CN1226305C - 一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质及其制备方法和用途，所述蛋白质为一碱性蛋白质，其分子量为65,000Da，等电点为8.3；所述的制备蛋白质的方法，是将沙蚕以人工海水养24-48小时，使其吐净内含物，再用5-10V直流电击沙蚕体壁获得体液，经离心、过滤处理后，依次以反相浓缩、凝胶过滤和阴离子交换柱层析洗脱，收集得到活性蛋白；所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的在制备抗菌或抗癌药物中的应用，是指在制备对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌或节杆菌有抑制作用的抗菌药物中的应用，及在制备抑制人肝癌细胞株增殖和产生甲胎蛋白的抗癌药物中的应用；该蛋白质抗菌活性高，抗癌效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质，及其该蛋白质的制备方法和用途。
背景技术
抗菌蛋白(antibacterial protein，简称为ABP)是动物免疫系统产生的一类抵抗外来病原体致病作用的防御性物质，具有许多优于目前使用的抗生素的特性。首先，它的抗菌谱广泛，对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌、真菌以及病毒等都有一定的杀灭或抑制作用；其次，连续使用抗菌蛋白很少产生耐药性，也不会和其他药物产生交叉耐药；再次，抗菌蛋白在自然界中来源广泛，而且易提取、成本低；最后，ABP的抗菌活性很高，对细菌的致死浓度均在umol。L-1级，对肿瘤细胞亦有选择性杀伤作用。
海洋生物由于种类多样性和地域分布广泛性其天然药用价值愈来愈受到重视，“向海洋要药”现已成为我国海洋产业研究攻关的热门。沙蚕在环节动物门多毛纲中是很重要的一个科，其生态分布从潮间带上部至深海带5023米都有分布，研究表明，除了较为关注的沙蚕抗血栓纤溶酶-沙蚕激酶外，沙蚕体内还含有β-胍基异丁酸、羟高铁血红素、磷酸脒基牛磺酸、海蚯蚓素等多种活性和药用成分，其应用开发前景十分广泛。但是，以沙蚕为原料制备的抗菌和抗癌的活性蛋白质的研发未得到应有的重视，国内外有关此方面研究报告和有关专利技术也鲜见。
发明内容
本发明的目的在于：填补以沙蚕为原料制备抗菌和抗癌的活性蛋白质的研发空白，从而提供一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质及其制备方法和用途。
本发明的目的是这样实现的：本发明的一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质，其特征在于，该蛋白质为一碱性蛋白质，其分子量为65,000Da，等电点为8.3，如图1所示。
本发明的一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的制备方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：
(1)将人工养殖的新鲜双齿围沙蚕放入人工海水中养24-48小时，使其吐净内含物；
(2)将吐净内含物的双齿围沙蚕洗净后，放在滤纸上快速吸干，再用5-10V直流电电击双齿围沙蚕体壁，并收集双齿围沙蚕分泌的体液；
(3)将收集到的双齿围沙蚕的体液置于超速离心机中离心，收集上清液，并过滤除菌；
(4)对过滤除菌后的上清液进行反相浓缩，收集浓缩液；
(5)将浓缩液用凝胶过滤柱进行层析，收集经层析得到的活性组分；
(6)对收集到的活性组分进行梯度洗脱后，得到活性蛋白，再对该活性蛋白进行脱盐、浓缩和冻干处理。
所述步骤(3)中的离心，是在4-10℃的条件下，将沙蚕体液置超速离心机中以108,000-120,000×g的转速离心20-30分钟。
所述步骤(4)中的反相浓缩，是将上清液对反相柱上样后用三氟乙酸冲洗，再用含三氟乙酸的乙腈溶液洗脱浓缩组分。
所述步骤(5)中的凝胶过滤柱层析，是将浓缩液重新悬浮后，上凝胶过滤柱洗脱。
所述步骤(6)中的梯度洗脱，是将凝胶过滤层析制备的活性组分上阴离子交换柱进行梯度洗脱。
本发明的一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的应用，其特征在于，该应用为在制备抗菌或抗癌药物中的应用。
所述的在制备抗菌药物中的应用是指在制备对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌或节杆菌有抑制作用的抗菌药物中的应用。
所述的在制备抗癌药物中的应用是指在制备抑制人肝癌细胞株增殖的抗癌药物中的应用。
所述的在制备抗癌药物中的应用是指制备抑制人肝癌细胞株产生甲胎蛋白的抗癌药物中的应用。
本发明的优点在于：本发明一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质及其制备方法和用途，以人工养殖的双齿围沙蚕为原料，用电击的方法获得双齿围沙蚕体液，取材容易、操作简便；制备方法细致严谨，重复性高；经检测，所制备的蛋白质抗菌活性高，且能抑制人肝癌细胞株HepG2增殖，能抑制人肝癌细胞株HepG2特征蛋白AFP(即甲胎蛋白)的分泌量。
本发明的目的、特征及优点将通过优选的实施例结合附图加以说明。
图面说明
图1是本发明从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱
图2是使用本发明制得的蛋白质处理人肝癌细胞株HepG2的OD值比较图
图3是使用本发明制得的蛋白质处理人肝癌细胞株HepG2的OD值的MTS标准曲线图
图4是不同浓度的本发明从双齿围沙蚕中提取的蛋白质对癌细胞的作用曲线图
图5是使用本发明制得的蛋白质处理人肝癌细胞株HepG2的AFP值比较图
图6是使用本发明制得的蛋白质处理人肝癌细胞株HepG2的AFP值的标准曲线图
图7是正常生长的人肝癌细胞株HepG2相差镜观察图
图8是低浓度的本发明从双齿围沙蚕中提取的蛋白质对人肝癌细胞株HepG2作用相差镜观察图
图9是高浓度的本发明从双齿围沙蚕中提取的蛋白质对人肝癌细胞株HepG2作用相差镜观察图
具体实施方式
实施例1
用本发明所述的制备方法从双齿围沙蚕中提取蛋白质，制备的具体步骤如下：
1、将人工养殖的新鲜沙蚕科NEREIDAE围沙蚕属PerinereisKinberg双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis Grube，放入海水晶配制的人工海水养24小时，使其吐净内含物；
2、将沙蚕洗净后，在滤纸上快速吸干，用5V直流电击沙蚕体壁，收集沙蚕分泌的体液；
3、将沙蚕体液置超速离心机中，在4°C时，以108,000×g离心30分钟，收集上清液，用0.20μm滤器过滤除菌。
4、将除菌后的上清液对Sep-Pak C18cartridge反相柱上样后，用0.1％(v/v)的三氟乙酸冲洗，再用含三氟乙酸80％(v/v)的的乙腈溶液洗脱，收集洗脱组分。
5、将上述洗脱组分以Dulbecco’s PBS(pH7.2)重新悬浮后，上凝胶过滤柱Sephadex G-75(1.6×90cm，以Dulbecco’s PBS(pH7.2)平衡)层析，收集层析组分。
6、将上述层析组分用阴离子交换柱DEAE-52(2.5×30cm，以0.02 M Tris-HCl(pH 8.0)平衡)进行梯度洗脱0-1.0 M NaClo，收集活性蛋白，脱盐、浓缩后冻干。
对从双齿围沙蚕中所提取的蛋白质做SDS-PAGE电泳图谱，结果如图1所示。
实施例2
用MTS/PMS(氮兰四唑盐/吩嗪硫酸甲酯)方法检测本发明的蛋白质对多种致病菌如大肠埃西氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等的抗菌活性；具体检测步骤如下：
(1)将按本发明方法制备的蛋白质以Dulbecco’s PBS(pH7.2)重新悬浮后，用Bradford法测定，再用RPMI 1640培养基稀释到60μg/ml；
(2)以大肠埃希氏菌Escherichia coli(CGMCC 1.1543)、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(CGMCC 1.50)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(CGMCC 1.879)和节杆菌Arthrobacter sp.(CGMCC 1.8)为材料，在96孔平底酶标板上每孔加150μl培养基、50μl细菌悬液(滴度为104cells/ml)培养24小时；
(3)在培养板选定48个实验组，每个实验组各加30μl活性蛋白(浓度为60μg/ml)，另外48个对照组加30μl磷酸盐缓冲液PBS，这样处理后，置96孔板于37℃继续温育24小时；
(4)再在每个孔中加入MTS/PMS溶液0.02ml，将培养板送回CO2培养箱培养1小时后取出，轻微振荡培养板1分钟，用酶标仪以490nm波长测定OD值，检测结果如表1所示：
表1
| 菌株 | 抗菌蛋白相对OD值(％) | 抗菌蛋白相对比活力(％) | Student-T检验(P值) | 抗菌蛋白最低抑制浓度(μg/ml) |
| 金黄色葡萄球菌 | 14.22±2.12 | 302.30±45.23 | 0.001 | 16 |
| 节杆菌 | 26.41±4.40 | 84.47±14.07 | 0.016 | 25 |
| 铜绿假单胞菌 | 32.17±7.03 | 185.66±29.01 | 0.032 | 50 |
| 大肠埃希氏菌 | 19.83±2.75 | 55.86±8.73 | 0.045 | 18 |
由表1可知，本发明所制备的蛋白质对多种致病菌有抗菌活性，其对各致病菌的最低抑制浓度均≤50μg/ml，特别是对临床上引起一些致死或慢性疾病如菌血症、尿道感染(UTI)和慢性肺炎的元凶-铜绿假单胞菌的抑制率达68.83％，而传统抗假单胞菌药物喹喏酮类的抑菌率仅有63.2-67.0％，显示了良好的应用前景。
以下实施例中所使用的癌细胞株为：人肝癌细胞株HepG2(ATCCHB8065)。该人肝癌细胞株是用MEM培养液(1000ml培养液中含青霉素10万单位、链霉素0.1g和胎牛血清100ml)在37℃下，用5％的CO2恒温培养，每2天或3天更换一次培养液，制备成本发明实施例中检测所用的人肝癌细胞株。
实施例3
用MTS/PMS(氮兰四唑盐/吩嗪硫酸甲酯)方法检测本发明的蛋白质对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响，具体检测步骤如下：
(1)将按本发明方法制备的蛋白质以Dulbecco’s PBS(pH7.2)重新悬浮后，用Bradford法测定，再用RPMI 1640培养基稀释到60μg/ml；
(2)以人肝癌细胞株HepG2为材料，根据MTS标准曲线和HepG2细胞生长曲线，将癌细胞按2×104个/ml接种于96孔培养板中，每孔加80μl癌细胞培养24小时；
(3)在培养板选定48个实验组，每个实验组各加20μl经步骤(1)制得的蛋白质，另外48个对照组加20μl磷酸盐缓冲液PBS，这样处理后继续培养24小时；
(4)再在每个孔中加入MTS/PMS溶液0.02ml，将培养板送回CO2培养箱培养4小时后取出，轻微振荡培养板1分钟，用酶标仪以490nm波长测定OD值，测定结果如图2所示。
实施例4
用MTS/PMS(氮兰四唑盐/吩嗪硫酸甲酯)方法检测本发明的蛋白质对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响，具体检测步骤如下：
(1)将蛋白质以Dulbecco’s PBS(pH7.2)重新悬浮后，测定蛋白量，用RPMI 1640培养基稀释到60μg/ml；
(2)以人肝癌细胞株HepG2为材料，根据MTS标准曲线和HepG2细胞生长曲线，将癌细胞按2×104个/ml接种于96孔培养板中，每孔加80μl癌细胞，培养24小时；
(3)在培养板选定48个实验组，每个实验组各加20μl经步骤(1)制得的蛋白质，另外48个对照组加20μl磷酸盐缓冲液PBS，这样处理后继续培养24小时；
(4)再将培养板以3000rpm离心5min，每孔取上清液50μl后，分别将50μl甲胎蛋白AFP标准品、本发明蛋白质加至相应孔中，再分别加入150μlAFP酶标记物；轻摇使充分混匀后，在37℃下温育1小时，倾去孔中反应液，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤都须甩尽孔中水珠，并将培养板拍干；
(5)再向每个孔中加入200μlTMB底物溶液，在室温下避光发色15分钟；最后，向每个孔中加入50μl的2M H2SO4终止反应，轻摇混匀，确保蓝色完全转变成黄色，用酶标仪以450nm波长测定OD值。
实施例5
用ELISA方法检测不同浓度的蛋白质对肝癌细胞AFP(甲胎蛋白)分泌量的影响，具体的检测步骤如下：
(1)通过阴离子交换柱层析获得的活性组分以Dulbecco’s PBS(pH7.2)重新悬浮后，以Bradford法测定蛋白量，用RPMI 1640培养基稀释到60μg/ml；
(2)以人肝癌细胞株HepG2为材料，根据MTS标准曲线和HepG2细胞生长曲线，将癌细胞按2×104个/ml接种于96孔培养板中，每孔加80μl癌细胞培养24小时；
(3)在培养板选定48个实验组，每个实验组各加20μl蛋白质，另外48个对照组加20μl磷酸盐缓冲液PBS，这样处理后继续培养24小时；
(4)再将培养板以3000rpm离心5min，每孔取上清液50μl，用ELISA-AFP(甲胎蛋白)试剂盒测定甲胎蛋白含量。
总之，实施例3-5中所测得的数据表明，用本发明方法以沙蚕为原料制备的蛋白质，能明显抑制人肝癌细胞株HepG2增殖，抑制率达82.3％，如图2所示，处理后癌细胞数只有2.21×104个/ml如图3所示；还能明显抑制人肝癌细胞株HepG2产生甲胎蛋白AFP，抑制率达60.6％，如图5所示，处理后癌细胞的甲胎蛋白AFP的含量只有81.28ng/ml，如图6所示。
另外，不同浓度的蛋白质与抑制人肝癌细胞株HepG2增殖的程度成正相关，如图4所示；不同浓度的蛋白质与抑制人肝癌细胞株HepG2产生的甲胎蛋白AFP的程度成正相关，见下表2：
表2
| 浓度(μg/ml) | AFP含量(ng/ml)( X±SE) |
| 20 | 81.28±1.72 |
| 10 | 107.15±2.49 |
| 5 | 164.44±2.19 |
| 2.5 | 186.37±2.37 |
| 对照 | 206.54±4.25 |
由表2可知，不同浓度的蛋白质作用于人肝癌细胞株HepG2，导致细胞膜破坏、细胞内容物泄出，最后癌细胞崩坏而死亡对比如图7、图8及图9可知，浓度越高的蛋白质抑制人肝癌细胞株HepG2的效果越好。
Claims (14)
1、一种从双齿围沙蚕中提取的蛋白质，其特征在于，该蛋白质为一碱性蛋白质，其分子量为65,000Da，等电点为8.3；其制备步骤包含：
(1)将人工养殖的新鲜双齿围沙蚕放入人工海水中养24-48小时，使其吐净内含物；
(2)将吐净内含物的双齿围沙蚕洗净后，放在滤纸上快速吸干，再用5-10V直流电电击双齿围沙蚕体壁，并收集双齿围沙蚕分泌的体液；
(3)将收集到的双齿围沙蚕的体液置于超速离心机中离心，收集上清液，并过滤除菌；
(4)对过滤除菌后的上清液进行反相浓缩，收集浓缩液；
(5)将浓缩液用凝胶过滤柱进行层析，收集经层析得到的活性组分；
(6)对收集到的活性组分进行梯度洗脱后，得到活性蛋白，再对该活性蛋白进行脱盐、浓缩和冻干处理。
2、按权利要求1所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质，其特征还在于，所述步骤(3)中的离心，是在4-10℃的条件下，将沙蚕体液置超速离心机中以108,000-120,000×g的转速离心20-30分钟。
3、按权利要求1所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质，其特征还在于，所述步骤(4)中的反相浓缩，是将上清液对反相柱上样后用三氟乙酸冲洗，再用含三氟乙酸的乙腈溶液洗脱浓缩组分。
4、按权利要求1所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质，其特征还在于，所述步骤(5)中的凝胶过滤柱层析，是将浓缩液重新悬浮后，上凝胶过滤柱洗脱。
5、按权利要求1所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质，其特征还在于，所述步骤(6)中的梯度洗脱，是将凝胶过滤层析制备的活性组分上阴离子交换柱进行梯度洗脱。
6、一种权利要求1所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的制备方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：
(1)将人工养殖的新鲜双齿围沙蚕放入人工海水中养24-48小时，使其吐净内含物；
(2)将吐净内含物的双齿围沙蚕洗净后，放在滤纸上快速吸干，再用5-10V直流电电击双齿围沙蚕体壁，并收集双齿围沙蚕分泌的体液；
(3)将收集到的双齿围沙蚕的体液置于超速离心机中离心，收集上清液，并过滤除菌；
(4)对过滤除菌后的上清液进行反相浓缩，收集浓缩液；
(5)将浓缩液用凝胶过滤柱进行层析，收集经层析得到的活性组分；
(6)对收集到的活性组分进行梯度洗脱后，得到活性蛋白，再对该活性蛋白进行脱盐、浓缩和冻干处理。
7、按权利要求6所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的制备方法，其特征还在于，所述步骤(3)中的离心，是在4-10℃的条件下，将沙蚕体液置超速离心机中以108,000-120,000×g的转速离心20-30分钟。
8、按权利要求6所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的制备方法，其特征还在于，所述步骤(4)中的反相浓缩，是将上清液对反相柱上样后用三氟乙酸冲洗，再用含三氟乙酸的乙腈溶液洗脱浓缩组分。
9、按权利要求6所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的制备方法，其特征还在于，所述步骤(5)中的凝胶过滤柱层析，是将浓缩液重新悬浮后，上凝胶过滤柱洗脱。
10、按权利要求6所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的制备方法，其特征还在于，所述步骤(6)中的梯度洗脱，是将凝胶过滤层析制备的活性组分上阴离子交换柱进行梯度洗脱。
11、一种权利要求1所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的应用，其特征在于，该应用为在制备抗菌或抗癌药物中的应用。
12、按权利要求11所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的应用，其特征还在于，所述的在制备抗菌药物中的应用是指在制备对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌或节杆菌有抑制作用的抗菌药物中的应用。
13、按权利要求11所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的应用，其特征还在于，所述的在制备抗癌药物中的应用是指在制备抑制人肝癌细胞株增殖的抗癌药物中的应用。
14、按权利要求11所述的从双齿围沙蚕中提取的蛋白质的应用，其特征还在于，所述的在制备抗癌药物中的应用是指制备抑制人肝癌细胞株产生甲胎蛋白的抗癌药物中的应用。
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