CN109954003B - 沙蚕精液胞浆素及其制备方法与应用 - Google Patents

沙蚕精液胞浆素及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种沙蚕精液胞浆素及其制备方法与应用。本发明对沙蚕精液胞浆素提取方法进行改进，提供了一种沙蚕精液胞浆素的制备方法，该方法制备的沙蚕精液胞浆素抑菌效果较强，并以此作为主要抑菌物质制备成沙蚕精液胞浆素栓剂、凝胶剂和软胶囊。

Description

沙蚕精液胞浆素及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种沙蚕精液胞浆素及其制备方法与应用，属于生物制药技术领域。
背景技术
妇科炎症是临床上常见病、多发病，常见的妇科炎症主要有阴道炎、宫颈炎、盆腔炎等，多为细菌、真菌、念珠菌、衣原体等病原体的感染，少为几种病原体的混合感染，且患者多数伴有免疫能力降低，而目前临床上常用的妇科炎症治疗药物一般只对其中一种或两种病原体有作用。而本发明对几种病原菌均有作用，从而对治疗妇科炎症有着更好作用。精液胞浆素是精液中的一种杀菌物质，本质为一类具有杀菌活性的蛋白质。
性成熟的沙蚕其体腔内为配子所充盈，外观十分饱满。在显微镜下可观察到体腔内的精子交错缠绕成束，在精子形成过程中，在精母细胞的细胞器中，高尔基体活性较低，多泡体有磷酸酶的活性，其在体外具有较强的溶菌活性，磷酸酶随精子逐渐释放到体外。
目前临床上常用的阴道栓剂的抑菌物质主要为抗生素，滥用抗生素栓剂治疗，会使病情加重。比如急性滴虫、真菌感染时，不能用腐蚀性的阴道栓剂；如果是急性阴道炎，用抗生素栓剂可促使炎症扩散。过多使用抗生素会使病菌产生耐药性，破坏阴道菌群间平衡，使治疗周期不断延长，特别是真菌感染用抗生素会加重感染症状。
本发明利用精液胞浆素作为药物制剂的主要抑菌物质。精液胞浆素不但对细菌和各种病原微生物有效，还具有增强免疫能力的作用，在用于治疗妇科炎症时，本发明可对妇科炎症予以治疗，对于妇科疾病的疗效有着积极的意义。通过从患者的阴道给药，药物直接作用于病变部位，避免口服给药可能产生的肝脏首过效应、对胃肠道的刺激性及静脉给药可能产生的血管黏膜刺激性，目前尚无有精液胞浆素阴道制剂的报道。
发明内容
为更佳高效地制备沙蚕精液胞浆素，提高抑菌效果，本发明对现有制备方法进行了改进，提供一种沙蚕精液胞浆素的制备方法。采用本发明方法制备的沙蚕精液胞浆素抑菌活性强，可进一步制成栓剂、凝胶剂、软胶囊等剂型，方便用药。
本发明技术方案如下，一种沙蚕精液胞浆素的制备方法，包括以下步骤：
取沙蚕精液或雄性沙蚕匀浆，低温离心，获得上清液；
向所得上清液中加入氯化钠解离，超滤，硫酸铵分级盐析沉淀；
所述硫酸铵分级盐析沉淀为先向所得超滤液中加入硫酸铵，使其浓度达到25％-30％(指硫酸铵在所述超滤浓缩液中的质量分数，下同)，盐析，去除沉淀；保留上清液，继续加入硫酸铵，使其浓度达到40％-50％，盐析，收集沉淀，得粗提物；
将所得粗提物采用高速逆流色谱法分离，收集活性组分，添加硫酸铵盐析，收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。
若无特殊指明，本发明所述低温离心一般是指在4℃左右，4000r/min离心40min左右。
进一步地，向所得上清液中加入氯化钠解离时是使氯化钠浓度达到3.0％-4.0％(指氯化钠在所述上清液中的质量分数)。解离时间一般为2.0-3.0h。可以通过搅拌处理加速盐析过程。本发明研究发现，通过加入氯化钠解离可以提高沙蚕精液胞浆素的抑菌活性，并且其活性在一定范围内随着氯化钠添加量的增加而升高，有利于结合的精液胞浆素游离到氯化钠盐溶液中。较佳的氯化钠添加量是氯化钠在所述上清液中的质量分数(浓度)为3.0％-4.0％。
进一步地，所述超滤浓缩是指将氯化钠解离后的含精液胞浆素的上清液用超滤系统进行处理，优选用膜截留分子量为20-40kD的滤膜超滤，收集超滤液。通过超滤可以截留分子量较大的蛋白，使精液胞浆素通过滤膜，起到纯化的精液胞浆素的作用。然后可进一步用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩，例如浓缩5-8倍。超滤可在在压力0.2-0.5MPa条件下进行。
进一步地，向所得超滤(浓缩)液中加入硫酸铵盐析时，优选加入预冷的饱和硫酸铵溶液。盐析优选在低温(例如4-6℃)条件下进行，例如一般可低温静置8-10h。可通过低温离心的方法去除和/或收集硫酸铵盐析沉淀。
进一步地，采用pH为8.5-9.0的14％-16％PEG1000和16％-18％磷酸钾组成的双水相体系进行高速逆流色谱法分离。
进一步地，采用高速逆流色谱法分离，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分。
进一步地，选取生理阶段为性成熟的雄性沙蚕成虫消毒后，获得其精液。优选采用鲜活的沙蚕。具体采用的沙蚕种类可为疣吻沙蚕(Tylorrhynchus heterochaetus)，俗称禾虫。
进一步地，将选取鲜活的性成熟的雄性沙蚕进行饥饿饲养(例如可置于清洁的流动海水中饥饿饲养12h)后再进行后续操作。
沙蚕消毒方法优选采用臭氧消毒。为进一步提高消毒效果，降低对沙蚕活性的影响，可将沙蚕放在臭氧浓度0.3-0.5mg/L的水中，并在此浓度下维持10-15min进行消毒。
为进一步提高沙蚕释放精液胞浆素含量及其活性，取沙蚕精液时可添加少量的性成熟的雌性沙蚕匀浆的上清液。一般可在添加性成熟的雌性沙蚕匀浆的离心上清液后4-6h收集沙蚕精液。可将沙蚕至于清洁海水中取清液。具体取精液方法可参照现有技术。
本发明所述雄性沙蚕匀浆可按常规方法制备，例如取按上述方法消毒后的性成熟的雄性沙蚕，置于预冷到8-10℃的清洁海水中(一般2.0-3.0L海水可加入1kg沙蚕)组织匀浆(时间一般为30-60s)，即可。
具体地，上述沙蚕精液胞浆素的制备方法，包括以下步骤：
1)选取生理阶段为性成熟的雄性沙蚕成虫进行饥饿处理后，消毒；
2)向清洁海水中添加消毒后的雄性沙蚕，然后添加少量的性成熟的雌性沙蚕匀浆离心上清液，收集沙蚕精液，低温离心，获得上清液；
3)搅拌条件下向步骤2)所得上清液加入氯化钠使其浓度达到3.0％-4.0％，盐析；用膜截留分子量为20-40kD的滤膜超滤，收集超滤液；然后进一步用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩，得浓缩液；
4)向步骤3)所得浓缩液中加入硫酸铵，使其浓度达到25％-30％，盐析，去除沉淀；保留上清液，继续加入硫酸铵，使其浓度达到40％-50％，盐析，收集沉淀，得粗提物；
5)采用pH为8.5-9.0的14％-16％PEG1000和16％-18％磷酸钾组成的双水相体系，将所得粗提物采用高速逆流色谱法分离，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分，添加硫酸铵盐析，收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。
较佳地，上述沙蚕精液胞浆素的制备，包括以下步骤：
1)预处理：取鲜活性成熟沙蚕雄虫，置于清洁流动海水中饥饿培养10-12h；然后置于清洁海水中，充入臭氧使海水中臭氧浓度为0.3-0.4mg/L，消毒10-15min；。
2)沙蚕精液释放：在遮光的环境中，将经过预处理后的雄性沙蚕置于清洁海水中，添加性成熟的雌性沙蚕匀浆的上清液(添加量一般为雄性沙蚕重量的0.5-2.0％)，促进雄性沙蚕释放精液，4-6h后收集沙蚕精液，低温离心(4000r/min，40min，4℃)除去沉淀，收集上清液；
或将经过预处理后的雄性沙蚕置于预冷到8-10℃的清洁海水中，(一般2.0-3.0L海水可加入1kg沙蚕)组织匀浆，(时间一般为30-60s)，低温离心(4000r/min，40min，4℃)除去组织碎片，收集上清液；
3)解离及超滤处理：搅拌条件下向步骤2)所得上清液加入氯化钠使其浓度达到3.0％-4.0％，搅拌2.0-3.0h，进行解离；用膜截留分子量为20-40kD的滤膜超滤，收集超滤液；然后进一步用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩，得浓缩液；
4)分级沉淀：向步骤3)所得浓缩液中加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使其浓度达到25％-30％，低温静置8-10h，盐析，低温离心(4000r/min，40min，4℃)去除沉淀；保留上清液，继续加入预冷的饱和硫酸铵溶液硫酸铵，使其浓度达到40％-50％，低温静置8-10h，盐析，收集沉淀，得粗提物；
5)高速逆流色谱分离：采用pH为8.5-9.0的14％-16％PEG1000和16％-18％磷酸钾双水相体系进行分离精液胞浆素，以上相为固定相，下相为流动相，控制流速为1.5-2.5ml/min，转速为800-900r/min，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分，浓缩后添加硫酸铵至浓度为40-45％，低温静置8-10h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。
本发明还包括上述方法制备的沙蚕精液胞浆素，其具有较强的抑菌活性，可作为阴道栓剂、凝胶剂和软胶囊的抑菌成分。
本发明还包括上述方法制备的沙蚕精液胞浆素在制药方面的用途，尤其是制备具有抑菌作用的药物方面的用途。
本发明还包括含有上述方法制备的沙蚕精液胞浆素为活性成分的药物制剂，具体可为栓剂、凝胶剂、软胶囊剂等剂型。
具体地，本发明提供一种(阴道)栓剂，包括如下重量份的组分：
上述方法制备的沙蚕精液胞浆素1-10份
基质80-100份
甘油40-60份
水溶性壳聚糖1-10份
蒸馏水20-60份
氯化钙0.1-0.5份
氯化镁0.1-0.5份；
优选地，所述栓剂包括如下重量份的组分：
上述方法制备的沙蚕精液胞浆素4-6份
基质85-90份
甘油45-50份
水溶性壳聚糖2-4份
蒸馏水30-40份
氯化钙0.1-0.2份
氯化镁0.1-0.2份。
进一步地，所述栓剂的基质选自明胶、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000中的一种或任意几种的组合。
所述栓剂可采用本领域常规方法制备而成。例如具体制备方法包括：称取处方量的基质，以适量蒸馏水浸泡，使之膨胀变软，再加入甘油和水溶性壳聚糖，水浴中使明胶、甘油和水溶性壳聚糖溶解均匀，置于121℃压力锅内，热压灭菌10-30分钟；使用适量蒸馏水溶解氯化钙和氯化镁溶液，然后溶解蛋白质配制成蛋白质溶液；将灭菌过的基质溶液温度降至45-55℃时加入蛋白质溶液，混匀，注入阴道栓磨具中，制成适宜规格，于4℃条件下内冷却，凝固成型，去除包装，即得成品。
具体地，本发明还提供一种(阴道)凝胶剂，包括以下重量份的组分：
上述方法制备的沙蚕精液胞浆素20-30份
海藻酸钠20-40份
明胶30-50份
水溶性壳聚糖4-6份
氯化钙0.5-1.0份
氯化镁0.5-1.0份
蒸馏水900份。
所述凝胶剂可采用本领域常规方法制备而成。例如具体制备方法包括：称取处方量的海藻酸钠、明胶和水溶性壳聚糖溶液，加入适量的蒸馏水中，置于70-80℃条件下，磁力搅拌至完全溶解，得到各组分水溶液，并采用进行Co60辐照灭菌，
灭菌剂量为20-30kGy。将沙蚕精液胞浆素添加到溶解氯化钙和氯化镁的溶液中，并与降温至35℃的海藻酸钠溶液、水溶性壳聚糖溶液混合，然后通过高频振荡分散混匀，最后添加明胶高频振荡混匀，无菌分装，获得产品。
具体地，本发明还提供一种(阴道)软胶囊，包括以下重量份的组分：
上述方法制备的沙蚕精液胞浆素：20-30份
聚乙二醇4000：15-20份
聚乙二醇200：50-60份
氯化钙：0.5-1.0份
氯化镁：0.5-1.0份
蒸馏水：10份。
所述软胶囊可采用本领域常规方法制备而成。例如具体制备方法包括：称取处方量的聚乙二醇4000和聚乙二醇200在水浴中加热至30℃，边溶解边搅拌，使聚乙二醇4000均匀的溶解在聚乙二醇200中，冷却至20-25℃，聚乙二醇凝胶；将沙蚕精液胞浆素添加到溶解氯化钙和氯化镁的溶液中，并与聚乙二醇凝搅拌混匀，然后通过胶体磨研细并且混合均匀，得到的混合物罐装到软胶囊内，干燥后包装。
本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
综上所述，本发明具有如下优点：
1.本发明药物制剂的主要抑菌物质为沙蚕精液胞浆素，其为天然抑菌物质，与抗生素类抑菌物质相比，其具有较低细菌耐药性产生率，也可降低因抗生素滥用产生的危害。
2.本发明药物制剂中，通过添加Ca2+和Mg2+离子起到保护精液胞浆素的作用，可维持其在较长时间内保持较高的抑菌活性。
附图说明
图1为实施例1沙蚕精液胞浆素高速逆流色谱吸光度图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
采用如下方法制备沙蚕精液胞浆素：
1、样品预处理：称取鲜活性成熟的疣吻沙蚕雄虫俗称禾虫(Tylorrhynchusheterochaetus)2kg，置于过滤后流动海水中饥饿培养12h，饥饿处理后将沙蚕置于经过滤净化的海水中，并用臭氧发生器向水中充入臭氧，使水中臭氧浓度0.3mg/L，并在此浓度下维持13min。
2、沙蚕精液释放：在遮光的房间内，将经过预处理后的雄性沙蚕放到5L灭菌后过滤的海水中，添加运浆后的性成熟的雌性沙蚕20g，促雄性沙蚕释放精子，4h后低温离心(4000r/min，40min，4℃)除去沉淀，收集上层清液。
3、解离及超滤处理：取上清液边加入氯化钠边搅拌使氯化钠浓度为3.0％，并继续搅拌2.0h，进行解离提取。将含精液胞浆素的上清液用超滤系统进行处理，在压力0.2MPa的条件下，膜截留分子量为30kD，收集膜过滤液；在压力0.2MPa的条件下，再用截留分子量为3kD的膜进行浓缩5倍。
4、分级沉淀：向预冷的上述超滤液中缓慢加入硫酸铵，边搅拌便加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度为28％，低温静置8.0h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)去除沉淀；向上述上清液中继续加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使溶液中的硫酸铵浓度达到43％，低温静置8.0h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻保存。
5、高速逆流色谱分离：分离采用版制备型高速逆流色谱TBE-300V，采用pH为8.6的15％PEG1000和17％磷酸钾盐双水相体系分离精液胞浆素，以上相为固定相，下相为流动相，控制流速为2.0ml/min，转速为850r/min，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的组分(即图1组分2)，浓缩后添加硫酸铵至浓度为43％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻干燥后低温保存，获得沙蚕精液胞浆素。
本实施例还提供一种栓剂，其以本实施例制备的沙蚕精液胞浆素为活性成分，具体配方如下：
沙蚕精液胞浆素5份
明胶90份
甘油50份
水溶性壳聚糖3份
蒸馏水30份
氯化钙0.1份
氯化镁0.1份。
该栓剂制备方法：称取处方量的明胶，以适量蒸馏水浸泡，使之膨胀变软，再加入甘油和水溶性壳聚糖，水浴中使明胶、甘油和水溶性壳聚糖溶解均匀，置于121℃压力锅内，热压灭菌10-30分钟；使用适量蒸馏水溶解氯化钙和氯化镁溶液，然后溶解蛋白质配制成蛋白质溶液；将灭菌过的基质溶液温度降至45-55℃时加入蛋白质溶液，混匀，注入阴道栓磨具中，制成适宜规格，于4℃冷库内冷却，凝固成型，去除包装，即得成品。
本实施例还提供一种凝聚剂，其以本实施例制备的沙蚕精液胞浆素为活性成分，具体配方如下：
沙蚕精液胞浆素25份
海藻酸钠30份
明胶35份
水溶性壳聚糖5份
氯化钙0.6份
氯化镁0.6份
蒸馏水900份。
该凝胶剂制备方法：称取处方量的海藻酸钠、明胶和水溶性壳聚糖溶液，加入适量的蒸馏水中，置于70-80℃条件下，磁力搅拌至完全溶解，得到各组分水溶液，并采用进行Co60辐照灭菌，灭菌剂量为20-30kGy。将沙蚕精液胞浆素添加到溶解氯化钙和氯化镁的溶液中，并与降温至35℃的海藻酸钠溶液、水溶性壳聚糖溶液混合，然后通过高频振荡分散混匀，最后添加明胶高频振荡混匀，无菌分装，获得产品。
本实施例还提供一种软胶囊剂，其以本实施例制备的沙蚕精液胞浆素为活性成分，具体配方如下：
沙蚕精液胞浆素25份
聚乙二醇4000 18份
聚乙二醇200 45份
氯化钙0.8份
氯化镁0.8份
蒸馏水10份。
该软胶囊制备方法：称取处方量的聚乙二醇4000和聚乙二醇200在水浴中加热至30℃，边溶解边搅拌，使聚乙二醇4000均匀的溶解在聚乙二醇200中，冷却至20-25℃，聚乙二醇凝胶；将沙蚕精液胞浆素添加到溶解氯化钙和氯化镁的溶液中，并与聚乙二醇凝胶搅拌均匀，然后通过胶体磨研细并且混合均匀，得到的混合物罐装到软胶囊内，干燥后包装。
实施例2
采用如下方法制备沙蚕精液胞浆素：
1.样品预处理：称取鲜活性成熟的疣吻沙蚕雄虫俗称禾虫(Tylorrhynchusheterochaetus)，置于过滤后流动海水中饥饿培养12h，饥饿处理后将沙蚕置于经过滤净化的海水中，并用臭氧发生器向水中充入臭氧，使水中臭氧浓度0.4mg/L，并在此浓度下维持10min。
2、沙蚕精液释放：在遮光的房间内，将经过预处理后的雄性沙蚕放到过滤除菌的海水中，添加量为4L，运浆后的性成熟的雌性沙蚕添加比例为雄性沙蚕的10g，促雄性沙蚕释放精子，4h后低温离心(4000r/min，40min，4℃)除去沉淀，收集上层清液。
3、解离及超滤处理：取上清液边加入氯化钠边搅拌使氯化钠的浓度维持在3.5％，并继续搅拌3h，进行解离提取。含精液胞浆素的上清液用超滤系统进行处理，在压力0.2MPa的条件下，膜截留分子量为20kD，收集膜过滤液；在压力0.2MPa的条件下，再用截留分子量为1kD的膜进行浓缩5倍。
4、分级沉淀：向预冷的上述超滤液中缓慢加入硫酸铵，边搅拌便加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度为25％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)去除沉淀；向上述上清液中继续加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使溶液中的硫酸铵浓度达到40％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻保存。
5、高速逆流色谱分离：分离采用制备型高速逆流色谱TBE-300V，采用pH为8.8的14％PEG1000和16％磷酸钾盐双水相体系分离精液胞浆素，以上相为固定相，下相为流动相，控制流速为1.5ml/min，转速为800r/min，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的组分，浓缩后添加硫酸铵至浓度为45％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻干燥后低温保存，获得沙蚕精液胞浆素。
本实施例还提供一种栓剂，其以本实施例制备的沙蚕精液胞浆素为活性成分，具体配方如下：
沙蚕精液胞浆素3份
聚乙二醇4000 90份
甘油50份
水溶性壳聚糖3份
蒸馏水30份
氯化钙0.1份
氯化镁0.1份。
栓剂制备方法与实施例1相同。
实施例3
采用如下方法制备沙蚕精液胞浆素：
1.样品预处理：称取鲜活性成熟的疣吻沙蚕雄虫俗称禾虫(Tylorrhynchusheterochaetus)，置于过滤后流动海水中饥饿培养12h，饥饿处理后将沙蚕置于经过滤净化的海水中，并用臭氧发生器向水中充入臭氧，使水中臭氧浓度0.3mg/L，并在此浓度下维持15min。
2、沙蚕精液释放：在遮光的房间内，将经过预处理后的雄性沙蚕放到过滤除菌的海水中，添加量为6L，运浆后的性成熟的雌性沙蚕添加比例为雄性沙蚕的40g，促雄性沙蚕释放精子，4h后低温离心(4000r/min，40min，4℃)除去沉淀，收集上层清液。
3、解离及超滤处理：取上清液边加入氯化钠边搅拌使氯化钠浓度维持在4％，并继续搅拌2h，进行解离提取。含精液胞浆素的上清液用超滤系统进行处理，在压力0.2MPa的条件下，膜截留分子量为40kD，收集膜过滤液；在压力0.2MPa的条件下，再用截留分子量为5kD的膜进行浓缩5倍。
4、分级沉淀：向预冷的上述超滤液中缓慢加入硫酸铵，边搅拌便加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度为30％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)去除沉淀；向上述上清液中继续加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使溶液中的硫酸铵浓度达到45％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻保存。
5、高速逆流色谱分离：分离采用制备型高速逆流色谱TBE-300V，采用pH9.0的16％PEG1000和18％磷酸钾双水相体系分离精液胞浆素，以上相为固定相，下相为流动相，控制流速为2.5ml/min，转速为900r/min，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的组分，浓缩后添加硫酸铵至浓度为45％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻干燥后低温保存，获得沙蚕精液胞浆素。
本实施例还提供一种栓剂，其以本实施例制备的沙蚕精液胞浆素为活性成分，具体配方如下：
沙蚕精液胞浆素5份
明胶90份
甘油50份
水溶性壳聚糖3份
蒸馏水30份
氯化钙0.1份
氯化镁0.1份。
栓剂制备方法与实施例1相同。
实施例4
采用如下方法制备沙蚕精液胞浆素：
步骤1-2与实施例1相同；
3、解离及超滤处理：取上清液边加入氯化钠边搅拌使氯化钠浓度维持在4％，并继续搅拌30min，进行解离提取。含精液胞浆素的上清液用超滤系统进行处理，在压力0.2MPa的条件下，膜截留分子量为20kD，收集膜过滤液；在压力0.2MPa的条件下，再用截留分子量为5kD的膜进行浓缩5倍。
4、分级沉淀：向预冷的上述超滤液中缓慢加入硫酸铵，边搅拌便加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度为30％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)去除沉淀；向上述上清液中继续加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使溶液中的硫酸铵浓度达到40％，低温静置8h，低温离心(4000r/min，40min，4℃)收集沉淀，冷冻保存。
步骤5-6与实施例1相同。
实施例5
采用如下方法制备沙蚕精液胞浆素：
步骤1与实施例4相同；
2、沙蚕精液释放：将消毒后的沙蚕放入到提前预冷到8-10℃的过滤除菌的海水中，添加量为5L，组织匀浆时间为60s，低温离心(4000r/min，40min，4℃)除去组织碎片，收集上层清液。
步骤3-6与实施例4相同。
实验例1抑菌活性试验
实验材料：实施例1制备的沙蚕精液胞浆素，洁尔阴洗液(四川省成都恩威制药有限公司，批号：1406069)。
菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌。
方法：采用药物琼脂平皿法，制备分别含有150、100、50、10、5、2.5mg/mL精液胞浆素及洁尔阴的培养基和不含药物的培养基，即药物营养琼脂平皿、药物沙氏培养基。取接种大肠杆菌18h的培养液分别接种于不同浓度的药物营养琼脂平皿中，同法将金黄色葡萄球菌接种于药物琼脂培养基中，将白色念珠菌接种于药物沙氏培养基中；对照培养基不含药物，但接种相应的菌。置于37℃条件下培养并于不同时间进行观察，观察结果详见表1。
表1精液胞浆素与洁尔阴对照阴道致病菌的体外抑菌实验结果
Figure BDA0002048819010000131
“+”表示抑菌环小于12mm或无抑菌环；“-”表示抑菌环在12-18mm。
结果，一定浓度精液胞浆素和洁尔阴对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等阴道致病菌均有抑制作用，实验结果提示精液胞浆素对阴道致病菌有较强的抑菌作用，且效果优于洁尔阴。
实验例2给药刺激性试验
本实验为了观察精液胞浆素与阴道壁接触后所产生的刺激反应，观察局部接触精液胞浆素阴道栓剂、凝胶剂和软胶囊所产生的刺激反应，评价沙蚕精液胞浆素药物制剂的刺激性。
取健康的雌性大耳白兔35只，随即分为7组，分别为空白对照组(不给药)、基质对照组1(除不含活性成分沙蚕精液胞浆素外，配方同实施例1栓剂)、基质对照组2(除不含活性成分沙蚕精液胞浆素外，配方同实施例1凝胶剂)、基质对照组3(除不含活性成分沙蚕精液胞浆素外，配方同实施例1软胶囊剂)、实施例1栓剂实验组、实施例1凝胶剂实验组、实施例1软胶囊实验组。试验采用重复给药的方式，每天定时给药1次，连续给药7天，每天保持各受试物与家兔阴道接触4小时以上，停用0、1、7天后处死家兔，取其阴道组织进行观察和病理检测。与空白对照组相比，基质对照组和实验组家兔未见明显的不适。肉眼观察，各实验组的家兔阴道及周围组织间均未见有明显充血、水肿及分泌物的异常改变，与基质对照组和空白对照组无明显差异。经病理学切片检查，各实验组阴道组织正常，粘膜上皮、肌层均未见病理组织学改变。实验结果表明，本发明药物制剂对家兔阴道粘膜无明显的刺激性。
实验例3给药药效学试验
选取经诊断为女性妇科炎症-细菌真菌混合感染的阴道炎患者6例，随机分为3组，每组2人，分别给予实施例1制备的栓剂、凝胶剂和软胶囊。试验者每晚阴道给药1剂，共给药12天，观察结果。结果显示，在使用过程中，3组患者均未见明显的不良反应，12天后6例患者均痊愈。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种沙蚕精液胞浆素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取沙蚕精液，低温离心，获得上清液；
向所得上清液中加入氯化钠解离，超滤，硫酸铵分级盐析沉淀；
氯化钠解离时使所得上清液中氯化钠浓度达到3.0%-4.0%；解离时间为2.0-3.0h；
所述超滤选用膜截留分子量为20-40kD的滤膜；进一步将超滤液用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩；
所述硫酸铵分级盐析沉淀为先向所得超滤液中加入硫酸铵，使其浓度达到25%-30%，盐析，去除沉淀；保留上清液，继续加入硫酸铵，使其浓度达到40%-50%，盐析，收集沉淀，得粗提物；
将所得粗提物采用pH为8.5-9.0的14%-16%PEG1000和16%-18%磷酸钾组成的双水相体系进行高速逆流色谱法分离；在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分添加硫酸铵盐析，收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）选取生理阶段为性成熟的雄性沙蚕成虫进行饥饿处理后，消毒；
2）向清洁海水中添加消毒后的雄性沙蚕，然后添加少量的性成熟的雌性沙蚕匀浆离心上清液，收集沙蚕精液，低温离心，获得上清液；
3）搅拌条件下向步骤2）所得上清液加入氯化钠使其浓度达到3.0%-4.0%，解离；用膜截留分子量为20-40kD的滤膜超滤，收集超滤液；然后进一步用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩，得浓缩液；
4）向步骤3）所得浓缩液中加入硫酸铵，使其浓度达到25%-30%，盐析，去除沉淀；保留上清液，继续加入硫酸铵，使其浓度达到40%-50%，盐析，收集沉淀，得粗提物；
5）采用pH为8.5-9.0的14%-16%PEG1000和16%-18%磷酸钾组成的双水相体系，将所得粗提物采用高速逆流色谱法分离，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分，添加硫酸铵盐析，收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）预处理：取鲜活性成熟沙蚕雄虫，置于清洁流动海水中饥饿培养10-12h；然后置于清洁海水中，充入臭氧使海水中臭氧浓度为0.3-0.4mg/L，消毒10-15min；
2）沙蚕精液释放：在遮光的环境中，将经过预处理后的雄性沙蚕置于清洁海水中，添加性成熟的雌性沙蚕匀浆的上清液，促进雄性沙蚕释放精液，4-6h后收集沙蚕精液，低温离心除去沉淀，收集上清液；
3）解离及超滤处理：搅拌条件下向步骤2）所得上清液加入氯化钠使其浓度达到3.0%-4.0%，搅拌2.0-3.0h，解离；用膜截留分子量为20-40kD的滤膜超滤，收集超滤液；然后进一步用截留分子量为1-5kD的滤膜进行浓缩，得浓缩液；
4）分级沉淀：向步骤3）所得浓缩液中加入预冷的饱和硫酸铵溶液，使其浓度达到25%-30%，低温静置8-10h，盐析，低温离心去除沉淀；保留上清液，继续加入预冷的饱和硫酸铵溶液硫酸铵，使其浓度达到40%-50%，低温静置8-10h，盐析，收集沉淀，得粗提物；
5）高速逆流色谱分离：采用pH为8.5-9.0的14%-16%PEG1000和16%-18%磷酸钾双水相体系进行分离精液胞浆素，以上相为固定相，下相为流动相，控制流速为1.5-2.5ml/min，转速为800-900r/min，在检测波长为280nm下收集保留时间为80-120min的活性组分，浓缩后添加硫酸铵至浓度为40-45%，低温静置8-10h，低温离心收集沉淀，冷冻干燥，获得沙蚕精液胞浆素。
4.权利要求1-3任一项所述方法制备的沙蚕精液胞浆素。
5.权利要求4所述沙蚕精液胞浆素在制药方面的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，是在制备具有抑菌作用的药物方面的用途。
7.一种栓剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
权利要求4所述沙蚕精液胞浆素1-10份
基质80-100份
甘油40-60份
水溶性壳聚糖1-10份
蒸馏水20-60份
氯化钙0.1-0.5份
氯化镁0.1-0.5份。
8.根据权利要求7所述的栓剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
所述沙蚕精液胞浆素4-6份
基质85-90份
甘油45-50份
水溶性壳聚糖2-4份
蒸馏水30-40份
氯化钙0.1-0.2份
氯化镁0.1-0.2份。
9.根据权利要求7或8所述的栓剂，其特征在于，所述基质选自明胶、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000中的一种或任意几种的组合。
10.一种凝胶剂，其特征在于，由以下重量份的组分组成：
权利要求4所述沙蚕精液胞浆素 20-30份
海藻酸钠 20-40份
明胶 30-50份
水溶性壳聚糖 4-6份
氯化钙 0.5-1.0份
氯化镁 0.5-1.0份
蒸馏水 900份。
11.一种软胶囊，其特征在于，由包括以下重量份的组分组成：
权利要求4所述沙蚕精液胞浆素： 20-30份
聚乙二醇4000： 15-20份
聚乙二醇200： 50-60份
氯化钙： 0.5-1.0份
氯化镁： 0.5-1.0份
蒸馏水： 10份。
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