CN1177044C - 萝卜几丁质结合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是以萝卜为材料，经壳聚糖亲和层析和离子交换柱层析，获得4种几丁质结合蛋白命为M₁、M₂、M₃、M₄。洗脱液分别浓缩或冻干制得上述4种萝卜几丁质结合蛋白制剂，均达到电泳纯度。M₁、M₂的溶菌酶活力6-7万U/mg蛋白质，几丁质酶活力24-47U/mL；M₃、M₄的几丁质酶活力为47-62U/mL。表明M₁、M₂是种双功能酶。M₁、M₂的相对分子质量分别为26915、24831。Asp、Glu、His、Trp是M₁、M₂活性所必需的氨基酸。萝卜几丁质结合蛋白对细菌G^-及G⁺均有杀菌作用，同时对真菌、酵母和昆虫的细胞壁也起水解作用。在医药、食品、日化业及农作物病虫防治上具有广泛应用的良好前景。

Description

萝卜几丁质结合蛋白及其制备方法

本发明涉及几丁质结合蛋白，尤其涉及萝卜几丁质结合蛋白的制备。

几丁质结合蛋白是一类能与几丁质特异结合的蛋白质，现已发现几丁质结合蛋白广泛存在于动植物微生物中，其中几丁质酶和溶菌酶占有重要的地位，它们在植物防卫反应体系中发挥重要作用。因此研究比较多，陈崇顺、徐凤彩1993年，发现21科41种(变种)植物中具有几丁质酶，并比较了它们的酶活力。植物溶菌酶发现较早，自从1922年Fleming发现植物的根和花含有溶菌酶以来，先后从不同植物、植物的不同组织中发现了溶菌酶。但是，从植物中分离出既具有溶菌酶活力又具有几丁质酶活力的几丁质结合蛋白M₁、M₂和具有几丁质酶活力的几丁质结合蛋白M₃、M₄仍未见报导。

溶菌酶普遍用于食品行业的杀菌、防腐和保鲜，在发酵工业和生物工程的菌体破裂，在医药上用于临床治疗和诊断，国外利用溶菌酶制成药物，用于治疗出血、血尿、血痰、慢性鼻窦炎和副鼻窦炎、预防龋齿等疾病，以及白血病、肺结核、肾功能衰竭等疾病的临床诊断。溶菌酶的应用越来越广泛，国内的溶菌酶生产远未能满足国内市场需要，部分溶菌酶及其制剂需要进口。

目前市售的溶菌酶，主要以鸡蛋清为原料制备的，其制备技术复杂、原料成本高、产品酶活力低，鸡蛋来源有限，且与食品争原料。用鸡蛋清制取的溶菌酶只对G⁺菌有杀灭作用，而对G^-菌、真菌不起作用。

几丁质酶能水解真菌、酵母和昆虫细胞壁成分中的几丁质，从而杀之。

而作为生产应用的几丁结合蛋白M₁、M₂和作为生产应用的几丁质结蛋白M₃和M₄仍未有报导。

目前无论在医药上，还是农作物保护上以酶制剂制成的防治真菌药物极少。如水稻100多种病害，其中90％以上是由真菌引起的。因此，随着食品、医药和植保上高新技术的发展，寻找新酶源和新酶种势在必行。

我们研究中发现萝卜中几丁质结合蛋白含量最高。从而发现了萝卜几丁质结合蛋白(中文名为萝卜几丁质结合蛋白，汉语拼音为Luobo ji ding zhi jie he dan bai；英文名为Raphanuns SativusChitin-binding protein，缩写R-CBP)。经提纯得萝卜几丁质结合蛋白，这种萝卜几丁质结合蛋白含有四种蛋白质成分，我们叫它为M₁、M₂、M₃、M₄。

本发明目的在于寻找一种溶菌广谱、稳定性好、制备简便、应用效果好及应用范围广的酶制剂，开拓了新的酶制剂来源。

萝卜几丁质结合蛋白的特性特征：

萝卜几丁质结合蛋白包含蛋白质M₁、蛋白质M₂、蛋白质M₃、蛋白质M₄，几丁质结合蛋白是蛋白质M₁、M₂、M₃、M₄的总称。它的共同特征在于：都为白色粉末，无毒、无味，易溶于水。其水溶液可达电泳纯(SDS-PAGE)。具有蛋白质结构和性质。固体制品的灰分：常规法测定≤5％，水分：恒重法测定期≤7％。M₁和M₂既具有溶菌酶活性，又具有几丁质酶活力，是双功能酶；M₃、M₄具有的几丁质含内切酶和外切酶活力。

萝卜几丁质结合蛋白氨基酸组成如表1。

        质量百分数(％)       残基数/mol蛋白

     残基      M₁      M₂      M₁      M₂

     Asp      9.80     10.31     23       22

     Thr      7.52     5.72      20       14

     Ser      7.10     6.54      22       19

     Glu      10.98    9.38      23       18

     Gly      8.78     9.67      41       43

     Ala      7.90     8.61      30       30

     Cys      0.00     0.00      0        0

     Val      5.15     5.06      14       13

     Met      1.30     1.69      3        3

     Ile      4.21     4.65      10       10

     Leu      4.52     5.50      11       12

     Tyr      5.71     6.60      9        10

     Lys      4.88     4.53      10       9

     His      1.77     0.61      3        1

     Arg      9.58     9.51      17       15

     Pro      5.15     5.45      14       14

    合计      100      100       262      243

                 表1

M₁、M₂的化学性质：

M₁、M₂的相对分子质量分别为26915和24831。二者都不是糖蛋白，均不含Cys及链内和链间二硫键，均为单成分、单体蛋白质。它们的生物催化活性中心由Glu、Asp、His和Trp残基组成。

它们的pI值为9.5-10。

以溶壁微球菌为底物时，M₁的K_m值为0.287mg/mL、V_max为666.67U/min，M₂的K_m值为0.1533mg/mL、V_max值为3333.33U/min。

反应活化能M₁为3945J/mol；M₂为35786.01J/mol。

M₁反应的温度为45-60℃、反应的pH为5-7；M₂反应的温度为35-55℃，反应的pH为6-8。M₁、M₂均在0-60℃、pH3.4-10.6范围内稳定。以N-乙酰葡萄糖胺为底物时，M₁反应的pH为3.6-5.6、M₂的为2.4-4.4；

贮藏稳定性：M₁、M₂的半衰期为180天，固体制剂年衰变率约为10％；

0.002％NaClO和24％H₂O₂能使M₁、M₂失去活性，木瓜蛋白酶可使M₁、M₂失去活性，

无机盐离子在浓度为50mmol/L以下对M₁、M₂活性呈促进，在50mmol/L以上表现为抑制作用，其中一价阳离子如Na⁺、K⁺、NH₄ ^-完全抑制的浓度为200mmol/L，二价阳离子如Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺完全抑制浓度为50mmol/L，NO₃ ^-能缓解阳离子的抑制作用。N-乙酰葡萄糖对M₁、M₂为竞争性抑制，His对M₁，M₂为反竞争性抑制剂，组胺对M₁、M₂为非竞争性抑制，咪唑对M₁、M₂也有抑制作用；

M₁、M₂的溶菌酶活力为3.0-3.5万U/mg蛋白质，M₁、M₂几丁质酶活力分别为24和47U/mL，M₃、M₄的几丁质酶活力为63和48U/mL；

M₁、M₂的活性中心含有Trp、His、Glu和Asp残基，这与其它溶菌酶不同，其中Trp残基参与了酶-底物复合物的形成；经过“诱导契合”和“底物变形”，His、Glu和Asp残基在有水存在时，参与催化过程中的电子、质子的传递而对底物行使催化作用。

M₁、M₂、M₃、M₄溶菌酶活力测定  M₁、M₂、M₃、M₄溶菌酶活力测定根据1952年Shugal的溶壁微球菌方法进行。测定结果M₁的溶菌酶活力3.0-4.0万U/mg蛋白，M₂的溶菌酶活力2.5-3.5U/mg蛋白。M₃、M₄测不出溶菌酶活力。

M₁、M₂、M₃、M₄几丁质酶活力测定

根据1993年陈崇顺、徐凤彩发表在植物资源与环境第2卷第2期上的“21科41种(变种)植物叶片几丁质酶系的研究”中的方法进行。测定结果为：M₁几丁质酶活力为22-25U/mL，M₂的几丁质活力为40-50U/mL。M₃几丁质酶活力为55-70U/mL，M₄几丁质酶活力为40-50U/mL。

M₁、M₂、M₃、M₄的蛋白质含量的测定方法  按1976年Bradford的考马斯亮蓝方法测定。测定结果：纯化了的M₁蛋白质含量为0.01-0.04mg/mL、纯化了的M₂蛋白质含量为0.01-0.02mg/mL、纯化了的M₃蛋白质含量为0.01-0.1mg/mL，纯化了的M₄蛋白质含量为0.001-0.015mg/mL。

M₁、M₂、M₃、M₄氨基酸的测定  氨基酸组成采用氨基酸自动分析仪测定。萝卜几丁质结合蛋白产品质量标准：

M₁活力回收约30％，纯化倍数约90倍，溶菌酶活力3.5万U/mg蛋白，几丁质酶活力25U/mL。M₂活力回收约70％，纯化倍数约70倍，溶菌酶活力3.1万U/mg蛋白，几丁质酶活力47U/mL。M₃几丁质酶活力62U/mL。M₄几丁质酶活力48U/mL。都达到电泳纯度。

萝卜几丁质结合蛋白的制备：

(1)取新鲜萝卜叶或块根洗净、凉干，投入灭活微生物菌液中诱导2-3天，洗净、凉干；(2)提取：于原料中加入1-1.5倍体积材料量的经过4℃预冷的NaHCO₃匀浆，过滤，滤液离心，收集上清液，为抽提液。(3)选择性变性：抽提液用HCl调至弱酸性，于恒温水浴中保温至抽提液达45-55℃后取出，流水冷却后低温离心。上清液用NaOH调至pH至7.0，低温离心，收集上清液。(4)超过滤  将上述上清液超过滤至原体积的1/4。(5)亲和层析：于上述超过滤至原体积1/4的浓缩液中加入1.5倍体积的壳聚糖凝胶，于4℃下搅拌吸附完全后，用自来水冲洗除去杂质，再用5mmol/LNaHCO₃平衡后装柱并用5mmol/LNaHCO₃洗涤至A₂₈₀≤0.1。用0.1mol/LHAc洗脱，收集洗脱液。(6)再超过滤：将收集的洗脱液超过滤至原体积的1/4。(7)CMC离子交换柱层析：上述浓缩液经内含0.005mol/L KCl的0.025mol/LpH5.4HAc-NaAc透析完全，上CMC柱，用内含0.05-0.4mol/LKCl的0.025mol/LpH5.4HAC-NaAc洗脱，收集洗脱液，洗脱液为萝卜几丁质结合蛋白，收集时3mL/管，6min/管，所收集的8-16管为蛋白质M₄，17-28管为蛋白质M₃，29-34管为蛋白质M₂，35-45管为蛋白质M₁，测定各蛋白质的蛋白质含量和酶活力，作为产品的质量标准。(8)将收集的各组分洗脱液，分别浓缩或冻干，浓缩的为蛋白质溶液，冻干的为冻干粉；蛋白质溶液的制备：将收集的各组分洗脱液，分别浓缩至原体积1/3，于浓缩液中加入保护剂和防腐剂可制成各种蛋白质溶液；蛋白质冻干粉的制备：将收集的各组分洗脱液真空冷冻干燥成各种蛋白质冻干粉。保护剂和防腐剂为NaF、甘油、乙醇、苯甲酸。各蛋白质浓缩液与保护剂和防腐剂按下列体积百分数混合：各蛋白质浓缩液为74.825％、0.01mol/LNaF为0.125％、甘油为20％、苯甲酸为0.05％、乙醇为5％；或各蛋白质浓缩液为79.95％、甘油为20％、苯甲酸为0.05％。

本发明的优点：

一.本发明以萝卜的根、叶为原料，原料来源容易、价廉，适应农副产品的综合开发利用。

二.本发明的工艺生产设备投资少，工艺简单。

三.本产品M₁、M₂、M₃、M₄的相对分子质量都小，都为单成分、单体蛋白，都是碱性蛋白，作用无须辅因子参与。产品稳定性高。产品的活性中心含有Trp、His、Glu和Asp残基，这与其它溶菌酶不同。

四.杀菌谱广，不仅对G⁺菌有杀灭作用，对G^-菌同样有杀灭作用，而且对真菌、酵母有极好抑菌作用，对昆虫也有一定杀伤作用。这也与其它溶菌酶不同。

五.M₁、M₂是既具有溶菌酶活力，又具有几丁质酶活力是双功能酶，M₃、M₄具有几丁质酶活力。

实例：

取新鲜萝卜叶或块根洗净、凉干，投入灭活微生物菌液中浸泡2-3天取出后洗净、凉干，取400g加入400mL 4℃下预冷的5mmol/LNaHCO₃，匀浆，尼龙布过滤，10000r/min4℃离心10min，取上清液，为抽提液，抽提液用1mol/L HCl调至pH5.4，于65℃恒温水浴中保温至抽提液达50℃后取出，流水冷却后，10000r/min 4℃离心10min。上清液用1mol/L NaOH调至pH7.0，10000r/min 4℃再离心10min，收集上清液。将上清液经超过滤至原体积的1/4。再于浓缩液中加入1.5倍体积的壳聚糖凝胶，于4℃下搅拌吸附1h后，用自来水冲洗除去杂质，用5mmol/LNaHCO₃平衡后装柱，并用5mmol/LNaHCO₃洗涤至A₂₈₀≤0.1.用0.1mol/LHAc洗脱，收集洗脱液。经超过滤的洗脱液浓缩至原体积的1/4。浓缩液用内含0.05mol/LKCl的0.025mol/LpH5.4HAc-NaAc透析6h后，上CMC柱。用含0.05-0.4mol/LKCl0.025mol/LpH5.4 Ac-NaAc洗脱，收集洗脱液，洗脱液为萝卜几丁质结合蛋白。收集时3mL/管、6min/管，并测定蛋白质含量和酶活力。所收集的洗脱液，8-16管为M₄、17-28管为M₃、29-34管为M₂、35-45管为M₁，各组分均为纯净萝卜几丁质结合蛋白。

本产品的分析结果如表2和表3。表2为萝卜几丁质结合蛋白的溶菌酶活力；表3为萝卜几丁质结合蛋白的四组分几丁质酶/溶菌酶活力对比。

步聚      总体积    总活力   总蛋白    比活力    蛋白质浓    纯化      活力回收

(mL)      (U)       (mg)     (U/mg)    度(mg/mL) 倍数        (％)

粗酶液    800       40000    1033      38.71     1.29        1         100

亲和层析  9.6       5.400    11        4583      1.15        118.38    126

M₁       9         10980    0.312     35197     0.035       909.23    27.45

M₂       11.3      28250    0.917     30798     0.018       795.59    70.625

M₃       11        0        0.77      0         0.07        0         0

M₄       10.4      0        0.104     0         0.01        0         0

                   表2

                                 M₁         M₂         M₃      M₄      HEWL

总几丁质酶活力(U/mL)             24.66       47.31       62       47.78    10.49

外切几丁质酶活力(U/mL)           9.81        14.03       21.69    11.53    2.34

内切几丁质酶活力(U/mL)           14.84       33.28       40.31    36.25    8.15

溶菌酶比活力(U/mg Pro)           73037.04    66095.89    0        0        4902.0

总几丁质酶所占百分数(％)         100         100         100      100      100

外切几丁质酶占百分数(％)         39.8        29.7        35.0     24.3     22.3

内切几丁质酶占百分数(％)         60.2        70.3        65.0     75.7     77.7

溶菌酶比活力/总几丁质酶比活力    99.97       122.38      0        0        521.49

                               表3

取上述各洗脱液50mL对0.066mol/L、pH6.2 PBS透析12h，超滤浓缩至15mL，取10mL加入2.5mL甘油、7ul苯甲酸，冻干机冻干，得0.7mg冻干粉，酶的比活力为3万U/mg蛋白。

另取5mL浓缩蛋白质溶液各加入8μL NaF(12.5mmol/L)、1.3mL甘油、0.3mL乙醇、3μL苯甲酸、即可制成4万U/mg蛋白溶液。

Claims (6)

1.萝卜几丁质结合蛋白，其特征在于：该种几丁质结合蛋白中的蛋白质M₁：为白色粉末，无毒、无味，易溶于水，其水溶液可达电泳纯：SDS-PAGE，具有蛋白质结构和性质，固体制品的灰分：常规法测定≤5％，水分：恒重法测定≤7％，既具有溶菌酶活力，又具有几丁质酶活力，是双功能酶；

化学性质：

相对分子质量为26915，不是糖蛋白，不含Cys及链内和链间二硫键，为单成分、单体蛋白质，它的生物催化活性中心由Glu、Asp、His和Trp氨基酸残基组成；

pI值为9.5-10；

以溶壁微球菌为底物时，Km值为0.287mg/mL、Vmax为666.67U/min；

反应活化能为3945J/mol；

反应的温度为45-60℃、反应的pH为5.0-7.0；在0-60℃、pH3.4-10.6范围内稳定，以N-乙酰葡萄糖胺为底物时，反应的pH为3.6-5.6；

贮藏稳定性；半衰期为180天，固体制剂年衰变率约为10％；

0.002％NaClO和24％H₂O₂能使其失去活性；

木瓜蛋白酶可使其失去活性；

无机盐离子在50mmol/L的浓度下对其活性呈促进，在50mmol/L的浓度以上时表现为抑制作用，其中一价阳离子如Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺完全抑制的浓度为200mmol/L，二价阳离子如Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺完全抑制浓度为50mmol/L，NO₃ ^-能缓解阳离子的抑制作用，N-乙酰葡萄糖对M₁为竞争性抑制，组胺对M₁为非竞争性抑制，His对M₁为反竞争性抑制，咪唑对M₁也有抑制作用；

M₁的溶菌酶比活力为3.0-4.0万U/mg蛋白、几丁质酶活力为22-25U/ml。

2.萝卜几丁质结合蛋白，其特征在于：该种几丁质结合蛋白中的蛋白质M₂：为白色粉末，无毒、无味，易溶于水，其水溶液可达电泳纯：SDS-PAGE，具有蛋白质结构和性质，固体制品的灰分：常规法测定≤5％，水分：恒重法测定≤7％，既具有溶菌酶活力，又具有几丁质酶活力，是双功能酶；

化学性质：

相对分子质量为24831，不是糖蛋白，不含Cys及链内和链间二硫键，为单成分、单体蛋白质，它的生物催化活性中心由Glu、Asp、His和Trp氨基酸残基组成；

pI值为9.5-10；

以溶壁微球菌为底物时，Km值为0.1533mg/mL、Vmax为3333.33U/min；

反应活化能为35786.01J/mol；

反应的温度为35-55℃、反应的pH为6.0-8.0；在0-60℃、pH3.4-10.6范围内稳定，以N-乙酰葡萄糖胺为底物时，反应的pH为2.4-4.4；

贮藏稳定性：半衰期为180天，固体制剂年衰变率约为10％；

0.002％NaClO和24％H₂O₂能使其失去活性；

木瓜蛋白酶可使其失去活性；

无机盐离子在50mmol/L的浓度下对M₂活性呈促进，在50mmol/L的浓度以上时表现为抑制作用，其中一价阳离子如Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺完全抑制的浓度为200mmol/L，二价阳离子如Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺完全抑制浓度为50mmol/L，NO₃ ^-能缓解阳离子的抑制作用，N-乙酰葡萄糖对M₂为竞争性抑制，组胺对M₂为非竞争性抑制，His对M₂为反竞争性抑制，咪唑对M₂也有抑制作用；

M₂的溶菌酶比活力为2.5-3.5万U/mg蛋白、几丁质酶活力为40-50U/ml。

3.萝卜几丁质结合蛋白的制备方法，其特征在于：(1)取新鲜萝卜叶或块根洗净、凉干，用灭活微生物菌液诱导2-3天，洗净、凉干；(2)提取：于原料中加入1-1.5倍体积材料量的经过4℃预冷的5mmol/LNaHCO₃匀浆，过滤，滤液离心，收集上清液，为抽提液；(3)选择性变性：将抽提液用HCl调至弱酸性，于恒温水浴中保温至抽提液达45-55℃后取出，流水冷却后4℃下离心，上清液用NaOH再调pH至7.0，4℃下离心，收集上清液，(4)超过滤：将上述上清液超过滤至原体积的1/4，(5)亲和层析：于上述超过滤至原体积1/4的浓缩液中加入1.5倍体积的壳聚糖凝胶，于4℃下搅拌吸附完全，用自来水冲洗除去杂质，用NaHCO₃平衡后装柱，并用NaHCO₃洗涤至A₂₈₀≤0.1，用0.1mol/LHAc洗脱，收集洗脱液，(6)再超过滤：将收集的洗脱液超过滤至原体积的1/4，(7)CMC离子交换柱层析：上述浓缩液经对内含0.05mol/L KCl的0.025mol/L pH5.4 HAc-NaAc透析完全，上CMC柱，用内含0.05-0.4mol/L KCl的0.025mol/L pH5.4HAc-NaAc洗脱，收集洗脱液，洗脱液为萝卜几丁质结合蛋白，收集时3ml/管，6min/管，29-34管为蛋白质M₂，35-45管为蛋白质M₁，(8)将收集的各组分洗脱液，分别浓缩或冻干，浓缩的为蛋白质溶液，冻干的为冻干粉。

4.根据权利要求3所说的萝卜几丁质结合蛋白的制备方法，其特征在于抽提液用1mol/L HCl调至pH5.4，于65℃温水浴中使抽提液达到50℃后取出。

5.根据权利要求3所说的萝卜几丁质结合蛋白的制备方法，其特征在于所说的流水冷却后4℃下离心得上清液，用1mol/LNaOH调至pH7.0。

6.根据权利要求3所说的萝卜几丁质结合蛋白的制备方法，其特征在于所说的经壳聚糖凝胶吸附后的蛋白质用NaHCO₃平衡后装柱，装柱后用NaHCO₃洗涤，其NaHCO₃的浓度为5mmol/L。