸收峰是C-H的伸缩振动吸收峰；
(3)1642.87cm-1附近的吸收峰是-OH的弯曲振动吸收峰；
(4)1384.53cm-1附近的吸收峰是C-H弯曲振动吸收峰；
(5)1033.08cm-1处的吸收峰是醇羟基-OH的变角振动吸收峰；
(6)在890cm-1处存在β-D-吡喃糖糖苷键的特征吸收峰，说明提取物为β-D-吡喃糖；
(7)在570cm-1处的吸收峰是-CO-变形振动，436cm-1处及以下的吸收峰为-C-C-C-和-C-CO-的变形振动。
由上可知，提取物具有β-D-葡聚糖的红外光谱特性。
3 凝胶渗透色谱(GPC)
3.1 将提取物送至上海微谱化工技术服务有限公司进行GPC检测。
3.2 结果与分析
如图3和表2所示，图3中横坐标为样品保留时间，纵坐标为平均分子量 (Mv)，结果显示，数均分子量(Mn)为3267Da，重均分子量(Mw)为154kDa，多分散性指数(PDI)为47.2，凝胶排阻层析图显示为单峰，说明提取物是分子量分布较均匀、纯度较高的物质。
表2
4 鲎试剂检测(G试验)
4.1 鲎试剂中含有对β-1，3-葡聚糖敏感的G因子和会形成凝胶的凝固蛋白，当葡聚糖激活G因子形成活化的G因子，会近一步激活凝固蛋白形成凝胶，因此，鲎试剂可用于检测β-1，3-D-葡聚糖。
(1)称量相同质量的提取物和购买于Megazyme公司的Pachyman(主要为β-1，3-D-葡聚糖)，溶解后稀释至相同理论浓度。
(2)参照天津喜诺生物医药有限公司生产的真菌葡聚糖检测试剂盒(显色法)是使用说明书，对两者同时进行G试验检测，并计算两者葡聚糖含量，进而比较两者活性。
4.2 结果与分析
结果如表3所示，提取物与对照品在同一理论浓度时，G试验反应结果相似，不同浓度的差异百分比皆低于5％，说明提取物中的活性成分与对照品类似；用试剂盒检测提取物中的葡聚糖含量时，与理论浓度的相对偏差皆不高于15％，说明提取物中的葡聚糖纯度较高。综上，试验说明提取物中主要活性成分为β-1，3- D-葡聚糖。
表3
5 高效液相色谱分析
5.1 将提取物送至青岛科创质量检测有限公司，对提取物的组分进行高效液相色谱分析。
5.2 结果与分析
结果如表4所示，提取物的主要组成成分是由葡萄糖构成的葡聚糖，且含量不低于95％；另外提取物中也含有极少量的甘露糖；由此可见，通过本方案制得的β-1，3-D-葡聚糖纯度非常高，纯度不低于95％。
表4
6 多种葡聚糖间的活性比较
6.1 由于不同原料中提取的葡聚糖具有分子量不均一、分子结构有差异的特点，其应用性也不同，应用于鲎试剂中的效果也不相同。如表5所示，比较了几种葡聚糖在鲎试剂中的检测活性。
表5
6.2 结果及分析
结果如表6所示，不同来源的葡聚糖的真菌鲎试剂检测活性不同，以 Pachyman茯苓多糖、提取物和USP-酵母多糖活性最好，但Pachyman茯苓多糖和提取物的反应灵敏性最高，用于鲎试剂检测可体现较高的灵敏性。参考前面对 Pachyman茯苓多糖和提取物活性的检测结果，如表3所示，可以说明提取物在鲎试剂检测活性方面优于其他葡聚糖，具有反应灵敏、活性好的优点。
表6
实施例1：
步骤1将茯苓块打碎成粉，向茯苓粉中加入无水乙醇，80℃水浴回流3h 脱除茯苓粉中的脂类，冷却至室温后抽滤提取固体物，再将抽滤得到的固体物质烘干呈粉状；
步骤2向步骤1获得粉状产物中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入终浓度为0.2％的果胶酶，50℃水浴5h，水浴完成后，沸水孵育10min使果胶酶失活，冷却至室温后抽滤提取固体物，再将抽滤得到的固体物质烘干；将上述步骤重复 2次，尽量除尽茯苓粉中的果胶类物质；
步骤3向上述粉状产物中加入1M氢氧化钾溶液，在60℃水浴1.5h得到浸提液，冷却到室温后，离心取上清，将上清液稀释并透析，获得淡棕色澄清液体；向透析后的浸提液中滴加1M盐酸溶液，当溶液pH值为7时，分离出沉淀物，洗涤后获得β-1，3-D-葡聚糖
实施例2：
1.原料脱脂
称取20g茯苓块，用打粉机粉碎成茯苓粉，装入圆底烧瓶内，加入300mL 无水乙醇后，安装冷凝管，于80℃水浴中回流提取3h脱除茯苓中的脂类，反应结束后自然冷却至室温；产物用抽滤法进行固液分离，将得到的固形物置于50℃烘箱中烘干，产物成粉状。
2.果胶的去除
将上述产物倒入烧杯中，加入200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.5)，添加果胶酶使之终浓度为0.2％，置于50℃水浴锅中反应5h后，于沸水浴中孵育 10min使酶失活；产物用抽滤法进行固液分离，将得到的固形物置于50℃烘箱中烘干。
3.再纯化
将烘干后的产物按步骤2再进行一次除果胶试验。
4.碱液浸提
将上述产物倒入烧杯中，加入800mL 1M氢氧化钾溶液，置于60℃水浴锅中反应1.5h后自然冷却至室温，得到浸提产物；此浸提产物用离心法(8000g 10min)去除粘稠的沉淀物，得到上清液；将上清液稀释10倍后，装入14kD透析袋内，用0.1M氢氧化钾溶液透析完全，去除小分子物质，产物呈淡棕色澄清液体。
5.析出纯化
由于目的产物具有易溶于碱、不易溶于酸和水的特点，向上述产物中缓慢滴加1M盐酸溶液进行中和，并不断搅拌混匀，可使葡聚糖因溶液酸碱度变化而析出，但其余可溶性提取物依然溶于提取液内，当出现大量析出物且pH值约7～8 时，停止滴加盐酸溶液；用离心法(8000g 10min)分离出白色沉淀物；将此沉淀物用蒸馏水浸泡并搅拌5min，离心法(8000g 10min)洗涤，重复操作3-5次。
6.冷冻干燥
将上述产物用蒸馏水重悬，分装后进行冷冻干燥，得到白色粉末状终产物。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：先通过果胶酶去除茯苓粉中的果胶类物质，再用碱液提取得到β-1,3-D-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一将茯苓块打碎成粉，使用无水乙醇脱除茯苓粉中的脂类；
步骤二使用果胶酶去除果胶类物质；
步骤三使用碱液浸提，再用酸液进行中和，析出β-1,3-D-葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：所述步骤二具体为向步骤一所得产物中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入终浓度为0.2％的果胶酶，水浴反应后，分离烘干得到固体粉末。
4.根据权利要求3所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：水浴温度为45-50℃，时长为5-6h。
5.根据权利要求4所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：水浴完成后，沸水孵育10-15min使果胶酶失活。
6.根据权利要求3所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：所述步骤二执行2-3次后再执行步骤三。
7.根据权利要求3-6中任一所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：所述步骤三具体为向步骤二产物中加入氢氧化钾溶液，水浴反应后得到浸提液；向浸提液中滴加盐酸溶液，当溶液pH值为7-8时，分离出沉淀物，洗涤后获得β-1,3-D-葡聚糖。
8.根据权利要求7所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：浸提过程为在55-60℃水浴1.5-2h。
9.根据权利要求3-6中任一所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法，其特征在于：所述步骤一具体为向茯苓粉中加入无水乙醇，70-80℃水浴回流3-4h，再将抽滤得到的固体物质烘干。
10.权利要求1-9中任一所述的茯苓中提取β-1,3-D-葡聚糖的方法提取所得的β-1,3-D-葡聚糖用于鲎试剂检测。
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