KR101542882B1 - 감태 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감태 추출물 또는 그로부터 유래된 성분을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 (viral hemorrhagic septicemia, VHS)에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 약학조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료 방법, 감태 추출물로부터 유래된 성분을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물, 감태 추출물 또는 그로부터 유래된 성분을 포함하는 사료첨가용 조성물 및 상기 사료첨가용 조성물을 포함하는 사료를 어류에 섭식시키는 단계를 포함하는 어류의 사육방법에 관한 것이다.

Description

감태 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료용 조성물{A composition for prevention and treatment of fish viral hemorrhagic septicemia containing extracts of Ecklonia cava}

본 발명은 감태 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 감태 추출물 또는 그로부터 유래된 성분을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 (viral hemorrhagic septicemia, VHS)에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 약학조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료 방법, 감태 추출물로부터 유래된 성분을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물, 감태 추출물 또는 그로부터 유래된 성분을 포함하는 사료첨가용 조성물 및 상기 사료첨가용 조성물을 포함하는 사료를 어류에 섭식시키는 단계를 포함하는 어류의 사육방법에 관한 것이다.

일반적으로 넙치 양식 산업의 심각한 피해를 입히는 주요한 원인체는 3종 이상의 복합감염증, 그 중에서도 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (VHSV), 세균인 에드워지엘라 (Edwardsiella), 연쇄상구균 (Strepococcus), 비브리오 (Vibrio), 플렉시박터 (Flexibacter) 및 기생충인 스쿠티카충 (Miamiensis avidus)으로 잘 알려져 있다. 특히, 바이러스성 출혈성 패혈증 (Viral hemorrhagic septicemia, VHS)과 같은 바이러스성 질병은 넙치의 입식초기 저수온기에 발생하여 대량폐사를 유발하는데, 치어뿐만 아니라 성어에 있어서도 대량폐사를 유발하며, 해양오염 및 양식 수산물의 질병으로 인한 양식어가의 경제적 손실이 약 3,000억 원에 이른다고 보고되었다.

상기 VHS는 국내에서는 2001년 넙치에서 처음 보고되었으며 이후 각종 자연산 해산어에서도 보고되고 있으며 양식 넙치의 피해가 매우 심각한 치명적인 질병이다. 2011년 국내 넙치 양식장의 주요 폐사 원인체를 조사한 결과, VHSV에 의한 폐사가 전체 폐사 원인 중 약 12.5%를 차지하였으며, 이는 넙치의 바이러스 질병 중 가장 높은 비율을 차지하였다. 또한, 국내 넙치 생산량 중 절반 가량을 생산하는 제주도 지역의 경우 2007년부터 2010년까지 질병검사 의뢰 시료 중 바이러스성 출혈성 패혈증의 양성율이 30%로 가장 높게 나타났으며, 그 피해도 증가하고 있는 실정이다. 또한, VHSV는 국제수역사무국 (OIE)에서 'OIE 신고대상 질병 (OIE notifiable disease)'으로 규정되어 있어 수산물 유통시 검역 대상이 되는 질병으로 넙치를 포함한 양식 어류의 수출입에 있어서 무역장벽으로 작용하는 중요한 질병요인이기도 하다. VHSV는 무지개송어의 중요 바이러스성 질병으로 처음 보고가 되었는데 최근 다양한 어류, 송어, 무지개송어, 은연어, 강송어, 브라운송어, 스틸헤드 송어 (steelhead trout) 등의 연어과 어류뿐만 아니라 대구, 청어등과 같은 자연수계의 어류 및 넙치 등과 같은 해산양식어류에서도 널리 발생하며, 주로 유럽, 북미, 아시아 지역에서 널리 발생한다. 감염된 넙치를 육안으로 살펴보면, 체색흑화, 전신의 출혈, 복수저류로 인한 복부 팽만과 탈장, 아가미 퇴색, 무안측 체표에 붉은 반점모양의 출혈이 관찰된다. 발병 수온은 10~13℃로 넙치의 크기에 상관없이 폐사가 발생하며, 현재 치료법은 전무하며 다른 지역으로 전파되지 않도록 주의를 기울이는 것이 전부인 것이 현 실정이다. 이에 바이러스성 출혈성 패혈증에 의한 양식 어가의 경제적 손실을 줄이고, 넙치의 원활한 수출 및 유통을 위해 효과적인 바이러스성 출혈성 패혈증의 치료 방법이 절실히 요구되고 있다.

VHSV는 음성 단일가닥 RNA 바이러스로 1963년에 국제수역사무국 (OIE)의 어병 심포지엄에 처음으로 보고되었으며 총알 모양이며 길이는 180 ㎚, 직경이 60 ㎚인 바이러스이며 크기는 11 kb이며 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleocapsid protein) (N), 폴리머라제-관련된 인산 단백질 (polymerase-associated phosphoprotein) (P), 기질 단백질 (matrix protein) (M), 표면 당단백질 (surface glycoprotein) (G), 독특한 비리온성 단백질 (a unique non-virion protein) (NV), 및 바이러스 폴리머라제 (virus polymerase) (L)의 6가지 단백질로 구성되어 있는 랍도바이러스 (rhabdovirus)과에 속한다. 유전자형은 4가지 아형으로 구분되어지고 있으며 I - III형은 북유럽에서 분리된 형이며 IV형은 북미에서 분리된 아형으로 알려져 있다. VHSV의 구조와 항원단백질에 대한 연구, 및 이들 기초 연구를 바탕으로 불활화백신, 단백질 재조합 백신, 약독화 백신, DNA 백신에 대한 연구가 수행되고 있다. 그러나 약독화 (attenuated) 바이러스 백신은 실험 조건에서는 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나 바이러스의 병원성 회복의 위험성과 자연계로의 확산 위험성 때문에 허가가 되지 않고 있다. 또한, 출혈성 패혈증 바이러스 G 혹은 N 유전자를 삽입한 플라스미드를 근육 주사한 DNA백신 실험에서는 강력한 면역반응이 유도되고 폐사율도 경감되었다는 보고가 무지개송어와 넙치에서 보고되고 있으나 DNA백신 유전자 조작에 대한 안전성의 문제 때문에 현재까지 허가된 DNA백신은 단 한 개뿐으로, 아직은 실용화 단계의 DNA백신은 없는 실정이며 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신은 상용화되어 있지 않다. 국내에서는 넙치에서 분리된 바이러스주에 대한 백신개발이 주로 진행되고 있으며 천연제제를 사용한 바이러스 활성 억제 연구는 거의 이루어지고 있지 않다. 특히 조추출물에서 보다 정제된 물질 군을 대상으로 연구를 진행하여 저독성 및 약재 효율성의 향상뿐만 아니라 항-VHSV에 관한 연구는 미비한 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 VHS를 예방 또는 치료하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 천연물의 일종인 감태 (Ecklonia cava) 추출물 또는 이의 분획물 및 이로부터 분리한 플로로탄닌계 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물이 어류 VHSV에 대해 효과적인 항바이러스 활성을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 감태 추출물 또는 그로부터 유래된 성분을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 (VHS)에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 감태 추출물로부터 유래된 성분을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 감태 추출물 또는 그로부터 유래된 성분을 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 사료첨가용 조성물을 포함하는 사료를 어류에 섭식시키는 단계를 포함하는 어류의 사육방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 보다 안전하면서도 효과적으로 VHS를 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중 천연물의 일종인 감태에 주목하게 되었다. 본 발명자들은 상기 감태의 에탄올 추출물을 수득하고, 이로부터 VHSV에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 3종의 화합물을 분리정제하였다. 이어, 상기 분리정제된 3종의 화합물의 세포독성 및 항바이러스 활성을 측정한 결과, 상기 3종의 화합물을 세포독성을 나타내지 않는 농도로 세포에 처리할 경우, 항바이러스 활성을 나타냄을 확인하였다. 또한, 넙치를 대상으로 상기 감태 추출물의 항바이러스 활성을 측정한 결과, 감태 추출물을 전처리한 넙치는 VHSV가 감염되더라도 생존율이 증가함을 확인하였다.

따라서, 상기 감태 추출물 또는 이로부터 유래된 3종의 화합물은 VHS를 예방 또는 치료하거나, 또는 어류를 사육하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태로서, 본 발명은 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 (VHS)에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “감태”란, 길이는 보통 1 ~ 2 m이며, 줄기는 원기둥 모양이고 밑동은 뿌리 모양인 해조류의 일종을 의미한다. 형태적으로 가운데 부분은 굵고 어릴 때에는 속이 차 있으나 다 자란 뒤에는 속이 비기도 한다. 줄기 끝에는 곁잎 조각을 가진 납작한 1개의 가운데 잎이 달린다. 이 잎은 길이 1 m 정도이고 갈색이지만 말리면 검은 빛이 된다. 두꺼우며 가죽같은 질감이고 양쪽에 깃꼴의 작은 잎이 달린다. 어린 식물체는 봄에 나타나는데 초년에는 줄기 길이 5 ~ 10 ㎝, 지름 약 5 ㎜이며 가운데 잎은 길이가 20 ~ 30 ㎝, 너비가 4 ㎝ 정도로 된다. 2년째의 가을에 가운데 잎에 만들어진 포자를 내보낸 뒤 잎은 떨어져 나가고 줄기만 있다가 옛날 잎의 자리에 새 가운데 잎이 달린다. 해조류를 구성하는 중요한 조류 식물이며, 주로 전복과 소라 등의 먹이가 된다. 알긴산이나 요오드, 칼륨을 만드는 주요 원료가 되고, 채취하여 식용으로 이용되기도 한다. 한국 남해안과 제주도, 울릉도 연안, 일본 등지에 분포한다.

본 발명에서 감태는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 직접 채취한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "감태 추출물"이란, 상기 감태를 물 또는 유기용매로 추출하여 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 감태 추출물은 VHS의 예방, 치료 또는 개선용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는데, 상기 감태 추출물은 감태를 극성용매, 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 추출물이 될 수 있다. 상기 극성용매로는 물, 탄소수 1 내지 6의 무수 또는 함수 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 등) 또는 알콜성 화합물(에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 등), 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 비극성 용매로는 헥산, 오로알칸, 펜탄, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 부틸아세테이트, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 아세톤, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 디에틸에테르, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소, THF 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 추출물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 물, 탄소수 1-6의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산, 디에틸에테르 등을 단독으로 포함하거나 또는 혼합한 용매를 사용하여 수득할 수 있고, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 부탄올, 에틸 아세테이트 등을 단독으로 포함하거나 또는 혼합한 용매를 사용하여 수득할 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올을 사용하여 수득할 수 있다.

상기 용매를 이용하여 추출하는 방법은 당업계에서 공지된 방법에 따라 수행할 수 있고, 바람직하게는 감태를 상기 용매에 침지하고, 10 내지 25℃의 상온에서 추출하는 냉침추출법, 40 내지 100℃로 가열하여 추출하는 가열추출법, 환류냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 통하여 수행될 수 있다.

본 발명의 용어 "분획물"이란, 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 분획물은 감태 추출물을 다양한 분획방법에 적용하여 수득할 수 있는데, 상기 분획방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 등이 될 수 있다. 특히, 용매 분획법에 사용되는 용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상술한 극성 용매 또는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 비극성 용매를 사용하며, 가장 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 용매 분획법은 비극성 수준이 높은 용매로부터 낮은 용매를 사용하여 상기 상엽 추출물을 순차적으로 분획하는 방식으로 수행될 수 있는데, 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 상기 감태 추출물을 순차적으로 분획하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물"이란, 감태 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래되고, 하기의 화학식으로 표시되는 화합물을 의미한다.

본 발명의 용어 "약학적으로 허용되는 염"이란, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 염은 화학식 1 내지 3으로 표시되는 플로로탄닌계 화합물에 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)을 처리하여 제조된 산 부가염, 염기를 처리하여 제조된 금속염 등이 될 수 있다.

상기 산 부가염으로는 설페이트, 파이로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 파이로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등이 될 수 있다. 또한, 금속염으로는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “바이러스성 출혈성 패혈증 (Viral hemorrhagic septicemia, VHS)”은 “Egtved diseases”라고도 하고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (VHSV)에 의해 야기되는 어류의 전염성 질환을 의미하는데, 증상으로는 내장 기관, 피부, 근육 등의 내부기관에서 출혈이 발생하고, 외부적으로는 별다른 증상이 나타나지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 "바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)"는 “Egtved virsu”라고도 하고, 11 kb의 negative sense 단일 가닥의 RNA를 포함하는 ,RNA 바이러스를 의미한다. 상기 VHSV는 지역적으로 서로 상이한 아종이 존재하고, 상호 다양한 영향을 미칠 수 있으나, 사람에게는 특별한 영향을 미치지 않는다고 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 자연에서 쉽게 채집할 수 있는 감태 에 95 %의 에탄올을 가하여 추출하고, 여과, 농축 및 건조를 통해 감태 에탄올 추출물을 제조하였다(실시예 1). 이어. 감태의 에탄올 추출물로부터 헥산, 에틸아세테이트, 및 증류수를 사용하여 분획화하고, 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 15개의 분획물로 분리할 수 있었다. 이들 중 다섯 번째 분획물을 다시 클로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 5개의 분획물로 분리하였다. 순수한 화합물 3은 MPLC 기기를 이용하여 클로로포름, 메타올 및 이들의 혼합 용매 (100:0 ~7:3, v/v)를 이동상으로 분리하였다. 계속적으로 화합물 1과 2는 다섯 번째 분획물에서 역상 컬럼 크로마토그래피법을 활용한 물, 메탄올, 및 이들의 혼합용매를 이동상으로 각각 분리하여 화학식 1 내지 3의 화합물들을 분리정제하였다(실시예 2). 다음으로, 분리한 상기 화합물들의 분자량 및 분자식을 핵자기공명 (NMR) 분석을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR 및 2D NMR 분광학 자료, 융점 (melting point) 및 적외선 분광학 (IR) 자료를 이용하여 분자구조를 결정하였다(실시예 3).

따라서, 본 발명의 감태 추출물, 그의 분획물 및 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물은 VHS의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 상엽 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 상기 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 본 발명의 약학 조성물을 어류에 하루 동안 1 내지 20 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 (VHS)이 발병하거나 또는 발병할 우려가 있는 개체에 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있으므로, 상기 조성물은 바이러스성 출혈성 패혈증을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"란 바이러스성 출혈성 패혈증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 어류, 조류, 포유동물 등을 제한 없이 포함한다.

본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”은 본 발명에 따른 감태 추출물 또는 플로로탄닌계 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 VHS의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”는 본 발명에 따른 감태 추출물 또는 플로로탄닌계 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질병의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 바이러스성 출혈성 패혈증을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함하는, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 감태 추출물을 포함하는 VHS에 대한 조성물은 천연물 기반으로서 종래 포르말린과 같은 항바이러스성 물질에 비하여 인체나 어류에 피해를 주지 않으면서 소독 효과를 나타내는 이점이 있다. 포르말린은 저가의 강력한 살균소독제 이지만 자극성 냄새를 발산하는 독극물일 뿐만 아니라 발암성 물질로 분류됨에 따라 해양오염 방지법, 약사법, 및 식품위생법 등에서 그 사용을 엄격하게 제한하고 있다. 또한, 본 발명의 항바이러스용 조성물의 경우 다른 항생제와 병용하여 그 효과를 극대화시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물은 어류세포 (FHM cells) 내 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (VHSV) 감염을 억제하여 세포 생존율을 증가시킨다 (실험예 1).

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함하는, 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 (VHS)에 대한 예방 또는 개선용 사료첨가제 및 상기 사료첨가제를 포함하는 사료를 어류에 섭식시키는 단계를 포함하는, 어류의 사육방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 감태 추출물 또는 화합물을 유효성분으로 포함하는 당업계의 공지된 다양한 형태로 사료로 제조 가능하며, 바람직하게는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.

농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 육분 (肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이 (whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질 사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.

조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초 (生草) 사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실 (穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지 (silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용 (種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎 등이 있다. 특수사료에는 굴껍테기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제 등이 있다.

상기 “식이 보조제”는 예를 들어 치료제 또는 소화제를 동물에 제공하는 제제 함유 조성물로, 통상 생체의 열량 섭취 공급원, 즉 에너지 공급원은 아니지만, 통상의 동물 사료에 추가하여 섭취되는 조성물을 의미한다.

본 발명의 어류 질환의 예방 또는 개선용 사료첨가제는 통상적인 사료에 첨가될 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 어류 사료첨가제는 해양 단백질 (어분 또는 크릴밀), 식물성 단백질 (콩 분말, 밀 글루텐, 옥수수 글루텐, 루핀 분말, 완두콩 또는 해바라기 분말), 혈분 및 골분을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질원, 어류 기름 (오징어간유) 또는 식물성 기름 (평지씨 기름, 콩기름, 대두유)을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 에너지원, 비타민혼합물 및 무기질혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항바이러스 조성물이 적용될 수 있는 양식어류는 바람직하게는, 넙치 (Paralichthys olivaceus), 방어 (Seriola quinqueradiata), 참돔 (Pagrus major), 자주복 (Takifugu rubripes), 부시리 (Seriola aureovittata), 송어 (Oncorhynchus masou), 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss), 잿방어 (Seriola dumerili), 전갱이 (Trachurus japonicus), 흑점줄전갱이(Pseudocaranx dentex), 능성어 (Epinephelus septemfasciatus), 참다랑어 (Thunnus thynnus), 잉어 (Cyprinus carpio), 제브라피쉬 (Danio rerio), 메기 (Silurus asotus), 클라리아스 가리에피누스 (Clarias gariepinus), 틸라피아 (Oreochronis niloticus), 연어 (Oncorhynchus keta), 대서양 연어 (Salmo salar) 및 송사리 (Oryzias latipes)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 어류이고 이에 한정하지 않는다. 가장 바람직하게는 넙치 (Paralichthys olivaceus)일 수 있다.

본 발명의 감태 추출물 또는 그로부터 유래된 성분을 포함하는 조성물은 VHSV에 대한 활성을 억제하는 효과를 나타내고, 이를 이용하여 높은 안전성을 가진 어류 VHS의 예방 또는 치료를 향상시키는 효과를 나타내므로, VHSV의 감염에 대한 넙치의 생존율 향상 및 어업 생산성 향상으로 인한 어업 안정성의 증대에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 넙치를 대상으로 생체 내 (in vivo)에서 항 VHSV를 검증하기 위하여, 공격 시험 VHSV 투여 농도를 결정하는 그래프이다.
도 2는 넙치를 대상으로 본 발명의 감태 추출물의 VHS 예방효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 감태 추출물의 제조

본 발명에서 사용한 감태는 일반적으로 자연에서 쉽게 채집할 수 있는 것으로 본 발명의 추출물을 효율적으로 얻기 위하여 분말 (powder) 형태로 분쇄하여 사용하였다.

감태 3 ㎏에 95 %의 에탄올 (ethanol) 20 ℓ를 가하여 실온에서 7일 동안 방치하여 추출하고, 이를 여과지로 여과하여 액상성분을 수득한 후, 이를 농축 및 건조시켜서 감태의 에탄올 추출물 (230 g)을 제조하였다.

실시예 2 : 감태 추출물로부터 분획물 및 화합물의 분리 및 정제

상기 실시예 1에서 수득한 감태의 에탄올 추출물 230 g에 물 2ℓ를 넣어 현탁시켰다. 이를 분별 깔대기에 넣고, 헥산, 에틸아세테이트 및 물을 사용하여 순차적으로 분획하여 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획 및 물 분획을 수득하였다.

상기에서 수득한 에틸아세테이트 분획을 농축 및 건조시켜서 에틸아세테이트 분획물을 수득하고, 상기 에틸아세테이트 분획물 85 g을 클로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매 (100:0 ~ 1:3, v/v)를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 [실리카겔 700 g, 70 ~ 230 메쉬 (mesh)]를 실시하여 15개의 분획물(Fraction 1 ~ 15)로 분리하였다. 이들 중 목적하는 화합물이 검출되는 다섯 번째 분획물을 선발하고, 상기 선발된 다섯 번째 분획물을 다시 클로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매 (100:0 ~ 1:5, v/v)를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (실리카겔 700 g, 70 ~ 230 메쉬 (mesh))를 실시하여 5개의 분획물로 분리하였다. 순수한 화합물 3은 MPLC 기기를 이용하여 클로로포름, 메타올 및 이들의 혼합 용매 (100:0 ~7:3, v/v)를 이동상으로 분리하였다.) 계속적으로, 화합물 1과 2는 이에 다섯 번째 분획물에서 역상 컬럼 크로마토그래피법을 활용한 물, 메탄올 및 이들의 혼합용매 (100:0 ~ 1:4, v/v)를 이동상으로 각각 분리하였다.

실시예 3: 화합물 1 내지 3의 구조 분석

상기 실시예 2에서 얻은 화합물들의 분자량 및 분자식을 핵자기공명 (NMR) 분석 (Bruker AM 300, 500)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR 및 2D NMR 분광학 자료, 융점 (melting point) 및 적외선 분광학 (IR) 자료를 이용하여 분자구조를 결정하였다.

화합물 1 (eckol)의 분광학적 자료.

옅은 갈색 분말 - 녹는 점 (m.p.) 235 ℃, ESI-MS m/z = 371 [MH], [calcd C₁₈H₁₂O₉, 372]; ¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) d 6.15 (s,1H, H-3), 5.96 (s, 2H, H-3, H-6), 6.03 (s, 3H, H-2' , H-4' , H-6'); ¹³C NMR (100 MHz, 메탄올-d4) d 161.9 (C-1'), 160.3 (C-3', H-5'), 154.6 (C-7), 147.3 (C-2), 147.2 (C-9), 144.3 (C-5a), 143.4(C-4), 138.6 (C-10a), 125.7 (C-1), 124.9 (C-4a), 124.6 (C-9a), 99.9 (C-8), 99.5 (C-3), 97.8 (C-4'), 95.9 (C-6), 95.5 (C-4' , C-6').

화합물 2 (fucodiphloroethol G)의 분광학적 자료.

하얀 분말 - ESI-MS m/z = 499 [M+H]+, [calcd C₂₄H₁₆O₁₂,498]; ¹H NMR (400 MHz, methanol-d4) d 6.13 (d, J = 2.44 Hz,1H, H-4"), 6.07 (s, 2H, H-3'" , H-5'"), 6.03 (s, 1H, H-6"), 6.03 (d, J = 0.98 Hz, 1H, H-5), 5.92 (s, 2H, H-30 , H-5'), 5.70 (d, J = 2.44 Hz, 1H, H-3); ¹³C NMR (100 MHz, methanol-d4) d 159.6 (C-5"), 159.5 (C-1"), 159.3 (C-3"), 159.2 (C-4'"), 158.1 (C-4'), 157.6 (C-2), 156.5 (C-2'" , C-6'"), 153.9 (C-4), 152.3 (C-2' , C-6'), 152.1 (C-6), 124.9 (C-1), 124.4 (C-1'), 102.1 (C-2"), 101.9 (C-1'"), 98.1 (C-3), 97.6 (C-4"), 96.8 (C-5'"), 96.4 (C-3'" , C-5' , C-3'), 94.6 (C-5), 94.3 (C-6").

화합물 3 (phlorofucoeckol A)의 분광학적 자료.

색깔이 없는 무형태의 고체 - 녹는 점 (m.p.) 278 ℃, ESI-MS m/z = 601 [MH], [calcd C₃₀H₁₈O₁₄, 602]; ¹H NMR (400 MHz, methanol-d4) d 6.64 (s, 1H, H-13), 6.41 (s, 1H, H-9), 6.27 (s, 1H, H-3), 6.07 (d, 1H, J = 2.93 Hz, H-6), 5.99 (d, 2H, J = 1.95 Hz, H-2' , H-6'), 5.95 (t, 1H, J = 1.95 Hz, H-4'), 5.93 (t, 1H, J = 1.95 Hz, H-4"), 5.90 (d, 2H, J = 1.95 Hz, H-2" , H-6"); ¹³C NMR (100 MHz, methanol-d4) d 162.0 (C-1' , C-1"), 160.3 (C-3" , C-5" , C-3' , C-5'), 153.3 (C-12a), 151.8 (C-1'), 151.3 (C-11a), 146.1 (C-14), 144.1 (C-4), 138.5 (C-15a), 135.4 (C-5a), 128.3 (C-14a), 125.2 (C-4a), 124.8 (C-1), 122.5 (C-11), 105.5 (C-7), 105.4 (C-6), 100.1 (C-9), 99.5 (C-3), 97.9 (C-4"), 97.8 (C-4'), 96.3 (C-13), 95.5 (C-2' , C-6' , C-2" , C-6").

실험예 1: 감태 추출물 또는 플로로탄닌계 화합물의 VHSV에 대한 저해 효과 및 세포독성 측정

실시예 2에서 수득한 플로로탄닌계 화합물의 세포 병리감소 효과 (Cytopathic reduction effect) 및 세포독성을 측정하였다.

먼저, VHSV에 대한 저해활성을 알아보기 위하여 다음과 같이 세포 병리감소 효과를 측정하였다. FHM 세포를 MEM10 배지가 담겨진 96 웰 플레이트 (well plate)에 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하고 이에 VHSV (10^2.8)를 10 ㎕씩 분주하였으며, 각 웰에 4, 2, 1, 0.5, 0.25 또는 0.125 ㎍/㎕의 농도가 되도록 상기 각 화합물을 가하고, 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 적량의 MEM10 배지를 가한 다음, 16 ℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 각 웰로부터 MEM10 배지를 제거하고 플라스틱 파라핀 필름 (plastic paraffin film)으로 밀봉한 세트를 각각 4세트씩 준비하고, 이들 각 세트를 16 ℃에서 10 ~ 14일 동안 방치하면서, 생존하는 세트의 수를 계수하여, 생존율을 산출하는 방식으로 세포병리 감소효과를 측정하였다(표 1).

또한, 세포독성을 측정하기 위하여, FHM 세포에 대한 상기 각 화합물의 EC₅₀(μM) 값을 측정하였다(표 1).

플로로탄닌계 화합물의 세포병리 감소효과 및 EC₅₀(μM) 값

	4	2	1	0.5	0.25	0.125	EC50 (μM)
화합물 1 (Eckol)	-	-	3/4	4/4	4/4	4/4	5.1
화합물 2 (Fucodiphloroethol G)	-	-	-	-	1/4	4/4	0.7
화합물 3 (Phlorofucoeckol A)	-	-	2/4	4/4	4/4	4/4	1.8

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 감태 추출물로부터 얻어진 각각의 플로로탄닌계 화합물은 세포독성이 없는 농도 (각각 5.1, 0.7, 1.8 μM)에서 VHSV에 대한 우수한 저해활성을 나타냄을 확인하였다.

실험예 2 : 감태 추출물의 VHSV에 대한 저해 효과

먼저, 상기 실험예 1에서 제조된 감태 에탄올 추출물의 EC₅₀을 측정한 결과, 4.75 ㎍/㎕임이 확인되었으므로, 넙치를 대상으로 하여 생체 내에서 항VHSV 효과를 검증하기 위하여, 공격실험 VHSV 투여농도를 결정하였다 (도 1).

도 1에서 보듯이, 바이러스성 병원체인 VHSV가 세포에 감염할 수 있는 용량을 TCID₅₀으로 보았을 때 (바이러스 적정시), 10^5.1, 10^6.1, 10^7.1 TCID₅₀ / fish 의 농도로 공격실험을 수행한 결과, 2일째부터 폐사가 시작되어 11일째에 최대 80%의 폐사율을 보였다. 따라서 VHSV 공격실험의 적정 투여 농도는 10^7.1 TCID₅₀ / fish 로 결정하였다.

다음으로, 사료에 감태추출물을 0.3 %의 함량으로 첨가하여 4주간 동물에게 섭식시킨 후 각 실험구별로 각각 15 마리씩 무작위로 선발하여 인위감염을 통한 공격실험을 수행하였다. 인위감염 공격실험은 모든 개체에 10^7.1 TCID₅₀ / fish 의 농도로 VHSV 100 ㎕를 복강 주사한 후, 약 1톤 규모의 원형 수조에서 함께 사육하였다. 환수는 1일 2회 실시하였으며, 냉각기를 사용하여 수온을 약 14℃ 정도로 유지하였고, 사육기간 동안에는 절식하였다. 이어, 4주 후의 폐사율을 비롯하여 상대생존율 (Relative Percent Survival, RPS = (1-실험군 페사율/대조군 폐사율)× 100)을 계산하였고 (수학식 1), 감태 추출물의 VHSV에 대한 항바이러스 효과를 분석하였다 (도 2).

도 2에서 보듯이, 7일째부터 폐사가 시작되어 2주 ~ 3주 사이에 대부분의 폐사가 진행되었다. 실험 28일까지 누적폐사율은 대조군이 53% 그리고 감태 추출물에 대한 누적폐사율은 20%로 확인되었다. 대조군 대비 상대 생존율을 분석한 결과, 감태 추출물을 처리한 경우에는 62.5%의 상대생존율을 나타냄이 확인되었다.

Claims (9)

1. 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 (VHS)에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 감태에 물, 에탄올, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 가하여 추출하여 수득한 것인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 분획물은 감태 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것인 조성물.
   
4. 바이러스성 출혈성 패혈증 (VHS)이 발병하거나 또는 발병할 우려가 있는, 인간을 제외한 개체에 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료 방법.
   

   

   
   
5. 감태 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 플로로탄닌계 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함하는, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물.
   

   

   
   
6. 제5항의 항바이러스 조성물을 포함하는, 사료첨가제.
   
7. 제6항의 사료첨가제를 포함하는 사료를 어류에 섭식시키는 단계를 포함하는, 어류의 사육방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 어류는 넙치, 방어, 참돔, 자주복, 부시리, 송어, 무지개 송어, 잿방어, 전갱이, 흑점줄전갱이, 능성어, 참다랑어, 잉어, 제브라피쉬, 메기, 클라리아스 가리에피누스, 틸라피아, 연어, 대서양 연어, 송사리 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 어류는 넙치(Paralichithys olivaceus)인 것인 방법.

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