CN1170588C - 人肿瘤坏死因子α口服剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人肿瘤坏死因子α口服剂，含有表达人肿瘤坏死因子α(hTNFα)的念珠藻。本发明的口服剂毒性低，并可直接作用于消化道的肿瘤。

Description

人肿瘤坏死因子α口服剂

(一)技术领域

本发明涉及一种口服剂，具体地说，本发明涉及一种人肿瘤坏死因子α口服剂。

(二)背景技术

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα简称TNFα)是由激活的单核巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子。人的有活性的TNFα由3个分子量为17KDa的非糖蛋白单体构成单体呈片层折叠结构，它们之间通过一个Cys69-Cys101间的二硫键非共价组成体。不同种属哺乳动物来源的TNFα在一级结构上具有极高的同源性，在生物学活性上也无明显的种属特弃性。纯化的TNFα等电点在5.3左右；pH6-8时稳定；对酸敏感：对蛋白水解酶(胰蛋白酶、糜蛋白等)敏感；50％的饱和硫酸铵可使其沉淀。在反复冻融和无保护剂时，室温下失活。

TNFα基因为单拷贝基因。人的基因大小为2.67kb，定位于人第6号染色体。基因组由4个外显子和3个内含子组成；编码一个由233个氨基酸组成的前体蛋白、其前76个氨基酸为信号肽、使TNFα前体能跨膜存在于细膜上，通过降解后，分出含157个氨基酸的成熟蛋白、糖基化。人TNFα基因第1外显于编码81％的信号肽，第4外显子编码89％成熟型TNFα氨基酸序列。

用TNFα对肿瘤作临床的免疫治疗是十几年来发展较快的新型抗瘤疗法、对临床手术、放疗、化疗等常规手段是有效补充。这在美国、日本和德国都取得了较好的进展。美国的Genentech公司在临床试验中用TNFα治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌等方面居领先地位；Cetus公司把TNFα和IL-2联用开创了复合生物反应调节剂法。日本的重组产品已进入临床试验，对胸、腹水晚期转移癌、大肠癌、胆囊癌等取得了好的进展。德国BASF公司年产可达500g，德国用TNFα在胃肠道肿瘤、肝癌、卵巢肿瘤、乳腺癌等方面取得了成功，尤其在控制癌性胸腹水方面的疗效居世界前列。我国卫生部1998年初已批准上海、西安的5家单位开始临床试验。

临床上给药途径早年多为静脉、肌肉和皮下注射，近年来为了减轻TNFα的毒性，常采用局部注射或局部灌注方法，治疗中、晚期肿瘤。给药量从10μg/m²到400μg/m²。较多的治疗方案是2周为1疗程，每个疗程中连续5天给药，每天给50μg/m²。给药量主要取决于药效，通常80万单位/m²有效。

虽然1975年已分离、纯化了TNFα，并阐明了结构，1985年已经用大肠杆菌基因工程得到了TNFα的重组产品；但是至今TNFα还停留在临床阶段，世界各国的医药行政部门都未批准TNFα作为商品药，在市场上出售。这主要由于从最初的临床试验时发现，TNFα有严重的全身毒性作用，对人的毒性作用要比小鼠高20倍。

这种毒性作用主要表现在：发热(35-100％)，寒颤(70-100％)，恶心头痛(20-70％)。乏力(20-77％)、食欲下降(24-46％)，；还发生腹泻、血小板降低、白细胞减少、GTP上升、体液潴留、肌痛，甚至内毒素性休克。这就大大限制了了TNFα的临床应用剂量，严重影响其治疗肿瘤的效果。

至今能选择性地、又直接杀伤肿瘤的药物很少，癌症的死亡率仍高于其他各种疾病。TNFα被发现后大家对其抱有极大的希望。但全身毒性的严重性，限制了它的应用。十几年来各国学者正在千方百计降低TNFα的毒性，主要从两方面取得了一些进展：第一方面是改变给药途径。1990年前后，美国曾经试验用基因治疗，即把TNFα直接注入肿瘤组织。第二方面是用蛋白质工程技术对TNFα的结构进行改造，改构的目的是降低毒性和提高抗肿瘤。十几年来已突变成功了数十种TNFα的衍生物，其中有些毒性有明显得下降，而抗肿瘤活性有显著提高。虽然如此，各国仍然还在作临床试验。

(三)发明内容

针对目前存在的上述问题，本发明采用了蓝藻基因工程的方法以蓝藻为重组TNFα的宿主生产肿瘤坏死因子α。以降低毒性，并可直接作用于消化道的肿瘤。

本发明提供了一种人肿瘤坏死因子α口服剂，含有表达人肿瘤坏死因子α(hTNFα)的念珠藻。

本发明的口服剂中，所述的念珠藻最好是灰色念珠藻(Nostocmuscorum)。所述的编码该肿瘤坏死因子α(hTNFα)的cDNA可具有如图1所示的核苷酸序列。图1所示的TNFαcDNA与原来的有6个碱基不同：

氨基酸	Val	Arg	Ser	Arg	Gln
						蓝藻中的碱基	GT T	CGT(128，130)	TC T(133)	CG T(142)	GAG(561)
人体中的碱基	GTC	AGA	TCA	CGA	CGA

本发明的口服剂中，所述的表达人肿瘤坏死因子α的念珠藻可以是CGMCC 0461。

本发明的口服剂的用量以纯TNFα计为每人(成人)每天5-500μg，优选50-300μg，更优选100-200μg。

本发明的特点是利用蓝藻作为宿主，它不含内毒素，用它作为宿主生产重组产品可以简化下游工序。本发明还有的一个特点是，蓝藻本身含丰富的营养成分，所以以蓝藻为宿主生产的TNFα经过粗提取后可以直接口服。有利于药物的吸收，克服了注射药的许多缺欠。本发明的再一个特点是制备的口服剂十分稳定。在室温下放置15天，活性未受影响。而纯化制成的针剂只能保存在低温下，使用不方便。

(四)附图简要说明

图1是灰色念珠藻中的hTNFcDNA核苷酸序列及蛋白质氨基酸序列

依照本发明获得的转hTNF-α基因的转化的灰色念珠藻于2000年6月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京，中关村)，保藏号为CGMCC NO.0461。

(五)具体实施方式

实施例：

一  菌株及载体质粒1.  蓝藻藻种：Nostoc muscorum灰色念珠藻，由法国巴斯德研究所提供。2.大肠杆菌菌株：E.coli HB101作为转化质粒的受体菌。3.质粒：

(1)pRL-TC由本实验室构建，将rhTNF插入质粒pRL439的多克隆位点。pRL439上带有psbA启动子、氨苄青霉素抗性基因、以及非受损的bom区(转移必需区)(2)pDC-8。(3)RP4+pRL542 in E.coli HB101，是一种辅助质粒。

二  蓝藻的培养

蓝藻一般培养于液体培养基中，置于Gallenkamp型光照冷却旋转培养箱中摇振培养，转速130rpm，25-30℃，10天更换一次培养液，传代以1∶50接种。

纯化藻种时可采用划线分离和涂布分离的方法。在含有1.5％琼脂的固体培养基平板上，倒置照光培养，待出现单藻落后，光镜下确认藻种，重复划线纯化。

固体平板更适于蓝藻藻种的保存。将平板置于弱光下，室温可保存3-6个月。液体培养物静置于室温弱光下，两周更换一次培养液。收集10天的蓝藻培养物，加入灭菌甘油(终浓度为15％)，-70℃可保存两年以上。

转hTNF-α基因的Nostoc muscorum灰色念珠藻培养在含有新霉素25μg/ml的BG-11培养液中，培养方法与一般蓝藻相同。

三  穿梭表达载体pDC-TNF的构建过程

穿梭表达载体pDC-TNF的构建过程主要分2步：1)含有重组hTNFαcDNA全长的pRL-rhTNF质粒经XhoI酶切，在Klenow酶的作用下补平3’-末端后，继以EcoRI消化，回收包含hTNFαcDNA的700bp片段，将此片段定向插入到pRL-439载体上紧随启动子PpsbA之后的SmaI和EcoRI位点中，如此得到的重组质粒定名为pRL-TC；(2)用EcoRI/SalI双酶切分别消化pRL-TC和pDC-8，回收pRL-TC的800bp左右的含PpsbA及hTNFαcDNA的片段和pDC-8的9.0kb片段，连接后得到穿梭表达载体pDC-TNF。

四  转化和筛选灰色念珠藻

1.用三亲接合转移法转化灰色念珠藻

a.大肠杆菌的准备：

在20ml含有相应抗生素的LB培养液中接种含有穿梭表达载体的大肠杆菌及含有接合质粒RP4和辅助质粒pRL528的大肠杆菌，37℃摇菌过夜。4000rpm离心5min收菌，重悬于5ml普通LB培养液中。等体积混合两种菌液。

b.蓝藻的准备：

蓝藻培养物于4000rpm离心2min收集细胞，用培养液洗涤两次，再以适当体积的培养液悬浮藻细胞。

c.接合转移

将藻细胞与细菌混合后涂于混合纤维素酯微孔膜上，在无抗生素的固体培养基上培养2天后，置于含新霉素的培养基上继续光照培养直至转化子出现。

2.筛选和扩大培养转基因灰色念珠藻

将得到的转化子转入BG-11培养液其中含有新霉素，继续筛选并逐步扩大液体培养体积，经分子生物学检测后确定是否得到转hTNF-α基因的灰色念珠藻。将得到的转化的灰色念珠藻于2000年6月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京，中关村)，保藏号为CGMCC NO.0461。

五 产物的制备

取对数生长后期转hTNF-α基因的灰色念珠藻离心(转速6000r/min)收藻，用缓冲液洗涤沉淀2次，加入裂解液(50mmol Tris-Cl PH8.0)重悬沉淀，用液氮冻融3次，冰浴中超声10次(每次15-20s)，冷冻干燥此提取物。将冷冻干燥定量装入口服胶囊(100mg/胶囊)约含100μg纯hTNF-α，除藻细胞物质外不含其他添加剂。最好保存在低温中，在室温下15天未发现丧失活性。

六  转基因念珠藻表达产物的细胞毒活性

本发明将pDC-hTNFα表达载体成功地转化丝状体灰色念珠藻，得到了稳定表达的人肿瘤坏死因子(hTNFα)的转基因蓝藻。本实验通过检测转hTNF基因蓝藻表达产物中hTNFα的细胞毒活性，确定其表达产物的生物学活性及鉴定其体外药效。

1.hTNF基因念珠藻表达物的提取

1)粗提物制备

于藻细胞对数生长中后期离心收藻，用缓冲液洗2次，除去培养液，-20℃冷藏备用。制备时将藻细胞溶于缓冲液，经液氮反复冻融，冰水浴超声破碎。离心得上清粗提物。

2)EAE52纤维素离子交换层析

DEAE52纤维素离子交换层析，柱规格2cm×30cm，用洗脱液平衡。上述粗提取液经硫铵沉淀，溶液透析后上柱，分别以0M，0.1M，0.3M NaCl阶段洗脱。收集含hTNFα的活性峰、透析、真空冷冻干燥浓缩。

2.转hTNF基因念珠藻取物生物学活性

采用常规的L929细胞毒试验，检测TNFα活性(方法参见文献BryanT.Spofford，Raymond A.Daynes，Gale A.Granger，Cell-mediated immunityin vitro：A highly sensitive assay for human lymphotoxin J.Immunol.1974，112，6)。

L929细胞系(1-3×10⁴细胞/孔[PRMI 1640+10％小牛血清，0.2ml])，接种在96孔塑料培养板上，37℃，5％CO₂培养过夜(18hr)。弃净培养液，加入终浓度为0.4μg/ml放线菌素D，不同稀释度的灰色念珠藻提取物样品各50μl，每一浓度设3个平行孔，37℃继续保温，18hr后观察细胞存活情况。

弃测试样品，细胞用0.1ml 0.2％结晶紫乙醇-水溶液(2∶98，V/V)室温染色10min，用蒸馏水冲洗培养板，室温晾干。加0.1ml 1％SDS溶液裂解细胞，在酶联免疫检测仪上选OD630测定吸光值A，计算每组平均值和存活率。

％细胞毒活性＝1-(A_实验-A_本底)/(A_对照-A_本底)以杀死50％细胞的hTNF-α稀释度为一个活性单位。

3.粗提物的细胞毒活性

粗提物蛋白质浓度为5.472mg/ml，样品做不同稀释度处理，加入96孔板(2～3万个细胞/孔)处理后测定吸光度。计算样品对L929细胞的抑制率，根据公式推算活性单位。结果如表1。表明细胞毒活性60000U/ml，比活10900 U/mg。

重复实验：粗提物细胞毒活性55000 U/ml，比活10000 U/mg经常规的L929细胞毒法检测表明转hTNFα基因灰色念珠藻粗提取物具有TNFα活性。

4.过DEAE离子交换杆分离产物的细胞毒活性分离产物蛋白质含量0.04896mg/ml，对L929细胞毒活性检测结果表明DEAE离子交换柱分离产物比活160000U/mg。上述粗提物经DEAE52纤维素离子交换层析后，纯度提高了16倍。

           表1 不同稀释度基因表达产物的细胞毒活性测定

稀释倍数	A630			平均值	成活率
						10	0.083	0.091	0.087	0.087	0.00％
50	0.111	0.127	0.116	0.118	7.52％
						250	0.126	0.138	0.135	0.133	13.03％
1250	0.220	0.161	0.188	0.189	33.82％
						6250	0.222	0.236	0.230	0.229	48.38％
31250	0.295	0.274	0.233	0.267	62.32％
						156250	0.321	0.346	0.328	0.331	85.93％
781250	0.355	0.395	0.365	0.371	100.00％

七  转hTNFα基因灰色念珠藻制品的小鼠急性毒性

1.hTNFα基因灰色念珠藻(野生藻种来自法国巴斯德研究所)是用pDC-hTNF表达载体转化并得到稳定表达三年hTNF的转基因蓝藻，经细胞毒试验和免疫学方法鉴定其具有生物学活性。大量培养，收集藻细胞，用蒸馏水洗去培养液后经超声破碎后冷冻干燥制成干粉。无病菌健康昆明小鼠20只，体重18-22g，雌雄各半，由中国医学科学院肿瘤研究所试验动物室提供(该动物室获“北京市动物实验许可证”，所用种鼠获清洁动物合格证)。

2.急性毒性试验是指动物一日内单次或多次给药后在7天或14天中，连续观察动物所产生的毒性反应及死亡情况。我国临床前毒理评价要求，急性毒性试验的给药途径至少有一种与临床给药途径一致。毒性试验的观察应从定性和定量两方面进行。所谓定性观察就是观察服药的后动物的中毒表现等。所谓定量观察就是观察动物毒性反应与剂量的关系，主要指标：半数致死量(lethal dose 50，LD50)。当有些药物用最大允许浓度和最大允许容量给予动物时，仍未测出LD50，可只求MTD值，即用最大浓度和最大允许容量一次给20只小鼠后，连续观察7-14天，未见任何动物死亡，则MTD＞XX g/kg。(参见《新药临床前安全性评价与实践》)。本试验根据预试验结果，属后一种情况。因此采用最大浓度(25％，即25g干粉溶于100ml无菌生理盐水)的冷冻干燥制品，以0.2ml/10g体重的体积给小鼠灌胃。给药后连续14天观察小鼠体重、活动情况、毛发、粪便、食欲等变化并记录死亡数量及时间。

3.口服给药5g/kg体重后，连续14天观察20只受试小鼠无一只死亡，活动正常、生长良好，体重增加到28-38g。

4.试验结果表明：转hTNFα基因蓝藻制品配制最大浓度(25％)，一次给20只小鼠，经口服给药(po)，动物不产生死亡。测得最大耐受剂量(MTD)＞5g/kg。FDA认为，若剂量＞5g/kg时可视为无毒。因此，判断此hTNFα的转基因灰色念珠藻制品，对小鼠口服给药不显示毒性。

八  转hTNFα基因灰色念珠藻制品体内抗肿瘤活性

1. 用常规方法检测口服转hTNFα基因灰色念珠藻制品对小鼠可移植性肿瘤肉瘤S180实体瘤的抑瘤活性。试验分设空白对照组，转空载体念珠藻和两种剂量转hTNFα基因念珠藻制品组。健康昆明小鼠接种瘤细胞后第二天，分别口服灌胃给转hTNFα基因念珠藻制品或转空载体念珠藻，对照组给予0.4ml生理盐水，连续6～9次后处死动物，取瘤称重，计算平均瘤重和抑制率，并进行统计学处理。

2.前后进行了两次实验，两次实验结果均显示口服转hTNFα基因灰色念珠藻制品对小鼠S180实体瘤具有一定抗肿瘤活性。第一次实验给予转hTNFα基因灰色念珠藻制品1.25g/kg/天，共9次，对S180实体瘤的抑瘤率可达46.6％(生理盐水对照组瘤重/用药组瘤重＝1.03g/0.55g)。第二次实验给予转hTNFα基因灰色念珠藻制品2.5g/kg/天，共6次，对S180实体瘤的抑瘤率可达30.3％(转空载体念珠藻对照组瘤重/用药组瘤重＝1.81g/1.26g)，经统计学处理，两次实验P值均小于0.05，具有显著性差异，表明口服转hTNFα基因灰色念珠藻制品对S180实体瘤有效。同时，实验表明转空载体念珠藻对S180生长无影响。

Claims (4)

1.一种人肿瘤坏死因子α口服剂，含有表达人肿瘤坏死因子α的念珠藻(Nostoc)细胞或其裂解物。

2.按照权利要求1所述的口服剂，其中所述的念珠藻是灰色念珠藻(Nostoc muscorum)。

3.根据权利要求1所述的口服剂，其中，编码该肿瘤坏死因子α的cDNA有如下所示的核苷酸序列：5’  ATG GTT CGT TCT TCT TCT CGT ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA

 GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC

 CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG

 GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC

 ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC

 AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG

 GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG

 CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC

 TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG TGA 3’

4.按照权利要求1所述的口服剂，其中，所述的表达人肿瘤坏死因子α的念珠藻是CGMCC 0461。

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