CN116019805B - 汉黄芩素在抗猪流行性腹泻病毒中的应用 - Google Patents
汉黄芩素在抗猪流行性腹泻病毒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明首次公开了汉黄芩素具有抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）的作用，汉黄芩素通过靶向猪流行性腹泻病毒‑3c样蛋白酶(PEDV‑3CLpro)，能显著抑制猪流行性腹泻病毒的内化、胞内复制和新的成熟病毒粒子释放，还可以体外直接生物灭活猪流行性腹泻病毒，因此汉黄芩素可用于制备抗猪流行性腹泻病毒的药物或饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及汉黄芩素在抗猪流行性腹泻病中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)感染引起的临床以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的高度接触性肠道传染病，是猪腹泻性病毒病中流行性最广，且反复发作的疾病。自2010年底，在我国大规模暴发，呈现高致病率、高死亡率的特征，尤其对哺乳仔猪危害率极大，给养猪业造成了重大经济损失。目前，接种疫苗是预防猪流行性腹泻的最有效方法，但由于PEDV的高变异性，传统疫苗对流行毒株保护力不高，缺乏高效的防控手段。另外，猪流行性腹泻的治疗尚未取得有效进展，尚无饲料添加剂可有效抑制PEDV的复制。使用中药治疗PEDV对机体损伤较小，不易产生耐药性。中药在治疗过程中不仅可以抑制PEDV的复制，还可以改善机体功能，提高免疫功能。因此开发有效的抗病毒药物对于PEDV的防控或治疗具有长远意义。
汉黄岑素(Wogonin)是一种天然的单黄醇类化合物，在体内外均具有治疗潜力。研究报道，汉黄岑素可以抑制多种病毒的复制，对多种流感病毒、轮状病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒和带状疱疹病毒具有广泛的抗病毒作用。PEDV属于α-冠状病毒，但致病机制不同于其他冠状病毒，且受体不使用其他冠状病毒常用宿主细胞受体，因此汉黄岑素对PEDV感染的影响目前尚未确定。猪流行性腹泻病毒-3c样蛋白酶(PEDV-3CLpro)在PEDV不同变异毒株中具有保守的结构和催化机制，在PEDV增殖及致病过程中发挥关键作用，是重要的抗病毒药物靶点。本发明提供的靶向PEDV-3CLpro蛋白的抑制剂汉黄岑素在治疗猪流行性腹泻病中的应用为首次报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供靶向PEDV-3CLpro蛋白酶的抑制剂汉黄芩素，将汉黄芩素用于制备治疗和或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物或饲料添加剂。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
汉黄芩素在制备猪流行性腹泻病毒3c样蛋白酶抑制剂中的应用：将猪流行性腹泻病毒-3c样蛋白酶(PEDV-3CLpro)和汉黄芩素进行结合亲和力分析和结合模式检测，结果表明汉黄芩素可靶向结合PEDV-3CLpro蛋白，汉黄芩素作为PEDV-3CLpro蛋白的抑制剂从而起到阻断猪流行性腹泻病毒的作用。
汉黄芩素在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒的药物或饲料添加剂中的应用：在本发明的具体实施例中，通过细胞实验证实汉黄芩素在不伤害细胞的情况下对PEDV具有显著抑制效果，在PEDV的不同生命周期中能显著抑制病毒的内化、胞内复制和新的成熟病毒粒子释放，还可以体外直接生物灭活PEDV，因此汉黄芩素可用于制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒的药物或饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明通过计算机方法模拟并识别针对PEDV-3CLpro蛋白酶的潜在重要小分子药物，以PEDV-3CLpro蛋白酶为靶点预防和治疗PEDV的感染，并通过研究证实了PEDV-3CLpro蛋白酶的抑制剂汉黄芩素作为PEDV治疗和新药开发以及进一步进行研究的合适候选药物。在实验模型中，证实了汉黄芩素能够抵抗PEDV的感染，且能显著抑制病毒的内化、胞内复制和新的成熟病毒粒子释放，还可以体外直接生物灭活PEDV，有一定的实用价值。因此，本发明首次公开了汉黄芩素具有抗PEDV的作用，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为汉黄芩素的化学结构式。
图2为实施例1中汉黄芩素与PEDV-3CLpro蛋白分子对接动力学模拟结果中互作氨基酸区域的示意图。
图3为实施例1中表面等离子体共振技术检测PEDV-3CLpro与汉黄芩素的亲和力。
图4为实施例2中Vero细胞系CCK8实验显示不同浓度的汉黄芩素毒性实验结果。
图5为实施例2中利用荧光定量PCR检测不同浓度的汉黄芩素对感染细胞中PEDV复制的抑制效果。
图6为实施例2中利用半数细胞培养物感染量(TCID50)检测不同浓度的汉黄芩素对感染细胞中PEDV复制的抑制效果。*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图7为实施例3中利用荧光定量PCR检测汉黄芩素在PEDV不同生命周期的抑制作用。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明实施例的一部分。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所采用的统计学分析，采用GraphPad Prism软件9.0进行统计分析，数据以均数±标准差表示。两组比较采用t检验；P<0.05被认为是显著的。
实施例1：汉黄芩素靶向结合PEDV-3CLpro蛋白
1、预测汉黄芩素靶向结合PEDV-3CLpro蛋白的关键氨基酸位点
PEDV-3CLpro蛋白的晶体结构检索自RCSB PDB数据库((http://www.rcsb.org))，ID:PDB:4XFQ。利用Autodock Vina1.1.2(http://vina.scripps.edu/)和AMBER16分子对接软件将汉黄芩素对接到PEDV-3CLpro蛋白结合口袋中。结果显示，结合亲和力分析和结合模式检测表明PEDV-3CLpro蛋白非常有利于汉黄芩素的结合。PEDV-3CLpro蛋白与配体汉黄芩素的这种结合模式由于配体尺寸较小而嵌入到活性囊袋的沟槽中，因此是稳定的。PEDV-3CLpro与汉黄芩素的最优对接模型如图2所示，配体与残基E165、H41和G142形成氢键。M25、Y53、I51、I140、C144、Q163、L164和P188的疏水相互作用在汉黄芩素的稳定中也发挥了不可忽视的作用。
2、表面等离子体共振技术检测PEDV-3CLpro与汉黄芩素的亲和力。
将表达纯化的无标签PEDV-3CLpro蛋白固定在激活的COOH传感器芯片上，汉黄芩素作为OpenSPR系统上的配体(Nicoya Lifesciences Inc.，Kitchener，on，Canada)。然后，将5–40μM汉黄芩素添加到传感器芯片中，PBS作为运行缓冲液。根据1:1结合模型计算动力学常数(kd)。结果表明(图3)，汉黄芩素的表面等离子体共振技术信号显著增加且呈剂量依赖性，汉黄芩素和PEDV-3CL-pro蛋白之间相互作用的亲和力常数为16μM。
由此可见，以上结果证实了汉黄芩素可靶向结合PEDV-3CLpro蛋白，以阻断PEDV感染。
实施例2：汉黄芩素在细胞水平抑制PEDV的功效评价实验
1、CCK8检测汉黄芩素对Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的毒性
细胞毒性试验采用Cell CountingKit-8(聚合美，北京)检测。将汉黄芩素对Vero细胞的毒性检测分别进行6.25～400μM浓度的实验评价，在细胞密度为80-90％的Vero细胞96孔细胞板上，加入不同浓度(终浓度0、6.25、12.5、25、50、100、200、400μM)的汉黄芩素。每个浓度设置3次重复，设置采用DMEM培养液替代待测溶液的空白对照组。置于37℃，5％CO2培养箱孵育24h后，弃掉培养上清，使用PBS洗2遍，加入100μl DMEM培养液和10μl CCK-8试剂，置于37℃，5％CO2培养箱里孵育2h，取受试样品，在酶标仪上检测，读取OD450读数，数据用graphpad处理，计算出抑制剂的CC50(半数细胞毒性浓度，即在细胞毒性实验中导致50％的细胞发生病变时的受试物浓度)。
结果如图4所示，汉黄芩素抑制Vero细胞呈现浓度依赖性，且汉黄芩素对Vero细胞的半抑制浓度(CC50)为475.3μM。
2、绝对定量RT-PCR检测PEDV病毒载量
在细胞密度为80-90％的Vero细胞12孔细胞板上按照MOI为0.01接种PEDV(AH2012/12毒株，NCBI ID：KU646831，以下相同)，胰酶终浓度8μg/mL，汉黄芩素终浓度12.5～100μM。对照组感染病毒和添加相同体积的DMEM，空白组只添加DMEM和胰酶。共孵育2h后，PBS冲洗实验组的培养孔后，加入基础培养基(含有终浓度为8μg/mL胰酶的DMEM培养液)置于37℃，5％CO2培养箱孵育24h。收集上清200μl，提取病毒RNA(Takara，9766)，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara，RR047A)操作反转录获得cDNA，检测PEDV病毒载量，计算出抑制剂汉黄芩素的IC50(半数最大效应浓度，即药效实验中能引起50％最大效应时的受试物浓度)。
结果如图5所示，汉黄芩素的IC50为54.873μM，治疗指数为CC50/IC50＝8.66，说明汉黄芩素在不伤害细胞的情况下对PEDV具有抑制作用。
3、半数细胞培养物感染量(TCID50)实验检测PEDV病毒滴度
取100μl步骤2中感染后细胞上清于1.5mL EP管里，加入900μl A液(0.8μl胰酶/mLDMEM)，做10倍梯度稀释，即10-1，10-2，10-3至10-8。在96孔微量培养板的1～8列加入不同梯度稀释液，每孔加入100μl，第九列为空白，10～11列加入200μl A液作为对照。最后在1～8列补加100μl A液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，逐日观察，记录细胞产生CPE的孔数，直到最低稀释度孔内细胞不再出现病变，且对照细胞开始衰老为止，按Reed-Muench两氏法计算病毒的TCID50值。
结果如图6所示，25～100μM汉黄芩素对PEDV抑制效果显著。
实施例3：汉黄芩素在细胞水平抑制PEDV不同生命周期的功效评价实验1.汉黄芩素抑制病毒粘附实验
在细胞密度为80-90％的Vero细胞12孔细胞板上接种PEDV(MOI为0.05)，每孔加入终浓度50μM汉黄芩素，对照组只感染病毒和添加相同体积的DMEM，置于4℃孵育1h。收集上清200μl，提取病毒RNA进行绝对定量RT-PCR检测病毒载量。
2、汉黄芩素抑制病毒内化实验
在细胞密度为80-90％的Vero细胞12孔细胞板上接种PEDV(MOI为0.05)，每孔加入终浓度50μM汉黄芩素，对照组只感染病毒和添加相同体积的DMEM，置于4℃孵育1h后，PBS1mL洗3遍，对照组加入1mL DMEM，实验组加入1mL 50μM汉黄芩素，置于37℃，5％CO2孵育2h。收集上清200μl，提取病毒RNA进行绝对定量RT-PCR检测病毒载量。
3、汉黄芩素抑制病毒复制实验
在细胞密度为80-90％的Vero细胞12孔细胞板上接种PEDV(MOI为0.05)，每孔加入1mL 50μM汉黄芩素，对照组只感染病毒和添加相同体积的DMEM，置于37℃孵育1h后，PBS1mL洗3遍，对照组加入1mL DMEM，实验组加入1mL 50μM汉黄芩素，37℃，5％CO2孵育1h。收集上清200μl，提取病毒RNA进行绝对定量RT-PCR检测病毒载量。
4、汉黄芩素抑制病毒释放实验
在细胞密度为80-90％的Vero细胞12孔细胞板上接种PEDV(MOI为0.05)，每孔加入1mL 50μM汉黄芩素，对照组只感染病毒和添加相同体积的DMEM，置于37℃孵育10h后，PBS1mL洗3遍，对照组加入1mL DMEM，实验组加入1mL 50μM汉黄芩素，37℃，5％CO2孵育12h。收集上清200μl，提取病毒RNA进行绝对定量RT-PCR检测病毒载量。
5、汉黄芩素直接灭活病毒实验
将PEDV(MOI为0.05)与50μM汉黄芩素混合置于37℃孵育2h，对照组只加入0.02MOIPEDV和基础培养基，接种于Vero细胞密度为80～90％的12孔板上孵育24小时，收集上清200μl，提取病毒RNA进行绝对定量RT-PCR检测病毒载量。
结果如图7所示，汉黄芩素既对PEDV的内化、胞内复制和新的成熟病毒粒子释放环节有显著抑制作用，还可以体外直接生物灭活PEDV。以上结果证实汉黄芩素不仅通过细胞内途径，还可以通过直接灭活病毒发挥抗病毒效果。
上述步骤中，未详尽描述、未特别指明的技术，均为现有技术中已有的常规技术手段，均可按照常规分子生物学和细胞生物学实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件进行。
Claims (2)
1.汉黄芩素在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用。
2.汉黄芩素在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染的饲料添加剂中的应用。
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| 基于网络药理学和分子对接的苍术治疗仔猪腹泻活性成分及其作用机理研究;王梓颖等;《饲料研究》(第9期);第70-74页 * |
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