CN112843043B - 盐霉素在制备抗冠状病毒药物中的应用 - Google Patents

盐霉素在制备抗冠状病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了盐霉素在制备抗冠状病毒药物中的应用，属于生物医药技术领域。具体地，本发明公开了盐霉素在制备抗冠状病毒TGEV药物中的应用，经试验验证，发现0.2‑5μM的盐霉素对猪肾细胞PK‑15没有明显的毒性作用，5μM的盐霉素能够显著抑制感染PK‑15中TGEV的拷贝数，表明盐霉素可以成为制备抗TGEV药物的新选择。本发明为老药新用，已经上市的盐霉素药动力学资料较为详尽，安全性较为可靠，新用途的开发很快就能进行二期临床评估，缩短研发周期，节约开发成本，可以最大化利用资源。

Description

盐霉素在制备抗冠状病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，涉及盐霉素在制备抗冠状病毒药物中的应用，特别是涉及盐霉素在制备抗冠状病毒TGEV药物中的应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种急性、高度接触性消化道传染病，该病于1945年首次在美国被报道，随后传播到世界各地。在我国随着养猪业的迅速发展，该病也在各个省市都出现过大面积爆发，给我国以及全球养猪业带来了极为严重的经济损失。该病能在各日龄段猪群间暴发，在断奶前仔猪中感染尤为严重，部分地区发病率高达到87.97％，病死率达到89.90％，感染后病毒会迅速破坏宿主胃肠道菌群和黏膜组织结构，病猪表现出呕吐、腹泻、脱水等临床症状。因其严重危害养猪业的发展，2019年TGE被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)列为烈性传染病。
接种疫苗是该病较为有效的预防措施，但由于各地区分离毒株存在差异，以及现有疫苗保护效果不是十分显著，所以该病仍未能从根本上得到控制。药物治疗是控制该病有希望的途径之一，但是目前该病无特效治疗药物，主要是通过增强自身免疫和对症治疗的药物对猪群进行防治。想要开发新型广谱有效的药物，药物靶点至关重要。据报道APN是冠状病毒的重要受体，其在TGEV、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、犬冠状病毒(CCV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) 等多种冠状病毒的入侵感染中起到重要作用，其被视为冠状病毒药物的关键靶点之一，因此筛选针对pAPN受体的抑制剂是开发TGEV药物具有前景的途径。
盐霉素是一种由白色链霉菌(Streptomyces albus)产生的聚醚类一元羧酸抗生素，能与细胞中阳离子如K+、Na+和Rb+紧密结合，破坏膜内外正常的离子平衡，对肠道内有害的革兰氏阳性菌、霉菌和球虫都有较强的抑制作用。该物质是世界上广泛使用的禽用抗球虫药，具有高效、广谱、低耐药和低残留的特点。近年来盐霉素也被用于猪的促生长剂，但是还未有研究报道其可以抑制TGEV。
发明内容
本发明的目的是提供盐霉素在制备抗冠状病毒药物中的应用，盐霉素成为抗冠状病毒药物的新选择。发明人基于pAPN受体筛选出对冠状病毒，主要是对TGEV有效抑制的化合物，旨在为临床生产中提供一种潜在的治疗TGE药物，以克服现有技术中抗冠状病毒药物不足的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供盐霉素在制备抗冠状病毒药物中的应用。
优选的是，所述盐霉素还包括药学上可接受的衍生物。
进一步地，药学上可接受的衍生物包括，但不限于，药学上可接受的前药、盐、酯类盐，或者能直接或间接根据动物的需要给药的其他任何衍生物。
本发明还提供盐霉素衍生物或盐霉素结构类似物在制备抗冠状病毒药物中的应用。
进一步地，盐霉素、盐霉素衍生物、盐霉素结构类似物的离体异构体、几何异构体、水合物、溶剂化物或药学上可接受的盐或前药也应该在本发明的保护范围之内。溶剂化物是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括但不限于，水、DMSO、乙酸乙酯。
优选的是，所述冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒TGEV。
本发明还提供一种抗冠状病毒的药物，包含盐霉素。所述盐霉素化学式如下式I所示：
Figure SMS_1
优选的是，所述药物还包括盐霉素衍生物、盐霉素结构类似物中的任意一种。
优选的是，所述冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒TGEV。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用计算机辅助药物设计手段，发现盐霉素可以很好地结合pAPN。其中，SYBYL-X 2.1.1评分8.78分，显示了很好的结合作用；PyMOL 2.4分析显示盐霉素可以通过氢键作用力结合到pAPN的Glu384、Glu413和Arg473位点。
本发明经过实验发现0.2-5μM的盐霉素对猪肾细胞(PK-15)没有明显的毒性作用，5μM的盐霉素能够显著抑制感染PK-15中TGEV的拷贝数，表明盐霉素可以成为制备抗TGEV药物的新选择。
本发明为老药新用，已经上市的盐霉素药动力学资料较为详尽，安全性较为可靠，新用途的开发很快就能进行二期临床评估，缩短研发周期，节约开发成本，可以最大化利用资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SYBYL-X 2.1.1模拟筛选后对盐霉素和pAPN结合的评分情况；
图2为PyMOL 2.4模拟盐霉素和pAPN的结合位点和空间分布情况；
图3为不同浓度盐霉素处理PK-15细胞24-72h后对细胞活力的影响；
图4为转录水平上验证不同浓度盐霉素对TGEV在PK-15细胞中拷贝数的影响；
图5为蛋白水平上验证不同浓度盐霉素对TGEV在PK-15细胞中拷贝数的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所用试剂或材料如无特殊说明，均能通过商业渠道获取。
实施例1计算机辅助药物设计筛选基于pAPN的小分子抑制剂
1实验方法：
1.1SYBYL-X 2.1.1筛选化合物
根据Basics Manual SYBYL-X使用手册，对PDB网站下载的pAPN晶体结构(4fke)和小分子化合物库进行对接前准备，之后分别进行Screen和GeomX模式下的对接筛选，筛选出排名靠前的小分子化合物。
1.2PyMOL 2.4模拟结合
将上述打分排名靠前的化合物盐霉素进行结合模拟，寻找pAPN与盐霉素结合的氨基酸位点，结合氢键以虚线标出，盐霉素以棍状(stick)形式呈现，受体结合口袋附近5A区域以线条(line)形式呈现，其他部分以卡通(cartoon)形式呈现。
如图1所示，结果显示盐霉素与pAPN的结合打分为8.78，说明该化合物与pAPN 具有很好的潜在结合能力。
如图2所示，结果表明盐霉素可以通过氢键作用力结合到pAPN的Glu384、Glu413和Arg473位点。
实施例2盐霉素对PK-15细胞的毒性作用
1实验方法
1.1野生型PK-15细胞的培养
将对数生长期的PK-15细胞从直径10cm的培养皿消化下来后，根据细胞密度用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基稀释至106个/mL的细胞悬浮液，将细胞混合均匀后用排枪接种到96孔板中，每个孔中加入100μL细胞悬浮液，在周围孔加入相同体积的PBS，轻轻拍打培养板的周围，使细胞分布均匀，待细胞沉淀到培养板底部后放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
待细胞长至70％-80％，吸去培养基，用无菌PBS将细胞洗一遍，之后加入无血清DMEM培养基，12h后待细胞周期同步化后吸去培养基。
1.2细胞给药
盐霉素用DMSO溶解，之后用DMEM培养基进一步稀释成浓度为0.2μM、1μM、5μM、25μM，96孔板中每孔加入100μL，每个剂量组设6个平行孔，同时设空白组 (不加细胞只加培养基)和对照组(加入与药物同体积的DMSO)，在周围孔加入相同体积的PBS，放入培养箱中培养；加药后24h、48h、72h取出进行细胞毒性检测。
1.3CCK-8检测盐霉素的细胞毒性
1、将CCK-8试剂与培养基以1：10比例配好后加到各个孔中。放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2h。
2、酶标仪读取450nm波长的吸光值(OD450)。计算得到实验组(即加药组)相对于对照组的细胞存活比率。
细胞存活率＝(实验组OD450—空白组OD450)/(对照组OD450—空白组OD450)。
结果如图3所示，说明盐霉素0.2-5μM时对于PK-15细胞的影响较小，没有明显的细胞毒性，25μM的盐霉素对PK-15具有较为明显的细胞毒性。
实施例3盐霉素对于TGEV在PK-15中的抑制效果
1病毒接种和盐霉素处理
将PK-15细胞按106个/孔加到6孔细胞培养板中，待细胞长成70-80％，接种TGEV病毒液，每天观察致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。
病毒接种后1h，每孔加入盐霉素至终浓度为5μM和15μM，于24h、36h后观察，并分别收集细胞上清液和细胞。
2盐霉素抑制TEGV拷贝数的效果
提取细胞上清液RNA，反转录成cDNA(RR047A，Takara)，进行荧光定量(RR820A，Takara)，反应条件如下：起始模板预变性95℃，1min；变性95℃，20s；退火58℃， 30s；延伸68℃，30s；35个循环，所有检测均进行3次重复；
取结果平均循环阈值(cycling threshold，Ct)，带入病毒标曲：y＝-3.8003x+38.945，其中y为Ct，拷贝数＝10x进行计算；
提取收集细胞的全蛋白，用BCA法进行蛋白定量，后利用Western Blot对病毒含量进行蛋白水平的验证。
结果如图4、5所示，说明5μM、15μM的盐霉素对PK-15细胞中的TGEV都有显著的抑制作用，且抑制作用随盐霉素浓度升高而增强。
综上，本发明研究发现盐霉素可以显著抑制PK-15细胞中的TGEV，且该药在细胞中低剂量(5μM)即可达到理想抑制效果，无明显毒副作用，具有治疗TGE的潜在作用价值，为TGE在临床生产中的治疗提供了一种新的方法。
研究显示，盐霉素对猪传染性胃肠炎病毒TGEV具有显著的抑制作用，其机制可能是通过竞争性结合猪氨肽酶N(pAPN)，阻断该病毒结合和侵入宿主细胞，从而达到治疗或预防的效果。本发明为TGEV在内的冠状病毒的防控提供了一种新型药物选择，而且该方案为老药新用，所述盐霉素是现有被广泛用于畜牧临床治疗中的动物专用抗生素，该药对大多数革兰氏阳性菌、真菌和各种球虫有较强的抑制和杀灭作用，不易产生耐药性和交叉抗药性，排泄迅速，具有高效、广谱、低耐药和低残留的特点，可以快速用于临床对于TGEV的防控，能大大节约开发时间和成本，最大化地利用资源。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.盐霉素在制备抗猪传染性胃肠炎病毒药物中的应用，其特征在于，所述盐霉素浓度为0.2-5μM。
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