KR101156082B1 - 젖소 유방염 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정제봉독, 키토산 및 프로폴리스를 포함하는 젖소 유방염 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 상용봉독, 키토산 또는 프로폴리스 단독에 비해 상승된 효과를 나타내므로, 젖소 유방염 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

젖소 유방염 치료용 조성물{Composition for treating bovine mastitis}

본 발명은 정제봉독, 키토산 및 프로폴리스를 포함하는 젖소 유방염 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 분자량 5,000 이상의 정제봉독을 키토산 및 프로폴리스가 함유된 용해액에 녹여 제조한, 젖소 유방염 치료용 조성물에 관한 것이다.

젖소 유방염(bovine mastitis)은 세균이나 곰팡이가 젖소 유방 내에 침입하여 염증을 일으키는 질병으로서 젖소 질병 중 가장 많이 발생되며, 우유 중에 체세포수가 증가하여 유질이 저하되고 유량감소, 치료비 지출 등 경제적 손실이 매우 큰 질병이다. 전 세계적으로 젖소의 질병 중 가장 빈번하여 막대한 경제적 손실을 가져오기 때문에 그 치료를 위하여 수많은 연구들이 다각적으로 수행되고 있다. 임상형 유방염(clinical mastitis)은 고름 등의 침전물이 원유 내에 존재하여 쉽게 육안으로 식별할 수 있는 유방염으로 젖소의 약 5.5%가 감염되어 있다. 임상 증상은 유방이 붓고 열이 나며 통증과 유방기능 장애를 유발하고 유즙 변화가 육안적으로 쉽게 구별되는 상태로서 화농되면 우유와 함께 고름이 섞여 나오기도 한다. 준임상형 유방염(subclinical mastitis)은 유방염에 감염되어 있으나 육안으로는 확인할 수 없는 상태를 말하며, 유즙을 캘리포니아 유방염 진단법(CMT) 등의 야외진단 방법이나 유즙의 세균배양 등 실험실 진단에 의해서만 판정할 수 있다. 임상형 유방염보다 발생율이 15 내지 40 배나 높고 치료하지 않은 채 방치하면 임상형으로 돌변할 가능성이 높으며, 평소에도 산유량 감소와 유질 저하 등의 커다란 경제적 손실을 가져온다. 젖소 유방염의 주요 원인균으로는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 무유성연쇄상구균(Streptococcus agalactiae), 장내세균류(coliform), 환경유래성연쇄상구균(non-agalactiae Streptococcus), 장내세균(Enterococci) 등이 알려져 있다. 젖소 유방염 치료를 위한 다양한 연구가 진행중이나, 아직 확실한 치료방법은 제시되어 있지 않으며, 안정성 확보를 위하여 천연물질을 이용한 연구가 시도되고 있다.

봉독(bee venom)은 자연 상태의 벌이 가지고 있는 독으로 면역기능을 활성화시켜 질병을 치료하는 효과가 있다고 알려져 있다. 봉독의 주요 성분은 약 40종 정도가 밝혀져 있으며, 대표적인 성분으로는 멜리틴, 아파민, MCD-펩타이드 등이 있고 전체적으로 진통, 소염, 항균작용과 함께 뇌하수체 호르몬 분비 촉진, 혈액순환 촉진 등의 작용이 알려져 있다. 국내 축산분야에서도 봉독을 이용한 돼지 관절염에 대한 치료 효과, 단미 창상에 대한 생봉독 요법, 모돈의 무유증에 대한 치료 효과 등에 대한 연구들이 보고되어 있으나, 대부분 살아 있는 벌의 생봉독에 대한 봉침 용법으로서 취급상의 문제점과 균일한 봉독 확보가 어려워 농가에서 실제로 적용하는데 한계가 있었다. 최근 벌에서 봉독을 채취하는 장치들이 개발되어 일정 함량의 봉독을 제조하는 것이 가능하게 되었다. 현재 유통되고 있는 봉독(일명 '상용봉독')들은 한국 특허 제10-0758814호에 개시된 방법으로 제조하고 있으나 아직 봉독에 대한 규격이 아직은 없어 품질이 일정하지 않는 문제점이 있다. 또한 젖소 유방염 치료에 있어 봉독 자체만으로는 효과가 낮으므로, 상기 효과를 상승시킬 수 있는 물질을 개발할 필요가 있다.

키토산은 갑각류나 곤충류의 껍데기와 곰팡이, 버섯 등의 균류의 세포벽 등에 많이 분포되어 있는 물질인 키틴을 고온, 강알칼리의 조건하에서 탈아세틸화하여 얻어지며 글루코사민이 5000개 이상 결합한 천연 고분자물질이다. 키토산은 탈아세틸화 과정에서 아미노기를 가지게 되어 산에 쉽게 용해되는 가용성을 갖게 된다. 키토산은 독성이 없고, 흡착성, 보습성, 유화성 및 생분해성을 나타내며, 항균작용, 제산작용과 궤양 억제작용, 콜레스테롤 및 중성지방을 낮추는 약리작용, 장내유용 세균의 생장 촉진, 항종양활성, 식물세포의 활성화작용, 면역부활작용 등 다양한 기능을 나타내는 것으로 알려져 있어 의약품, 건강식품, 식품 보존제, 중금속 흡착제, 효소 고정화제, 화장품 등 다양한 산업분야에서 응용되고 있다.

프로폴리스는 여러 가지 식물들이 생장점을 보호하기 위하여 분비하는 수지(樹脂)와 같은 물질에 꿀벌의 침샘 분비물이 혼합되어 만들어진 물질로 단일물질이 아니고 여러 가지 화합물로 구성된 복합물질이다. 프로폴리스는 지금까지 약 149가지 화합물과 22가지 미네랄 등이 함유된 것으로 알려져 있으며, 주요 구성성분은 수지(樹脂)가 50%, 밀납(蜜蠟) 30%, 정유 등의 유성(油性)성분 10%, 화분(花粉) 5%, 유기물 및 미네랄 5% 등으로 이루어져 있다. 프로폴리스의 구성성분 중 대표적인 물질은 플라보노이드(flavonoid)라고 할 수 있는데 1970년도에 빌라누에바(U.H.Villanueva)는 프로폴리스에 18종의 플라보노이드 성분이 들어 있음을 밝혀내었고, 그밖에 항생성분인 갈란지나 피노세모리나(Galangina Pinocemorina)가 들어 있분인 발표함으로써 벌집 속이 무균상태를 유지할 수 있는 것은 바로 이 프로폴리스 때문이라는 사실을 밝힌바 있다. 프로폴리스의 유효능에 대한 연구가 다각도로 진행되어, 항산화능 및 항균능에 대한 입증으로 단순추출방법으로 정제된 제품이 건강보조식품 및 구강청결제 등으로 활용되고 있다.

본 발명자는 정제봉독을 키토산 및 프로폴리스와 혼합한 조성물을 제조하였으며, 상기 조성물이 각 성분의 상승작용에 의하여 젖소 유방암을 치료하는 효과가 뛰어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 젖소 유방염 치료를 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분자량 5,000 이상의 정제봉독; 키토산; 및 프로폴리스를 포함하는, 젖소 유방염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 젖소 유방염 치료용 조성물은 상용봉독이나 키토산 또는 프로폴리스 단독에 비하여 상승된 젖소 유방염 치료 효과를 나타낸다.

도 1은 분자량별 봉독 분획의 항균능을 나타낸 것으로서, (a)는 황색포도상구균(S. aureus), (b)는 대장균(E. coli)에 대한 결과이다.
도 2는 상용봉독(a) 및 정제봉독(b)의 우유에 대한 용해도를 나타낸 것이다.
도 3은 우유에 용해시킨 상용봉독 및 정제봉독의 황색포도상구균(A) 및 무유성연쇄상구균(S. agalactiae)(B)에 대한 항균능을 나타낸 것으로서, (a)는 정제봉독 5 mg/mL, (b)는 정제봉독 2.5 mg/mL, (c)는 정제봉독 1.25 mg/mL, (d)는 상용봉독 5 mg/mL, (e)는 상용봉독 2.5 mg/mL, (f)는 상용봉독 1.25 mg/mL의 농도로 실험한 결과이다.
도 4는 상용봉독 및 정제봉독 내 단백질 함량 및 멜리틴 함량을 나타낸 것이다.
도 5는 키토산 첨가에 따른 황색포도상구균에 대한 항균능을 나타낸 것이다.
도 6은 PEG 첨가에 따른 황색포도상구균에 대한 항균능을 나타낸 것이다.
도 7은 프로폴리스 첨가에 따른 용해 성상을 나타낸 것이다.
도 8은 프로폴리스 첨가에 따른 황색포도상구균에 대한 항균능을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 사용된 용어 "정제봉독(purified bee venom)"은 벌의 독낭으로부터 얻은 "채취봉독"에서 불순물을 제거한 후, 분자량을 분획하여 정제한 것을 의미하며, 사용상의 편의를 위하여 단백질 함량을 규격화하거나 건조시킨 것을 모두 포함한다. 한편, "상용봉독"은 "채취봉독"에서 불순물만 제거한 것 또는 이를 건조시킨 것을 의미한다.

본 발명은 분자량 5,000 이상의 정제봉독; 키토산; 및 프로폴리스를 포함하는, 젖소 유방염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 함유되는 "분자량 5,000 이상의 정제봉독"은 "채취봉독"에서 불순물을 제거한 후, 분자량 5,000 이상으로 분획하여 얻거나, "상용봉독"에서 분자량 5,000 이상으로 분획하여 얻을 수 있다. 본 발명에 사용한 정제봉독은 액상일 수 있으며, 바람직하게는 단백질 농도를 일정하게 조정한 후 건조시킨 분말 형태일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 사용한 정제봉독은 1) 봉독 1 내지 6 중량부를 10 내지 30 중량부의 증류수에 용해시키는 단계; 2) 상기 용액을 원심분리 및 여과하여 불순물을 제거하는 단계; 3) 상기 여액으로부터 분자량 5,000 이상을 분획하는 단계; 및 4) 상기 분획의 단백질 농도가 10 내지 300 mg/mL이 되도록 희석 또는 농축하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다. 가장 바람직하게는, 1) 0.5 내지 3 g의 봉독을 10 mL의 3차 증류수에 용해시키는 단계; 2) 4℃, 3000 rpm 조건에서 5~20분간 원심분리하여 불순물을 제거하고, 상등액을 공극 크기 0.45 내지 0.2 μm의 필터를 통과시켜 용해되지 않은 미세 고형분을 제거하는 단계; 3) 상기 여액을 공극 크기 5,000 MW 막이 장착된 농축기를 이용하여 분자량 5,000 이상의 봉독 분획을 수득하는 단계; 및 4) 단백질 농도가 100 mg/mL이 되도록 희석 또는 농축하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다. 사용상의 편의를 위하여, 건조, 예를 들면 동결건조의 방법에 의해 분말 상태의 정제봉독을 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 키토산 및 프로폴리스는 시판 중인 제품을 사용할 수 있다.

상기 정제봉독, 키토산 및 프로폴리스 성분은 조성물 전체 중량에 대하여 각각 0.017~0.083%, 0.1~3% 및 0.01~0.2% 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 증류수에 수용성 프로폴리스를 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 내지 0.2%, 바람직하게는 0.1%의 양으로 용해시킨 후, 수용성 키토산을 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 3%, 바람직하게는 1%의 양으로 용해시키고, 정제봉독을 조성물 전체 중량에 대하여 0.017 내지 0.083%, 바람직하게는 0.033%의 양으로 용해시킨 다음, 0.45 μm의 무균 필터로 여과하여 본 발명의 조성물을 제조한다.

한편, 본 발명의 조성물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물에 사용되는 프로폴리스는 주성분이 플라보노이드로서 물에 잘 용해되지 않으므로, 유화제인 PEG 첨가에 의해 프로폴리스의 용해도를 높일 수 있으며, 또한, 조성물의 점성을 높여 유방 내 상피세포와의 점착성을 증가시키는 장점을 부여한다. 본 발명의 조성물에 있어서 상기 PEG는 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 3%의 양으로 포함되는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 1) 봉독 1 내지 6 중량부를 10 내지 30 중량부의 증류수에 용해시키는 단계; 2) 상기 용액을 원심분리 및 여과하여 불순물을 제거하는 단계; 3) 상기 여액으로부터 분자량 5,000 이상을 분획하는 단계; 및 4) 상기 분획의 단백질 농도가 10 내지 300 mg/mL이 되도록 희석 또는 농축하는 단계를 포함하는, 정제봉독의 제조방법을 제공한다. 상기 정제봉독의 제조방법은 위에서 언급한 바와 같으며, 상기 단계 4) 이후 건조 단계, 예를 들면 동결건조단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 젖소 유방염 치료용 조성물은 기존에 사용되던 항생제와는 달리, 내성발생 및 잔류의 위험성이 낮아 치료 후 항생제 잔류에 의해 폐기되는 우유가 발생되지 않으므로, 매우 경제적이다. 바람직한 치료 효과를 얻기 위하여 하루에 젖소 분방당 정제봉독을 기준으로 5 내지 25 mg의 양에 해당하는 본 발명의 조성물이 투여될 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 분자량별 봉독 분획의 수득

봉독채취기를 통해 회수된 봉독 3g을 3차 증류수 10 mL에 10분간 교반하여 용해시킨 다음, 4℃, 3000rpm 조건에서 10분간 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 상등액을 공극 크기 0.2 μm의 필터를 통과시켜 용해되지 않은 미세 고형분을 제거하였다. 봉독의 정제 및 항균능을 높이기 위하여 상기 여액을 각각 공극 크기 5,000, 10,000, 30,000 및 50,000 MW 막이 장착된 농축기(Satorius Vivaspin 2, Polyethersulfone membrane)를 이용하여 분자량별로 봉독 분획을 수득하였다.

실험예 1: 분자량별 봉독 분획의 단백질 함량, 항산화능 및 항균능 분석

상기 실시예 1에서 얻은 분자량별 봉독 분획(분자량 5,000 미만, 5,000~10,000, 10,000~30,000, 30,000~50,000, 50,000 초과)을 대상으로, 정제 및 유방염 치료제로서의 효과의 극대화를 위한 최적의 정제방법을 결정하기 위하여, 단백질 함량, 항산화능 및 항균능을 측정하였다.

각 분획의 단백질 함량은 로우리(Lowry)법에 의해 측정하였다. 항산화능은 전자공여능을 측정할 수 있는 DPPH 측정법에 의해 측정하였다. 또한, 항균능은 황색포도상구균(S. aureus) 및 대장균(E. coli)을 대상으로 지시균을 탑 한천(top agar)에 접종하여 혼합한 다음 베이스 한천(base agar)에 도포하여 굳히고 20 μL의 시료를 점적(spot)하는 한천 확산법(Agar diffusion method)에 의해 측정하였다.

단백질 함량 및 항산화능 측정 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 항균능 측정 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 (a)는 황색포도상구균을 대상으로, (b)는 대장균을 대상으로 항균능을 측정한 결과이다.

분자량별 봉독 분획의 단백질 함량 및 항산화능

분자량	5,000 미만	5,000~ 10,000	10,000~ 30,000	30,000~ 50,000	50,000 초과
회수량(mL)	2.5	3.0	0.5	1.0	1.5
단백질함량(mg/mL)	1.8	8.4	9.9	12.8	61.5
항산화능(%)	8	38	172	110	236
초기 액량 : 10 mL, 초기 단백질 농도 : 15 mg/mL

표 1과 도 1에서 보는 바와 같이, 분자량이 5,000 미만에서는 항균능 및 항산화능이 없는 것으로 나타났다. 반면, 분자량 5,000 이상에서는 어느 정도 항균능 및 항산화능을 갖는 것으로 나타났다. 특히, 분자량이 10,000~30,000 사이의 단백질이 항산화능이 높으나 항균능은 약한 것으로 나타났으며, 30,000 이상에서는 항균능 및 항산화능을 모두 가지는 것으로 나타났다.

상기 결과로부터, 분자량 5,000 이상의 정제품이 유방염 치료제로서의 활용이 용이할 것으로 판단되어 이후 실험은 분자량 5,000 이상의 정제봉독을 바탕으로 진행하였다.

실시예 2: 정제봉독의 제조

실험예 1의 결과를 바탕으로, 정제봉독을 다음과 같이 제조하였다. 구체적으로, 봉독채취기를 통해 회수된 봉독 3g을 3차 증류수 10 mL에 10분간 교반하여 용해한 다음 4℃, 3000rpm 조건에서 10분간 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 상등액을 공극 크기 0.2 μm의 필터를 통과시켜 용해되지 않은 미세 고형분을 제거하였다. 상기 여액을 공극 크기 5,000 MW 막이 장착된 농축기를 이용하여 분자량이 5,000 이상인 분획을 회수하였다. 상기 분획을 Lowry 법을 이용하여 단백질 농도를 정량하고, 증류수를 이용하여 100 mg/mL의 농도로 조정하여 일정규격이 되도록 하였다. 상기 용액을 -70℃에서 24시간 동안 동결건조를 수행하여 건조된 정제봉독을 수득하였다.

실험예 2: 정제봉독의 효과 분석

<2-1> 우유에 대한 용해도

봉독을 치료제로 젖소 유방에 직접 적용하기 위해서는 봉독 성분들이 우유에 희석될 경우에도 불활화되지 않고 항균능을 유지해야 한다. 따라서, 본 실험에서는 봉독의 우유에 대한 용해도 및 항균능을 살펴보았다.

실시예 2에서 제조된 정제봉독과 대조군으로 상용봉독(양봉연구연합회)을 각각 5mg 씩 우유 1mL에 희석하여 용해도를 비교하였다. 용해도 비교 결과를 도 2에 나타내었으며, 도 2의 (a)는 상용봉독을 (b)는 정제봉독의 결과를 나타낸다. 비교 결과, 상용봉독을 우유에 용해시, 우유가 응고되지 않는 pH인 5.5였음에도 불구하고, 우유의 응고현상이 관찰되어 우유를 응고시키는 물질이 포함되어 있음을 알 수 있었다. 그러나 정제봉독의 경우 우유의 응고현상이 전혀 나타나지 않았다. 따라서, 정제봉독이 상용봉독에 비해 유방염 치료제로 사용하기에 유리하다는 것을 알 수 있었다.

한편, 정제봉독과 상용봉독을 농도별로 우유에 희석하여 황색포도상구균(S. aureus) 및 무유성연쇄상구균(S. agalactiae) 균주들에 대한 항균능을 비교하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 (A)는 황색포도상구균, (B)는 무유성연쇄상구균에 대한 결과이고, (a)는 정제봉독 5 mg/mL, (b)는 정제봉독 2.5 mg/mL, (c)는 정제봉독 1.25 mg/mL, (d)는 상용봉독 5 mg/mL, (e)는 상용봉독 2.5 mg/mL, (f)는 상용봉독 1.25 mg/mL의 농도로 실험한 결과이다. 비교 결과, 상용봉독의 경우 황색포도당구균에 대해서는 항균능이 없었으며, 무유성연쇄상구균에 대해서는 정제봉독에 비해 낮은 항균능을 나타내었다. 반면, 정제봉독의 경우 물에 용해하였을 때와 같이 1.25 mg/mL의 농도에서 황색포도상구균에 대해 항균능을 나타내었다. 이는 정제봉독 내 항균능을 지닌 성분의 농도가 상용봉독보다 높기 때문일 수도 있겠으나, 상용봉독의 경우 2.5 mg/mL의 농도에서도 항균능이 없게 나타난 것을 보면 그보다는 상용봉독 내에 포함되어 있는 성분과 우유가 응고되면서 봉독 내 유효물의 확산을 방해하는 것으로 추정된다.

<2-2> 단백질 및 멜리틴 ( melittin ) 함량

상용봉독 및 정제봉독의 단백질 함량과 항염, 항균능이 있다고 알려진 멜리틴(melittin)의 함량을 비교하였다. 단백질의 함량은 로우리법을 이용하여 분석하였으며, 멜리틴은 시그마 시약을 표준품으로, Symmetry 300TM 컬럼과 0.1% 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴을 용매로 이용하여 HPLC 분석을 통해 정량하였다. 분석 결과를 도 4에 나타내었다. 단백질 함량은 정제봉독이 상용봉독에 비해 150 mg/g 이상 높았으며, 멜리틴 함량 역시 정제봉독이 상용봉독에 비해 높았고, 또한 멜리틴이 단백질 내에서 차지하는 비율 역시 높게 나타났다. 봉독 내 유효성분은 대부분 단백질로 알려져 있으며, 정제를 통해 이러한 단백질 함량과 더불어 멜리틴 함량이 높아짐을 알 수 있었다. 정제봉독에서 멜리틴 함량이 높은 것은 멜리틴의 분자량이 2817이나 수용 상태시 사량체(tetramer)를 형성하여 분자량이 5000 이상이므로 다른 불순물은 제거되고 멜리틴은 전량 회수되기 때문인 것으로 판단된다.

<2-3> 항균능

정제봉독의 항균능을 살펴보기 위하여 세 가지 지시균(S. aureus, S. agalactiae, E. coli)에 대한 최소 저해 농도(MIC)를 측정하였다.

구체적으로, 트립틱 소이 액체배지(Trytic soy broth; BD 사)를 2배 희석한 배지에 본 발명의 정제봉독 및 비교를 위한 상용봉독을 하기 표 2에 나타난 농도로 첨가한 후, 상기 세 가지 지시균을 각각 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 지시균을 접종하기 전 및 접종한 후 흡광도(660 nm) 및 pH를 측정하여 저해여부를 살펴보았다. 음성 대조군으로 배지에 균주만 접종하여 준 것을 사용하였고, 양성 대조군으로서 항생제 중 G(+)에 항균능이 있는 카나마이신(kanamycin) 및 G(-)에 항균능이 있는 콜리스틴(colistin)을 사용하였다. 항생제의 첨가 농도는 예비실험을 통하여 결정하였다. 즉, 카나마이신은 G(+)균주인 황색포도상구균과 무유성연쇄상구균 균주의 생장을 모두 저해하는 농도인 500 μg/mL로, 콜리스틴은 G(-)균주인 대장균의 생장을 저해하는 농도인 1,000 μg/mL로 첨가하여 주었다. 측정 결과를 표 2에 나타내었다.

정제봉독의 항균능

시료		초기 OD660nm (pH 6.40)	24시간 배양 후
			황색포도상구균		무유성연쇄상구균		대장균
			Growth (OD660nm)	pH	Growth (OD660nm)	pH	Growth (OD660nm)	pH
무첨가		0.006	0.80	5.20	0.61	4.40	1.77	5.79
상용봉독	100ug/mL	0.060	0.96	5.34	0.10	6.24	1.10	5.44
	300 ug / mL	0.180	0.18	6.36	0.26	6.31	0.23	6.40
	600ug/mL	0.890	0.80	6.34	0.83	6.34	0.71	6.39
정제봉독	50ug/mL	0.045	0.94	5.25	0.54	5.20	1.55	5.59
	100ug/mL	0.072	0.89	5.23	0.08	6.33	0.79	5.75
	150 ug / mL	0.189	0.18	6.40	0.18	6.31	0.19	6.39
콜리스틴		0.050	0.79	5.39	0.83	4.82	0.07	6.29
카나마이신		0.061	0.04	6.40	0.05	6.40	0.83	5.27

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 정제봉독은 상용봉독 및 항생제에 비해 적은 양을 첨가하여도 항균능을 보이는 것으로 나타났다. 봉독을 이용하여 항균능 측정 시에는 봉독의 정제와 관계없이 무유성연쇄상구균 균주가 다른 두 병원성 균주에 비해 감수성이 높게 나타났다. 정제봉독은 황색포도상구균과 대장균 두 균주 모두에 150 μg/mL 첨가될 경우 생장이 저해되어 상용봉독의 지시균 생장 저해농도 300 μg/mL보다 2배 낮은 농도에서도 항균활성이 있었다. 따라서 동량을 처리시 상용봉독에 비해 항균능이 2배 정도 향상된 것을 확인할 수 있었다.

<2-4> 봉독시료별 체세포 감소 효과

정제봉독과 상용봉독의 유방염 치료효과를 비교하기 위하여 유방염에 감염된 젖소 6개 농장, 30분방에 각 시료별 10분방씩 구분하여, 무처리구, 상용봉독 처리구, 정제봉독 처리구로 사양실험을 진행하였다. 무처리구의 경우 정제수만 30 mL을, 봉독처리구의 경우 상용봉독과 정제봉독을 20 mg/분방 농도로 멸균 증류수 30 mL에 용해하여 유두침을 이용하여 유방내로 투여하였다. 유두침은 1회용 플라스틱제품으로 길이가 2 cm인 유두침을 사용하였다. 일별 착유 후 한차례 봉독을 투여하였으며, 5일간 투여 후 Somacount 300 기기(Bnetley사, USA)를 이용하여 체세포수를 측정하였다. 상기 방법은 우유에 형광물질인 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)를 첨가하여 체세포를 염색 후 측정기기에 주입하여 레이져 빔으로 측정하는 것이다. 5일간 투여 후 체세포 수를 비교한 결과, 하기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이 사용봉독에 비하여 정제봉독에서의 체세포 감소 비율이 19% 정도 높음을 알 수 있었다. 따라서, 봉독의 정제시 상용봉독에 비해 유방암 치료효과가 향상됨을 확인하였다.

유방염 이환 젖소에 봉독 투여시 봉독 시료별 투여효과]

봉독시료	체세포 수(만/mL)				체세포 감소율(%)
	초기	5일	10일	15일
무처리구	155	155	170	164	0
상용봉독	140	95	89	85	39
정제봉독	155	87	72	65	58

<2-5> 정제봉독 농도별 체세포 감소 효과

유방염에 이환된 젖소를 대상으로 12개 농장, 50분방에 정제봉독의 농도별 체세포 감소효과를 비교해 보았다. 분말 상태로 10 mg, 20 mg 및 25 mg의 함량으로 갈색병에 포장한 것을 유방내로 투여하기 전에 증류수 30 mL에 희석하여 유두침을 이용하여 유방내로 1회/일로 하여 5일간 투여하였다. 투여 결과, 표 4에서 보는 바와 같이 정제봉독을 투여한 경우 투여시작일로부터 5일이 경과되었을 경우 투여초기에 비해 체세포수가 낮아지는 것으로 나타났다. 투여농도별 체세포 감소를 비교한 결과 10 mg/분방 농도로 투여할 경우 15일 경과 시 57% 이상 감소하는 것으로 나타났다. 또한 봉독을 분방 당 5~25 mg을 투여하여도 젖소의 유두에서는 발적과 부종, 국소 출혈 등의 국소 반응이 없었으며, 전신적으로도 심박수와 호흡수, 알레르기 반응 등의 임상증상도 나타나지 않았다.

유방염 이환 젖소에 봉독 투여시 투여량별 체세포수 변화

봉독 투여량 (mg/분방)	체세포 수(만/mL)				체세포 감소율(%)
	초기	5일	10일	15일
0	225	200	205	214	5
5	215	165	140	138	36
10	205	127	97	88	57
20	195	110	50	80	59
25	250	135	60	102	59

실시예 3: 정제봉독과 키토산 혼합용액의 제조

정제봉독의 유방염 치료 효과를 높이기 위하여, 키토산을 첨가하였다. 구체적으로, 수용성 키토산((주)와이비바이오)을 각각 0.1, 0.5, 1.0 및 3.0%의 농도로 증류수에 용해하고 각 용해액에 정제봉독을 1 mg/mL이 되도록 첨가하였다.

실험예 3 : 키토산 첨가에 따른 항균능 분석

실시예 3에서 제조된 키토산이 첨가된 4가지 용액을 대상으로 황색포도상구균(S. aureus)에 대한 항균능을 검토하였다. 비교를 위하여, 주사용수 단독, 정제봉독 단독, 키토산 0.1% 단독 및 키토산 0.5% 단독의 항균능을 측정하였다. 실험 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 키토산 단독에 비해 봉독과 키토산 용액의 혼합용액이 항균능이 더 높은 것으로 나타나, 키토산 첨가에 의해 봉독의 항균능이 반감되지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 정제봉독, 키토산, 폴리에틸렌 글리콜 혼합용액의 제조

봉독의 경우 수용성 단백질로 용매가 첨가될 경우 침전되는 특성이 있다. 반면 프로폴리스의 경우 주성분이 플라보노이드로 물에는 녹지 않으며 용매에 녹아 봉독과 상반되는 특성을 가지고 있다. 따라서, 봉독의 용해제의 점성을 높여 투여시 유방 내 상피세포와 점착성을 높이며, 프로폴리스의 용해를 도와줄 수 있는 유화제인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 첨가하였다. 구체적으로, 실험예 1에서 최적으로 결정된 1% 수용성 키토산 수용액에 PEG를 각각 0, 1, 3, 5 및 10%가 되도록 첨가하여 잘 혼합한 다음 봉독을 5 mg/mL 농도로 첨가하였다.

실험예 4: PEG 첨가에 따른 항균능 분석

유화제로서 PEG 첨가에 따른 봉독의 항균능 변화를 살펴보고자, 실시예 4에서 제조된 봉독을 이용하여 황색포도상구균에 대한 항균능을 측정하였다. 측정 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, PEG가 각각 1 및 3% 농도로 첨가될 경우 항균능에 영향을 미치지 않으나, 5% 이상 농도에서는 PEG 농도가 높아질수록 항균능이 줄어드는 것으로 나타났다. 따라서, 최적 PEG 농도는 1 내지 3%로 판단되었다.

실시예 5: 정제봉독, 키토산, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로폴리스 혼합용액의 제조

정제봉독의 유방염 치료 효과를 높이기 위하여, 실시예 4의 용액에 수용성 프로폴리스를 첨가한 용액을 제조하였다. 구체적으로, 1% 수용성 키토산을 녹인 후 1% PEG를 첨가하여 잘 혼합한 다음 수용성 프로폴리스((주)대호양행)를 0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0% 되도록 첨가하여 용해하였다. 이어 봉독을 1 mg/mL로 첨가하여 용액을 제조하였다.

실험예 5: 프로폴리스 첨가에 따른 성상 및 항균능 분석

실시예 5에서 제조된 용액의 성상 및 항균능을 살펴보았다. 도 7에서 보는 바와 같이, 프로폴리스의 농도가 0.2%로 낮을 경우 침전이 발생되지 않으나, 프로폴리스의 농도가 0.5% 이상일 경우 봉독과 혼합시 침전이 발생되며, 프로폴리스 농도가 높을수록 침전 발생량은 많아졌다.

한편, 상기 용액을 이용하여 황색포도상구균에 대한 항균능을 관찰한 결과, 수용성 프로폴리스 0.01% 단독의 경우 항균능이 없는 것으로 나타났으나, 키토산 및 봉독에 프로폴리스를 0.1% 첨가한 경우 항균능이 확연하게 나타났다. 그러나 침전이 발생되었던 프로폴리스 0.5% 및 1.0% 시료의 경우 항균능이 전혀 나타나지 않아 프로폴리스가 0.5% 이상으로 첨가될 경우 항균특성을 나타내는 물질이 항균능을 잃게 되는 것으로 추정되었다. 따라서 프로폴리스 농도는 0.2% 이하가 바람직할 것으로 판단된다.

실험예 6 : 용해제에 따른 체세포 감소효과

유방염에 이환된 젖소를 대상으로 20개 농장, 90분방에 봉독을 투여할 때 이용하는 용해제 제형별 체세포 감소효과를 비교해 보았다. 정제봉독을 분방당 10 mg함량으로 하여 용해제로 증류수 단독, 0.1% 수용성 프로폴리스 단독, 1% 수용성 키토산 단독 및 0.1% 수용성 프로폴리스와 1% 수용성 키토산과 1% 폴리에틸렌 글리콜이 혼합된 용액 30 mL을 이용하여 녹인 후 유두침을 이용하여 유방내로 투여하였다. 투여 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

유방염 이환 젖소에 봉독 투여시 용해제별 체세포수 변화

용해제	체세포 수(만/mL)				체세포 감소율(%)
	초기	5일	10일	15일
무첨가*	132	141	137	136	0
증류수	157	91	77	70	55
0.1% 수용성 프로폴리스	146	85	69	64	56
1% 수용성 키토산	160	80	65	62	61
0.1% 수용성 프로폴리스, 1% 수용성 키토산 및 1% 폴리에틸렌 글리콜 혼합액	143	53	30	21	85
무첨가: 봉독 무첨가 증류수만 투여, 봉독 투여량은 20mg/분방/일

투여 결과, 용해제로 증류수만을 사용한 경우 15일 경과시 55% 체세포 감소효과가 있었다. 그리고, 수용성 프로폴리스를 용해제로 사용한 경우 체세포 감소율이 56%로 증류수를 이용한 경우와 차이가 없었으나, 유방염 감염시 유두가 딱딱해지는 증상이 투여 5일 만에 없어져 임상증상 개선효과를 가지는 것으로 나타났다. 또한, 수용산 키토산을 용해제로 이용한 경우 증류수에 비해 6% 정도 체세포수 감소율이 높았으며, 수용성 프로폴리스와 수용성 키토산 및 폴리에틸렌 글리콜 혼합액을 용해제로 이용한 경우 체세포 감소율이 85%로 가장 높았다. 이는 수용성 프로폴리스와 수용성 키토산 단독에 비해 24 내지 29%나 높은 것으로서, 용해제로 수용성 프로폴리스와 수용성 키토산 및 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 봉독의 치료효과를 상승시키는데 도움이 된다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (3)

1. 봉독으로부터 얻은 분자량 5,000 이상의 봉독 분획; 키토산; 및 프로폴리스를 포함하는, 젖소 유방염 치료용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 봉독 분획이
   1) 봉독 1 내지 6 중량부를 10 내지 30 중량부의 증류수에 용해시키는 단계;
   2) 상기 용액을 원심분리 및 여과하여 불순물을 제거하는 단계;
   3) 상기 여액으로부터 분자량 5,000 이상을 분획하는 단계; 및
   4) 상기 분획의 단백질 농도가 10 내지 300 mg/mL이 되도록 희석 또는 농축하는 단계
   를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는, 젖소 유방염 치료용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   조성물 전체 중량에 대하여 상기 봉독 분획이 0.017~0.083%, 키토산이 0.1~3%, 프로폴리스가 0.01~0.2%의 양인 것을 특징으로 하는, 젖소 유방염 치료용 조성물.

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