JP7435987B2 - クルクミノイド及び甘草抽出物またはその分画物を含有するブタ流行性下痢ウイルス感染の予防または治療用組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、クルクミノイド系化合物、及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含むブタ流行性下痢（Porcine epidemic diarrhea, PED）ウイルス感染の予防、改善または治療用薬学組成物、医薬部外品組成物、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料及び飲用水に関する。
機能性物質が効能を示すためには、必ず血液内に吸収が起き、一定時間持続性を維持することが基本的必須条件である。水溶性物質であるアミノ酸、ブドウ糖、及びビタミンなどは肝臓を通じて心臓に到達し、脂溶性物質である脂肪が分解して生成される脂肪粒、大部分のファイトケミカル及び脂溶性ビタミンなどは心臓に吸収が起きる。結局、水溶性及び脂溶性物質は心臓で会うようになり、全身の細胞に移動する。
これに関連した研究動向を詳察すると、脂溶性物質はリン脂質を活用して水溶性化複合体を開発する研究が活発に進行されている。しかし、物質が分解されるなどの多様な問題が発生しており、限界があるのが現状である。これについて、脂溶性物質を水溶性化させて吸収率を最大に増加させると共に効能を極大化させる技術に対する要求があった。
一方、産業動物の生産性を低下させる代表的な原因の一つは、ウイルス性腸炎であり、ウイルス性腸炎は、仔豚飼育期間中に必ず１回以上発生し、増体率の低下とへい死を引き起こして持続的に経済的被害を与えている。
最近、国内外に変異型ブタ流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea, PED)の爆発的な発病により莫大な経済的被害が発生している。変異型ＰＥＤコロナウイルスを効果的に制御するための手段としては、ワクチン及び治療剤の開発であるといえる。変異型ＰＥＤコロナウイルスの治療剤は、世界的に現在まで皆無でこれに対する治療剤の開発は、養豚産業の生産性と付加価値の側面で非常に重要であり、これに産業動物の流行性下痢ウイルスを効果的に制御できる治療剤の開発は必須である。
韓国特許登録番号第10-1894087号
Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998
本発明者らは、新たなＰＥＤコロナウイルス感染治療剤に関する研究を行っていたところ、クルクミノイド系化合物及び甘草抽出物を共に用いる場合、クルクミノイド系成分の体内吸収率が増大するシナジー効果を奏することにより、ＰＥＤコロナウイルス感染を効果的に予防し、治療できることを初めて究明し、本発明を完成するに至った。
本発明の一つの目的は、クルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩;及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ブタ流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea, PED)ウイルス感染の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、クルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用食品組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、クルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用医薬部外品組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、クルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用飼料添加剤を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記飼料添加剤を含む飼料を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、クルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用飲用水添加剤を提供することにある。
本発明の更に他の一つの目的は、上記飲用水添加剤を含む飲用水を提供することにある。
本発明によるクルクミノイド系化合物、及び甘草抽出物またはその分画物を含む組成物は、これら成分間のシナジー効果が発揮され、体内吸収率が増大し、抗ウイルス効果に顕著に優れ、副作用がなく、少量の使用でもブタ流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea, PED)ウイルス感染を効果的に予防し、治療及び改善できる。これについて、ＰＥＤウイルス感染の予防、改善または治療用薬学組成物、医薬部外品組成物、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料及び飲用水に適用することができる。
クルクミン－甘草サポニン水溶性化複合体のブタ流行性下痢（Porcine epidemic diarrhea, PED）コロナウイルスＲＮＡ減少効果を奏した図である。 ＰＥＤコロナウイルスの核蛋白質（N protein）に対する複合体のターゲットタンパク質発現阻害能を確認した図である。 ＴＮＦ－αに対する複合体の阻害能を確認した図である。 ＩＬ－６に対する複合体の阻害能を確認した図である。 ＩＬ－８に対する複合体の阻害能を確認した図である。 新生仔豚ウイルス伝播動物モデルにおいて複合体投与による生存率を確認した図である。 新生仔豚ウイルス伝播動物モデルにおいて複合体投与による糞便状態を確認した図である。 新生仔豚ウイルス伝播動物モデルにおいて複合体投与による体重変化を確認した図である。 複合体投与群の糞便におけるウイルスＲＮＡ減少効果を確認した図である。 複合体投与群の十二指腸におけるウイルスＲＮＡ減少効果を確認した図である。 複合体投与群の空腸におけるウイルスＲＮＡ減少効果を確認した図である。 複合体投与群の回腸におけるウイルスＲＮＡ減少効果を確認した図である。 複合体投与群の十二指腸におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６及び、ＩＬ－８減少効果を確認した図である。 複合体投与群の空腸におけるウイルスＴＮＦ－α、ＩＬ－６及び、ＩＬ－８減少効果を確認した図である。 複合体投与群の回腸におけるウイルスＴＮＦ－α、ＩＬ－６及び、ＩＬ－８減少効果を確認した図である。 複合体投与群の腸間膜におけるウイルスＴＮＦ－α、ＩＬ－６及び、ＩＬ－８減少効果を確認した図である。 複合体投与群の小腸に対する病理組織検査結果である。 標本上における絨毛：腺窩の比を確認した写真（上）及び絨毛：腺窩の比を示したグラフ（下）である。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本明細書で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本明細書で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記記述された具体的な記述により本発明の範疇が制限されるとは見られない。
上記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、下記化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩;及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ブタ流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea, PED)ウイルス感染の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明において、上記有効成分は、化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体だけでなく、化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物の混合物も含み得る。
本発明において用語、「ブタ流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea, PED)」とは、ＰＥＤウイルス（PEDV）が原因になって発生する伝染性ブタ疾患であり、特徴的な肉眼的臨床症状としては、沈鬱、下痢直前／後の食欲不振、嘔吐、重度の水様性下痢による脱水及び体重減少があり、特徴的な剖検所見としては、小腸内ガス及び液体が満たされており、漿膜が薄くなり、腸粘膜シワの形態が消えることがある。上記ＰＥＤＶは、コロナウイルスの一種であるところ、本発明において上記ＰＥＤＶは、ＰＥＤウイルスまたはＰＥＤコロナウイルスと混用され得る。
本発明においてクルクミノイド系化合物は、下記化学式（１）で表されるものであってもよいが、これに制限されない。
上記Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシ基、またはＣ1～Ｃ10のアルコキシ基であり、上記ｎ及びｍは１≦ｎ≦５及び１≦ｍ≦５である。
具体的には、上記化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物は化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表される化合物またはこれらの混合物であってもよいが、これに制限されない。
上記化学式（２）はクルクミン(Curcumin)であり、上記化学式（３）及び化学式（４）はクルクミンの誘導体であり、化学式（３）はデメトキシクルクミン(Demethoxycurcumin)と命名することができ、化学式（４）はビスデメトキシクルクミン(Bisdemethoxycurcumin)と命名できる。
本発明の目的上、上記クルクミン、デメトキシクルクミン、及びビスデメトキシクルクミンだけでなく、クルクミノイド系化合物に属する化合物を制限なく用いることができ、上記クルクミン、デメトキシクルクミン、及びビスデメトキシクルクミンの誘導体または異性体も用いられることは当業者にとって自明である。
本発明において用語、「誘導体(derivative)」とは、上記化合物の構造の一部を他の原子や原子団で置換して得られる化合物をいう。
本発明において用語、「異性体(isomer)」とは、分子式は同一であるが、分子内にある構成原子の連結方式や空間配列が同一ではない化合物をいう。異性体は、例えば、構造異性体(structural isomers)、及び立体異性体(strereoisomer)を含む。
本発明において、上記化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物はターメリック（Ｔｕｒｍｅｒｉｃ）から分離したものであってもよいが、これに制限されない。
本発明において用語、「薬学的に許容可能な塩」とは、標的個体が生理学的に受認可能な本発明の化合物の全ての塩を意味し、化合物が投与される有機体に深刻な刺激を誘発せず、化合物の生物学的活性と物性を損傷させない化合物の剤形であることが好ましい。上記薬学的塩は、薬学的に許容されるアニオンを含有する無毒性酸付加塩を形成する酸、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などのような無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などのような有機カルボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などのようなスルホン酸などにより形成された酸付加塩が含まれる。例えば、薬学的に許容されるカルボン酸塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどにより形成された金属塩またはアルカリ土類金属塩、リシン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン及びトリエチルアミンなどのような有機塩などが含まれる。
本発明において用語、「甘草」とは、カンゾウ(Glycyrrhiza)属植物の根であり、せきを止め、熱を下げ、胃を和らげて緊急な状況を緩和させることが知られている。
本発明において用語、「抽出物」とは、上記甘草を抽出処理して得られる抽出液、上記抽出液の希釈液や濃縮液、上記抽出液を乾燥して得られる乾燥物、上記抽出液の粗精製物や精製物、またはこれらの混合物など、抽出液自体及び抽出液を用いて形成可能な全ての剤形の抽出物を含む。
上記甘草抽出物を製造する方法は、超音波抽出法、濾過法及び還流抽出法など、当業界の通常の抽出方法を用いることができる。望ましくは、洗浄及び乾燥により異物が除去された甘草を粉砕して得られた甘草乾燥物を、水、炭素数１～４（Ｃ１～Ｃ４）のアルコールまたはこれらの混合溶媒で抽出した抽出物であってもよく、より望ましくはＣ１～Ｃ４のアルコールで抽出した抽出物であってもよく、最も望ましくはメタノールまたはエタノールで抽出した抽出物であってもよい。この時、抽出溶媒は甘草の乾燥重量の２～２０倍とすることが好ましい。一例として、甘草乾燥物を細切した後、抽出容器に入れてＣ１～Ｃ４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒、望ましくはメタノールまたはエタノールを入れて一定期間常温で放置した後、濾過してアルコール抽出物を得ることができる。この時、抽出は常温で１週間放置することが好ましく、その後に濃縮または凍結乾燥などの方法をさらに経ることができる。または市販中の甘草抽出物を購入して用いることができる。
甘草抽出物の主要成分は、白色または無色の結晶性粉末であるグリチルリチン酸(glycyrrhizinic acid)である。上記グリチルリチン酸は甘草サポニンとも命名され得る。本発明において、上記甘草抽出物は、甘草エキスまたは粉末形態で製造されたグリチルリチン酸である甘草サポニンを７％以上含有したものであってもよいが、これに制限されない。
本発明において用語、「分画物」とは、多様な構成成分を含む混合物から特定成分または特定グループを分離する分画方法により得られた結果物を意味する。上記甘草分画物は、例えば、甘草抽出物を水で懸濁した後、ヘキサン、エチルアセテートのような非極性溶媒を用いて分画することにより極性溶媒分画物と非極性溶媒分画物をそれぞれ得ることができる。具体的には、甘草の粗抽出物を蒸溜水に懸濁した後、懸濁液の約１～１００倍、望ましくは約１～５倍体積のヘキサン及びエチルアセテートのような非極性溶媒を加えて１回～１０回、望ましくは２回～５回にわたって非極性溶媒の可溶層を抽出、分離して得ることができるが、これに制限されない。また、さらに通常の分画工程を行うことができる(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998)。
機能性物質が体内で効果を示すためには、血液内に吸収が起き、一定時間持続性を維持することが必須である。これについて、機能性難溶物質であるクルクミンを水溶性化するために、本発明の一実施例ではクルクミンに甘草抽出物を混合し、クルクミン－甘草サポニンの水溶性化複合体を製造するために、マイクロウェーブ攪拌抽出器（韓国登録番号第１０－１８９４０８７号）を用いた。
本発明において用語、「水溶性化」とは、界面活性剤のような物質の存在により水に十分に溶けない物質の溶解度が増加する現象を意味する。水溶性化のための方法で油溶性ビタミンやホルモンなどを可溶化して水溶性に替えたりエマルジョン重合を促進する方法などが広く応用されている。本発明では、水溶化剤として甘草抽出物を用い、本発明の甘草抽出物が難溶性物質であるクルクミノイド系化合物と混合され、クルクミノイド系化合物が水（または血液）に溶解しやすい構造を有するクルクミノイド系化合物－甘草サポニン水溶性化複合体を形成することができる。
上記複合体に含まれたクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物の重量比は１：１～１：４００、１：１０～１：４００、１：２０～１：４００、１：３０～１：１００、具体的には１：５０～１：７０であってもよいが、これに制限されない。
本発明において用語、「予防」とは、上記組成物の投与によりＰＥＤウイルス感染を抑制したり発病を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、上記組成物の投与によりＰＥＤウイルス感染による症状が好転したり有益に変更される全ての行為を意味する。
本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形体または希釈剤をさらに含んでもよい。この時、上記薬学的組成物に含まれる有効成分の含量は特にこれに制限されないが、組成物の全重量に対して０．０００１重量％～１０重量％であり、望ましくは０．００１重量％～１重量％を含んでもよい。
上記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができ、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、普通用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
本発明の組成物は経口投与用であってもよいが、これに制限されない。
本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。
本発明において用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は個体の種類及び重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られている要素により決定されてもよい。本発明の組成物は、個別の治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは段階的または同時に投与されてもよい。そして単一または多重投与されてもよい。上記要素をいずれも考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定され得る。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なるが、好ましい効果のために、本発明の組成物は、１日０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇであり、望ましくは０．００１～２００ｍｇ／ｋｇで投与することがよい。投与は１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。上記組成物は、ラット、家畜、ヒトなどの多様な哺乳動物に多様な経路に投与することができ、投与の方式は、当業界の通常の方法であれば制限なく含み、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射により投与され得る。具体的には経口投与であってもよいが、これに制限されない。
また、本発明の薬学的組成物は、ヒトに適用される医薬品だけでなく、動物医薬品の形態でも用いられる。ここで、動物とは、家畜及びペットを含む概念である。
本発明において、上記化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体は、ａ）化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む第１組成物；及び甘草抽出物またはその分画物を有効成分として含む第２組成物を混合する段階；及びｂ）上記混合物にマイクロウェーブ(microwave)を処理する段階を含む方法により製造されるものであってもよい。
上記ａ）段階において第１組成物及び第２組成物の混合時に、これらの重量比は１：１～１：４００、１：１０～１：４００、１：２０～１：４００、１：３０～１：１００、具体的には１：５０～１：７０であってもよいが、これに制限されない。
上記ｂ）段階においてマイクロウェーブを処理する方法は、これに制限されないが、マイクロウェーブ攪拌抽出器（韓国登録番号第10-1894087号）において２，２００～２４，０００Ｗ、好ましくは２，２００～１２，０００Ｗで１０～１２０ｍｉｎ、好ましくは１０～６０ｍｉｎ間攪拌抽出するものであってもよい。
本発明において用語「マイクロウェーブ」とは、周波数帯域が３００ＭＨｚ～３００ＧＨｚまたは波長の場合、１ｍ～１ｍｍの交流信号である。また、上記抽出が完了した後、ろ過紙で精製する段階をさらに含んでもよいが、これに制限されない。
更に他の様態として、本発明は、化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用食品組成物を提供する。
上記クルクミノイド系化合物、甘草抽出物またはその分画物、ＰＥＤウイルスについては、前述した通りである。
具体的には、上記化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物はクルクミン、デメトキシクルクミン、及びビスデメトキシクルクミンのいずれか一つまたはこれらの混合物であってもよいが、これに制限されない。
本発明の有効成分は、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善を目的として食品組成物に添加することができる。本発明の有効成分を食品添加物として用いる場合、上記有効成分をそのまま添加したり、他の食品または成分と共に用いることができ、通常の方法により好適に用いることができる。有効成分の混合量は、使用目的に応じて適切に決定することができ、上記食品組成物に含まれる有効成分の含量は、特にこれに制限されないが、組成物の全重量に対して０．０００１重量％～１０重量％であり、望ましくは０．００１重量％～１重量％を含んでもよい。
本発明の食品の種類には特別な制限はない。上記有効成分を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味での食品をすべて含むことができ、動物のための飼料として利用される食品を含むことができる。
上記以外に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に天然果物ジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。また、上記食品は、公知の製造方法により錠剤、顆粒、粉末、カプセル、液状の溶液及び丸剤などの剤形に製造されてもよい。本発明による有効成分を含む以外には、成分に特別な制限がなく、通常の様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含んでもよい。
更に他の様態として、本発明は、化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用医薬部外品組成物を提供する。
上記クルクミノイド系化合物、甘草抽出物またはその分画物、ＰＥＤウイルスについては、前述した通りである。
具体的には、上記化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物は、クルクミン、デメトキシクルクミン、及びビスデメトキシクルクミンのいずれか一つまたはこれらの混合物であってもよいが、これに制限されない。
本発明の有効成分は、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善を目的として医薬部外品組成物に添加できる。
本発明において用語、「医薬部外品」とは、ヒトや動物の疾病を治療、軽減、処置または予防する目的で用いられる繊維、ゴム製品またはこれと類似したもの、人体に対する作用が弱かったり人体に直接作用せず、器具または機械ではないものとこれと類似したもの、感染予防のために殺菌、殺虫及びこれと類似の用途に用いられる製剤の一つに該当する物品であり、ヒトや動物の疾病を診断、治療、軽減、処置または予防する目的で用いる物品のうち器具、機械または装置ではないもの及びヒトや動物の構造と機能に薬理学的影響を与える目的で用いる物品のうち器具、機械または装置ではないものを除いた物品を意味し、皮膚外用剤及び個人衛生用品も含む。
上記皮膚外用剤は、特にこれに制限されないが、望ましくは、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、貼付剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、ゲル剤またはゲルの形態に製造されて用いられる。上記個人衛生用品には、特にこれに制限されないが、望ましくは、石鹸、化粧品、ウェットティッシュ、ティッシュ、シャンプー、スキンクリーム、フェイスクリーム、歯磨き粉、口紅、香水、メイクアップ、ファンデーション、ボルタッチ、マスカラ、アイシャドウ、日焼け止めローション、ヘアケア製品、エアプレスナーゲルまたはクリーニングジェルであってもよい。また、本発明の医薬部外品組成物の他の例として、消毒清浄剤、シャワーフォーム、マウスウォッシュ、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドウォッシュ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤またはフィルター充填剤がある。
本発明の有効成分をＰＥＤウイルス感染の予防または改善を目的として医薬部外品組成物に添加する場合、上記有効成分をそのまま添加したり他の医薬部外品の成分と共に用いることができ、通常の方法により好適に用いることができる。有効成分の混合量は使用目的に応じて適切に決定することができ、上記医薬部外品組成物に含まれる有効成分の含量は特にこれに制限されないが、組成物の全重量に対して０．０００１重量％～１０重量％であり、望ましくは０．００１重量％～１重量％を含んでもよい。
もう一つの様態として、本発明は、化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用飼料添加剤または飲用水添加剤を提供する。
上記クルクミノイド系化合物、甘草抽出物またはその分画物、ＰＥＤウイルスについては、前述した通りである。
具体的には、上記化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物はクルクミン、デメトキシクルクミン、及びビスデメトキシクルクミンのいずれか一つまたはこれらの混合物であってもよいが、これに制限されない。
本発明において用語、「飼料添加剤」とは、栄養的または特定の目的のために飼料に微量で添加される物質を総称するものであり、本発明では、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善を目的として添加される物質を意味する。
本出願において、用語「飼料」とは、個体の生命を維持し、上記個体を飼育するのに必要な有機または無機栄養素を供給する物質を意味する。上記飼料は、飼料を摂取する個体が必要とするエネルギー、タンパク質、脂質、ビタミン、鉱物質などの栄養素を含んでもよく、特にこれに制限されないが、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、油脂類、澱粉類、ウリ類、穀物副産物類などの植物性飼料またはタンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、魚粉などの動物性飼料となり得る。
上記個体は、飼育対象を意味するものであり、本出願の飼料を摂取できる生命体であれば、制限なく含まれ、例えば、家畜及びペットを含む概念である。
また、上記飼料には、本出願の飼料添加剤の以外にも個体の成長促進、疾病の予防などのためのアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非蛋白態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などの追加の飼料添加剤が含まれてもよい。
本発明の飼料添加剤には、品質低下を防止するために添加される結着剤、乳化剤、保存剤などをさらに含んでもよく、効用の増大のために添加されるアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非蛋白態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴ糖などをさらに含めてもよく、それ以外にも飼料混合剤などをさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において用語、「飲用水添加剤」とは、栄養的または特定の目的のために動物を対象とする飲用水に微量で添加される物質を総称するものであり、本発明ではＰＥＤウイルス感染の予防または改善を目的として添加される物質を意味する。ここで、動物とは、家畜及びペットを含む概念である。
もう一つの様態として、本発明は、化学式（１）で表されるクルクミノイド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用飼料添加剤または飲用水添加剤を含む飼料または飲用水を提供する。
上記クルクミノイド系化合物、甘草抽出物またはその分画物、ＰＥＤウイルス、飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤については、前述した通りである。
以下、本発明を、実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：クルクミン－甘草サポニン水溶性化複合体及び粉末製造方法
クルクミノイド系化合物であるクルクミンは純度約９５％以上のクルクミンであり、インド産のクルクミンを用い、上記甘草抽出物（テピョン（株）、韓国）は、甘草エキスまたは粉末の形態に製造されたグリチルリチン酸である甘草サポニンを７％以上含有した抽出物である。
甘草抽出物２５Ｋｇを、水１２５Ｌを入れて溶解させた後、クルクミン３７５ｇを入れて混合させた。その後、マイクロウェーブ攪拌抽出器（韓国登録番号第１０－１８９４０８７号）に混合物を入れて１２，０００Ｗで６０分間攪拌抽出し、抽出が完了した後、ろ過紙で精製することにより、液状形態のクルクミン－甘草サポニン水溶性化複合体を製造した。その後、真空凍結乾燥を通じてクルクミン－甘草サポニン水溶性化複合体（以下、複合体）の粉末を得た。
実施例２：複合体のＰＥＤコロナウイルスｉｎ ｖｉｔｒｏ効果の評価
２－１．ＰＥＤコロナウイルスＲＮＡ減少効果
複合体によるブタ流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea, PED)コロナウイルスのＲＮＡ減少効果を確認するために、Ｖｅｒｏ細胞にＰＥＤコロナウイルスを０．００１ＭＯＩで１時間感染させた。複合体を濃度（２０、４０、６０μｇ／ｍＬ）別に処理した後、２４時間後にリアルタイムＰＣＲを用いて確認した結果、ウイルスＲＮＡ減少能はウイルス比２０、４０、６０μｇ／ｍｌの濃度の複合体処理群で濃度依存的に１．７倍、２．６倍、６．６倍のウイルスＲＮＡがそれぞれ減少することを確認した（図１）。
ＰＥＤコロナウイルスの核蛋白質(N protein)に対する複合体のターゲットタンパク質の発現阻害能を確認するために、Ｖｅｒｏ細胞にＰＥＤコロナウイルスを０．００１ＭＯＩで１時間感染させた。複合体を濃度別に処理２４時間後に確認した結果、ウイルス群比陽性対照物質である６－アザウリジン(6-azauridine)は１０μＭで６．８倍の阻害効果を奏し、複合体２０、４０、６０μｇ／ｍＬで濃度依存的に１．３倍、１．６倍、２．２倍の核蛋白質合成がそれぞれ阻害されることを確認した（図２）。
２－２．ＰＥＤコロナウイルス抗炎症因子減少効果
炎症の促進と関連した前炎症性サイトカイン(pro-inflammatory cytokines)であるＴＮＦ－αに対する複合体の阻害能を確認するために、実施例２－１と同様の方法でウイルス感染後に複合体を処理した結果、ウイルス群比陽性対照物質である６－アザウリジンは１０μＭで３．８倍の阻害効果を奏し、複合体２０、４０、６０μｇ／ｍＬで１．９倍、２．２倍、２．５倍の抗炎症阻害活性がそれぞれ示されることを確認した（図３）。
炎症の促進と関連した前炎症性サイトカインであるＩＬ－６に対する複合体の阻害能を確認するために、実施例２－１と同様の方法でウイルス感染後に複合体を処理した結果、ウイルス群比陽性対照物質である６－アザウリジンは１０μＭで５．８倍の阻害効果を奏し、複合体２０、４０、６０μｇ／ｍＬで濃度依存的に１．４倍、１．５倍、２．４倍の抗炎症阻害活性がそれぞれ示されることを確認した（図４）。
炎症の促進と関連した前炎症性サイトカインであるＩＬ－８に対する複合体の阻害能を確認するために、実施例２－１と同様の方法でウイルス感染後に複合体を処理した結果、ウイルス群比陽性対照物質である６－アザウリジンは１０μＭで２５．４倍の阻害効果を奏し、複合体２０、４０、６０μｇ／ｍＬで濃度依存的に３．７倍、４．１倍、６．４倍の高い抗炎症阻害活性がそれぞれ示されることを確認した（図５）。
実施例３：新生仔豚ウイルス伝播動物モデルの構築及び複合体の効果の評価
３－１．新生仔豚ウイルス伝播動物モデルの構築
ＰＥＤウイルスワクチン未接種母体出産の３日齢の新生仔豚を用いて群構成時に体重平均が類似するように分類し、代用乳を給餌した。ウイルスを接種せず、複合体を投与していない陰性対照群(control)にはアルファMEM培地(Alpha Modification of Eagles MEM)を同量経口投与した。複合体を投与した試験群（５ｎ）は５日間複合体を２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口投与した後、ほ乳仔豚にPEDV(Aram strain、中央ワクチン)を１ｘ１０2 ＰＦＵ／ｍｌで２ｍｌずつ経口接種して下痢が誘発された（ＰＩＤ２）仔豚（１ｎ）と合飼させ、下痢を誘発する伝播モデルをそれぞれ構築した。
３－２．生存に対する結果
評価グループの構成は、非感染(Mock-infected)グループ、感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）で構成し、試験グループは、仔豚（１ｎ）を非感染仔豚（５ｎ）に合飼させて下痢を誘発する伝播モデルで１４日間、複合体投与による生存率を測定した。
その結果、非感染グループは試験終了期間まで１００％生存し、感染グループは４０％の生存率を示した一方、複合体投与グループは８０％の生存率を示し、感染グループに比べて生存率を２倍上昇させることを確認した（図６）。
３－３．糞便状態の観察及び結果
実験の進行過程中に毎日糞便の状態を観察し、各個体の糞便点数を記録及び平均値を導き出した。糞便点数は糞便の状態に応じて普通(normal、0)、ペースト状(pasty、1)、半液体(semi-liquid、2)、液体(liquid、3)と付与した。
その結果、ウイルスを接種し、複合体を投与していない陽性対照群(virus)は接種後１０日目まで糞便点数３を示した。一方、ウイルス接種後、１０日目を基準に複合体２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを投与した試験群は、正常対照群のような糞便状態を示し、複合体がブタ流行性下痢に対して改善及び治療効能が非常に高いことを確認した（図７）。
３－４．体重
実施例３－２の伝播モデルで１４日間複合体投与による体重変化を測定した結果、非感染グループは開始日から試験終了期間まで１．５倍の増体率を示し、感染グループは体重変化の差はそれほど示していない一方、複合体投与グループは１．５倍の増体率を示し、感染時にも体重を増加させることを確認した（図８）。
３－５．複合体の糞便／小腸におけるウイルスＲＮＡ減少効果
３－５－１．糞便
非感染(Mock-infected)グループを除いた感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の糞便におけるウイルスＲＮＡは、感染３日目（ＰＩＤ３）から感染１４日目（ＰＩＤ１４）まで次第に減少する様相を示し、感染グループは試験終了期間までウイルスが検出された一方、複合体を投与したグループでは感染１１日目（ＰＩＤ１１）から終了日までウイルスＲＮＡが検出されず、ブタ流行性下痢に対して改善及び治療効能が非常に高いことを確認した（図９）。
３－５－２．十二指腸
非感染(Mock-infected)グループを除いた感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の十二指腸におけるウイルスＲＮＡは、感染３日目（ＰＩＤ３）から感染１４日目（ＰＩＤ１４）まで次第に減少する様相を示し、試験終了日（ＰＩＤ１４）を基準に、感染グループ比複合体投与グループの十二指腸におけるウイルスＲＮＡは約５倍減少することを確認し、ブタ流行性下痢に対して改善及び治療効能が非常に高いことを確認した（図１０）。
３－５－３．空腸
非感染(Mock-infected)グループを除いた感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の空腸におけるウイルスＲＮＡは、感染３日目（ＰＩＤ３）から感染１４日目（ＰＩＤ１４）まで次第に減少する様相を示し、試験終了日（ＰＩＤ１４）を基準に、感染グループ比複合体投与グループの空腸におけるウイルスＲＮＡは、約６倍減少することを確認し、ブタ流行性下痢に対して改善及び治療効能が非常に高いことを確認した（図１１）。
３－５－４．回腸
非感染(Mock-infected)グループを除いた感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の回腸におけるウイルスＲＮＡは、感染３日目（ＰＩＤ３）から感染１４日目（ＰＩＤ１４）まで次第に減少する様相を示し、試験終了日（ＰＩＤ１４）を基準に、感染グループ比複合体投与グループの回腸におけるウイルスＲＮＡは、約６倍減少することを確認し、ブタ流行性下痢に対して改善及び治療効能が非常に高いことを確認した（図１２）。
３－６．複合体の小腸／腸管膜における前炎症性因子減少効果
３－６－１．十二指腸
非感染(Mock-infected)グループ、感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の十二指腸における前炎症性因子の減少効果を確認した結果、ＴＮＦ－αは約１４倍、ＩＬ－６は約１９倍、ＩＬ－８は約５倍の減少効果をそれぞれ示すことを確認し、ブタ流行性下痢ウイルスの感染時に複合体による抗炎活性が非常に高いことを確認した（図１３）。
３－６－２．空腸
非感染(Mock-infected)グループ、感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の空腸における前炎症性因子の減少効果を確認した結果、ＴＮＦ－αは約２１倍、ＩＬ－６は約１３倍、ＩＬ－８は約２１倍の減少効果をそれぞれ示すことを確認し、ブタ流行性下痢ウイルスの感染時に複合体による抗炎活性が非常に高いことを確認した（図１４）。
３－６－３．回腸
非感染(Mock-infected)グループ、感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の回腸における前炎症性因子の減少効果を確認した結果、ＴＮＦ－αは約４５倍、ＩＬ－６は約６０倍、ＩＬ－８は約４５倍の減少効果をそれぞれ示すことを確認し、ブタ流行性下痢ウイルスの感染時に複合体による抗炎活性が非常に高いことを確認した（図１５）。
３－６－４．腸間膜
非感染(Mock-infected)グループ、感染グループ(Virus-infected)及び試験グループ（合飼及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与グループ）の腸間膜における前炎症性因子の減少効果を確認した結果、ＴＮＦ－αは約３６倍、ＩＬ－６は約８２倍、ＩＬ－８は約６０倍の減少効果をそれぞれ示すことを確認し、ブタ流行性下痢ウイルスの感染時に複合体による抗炎活性が非常に高いことを確認した（図１６）。
３－７．肉眼的臨床症状
陰性対照群(control)の仔豚は、実験期間中に下痢を含めて如何なる臨床症状も示さず、正常な腸の形態及び小腸壁を維持した。一方、陽性対照群(virus)はウイルス接種１日目から実験終了時点あるいはへい死時点まで持続的に下痢症状が示された。特徴的な肉眼的臨床症状としては、沈鬱、下痢直前／後の食欲不振、嘔吐があり、重度の水様性下痢による脱水により体重減少を示し、特徴的な剖検所見は、小腸内に液体が満たされており、ガス膨満と漿膜が薄くなって内容物が肉眼で観察された。複合体２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを投与した試験群の合飼３日目の小腸は、感染群と類似に小腸壁が薄くなり、水様性液体及びガスによる膨満を示したが、腸粘膜シワの形態を維持した。複合体の低濃度及び高濃度投与群の合飼１０日目の小腸は、非感染群と類似に正常な腸の形態及び小腸壁を維持し、腸粘膜シワの形態が明確であった（図１７）。
実験期間中、摂取率は陰性対照群(control)を除いた残りの実験群はいずれも接種後、経時により全体的に摂取率が低くなり、特に、陽性対照群(virus)は合飼３日目以降から急激に低くなることを確認した。しかし、複合体投与群はウイルス接種群と比較時に摂取率が約３０％以上高い状態を維持することにより、複合体投与時にウイルス感染による食欲不振及び体力低下の向上に効能を示すことを確認した。
３－８．病理組織学的検査
試験終了日に各個体を安楽死させた後、剖検し、小腸(十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)、回腸(ileum))を採取して切開した後、１０％の中性ホルマリンに固定し、病理組織標本の製作のための通常の過程を経て各組織のヘマトキシリンとエオシン（Hematoxylin & Eosin）の染色スライドを製作し、これを用いて小腸絨毛の萎縮有無に対して病理組織検査を行った。小腸絨毛の萎縮有無は、絨毛：腺窩の比(vili:crypt ratio)を求めて比較した。
その結果、陰性対照群(control)の小腸は、絨毛が正常の指状に長めなさまであり、陰窩は正常の大きさを示した一方、陽性対照群(virus)の仔豚ではウイルスが小腸絨毛の上皮細胞に増殖して絨毛上皮細胞を脱落させることにより、結果的に絨毛の長さが萎縮して融合され、脱落した絨毛に代替するために陰窩の増殖が著しく観察された。また、粘膜固有内に充血及び出血が観察され、単核細胞の浸潤が観察された。複合体２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを投与した試験群では陽性対照群に比べて絨毛の長さが全体的に増加し、絨毛が正常の指状に増加することを確認し、陰窩の大きさも正常の大きさに示されることを確認した（図１８）。
以上で説明した通り、甘草抽出物を用いてクルクミノイド系化合物であるクルクミンの水溶性を増大させたクルクミン－甘草サポニン水溶性化複合体は、ＰＥＤコロナウイルスに対する抑制効果に優れた。クルクミン単独及び甘草抽出物（甘草サポニン）単独に対する生理活性の効果は一部報告されているが、これらはＰＥＤコロナウイルスに対する抑制効果が全くない。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (8)

  1. 下記化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表されるクルクミノイド系化合物、またはこれらの混合物、またはその薬学的に許容可能な塩;及び甘草抽出物またはその分画物を含む混合物である複合体を有効成分として含む、ブタ流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea, PED)ウイルス感染の予防または治療用薬学組成物：
    Figure 0007435987000005
    Figure 0007435987000006
    Figure 0007435987000007
  2. 上記複合体に含まれた上記化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表されるクルクミノイド系化合物、またはこれらの混合物、またはその薬学的に許容可能な塩：甘草抽出物またはその分画物の重量比は１：１～１：４００である、請求項１に記載の薬学組成物。
  3. 上記化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表されるクルクミノイド系化合物、またはこれらの混合物は、ターメリック（Ｔｕｒｍｅｒｉｃ）から分離したものである、請求項１に記載の薬学組成物。
  4. 上記薬学組成物は、経口投与用である、請求項１に記載の薬学組成物。
  5. 下記化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表されるクルクミノイド系化合物、またはこれらの混合物、またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む混合物である複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用食品組成物：
    Figure 0007435987000008
    Figure 0007435987000009
    Figure 0007435987000010
  6. 下記化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表されるクルクミノイド系化合物、またはこれらの混合物、またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む混合物である複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用医薬部外品組成物：
    Figure 0007435987000011
    Figure 0007435987000012
    Figure 0007435987000013
  7. 下記化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表されるクルクミノイド系化合物、またはこれらの混合物、またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む混合物である複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用飼料添加剤：
    Figure 0007435987000014
    Figure 0007435987000015
    Figure 0007435987000016
  8. 下記化学式（２）～（４）から選択されるいずれか一つで表されるクルクミノイド系化合物、またはこれらの混合物、またはその薬学的に許容可能な塩；及び甘草抽出物またはその分画物を含む混合物である複合体を有効成分として含む、ＰＥＤウイルス感染の予防または改善用飲用水添加剤：
    Figure 0007435987000017
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