CN114796193B - 抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体 - Google Patents

抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体，所述的中药单体为大豆苷元、青蒿素、芹菜素和姜黄素中的任意一种。本发明通过分子对接技术将10种中药与BVDVNS5B进行分子对接，根据结合能打分，确定青蒿素、芹菜素、大豆苷元和姜黄素可能作为BVDV复制的候选抑制剂药物；MDBK细胞的体外感染BVDV试验证明，大豆苷元、姜黄素、青蒿素对BVDV复制具有良好的综合抑制作用效果；BALB/C小鼠体内感染BVDV的试验证明，大豆苷元、姜黄素、青蒿素三种药物均可有效的预防和抑制BALB/C小鼠感染BVDV；其中大豆苷元预防保护BALB/C小鼠感染BVDV的效果最佳，青蒿素对BVDV感染的治疗效果最佳。

Description

抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体
技术领域
本发明属于中兽药领域，涉及一种抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是牛病毒性腹泻-黏膜病的病原，是一种具有包膜的、单链的RNA病毒，大约12.5kb。在全球范围内，牛病毒性腹泻-黏膜病是一种广泛分布于世界各国的传染病，大部分的牛群都会受到感染。由于这种疾病的广泛传播和缺乏有效的治疗，它已成为了一种全球存在的传染病，也是牛病中最主要最常见的一种。这种疾病可能造成重大的经济损失，包括生育能力和奶量下降，胎儿生长缓慢，腹泻，呼吸系统症状，流产，畸形，胚胎再吸收，胎儿木乃伊化和死产，免疫功能紊乱，并发感染，畜群性能下降，以及可能造成重大经济损失的犊牛持续性感染(PI)。尽管BVDV是以其主要的宿主而命名的，但是BVDV在非奶牛品种中的传播也日益被接受。目前，已从40余个动物品种中分离到了这种病毒，而血清学的研究结果显示，大部分的野生反刍动物都容易受到BVDV的影响。除野生动物外，还有许多的家畜(如绵羊、山羊、猪、水牛等)也被报告携带了并且在传播这种疾病。有证据显示，大部分的此类动物都会出现暂时性的感染，并且引起常见的生殖功能障碍、呼吸系统疾病以及BVDV的免疫抑制。虽然在全球范围内，该病的传染是最严重的，但是目前还没有一种有效的疫苗和选择的抗病毒药物。对BVDV有潜力的药物研究已经引发了人们对中药材和人工合成化合物等的研究。
BVDV的开放阅读框被分成不同区域，分别对不同的病毒蛋白质进行编码。遗传因子代码约4000氨基酸，可以加工病毒编码的所有蛋白质，基因组按NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH的顺序从N的末端到C的末端依次排列。除ORF的首个Npro蛋白质以外，其它所有的蛋白质都是该基因粒子内的一部分。其中，C、Erns、E1、E2是结构蛋白，Erns、E1和E2是细胞膜蛋白，它们分别存在于细胞外，E1和E2是由疏水型的氨基酸残基构成。Erns蛋白质不能与病毒的包膜结合，它可以通过特定的C末端区与外部环境发生交互作用，或者分泌出细胞外基质。P 7、NS 2-3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b是非结构性蛋白质。
BVDV的RNA序列大约有3900个。从ORF转录的聚合体被转化为12种不同的蛋白质，NS5B是由多蛋白的羧基末端形成的，它包含Gly-Asp-Asp(GDD)，具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的活性。1998年LesterL等研究表明，经纯化后的NS5B在DNA核糖核酸的体外检测中显示出其活力。利用"复制"模板RNA的机理，利用同聚物RNA或BVDV的微小RNA作为模板，生成具有共价结合的双链型分子。因此，BVDV的NS5B具有RNA依赖核糖核酸聚合酶的能力。Jyung H.Choi等在2004年的研究中，发现NS5B的构造中，除了手指、手掌和大拇指的特殊区域之外，NS5B还包含一个特殊的N端区域。NS5B无需引物就能启动RNA的克隆，NS5B和GTP是合成的，GTP模仿残余RNA的产物与初始NTP邻接，此为初始机理的起点，在开始初始启动时，NTP不经引物就将NTP的第2个NTP直接添加到3'-OH中，后续的NTP则反复进行此过程生成RNA产物。在BVDV-NS5B中，Arg283、Arg285、Ile287是一个高保守性的氨基酸，在开始和扩展过程中，它是新RNA碱基对的一个主要结合囊。Elena Curti等人已经发现，用丙氨酸或更保守的赖氨酸取代了精氨酸，或者用丙氨酸、缬氨酸取代了异亮氨酸可以使NS5B的高效结合。RdRp活力下降是由于其与黄病毒RdRps相关的其它试验结果相吻合，结果显示，Arg283和Ile287在核糖核苷酸键和模板碱基的位置上有一定的关系。Arg285在同源核甘氨酸的筛选中有明显的作用。
当前，我国牛病毒性腹泻的发病率呈上升态势，严重地损害了牛的生产性能和繁殖性能，而至今为止尚无可有效预防和控制这种具有传染性疾病的疫苗，因此该病对我国畜牧业的发展产生了十分不利的影响。因此，在临床上寻找有效、灵敏的抗BVDV病毒药物是非常必要的。目前，对BVDV的疗效评价尚属空白。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体，克服目前尚无抗牛病毒性腹泻病毒的药物的问题。
本发明的第二目的是提供上述中药单体的用途。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体，所述的中药单体为大豆苷元、青蒿素、芹菜素和姜黄素中的任意一种。
进一步的，所述的中药单体为大豆苷元。
进一步的，所述的中药单体为青蒿素。
进一步的，所述的中药单体为芹菜素。
进一步的，所述的中药单体为姜黄素。
进一步的，所述的大豆苷元、青蒿素、芹菜素和姜黄素在牛肾细胞中对牛病毒性腹泻病毒的有效抑制率的浓度为3μmol/L、100μmol/L、60μmol/L和40μmol/L。
进一步的，所述的大豆苷元、青蒿素、芹菜素和姜黄素在牛肾细胞中对牛病毒性腹泻病毒的有效预防率的浓度为3μmol/L、100μmol/L、7.5μmol/L和5μmol/L。
进一步的，所述的大豆苷元、青蒿素、芹菜素和姜黄素在牛肾细胞中对牛病毒性腹泻病毒的有效杀灭率的浓度分别为3μmol/L、100μmol/L、15μmol/L和5μmol/L。
进一步的，大豆苷元、青蒿素、芹菜素和姜黄素均可有效的预防和抑制小鼠感染牛病毒性腹泻病毒；其中大豆苷元预防保护小鼠感染牛病毒性腹泻病毒的效果最佳，青蒿素对牛病毒性腹泻病毒感染的治疗效果最佳。
二、上述的大豆苷元、青蒿素、芹菜素和姜黄素在制备抗牛病毒性腹泻病毒的药物中的应用。
采用上述技术方案的积极效果：本发明是以BVDV非结构蛋白NS5B为靶点，中药单体为小分子配体，筛选潜在的BVDV-NS5B抑制剂中药单体成分，筛选出有效的抗病毒中药单体，通过分子对接技术将10种中药与BVDV NS5B进行分子对接，根据结合能打分，确定青蒿素、芹菜素、大豆苷元和姜黄素可能作为BVDV复制的候选抑制剂药物；体外试验证明，大豆苷元、姜黄素、青蒿素对BVDV复制具有良好的综合抑制作用效果；体内试验证明，大豆苷元、姜黄素、青蒿素三种药物均可有效的预防和抑制BALB/C小鼠感染BVDV；其中大豆苷元预防保护BALB/C小鼠感染BVDV的效果最佳，青蒿素对BVDV感染的治疗效果最佳；本发明为以后的临床治疗和新药的开发奠定基础，并对BVDV抑制剂的开发具有重要的意义。
附图说明
图1是4种中药对MDBK细胞的安全浓度测定；
图2是药物抑制BVDV后MDBK的细胞存活率；
图3是药物预防BVDV后MDBK的细胞存活率；
图4是药物杀灭BVDV后MDBK的细胞存活率；
图5是48h与72h药物抑制作用；
图6是48h与72h药物预防作用；
图7是48h与72h药物杀灭作用；
图8是48h和72h的药物抑制预防杀灭蛋白图，其中，1、2、3、4分别代表大豆苷元、青蒿素、姜黄素、芹菜素；
图9是3种药物体内预防作用；
图10是3种药物体内抑制作用；
图11是药物处理BALB/c小鼠脾脏病理变化(400×)；
图12是药物处理BALB/c小鼠小肠病理变化(400×)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
基于分子对接技术初步筛选抗BVDV的中药单体。以BVDV-NS5B为作用靶点，通过PDB数据库检索其蛋白三维晶体结构，并对结构进行适当处理；检索TCMSP数据库中10种中药结构，分别是大豆苷元、青蒿素、槲皮素、姜黄素、杨梅素、桑色素、芹菜素、黄芩苷、二氢槲皮素、山奈酚，应用Autodock进行分子对接及结合能打分。结果表明青蒿素、大豆苷元、芹菜素和姜黄素与BVDV NS5B蛋白的结合能力最强。
表1中药单体与BVDV NS5B结合能统计情况表
在选定的10种中药单体中，青蒿素、大豆苷元、芹菜素、姜黄素与BVDV NS5B蛋白的结合能力更强，有更大的可能通过与BVDV NS5B蛋白的结合对病毒的复制和逆转录过程中起着重要的作用，进行后续的试验。
实施例2
精确称取青蒿素、大豆苷元、芹菜素、姜黄素分别溶于微量(终浓度＜0.1％)的二甲基亚砜(DMSO)中，用DMEM无血清培养液补齐溶剂体积，将药物制成浓度为200μmol/L的贮存溶液，在4℃下贮存，使用时将其与DMEM的无血清混合培养基进行混合，使其达到理想的浓度。
将冷冻的牛肾细胞(MDBK细胞)从实验室液氮罐中取出，在37℃的恒温热水中迅速溶解，大约2min后，立即将MDBK细胞放入15mL的离心管，加入9mL的细胞生长液，1000r/min，离心5min，然后在超净工作台中进行操作，除去悬浮液，添加4mL左右的细胞生长液，用无菌台中的移液器将其移到细胞瓶中，用吸液枪轻轻吹吸，使其均匀地覆盖在细胞瓶子内，然后放在37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
在传代过程中，将培养瓶中的原液丢弃，用PBS冲洗，经过2到3次彻底冲洗，再添加1％的胰酶溶液，用于细胞的消化。在1-2min后，用倒置荧光显微镜观察，发现细胞间隙增大，细胞形状呈圆形。拧开瓶盖，将瓶子里的胰酶扔掉，然后倒入培养液，重复20-30次，直到细胞在瓶壁上均匀地分布。将其置于37℃，5％CO2培养箱中，直至细胞传代。
以1×105/mL的方式将生长状况良好的健康MDBK细胞接种于100μL/孔的96个细胞培养板，当细胞达到80％时，将其丢弃，重复用PBS清洗。
用DMEM无血清培养液将4种药剂进行稀释，稀释成8个不同浓度。并且将每个浓度按4个重复孔、4个对照组和4个非细胞空白对照孔4个进行设置。将100μL的药液或100μL的细胞保持液分别放入37℃，5％CO2培养箱中，72h后，每孔添加10uL的CCK-8，在细胞培养箱中再进行2h，用酶标仪测量吸收度(OD)值，按OD450值，计算各组细胞存活率及大豆苷元、青蒿素、芹菜素、姜黄素4种中药对MDBK细胞的抑制率。并将CPE和CCK-8比色分析方法结合起来，确定了该方法对细胞的最大安全剂量。
根据公式:细胞存活率＝(OD450样品－OD450空白)/(OD450对照－OD450空白)×100％，在一定条件下测定计算4种中药单体在不同浓度下的细胞存活率。
对传代后的MDBK细胞进行计数，将传代细胞按每2.5×105个/mL的密度将其置于96个小孔的细胞培养板中，加入100μL/孔。将细胞板放置于37℃，5％CO2的培养箱中，培养到80％左右。将BVDV(CP型NADL株)的原溶液按10倍稀释至10-10，加入长至单层MDBK细胞的96孔板中，每孔添加100μL，设置细胞对照组在最后两列，各个组做8个重复，37℃吸附病毒2h，每15min震动一次。每日定时监测细胞，记录细胞病变，培养后数天，然后用Reed-Muench方法，计算出BVDV的组织半数感染量(TCID50)。
公式为:距离比例＝(＞50％的细胞生长抑制率－50％)/(＞50％的细胞生长抑制率－＜50％的细胞生长抑制率)
lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+＞50％细胞生长抑制率的对数。
将研究了4种不同中药的不同剂量对MDBK细胞活性的影响，发现4种药物对MDBK的活性影响差异相近时，选用对MDBK细胞生长的影响最低的药剂，以达到最好的治疗效果，见图1。结果发现，4种中药作用细胞72h时，大豆苷元的药物浓度为200μmol/L时其存活率并没有明显得下降趋势，青蒿素的药物浓度为40μmol/L细胞存活率上升到最高随着浓度进一步得升高存活率逐渐下降，但当浓度上升到200μmol/L时存活率与对照组相近，随着姜黄素的药物浓度得升高与对照组相比细胞的存活率呈现一个递增趋势，芹菜素的药物浓度为10μmol/L细胞存活率达到最高随后开始下降当浓度为150μmol/L时细胞存活率小于对照组。
如图1所示，不同的药剂和浓度对MDBK均有影响，只有某一特定浓度时才会对细胞影响最小，对细胞存活率没有较大影响，此药物浓度则MDBK细胞的最大安全浓度，选定大豆苷元3μmol/L；青蒿素100μmol/L；芹菜素60μmol/L；姜黄素40μmol/L为最大安全浓度。
实施例3
将生长良好的MDBK细胞按1×105mL/孔的比例分别在96个孔中进行接种，在37℃、5％CO2的环境下将其培养为单层，然后将孔内生长液移除，用PBS冲洗3遍，然后将病毒量为0.1MOI的BVDV的病毒溶液注入细胞板的小孔中，然后在37℃、5％CO2环境下进行培养。在此过程中，每15min进行一次足够的振动，以保证病毒液体在细胞中的吸收。2h后，将病毒液体丢弃，添加200μL 4种药剂的4种不同浓度溶液，放在培养箱中，每天进行细胞损伤检测。五天后，按每个小孔分别添加CCK-8溶液20μL，2h后作用时间，用酶标仪测定OD450，计算并测定各组细胞的存活率。。
在先加病毒再加药的给药方式下，0.1MOI病毒感染细胞后将药物作用于细胞，计算药物对感染BVDV的MDBK细胞的保护率，各加药组的细胞存活率较病毒对照组明显差距。先加病毒后加中药，反映的是药物对病毒的抑制作用。由图2可看出，4种药物对BVDV感染后的MDBK细胞有保护作用，在安全浓度范围内，有效的抑制了BVDV在细胞上的复制。结果中的C1、C2、C3、C4、C5表示从中药的最大安全浓度开始依次做2倍稀释，稀释成5个不同浓度，细胞活性检测结果显示，所选的各个药物及浓度对BVDV均有抑制作用，但同种药物的不同浓度组对BVDV抑制效果不同，相比同种药物的其他浓度组，大豆苷元、青蒿素、芹菜素、姜黄素在最大药物安全浓度范围内有较高的有效抑制率的浓度分别为3μmol/L、100μmol/L、60μmol/L、40μmol/L，且对BVDV抑制效果最好的药物大豆苷元，质量浓度均为最大安全质量浓度，随着质量浓度越来越低，其抑制作用逐渐变弱。结果见图2。
实施例4
将生长良好的MDBK细胞按1×105mL/孔的比例分别在96个孔中进行接种，在37℃、5％CO2的环境下将其培养为单层，然后将孔内生长液移除，用PBS冲洗3遍，添加200μL 4种药剂的4种不同浓度溶液，放入培养箱作用4h后弃去，然后将病毒量为0.1MOI的BVDV的病毒溶液注入细胞板的小孔中，然后在37℃，5％CO2环境下进行培养。在此过程中，每15min进行一次足够的振动，以保证病毒液体在细胞中的吸收。2h后，将病毒液体丢弃，添加200μL细胞维持液，放在培养箱中，每天进行细胞损伤检测。五天后，按每个小孔分别添加CCK-8溶液20μL，2h后作用时间，用酶标仪测定OD450，计算并测定各组的生存率。
在先加药再加病毒的给药方式下，0.1MOI病毒感染细胞后将药物作用于细胞，计算药物对感染BVDV的MDBK细胞的保护率，各加药组的细胞存活率较病毒对照组明显差距。先加中药后加病毒，反映的是病毒对中药的预防作用。由图3可看出，4种药物对BVDV感染后的MDBK细胞有预防作用，在安全浓度范围内，有效的抑制了BVDV在细胞上的复制。结果中的C1、C2、C3、C4、C5表示从中药的最大安全浓度开始依次做2倍稀释，稀释成5个不同浓度，细胞活性检测结果显示，所选的各个药物及浓度对BVDV均有预防作用，但同种药物的不同浓度组对BVDV预防效果不同，相比同种药物的其他浓度组，大豆苷元、青蒿素、芹菜素、姜黄素在最大药物安全浓范围内有较高的有效预防率的浓度分别为3μmol/L、100μmol/L、7.5μmol/L、5μmol/L，且对BVDV预防效果最好的药物大豆苷元。结果见图3。
实施例5
将生长良好的MDBK细胞按1×105mL/孔的比例分别在96个孔中进行接种，在37℃、5％CO2的环境下将其培养为单层，然后将孔内生长液移除，用PBS冲洗3遍，每孔加入不同浓度的药物溶液与等体积病毒液的混合液200μL作用。置于37℃，5％CO2的培养箱中4h后，将液体丢弃，添加200μL细胞维持液，放在培养箱中，每天进行细胞损伤检测。五天后，按每个小孔分别添加CCK-8溶液20μL，2h后作用时间，用酶标仪测定OD450，计算并测定各组的生存率。
在药物与病毒同时作用的给药方式下，0.1MOI病毒感染细胞后将药物作用于细胞，计算药物对感染BVDV的MDBK细胞的保护率，各加药组的细胞存活率较病毒对照组明显差距。将中药与毒以1:1比例同时作用在细胞上，观察中药在细胞上对病毒的直接杀伤作用，由图4可看出，4种药物对BVDV感染后的MDBK细胞有保护作用，在安全浓度范围内，有效的抑制了BVDV在细胞上的复制。结果中的C1、C2、C3、C4、C5表示从中药的最大安全浓度开始依次做2倍稀释，稀释成5个不同浓度，细胞活性检测结果显示，所选的各个药物及浓度对BVDV均有杀灭作用，但同种药物的不同浓度组对BVDV杀灭效果不同，相比同种药物的其他浓度组，大豆苷元、青蒿素、芹菜素、姜黄素在最大药物安全浓度范围内有较高有效杀灭率的浓度分别为3μmol/L、100μmol/L、15μmol/L、5μmol/L，且对BVDV杀灭效果最好的药物是青蒿素和大豆苷元。结果见图4。
实施例6
在MDBK细胞长至单层的24孔培养板中加入中药液，加入0.1MOI值的BVDV病毒稀释液，置于37℃，每15min感作一次，2h后弃去病毒液，再配制在最大药物安全浓度范围内有效抑制率最佳的药物浓度(大豆苷元3μmol/L；青蒿素100μmol/L；芹菜素60μmol/L；姜黄素40μmol/L)，每个孔500μL，放置37℃，5％CO2培养箱，4h后，弃去药液，加无血清的DMEM保持液，每个孔500μL。将其置于37℃、5％CO2培养箱培养，每日定时进行CPE检测，48h，72h两次采集标本，除去上清，然后在每个孔中添加1mL Trizol进行溶解，重复多次吹吸裂解后，然后将各时间段裂解的溶液收集到EP管内，并作好记号。然后将RNA分离，用荧光PCR技术进行分析。
根据BVDV NADL株的5'UTR特异性保守区基因序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列表4。然后进行标准曲线的建立，将BVDV NADL株标准株的RNA进行10倍的梯度稀释，稀释成七个梯度。并且设阴性对照组。采用实时RT-PCR进行扩增。采用Ct值为纵坐标(Y)，标准RNA稀释度的对数为横坐标(X)进行标准曲线的建立。
反应条件：95℃30s，95℃30s，60℃30s，72℃30s共35个循环，根据标准曲线计算出其病毒载量。
表2引物序列
表3反应体系
先加病毒后加中药，然后检测4种药物用于MDBK细胞后BVDV在MDBK细胞中的复制水平。根据各组的Ct值和标准曲线，计算各组BVDV RNA拷贝数。(1)48h、72h时大豆苷元组病毒RNA拷贝数分别为2.48×104copies/mL和3.9×104copies/mL，病毒组拷贝数13.05×105copies/mL，阴性对照组中拷贝数为0.4×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数十分显著地高于大豆苷元组，两者差异极其显著。大豆苷元显著抑制了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(2)48h、72h时青蒿素组的病毒RNA拷贝数分别为1.6×104copies/mL和1.8×104copies/mL，病毒组拷贝数13.05×105copies/mL，阴性对照组中拷贝数为0.4×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数较显著地高于青蒿素组，两者差异极其显著。青蒿素组显著地抑制了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(3)48h、72h时姜黄素组中的病毒RNA拷贝数分别为4.4×104copies/mL和1.09×104copies/mL，病毒组拷贝数13.05×105copies/mL，阴性对照组中拷贝数为0.4×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数显著地高于姜黄素组，差异极其显著。姜黄素组显著抑制了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(4)48h、72h时芹菜素组中的病毒RNA拷贝数分别为2.27×104copies/mL和2.38×104copies/mL，病毒组拷贝数13.05×105copies/mL，阴性对照组中拷贝数为0.4×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数较显著高于芹菜素组，差异极其显著。芹菜素组显著抑制了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。结果见图5。
实施例7
在MDBK细胞长至单层的24孔培养板中加入中药液，配制最大药物安全浓度范围内有效抑制率最佳的药物浓度(大豆苷元3μmol/L；青蒿素100μmol/L；芹菜素60μmol/L；姜黄素40μmol/L)，每孔各500μL，置于37℃，4h后弃去药液，加入0.1MOI的BVDV病毒稀释液，置于37℃，每15min感作一次，4h后，弃去孔内液体，加无血清的DMEM保持液，每个孔500μL。将其置于37℃、5％CO2培养箱培养，每日定时进行CPE检测，48h、72h两次采集标本，除去上清，然后在每个孔中添加1mL Trizol进行溶解，重复多次吹吸裂解后，然后将各时间段裂解的溶液收集到EP管内，并作好记号。然后将RNA分离，用荧光PCR技术进行分析。方法同实施例6。
先加药后加病毒，然后检测4种药物用于MDBK细胞后BVDV在MDBK细胞中的复制水平。根据各组的Ct值和标准曲线，计算各组BVDV RNA拷贝数。(1)48h、72h大豆苷元组病毒RNA拷贝数分别为2.19×104copies/mL、0.95×104copies/mL。病毒组拷贝数12.15×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.6×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数显著地高于大豆苷元组，两者差异极其显著。大豆苷元显著预防了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(2)48h、72h时青蒿素组病毒RNA拷贝数分别为2.08×104copies/mL和1.89×104copies/mL。病毒组拷贝数12.15×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.6×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数显著地高于青蒿素组，两者差异极其显著。青蒿素组显著地预防了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(3)48h、72h姜黄素组的病毒RNA拷贝数分别为为1.26×104copies/mL和2.10×104copies/mL。病毒组拷贝数12.15×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.6×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数地显著高于姜黄素组，差异极其显著。姜黄素素显著预防了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(4)48h、72h时芹菜素组的病毒RNA拷贝数分别为为1.94×104copies/mL和7.37×104copies/mL。病毒组拷贝数13.05×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.4×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数显著地高于芹菜素组，差异极其显著。48h时芹菜素预防了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。结果见图6。
实施例8
在MDBK细胞长至单层的24孔培养板中加入中药液，配制以最大药物安全浓度范围内有效抑制率最佳的药物浓度(大豆苷元3μmol/L；青蒿素100μmol/L；芹菜素60μmol/L；姜黄素40μmol/L)与0.1MOI的BVDV病毒稀释液的混合培养液，每个孔500μL，放置37℃，5％CO2培养箱，4h后，弃去孔内液体，加无血清的DMEM保持液，每个孔500μL。将其置于37℃、5％CO2培养箱培养，每日定时进行CPE检测，48h、72h两次采集标本，除去上清，然后在每个孔中添加1mL Trizol进行溶解，重复多次吹吸裂解后，然后将各时间段裂解的溶液收集到EP管内，并作好记号。然后将RNA分离，用荧光PCR技术进行分析。方法同实施例6。
药物与病毒同时加入，然后检测4种药物用于MDBK细胞后BVDV在MDBK细胞中的复制水平。根据各组的Ct值和标准曲线，计算各组BVDV RNA拷贝数。(1)48h、72h时大豆苷元组病毒RNA拷贝数分别为4.63×104copies/mL和0.78×104copies/mL。病毒组拷贝数12.5×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.5×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数显著地高于大豆苷元组，两者差异极其显著。大豆苷元显著杀灭了细胞中病毒，进而有效的起到了抗病毒作用。(2)48h、72h时青蒿素组病毒RNA拷贝数分别为1.86×104copies/mL和5.09×104copies/mL。病毒组拷贝数12.5×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.5×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数显著地高于青蒿素组，两者差异极其显著。青蒿素组显著杀灭了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(3)48h、72h时姜黄素组的病毒RNA拷贝数分别为为2.35×104copies/mL和6.82×104copies/mL。病毒组拷贝数12.5×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.5×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数显著地高于姜黄素组，差异极其显著。姜黄素组显著杀灭了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。(4)48h、72h时芹菜素组中的病毒RNA拷贝数分别为2.76×104copies/mL和4.92×104copies/mL。病毒组拷贝数13.05×105copies/mL。阴性对照组中拷贝数为0.4×104copies/mL。BVDV组中的病毒RNA拷贝数较显著高于芹菜素组，差异极其显著。48h时芹菜素组影响了细胞中病毒的复制，进而有效的起到了抗病毒作用。结果见图7。
实施例9
进行免疫印迹试验，每个浓度分别设定3个重复的小孔，同时分别设定细胞对照以及病毒对照组。按照方法3.2.5，采用中药对细胞的3种不同的方法进行试验，在48h和72h采集标本，先将冰块预先预备，再将离心机冷却到4℃再以200μL RIPA(含有PMSF)将其从六孔板上裂解出来，再进行多次摩擦，最后将其吸收到EP管内，置于冰块上进行溶解25-35min，离心机12000r/min，共10min，取出得到的上清液，然后将其中的沉淀除去。在获得的上清液中添加适当的5×SDS loading Buffer，沸水煮至变性，大约10min左右，将样品置于4℃的冰箱中可以存放一段，但不宜放置太长。
根据蛋白胶配制说明书，根据所需要蛋白的大小进行配制适当的分离胶及浓缩胶，每个孔中加入蛋白样品入10μL，开始先使用80V电压，跑出蛋白Maker条带后(时间约为35min)，观察胶板是否所有的Maker条带都出现，而后换用120V的电压(时间约为45min)，最终将所有Maker条带拉开，直至样品跑到胶板底部，时长一般约为45min，完成跑胶过程，取出胶，留下自己所需条带，切去多余的浓缩胶分离胶。
首先进行转膜，准备可以完全覆盖胶的PVDF膜，放人甲醇溶液激活10～20s，超纯水中浸泡1-2min除去残留甲醇，最后放入适量转膜液中适应3～5min。将滤纸浸泡在转膜液中直至完全浸湿，正向摆放于转膜器上，然后依次将PVDF膜、蛋白胶、滤纸按顺序依次盖在上面，排除中间的气泡，最后根据蛋白胶的大小设定所需转膜时间，电压调制80V。
转膜完成后，用TBST轻柔冲洗下，用TBST配制5％脱脂乳在室温条件下进行封闭1～2h。封闭完成后用TBST轻柔冲洗，将一抗用TBST稀释至所需浓度后完全将覆盖在PEDV膜表面，放置4℃冰箱过夜。次日可将一抗回收二次重复利用，用TBST完全浸泡PEDV膜放置水平摇床清洗4～6次，每次8～10min。清洗完成后，将二抗用TBST稀释至所需浓度后完全将覆盖在PEDV膜表面，室温下水平摇床慢摇1～2h，弃掉所用二抗，再次将PEDV膜用TBST在摇床上清洗4～6次，每次8～10min，最后可以进行显色。配置显色液根据相应的试剂盒说明书，在仪器设备出进行显色，照膜留蛋白图，保存数据进行处理。最后可使用ImageJ软件进行相应灰度值分析，对数据进行分类处理。
4种药物在三种不同作用方式下均用BVDV感染MDBK细胞，分别收集48h、72h时的样品，检测此时的E0蛋白表达量。以此推断病毒的复制情况，结果显示，感染BVDV后，4种药物在先加病毒后加中药，先加中药后加病毒还是药物与病毒同时作用的条件下，检测大豆苷元；青蒿素；姜黄素；芹菜素4种药物作用后E0蛋白表达量与BVDV组进行比对。结果表明：E0蛋白的表达量在48h、72h时与对照组相比明显减少如图8。
大豆苷元、青蒿素、姜黄素、芹菜素均具有明显的抗BVDV作用，并证明了4种药物在体外对BVDV有显著抑制作用。无论是抑制，预防还是杀灭作用4种中药均对BVDV都有抑制作用，且在不同时间段，对BVDV的作用效果不断增强。
实施例10
将BALB/c小鼠放入动物房饲养并适应几日之后。病毒对照组、药物抑制组均腹腔注射0.5mL的0.1MOI的BVDV病毒液。健康对照组，药物对照组的各小鼠均腹腔注射0.4mLDMEM培养液。药物预防组则先进行三天药物灌胃，停药后第一天腹腔注射0.5mL的0.1MOI的病毒液。感染完成后让每组小鼠进行自由采食和饮水，每天按时观察小鼠日常活动情况，每日精神状态，并且及时记录。病毒对照组第一天腹腔注射BVDV完成后，连续七天观察精神状态，保证好采食及供水。药物抑制组小鼠第一天腹腔注射BVDV后，连续七日进行药物灌胃，每日观察精神状态，保证好采食及供水。药物预防组小鼠在先进行了三天的药物灌胃预处理后，腹腔注射BVDV，再连续七天进行药物灌胃，每日观察精神状态，保证好采食及供水。健康对照组，药物对照组的各小鼠再第一天腹腔注射0.4mL DMEM培养液后，连续七天观察精神状态，保证好采食及供水。
在采集了小鼠的眼内血以及脾脏后，采用手提式方法从血中抽取RNA，并将其逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR技术测定BVDV 5′UTR的含量。引物和反应系统同4.2.1.4，进行Ct的测定并与标准曲线比对后使用GraphPad Prism软件作图。
病毒对照组小鼠在腹腔注射BVDV后表现出现精神沉郁、聚集成堆、被毛粗糙等BVDV感染后的典型症状。对小鼠进行解剖，发现其脾脏及肝有显著的出血处，其周围有显著的肿块，周围有紫癜，肾组织有大量的淤血，内脏水肿，软化，大部分的肠腔都是黄色的。试验过程中，健康对照组、药物对照组小鼠均无明显的临床变化及病理变化。荧光定量结果如图9所示，在第4天时病毒对照组中的BVDV病毒含量显著高于三种药物组；其中大豆苷元组通过对BVDV进行预处理后，经肝脏、脾脏、肾脏、小肠等部位的出血点明显减少。各组织中BVDV的病毒含量较病毒对照组有显著降低，其他两种药物组，小鼠的心理状况良好，但毛发杂乱无章，病理切片显示肝脏、脾脏、肾脏、小肠等器官有少许出血，同病毒对照组相比BVDV病毒含量均出现显著性降低。结果如图9。
实施例11
病毒对照组小鼠在腹腔注射BVDV后表现出现精神沉郁、聚集成堆、被毛粗糙等BVDV感染后的典型症状。对小鼠进行解剖，发现其脾脏及肝有显著的出血处，其周围有显著的肿块，周围有紫癜，肾组织有大量的淤血，内脏水肿，软化，大部分的肠腔都是黄色的。试验过程中，健康对照组，药物对照组小鼠均无明显的临床变化及病理变化。荧光定量结果如图10所示，在第4天时病毒对照组中的BVDV病毒含量较三种药物组有显著升高；其中青蒿素通过对BVDV进行预处理后，经肝脏、脾脏、肾脏、小肠等部位的出血点明显减少各组织中BVDV的病毒含量较病毒对照组有显著降低，其他两药物组，小鼠的心理状况良好，但毛发杂乱无章，病理切片显示肝脏、脾脏、肾脏、小肠等器官有少许出血，同病毒对照组相比BVDV病毒含量均出现显著性降低。结果如图10。
实施例12
各组的灌胃及观察完成后第四天均采用拔颈术处理每组小鼠，采集鼠的内脏及血标本。本试验利用EDTA的抗凝血管进行了鼠的眼球采血，取鼠的血液用来检测BVDV的载量，并在无菌操作台上对其进行了解剖，并对其心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肠脏进行了分析。肠分为结肠、回肠、空肠和十二指肠，并将其分为四部分。取肝、脾、肾以及小肠等各个组织按照相关文献制成病理组织切片，先采用HE染色法染色，而后用使用中性树胶进行封片，在显微镜下观察组织病理变化情况；各组织病理变化程度分为不同程度有组织无病变且十分完整，组织无出血点；组织轻度病变，部分肿大且被膜紧张，伴随少量出血点；组织中度病变，有大量出血斑形成并伴随白色坏死灶形成；组织有严重病变，出血坏死情况严重，组织质地软烂等不同程度。
根据3种中药不同的用药方式和药物吸收代谢机理，灌胃后药物经肠吸收后再进行代谢。同时，因为BVDV感染特性严重影响机体免疫功能，故选择免疫器官脾组织切片，根据QPCR结果显示，血液中BVDV的检出率同脾脏检出率相差无几，故推测脾脏可能是BVDV复制的主要器官。取脾脏和小肠两个组织进行HE染色，观察结果表明，如图11，BVDV感染可引起小鼠的脾脏水肿充血，红细胞明显增多，红髓与白髓之间界限模糊，小梁显著增多；药物处理后的BALB/c小鼠可明显降低脾内的血流，增加中性粒细胞，增加巨细胞，脾小梁减少，大豆苷元预防组和青蒿素抑制组可使组织充血减轻，白细胞数量稳定，脾脏水肿充血明显减轻且红髓与白髓之间的界限清晰，巨细胞出现的数量减少。如图12，BVDV感染引起小肠粘膜充血、水肿、粘膜下层炎性细胞增多、肠绒毛代偿性增宽、缩短、隐窝减少、形态改变，药物处理后的小鼠可减少粘膜下层炎性细胞浸润减少，隐窝增多，肠绒毛增多，隐窝增大，大豆苷元预防组和青蒿素抑制组处理可使肠绒毛上皮细胞由多层转变成单层。结果表明三种药物处理BALB/c小鼠可有效抑制BVDV感染以及预防保护BALB/c小鼠。其中效果较明显的两组分别为大豆苷元预防组和青蒿素抑制组。结果见图11和12。
本发明通过分子对接技术将10种中药与BVDV NS5B进行分子对接，根据结合能打分，确定青蒿素、芹菜素、大豆苷元和姜黄素可能作为BVDV复制的候选抑制剂药物。体外试验证明，大豆苷元、姜黄素、青蒿素对BVDV复制具有良好的综合抑制作用效果。体内试验证明，大豆苷元、姜黄素、青蒿素三种药物均可有效的预防和抑制BALB/C小鼠感染BVDV。其中大豆苷元预防保护BALB/C小鼠感染BVDV的效果最佳，青蒿素对BVDV感染的治疗效果最佳。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 抗牛病毒性腹泻病毒的中药单体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtacaggg tagtcgtcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctgcagca ccctatcagg 20

Claims (5)

1.一种中药单体在制备抗牛病毒性腹泻病毒的药物中的应用，其特征在于：所述的中药单体为姜黄素。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的姜黄素在牛肾细胞中对牛病毒性腹泻病毒的有效抑制率的浓度为40μmol/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的姜黄素在牛肾细胞中对牛病毒性腹泻病毒的有效预防率的浓度为5μmol/L。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的姜黄素在牛肾细胞中对牛病毒性腹泻病毒的有效杀灭率的浓度为5μmol/L。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的姜黄素有效的预防和抑制小鼠感染牛病毒性腹泻病毒。
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