KR102048835B1

KR102048835B1 - 봉독을 포함하는 유단백 합성 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102048835B1
Application number: KR1020180037991A
Authority: KR
Inventors: 한상미; 우순옥; 김세건; 장혜리
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2018-04-02
Publication date: 2019-11-27
Also published as: KR20190115226A

Abstract

본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하는 유단백 합성 촉진용 조성물 또는 젖소의 우유 생산 촉진용 조성물에 관한 것이다. 봉독을 유효성분으로 포함하는 조성물을 젖소에게 급여할 경우 유선세포를 자극하여 카제인과 같은 유단백의 합성이 촉진되며, 이를 통해 젖소의 우유 생산이 증가되는 기능을 하여 낙농가의 소득증대에 도움이 될 수 있다.

Description

봉독을 포함하는 유단백 합성 촉진용 조성물 {Composition comprising bee venom for promoting synthesis of milk protein}

본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유단백 합성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

꿀벌의 종류는 일반적으로 서양종꿀벌(Apis mellifera), 동양종꿀벌(Apis cerana), 인도최대종(Apis dorsata), 인도최소종(Apis florea) 등 4개의 종이 알려져 있다. 이 중 현재 우리나라에는 서양종꿀벌과 동양종 꿀벌이 서식하고 있다. 특히 동양종꿀벌은 고려시대부터 사육되기 시작하였으며, 민간과 한방에서 봉침요법으로 사용되어져 왔다. 그러나 서양종꿀벌은 이탈리안 계통 일벌로서 조선시대 고종황제시기에 독일인 선교사에 의해 1892년경에 우리나라에 도입되어 사육되고 있다.

봉독은 벌의 독낭에 들어있는 것으로, 약 40여 가지의 물질로 이루어져 있으며 기원전부터 인체의 질병치료에 이용되어 왔다. 봉독은 벌의 종류에 따라 그 성분에 차이를 보이며, 동일한 벌이라도 일령에 따라 성분의 차이가 발생한다. 현재 봉독 성분에 따른 작용과 기전, 봉독의 과민성과 독성, 면역요법 및 관절염, 단순포진, 다발성 경화증, 종양 등의 질병 치료 등에 대한 연구가 보고되고 있으며 특히 항균작용과 세포 손상개선효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 낙농업 종사자에게 있어서 젖소의 우유 구성 성분 및 생산율은 경제적 관점에서 매우 중요하다. 젖소는 유생산(milk production)을 개선시키기 위하여 계속해서 유전적으로 선별되어 왔는데, 유생산은 이러한 젖소의 품종 이외에도 젖소가 주어진 환경, 특히, 사료 조성물의 성분과도 관련된다. 이는 사료 조성물의 성분에 따라 유선세포의 증식에 영향을 주면서 우유 생산량에 영향을 줄 수 있기 때문인데, 이를 뒷받침하는 것으로서, 포유동물의 우유생산이 유선 내의 유방실질(분비조직)의 양에 따라 제한되며, 유전학상 고등한 동물의 우유생산증가가 전적으로 실질세포의 양과도 관계가 있는 유방체적의 증가의 결과라고 보고된 바 있다(Davis 등, 43 Proc. N. Z. Soc. Anim. Prod. 71(1983)).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 정제봉독이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)의 15일령 이상 일벌에서 분리한 정제봉독이 유선세포의 증식에 관여하여 베타-카제인 등의 유단백의 합성을 촉진하고 젖소의 우유 생산량을 늘리는 효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0092509호 (발명의 명칭 : 젖소 유방염 치료용 조성물, 출원인 : 대한민국, 공개일 : 2011년08월18일) 대한민국 등록특허 제10-1061257호 (발명의 명칭 : 봉독과 생약추출물을 유효성분으로 하는 천연항생제 및 이의 제조방법, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2011년08월25일) 대한민국 등록특허 제10-0034230호 (발명의 명칭 : 반추동물의 우유생산량을 증가시키는 조성물, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 1990년07월07일)

본 발명의 목적은 봉독을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유단백 합성 촉진용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)의 15일령 이상 일벌의 독낭에서 분리한 봉독에서 당류와 휘발성 물질을 제거하여 얻은 정제봉독인 것을 특징으로 한다.

상기 유단백은 베타-카제인(beta-casein)일 수 있다.

본 발명은 상기 조성물을 함유하는 젖소의 우유 생산 촉진용 조성물을 제공하며, 이에, 상기 조성물을 함유하는 젖소의 우유 생산 촉진용 사료 조성물 또한 제공가능하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 봉독은 정제봉독으로서, 채집하는 과정은 통상의 양잠농가에서 사용하는 방법을 사용할 수 있는데, 특히, 상기 정제봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)의 15일령 이상 일벌의 독낭에서 봉독채집장치를 이용하여 분리한 봉독에서 봉독 외의 이물질인 당류와 휘발성 물질을 제거하여 얻은 것일 수 있다.

상기 조성물은 다양한 동물을 대상으로 할 수 있으나 특히 젖소에게 적합하다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상(동물)의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 각종 포유동물의 유생산 촉진용 조성물로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 젖소의 우유 생산 촉진용 조성물로 이용될 수 있으며, 더 바람직하게는 사료에 첨가되어 사료 조성물로서 이용될 수 있다.

도 1은 봉독채집장치를 이용하여 봉독을 채집하는 과정을 나타내는 사진이다.
도 2는 꿀벌의 일령별로 독낭을 액체크로마토그래피 분석하여 봉독 성분의 분포를 확인한 크로마토그램 결과이다.
도 3은 꿀벌의 일령에 따른 독낭을 액체크로마토그래피 분석하여 독낭 내의 봉독 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 15일령 이상된 일벌에서 채집한 정제봉독봉독의 정제 전(도 4의 좌측) 및 정제 후(도 4의 우측) 사진(도 4의 상단)과 이를 전자현미경으로 관찰한 사진(도 4의 하단)을 나타낸다.
도 5는 젖소유선세포주에 대한 봉독의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 젖소유선세포주에 대한 봉독의 세포생존율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 봉독의 bCSNB mRNA 발현 증가효과를 젖소유선세포주에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 봉독의 CSN2 단백질 발현 증가효과를 젖소유선세포주에서 확인한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 정제봉독의 제조>

서양종꿀벌(Apis meliffera L.)을 봉독채집장치를 이용하여 봉독을 채집하되, 성충이 된 시간이 1시간 이내인 일벌, 3~8일령인 일벌, 9~14일령인 일벌, 15일령 이상된 일벌에서 각각 봉독을 별도로 채집하였고, 봉독의 간이정제방법을 통해 당류와 휘발성 물질을 제거함으로써 순수한 수용성을 갖는 정제 봉독 건조물을 제조하였다. 도 1에는 이와 같은 봉독채집장치를 이용한 봉독 채집과정이 개시되어 있다.

한편, 각 일령별 꿀벌의 독낭 내의 봉독 함량을 확인한 바, 도 2 및 도 3에 개시된 것처럼, 15일령 이상된 일벌의 독낭에서 순수한 봉독의 함유량이 가장 높았이다. 따라서 본 발명에서는 15일령 이상된 일벌에서 채집된 정제봉독을 실험에 사용하기로 하였다.

<실시예 2. 정제봉독의 성분 확인을 위한 UPLC 분석>

15일령 이상된 일벌에서 채집한 정제봉독 40 ㎎을 3차 증류수 10 ㎖에 녹여 PTFE 0.2 μm필터로 여과하였고, 아파민, 멜리틴, 포스포리파아제 A2 표준품을 동일하게 3차 증류수에 녹여 2 ㎎/㎖로 만들어 시험봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하여 준비하였다. 봉독 성분 분석은 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)하여 확인하였으며, 분석기기는 Waters 회사의 I class 모델을 사용하였고, Advanced materials technology사의 Halo peptide ES-C18(입자크기: 2.7 μm, 내경: 4.6mm, 길이: 10 cm) 컬럼을 장착하였다. 이동상으로는, A용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 아세토나이트릴(MeCN) 용액과, B용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 수용액을 혼합한 혼합용액을 이용하였다. 상기 혼합용액은 이동시간이 3분 미만일 때는 A용액이 10 부피% 이상 31 부피% 미만, 이동시간이 3분 이상에서 5분 미만일 때는 A용액이 31 부피% 이상 40 부피% 미만, 이동시간이 5분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 40 부피% 이상에서 45 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하였다. 이동상의 흐름속도는 1.5 ㎖/min이고, 시료 주입량은 4 ㎕이며 자외부 흡광광도계 파장은 220 nm로 설정하였으며 분석시 컬럼의 온도는 50 ℃로 조절하였다. 검출한계는 ICH 가이드라인(International Conference on Harmonisation guideline)에 따라 산출하였다. 상기 조건은 다시 하기 표 1에 자세하게 나타내었다.

기 기	Waters I class
컬 럼	Halo ES-18 (4.6 x 100 mm, 2.7 μm)
컬럼온도	50℃
흐름속도	1.5 ㎖/min
주 입 량	4 ㎕
검출파장	220 nm
이 동 상	(A) 20 mM TFA/MeCN, (B) 20 mM TFA/H₂O (A) 0-3 min:10-31부피%/ 3-5 min:31-40부피%/ 5-10 min:40-45부피%

이렇게 분석한 정제봉독 수용액의 분석결과는 표준품 용액과의 피크 비교를 통해 도 5에 나타내었으며, 상기 정제봉독 수용액 내의 아파민, 멜리틴, 포스포리파아제 A2 함량은 하기 표 2에 나타내었다.

성분	함량(%)
아파민	2.3
멜리틴	63.6
포스포리파아제 A2	10.9

<실시예 3. 세포독성 및 세포증식 효과 확인>

젖소유선세포주(bovine mammary epithelial cells)인 MAC-T 세포에 대한 봉독의 세포독성을 평가하였다. 이를 위해 96 well에 MAC-T 세포를 2 × 10⁴ cell/well이 되도록 하여 24시간 배양한 후, 농도별 봉독(1, 10, 100 ng/mL)을 배양한 MAC-T 세포에 처리하여 8시간 동안 반응시켰다. Cell Counting Kit-8(Dojindo)을 각 well에 분주한 뒤 1시간 더 배양한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 WST-8의 formazan 발현을 확인하였다. 그 결과 도 5와 같이 봉독(BV)의 세포독성은 전혀 나타나지 않은 것으로 확인된다.

또한 위 실험과 동일하게 96 well에 MAC-T 세포를 배양한 후 농도별 봉독(1, 10, 100 ng/mL) 처리하여 24시간 동안 배양하였을 때에도 세포 독성이 나타나지 않았을 뿐만 아니라 도 6의 사진처럼 cell viability가 증가하는 것으로 나타났고, 이를 통해 MAC-T 세포의 증식에 정제봉독이 도움이 되는 것을 확인하였다. 도 6의 결과에서 대조군(negative control, NC)을 비롯하여 1, 10, 50, 100 ng/mL 농도의 정제 봉독을 함께 처리하여 배양한 세포를 현미경을 통해 관찰한 결과, MAC-T 세포의 증식에 있어 봉독 농도 100 ng/mL까지 정제봉독 처리 하에 세포가 잘 자라는 것을 알 수 있다.

<실시예 4. 유단백합성 관련 유전자 발현 확인>

beta-casein(=CSN2) 유전자인 bCSNB(bovine CSNB gene)를 RT-PCR 실험을 위해 6 well을 이용하여 MAC-T 세포를 4x10⁵ cell/well로 24시간 배양하였다. 세포 독성을 가지지 않는 농도 범위(1~100 ng/mL) 중 1, 10, 50, 100 ng/mL의 봉독을 처리한 것을 실험군으로 설정하여 MAC-T 세포와 반응시켜 24시간 동안 배양하였다.

배양한 MAC-T 세포에 Trizol reagent(Ambion), chloroform, isopropanol, 80% ethanol을 차례로 처리하여 RNA를 추출하였고, 추출한 RNA에서 cDNA를 합성하기 위해 amfiRivert Platinum cDNA Synthesis Master Mix(GenDEPOT)를 이용하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 RT-PCR을 진행하였다. cDNA를 이용하여 beta-casein 합성 유전자인 bCSNB의 발현을 확인하기 위해 AccuPower PCR Premix(Bioneer)로 RT-PCR을 수행하였다. 이때 사용한 bCSNB 프라이머는 forward(5'-GTGAGGAACAGCAGCAAACA-3'), reverse(5'-TTTTGTGGGAGGCTGTTAGG-3')이며, bGAPDH 프라이머는 forward(5'-GGGTCATCATCTCTGCACCT-3'), reverse(5'-GGTCATAAGTCCCTCCACGA-3')이다. RT-PCR은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 반응시키는 조건으로 35회 수행하고, 72℃에서 10분간 반응시켰다. 얻어진 증폭산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.

그 결과 도 7과 같이 beta-casein 합성 유전자인 bCSNB이 봉독에 대한 농도의존적으로 발현되는 것이 RT-PCR 통해 확인된다.

반면, 정제 봉독을 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 봉독 농도가 증가함에 따라 bCSNB의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 50 ng/mL의 봉독을 적용하였을 경우 bCSNB의 발현이 강하게 나타나는 것을 알 수 있다.

<실시예 5. 유단백 합성 단백질 발현 확인>

Cow Casein beta ELISA Kit(abx150083, Abbexa, UK)를 이용하여 베타-카제인(CSN2)의 단백질 발현을 확인하였다.

이를 위해, 봉독을 처리하지 않은 대조군과 1, 10, 50, 100 ng/mL 농도의 정제 봉독을 처리한 실험군의 MAC-T 세포 배양액을 이용하여 ELISA를 진행하였다.

그 결과, RT-PCR의 결과와 마찬가지로, 도 8에서처럼 처리한 봉독의 농도가 증가함에 따라 CSN2의 발현도 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 50 ng/mL의 봉독을 처리하였을 경우 CSN2의 단백질 발현이 가장 강하게 나타나는 것을 확인하였다.

<실시예 6. 우유 생산 촉진 효과>

젖소 6개 농장, 20분방에 각 시료별 10분방씩 구분하여, 무처리구, 봉독 처리구로 실험을 진행하였다. 무처리구의 경우 정제수만 30 mL을, 봉독처리구의 경우 서양종 꿀벌의 정제봉독 10 mg을 멸균 증류수 30 mL에 용해한 것을 유두침을 이용하여 각각 젖소의 유방 내로 투여하였다. 유두침은 1회용 플라스틱제품으로 길이가 2 cm인 유두침을 사용하였다. 봉독은 1주일 단위로 투여하였으며, 투여 4주 후 착유량을 비교하였다.

하기 표 3의 결과와 같이 서양종꿀벌의 봉독 투여군이 무처리군에 비하여 착유량이 32% 이상 증가하였음을 알 수 있다. 서양종 꿀벌의 정제봉독이 젖소의 우유 생산을 촉진할 수 있는 조성물임을 확인할 수 있다.

주사제 조건	착유량 (%)
무처리군	100.0
서양종 꿀벌의 봉독 처리군	132.3

이 외에도, 같은 조건으로 실험하되 주사제로 봉독을 투입하는 대신 매일 봉독이 0.001 중량%로 첨가된 사료 조성물을 투여하고, 4주 후에 착유량을 확인하여 표 4에 나타내었다.

사료 조성물 조건	착유량 (%)
무처리군	100.0
서양종 꿀벌의 봉독 처리군	124.3

이에, 상기 표 4의 결과와 같이 사료 조성물로 봉독이 젖소에게 투여되었을 때에도 역시 착유량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 이렇게 정제봉독이 처리된 젖소로부터 얻은 우유의 경우, 정제봉독이 우유 내에 잔류할 경우, 이 우유를 직접 섭취하는 송아지나 사람에게 알레르기 등의 문제를 일으킬 수 있어 실시예 2의 방법을 통해 봉독의 잔류량을 확인한 바, 우유 내에는 봉독 성분을 대표하는 아파민, 멜리틴, 포스포리파아제 A2가 전혀 확인되지 않았다.

따라서, 주기적으로 젖소의 유방에 봉독을 직접 투여하거나 또는 봉독을 사료를 통해 젖소가 이를 섭취할 경우, 우유의 생산이 증대될 수 있음을 확인하게 되었다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

실시예 1의 정제봉독 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 타정하여 동물용 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

실시예 1의 정제봉독 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열멸균하고 소분하여 동물용 주사액제를 제조하였다.

<제제예 2. 사료 조성물>

실시예 1의 정제봉독 200g을 젖소 사료 제조시 1t을 첨가하여 유단백 합성 촉진용 사료를 제조하였다.

Claims

봉독을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-카제인(beta-casein) 합성 촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)의 15일령 이상 일벌의 독낭에서 분리한 봉독에서 당류와 휘발성 물질을 제거하여 얻은 정제봉독인 것을 특징으로 하는 베타-카제인(beta-casein) 합성 촉진용 조성물.
삭제
삭제
삭제