CN115475154B - 棉酚及其衍生类似物在制备抗新型冠状病毒及其类似rna病毒产品的应用 - Google Patents
棉酚及其衍生类似物在制备抗新型冠状病毒及其类似rna病毒产品的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了棉酚及其衍生类似物在制备抗新型冠状病毒及其类似RNA病毒产品的应用。本发明提供了棉酚或其衍生类似物在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：1)治疗或预防新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒引发疾病；2)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染引发的疾病；3)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制引发的疾病；棉酚及其类似衍生物是现有被广泛应用的常见药物，药效稳定、药理清晰、安全可靠，可以快速应用于临床，对当前新型冠状肺炎疫情的预防与治疗，具有重大的应用潜力和价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及棉酚及其衍生类似物在制备抗新型冠状病毒及其类似RNA病毒产品的应用。
背景技术
棉花是一种全球性的纤维、油料和蛋白作物，此外，棉花还是一种传统的药用植物，据《本草纲目》和《中华本草》等药典记载，棉花具有止血止痛、祛痰平喘、抗菌消炎、抗癌、抗病毒以及治疗慢性气管炎等多种功效。棉花的代谢网络非常庞大，能够产生多种药用代谢产物，是一种极具发展前景的药用植物。棉酚是棉花中最主要的次生代谢产物之一，是棉花在抵抗病原体侵袭和虫子噬咬等过程中产生的一种重要抗生性次生代谢物。棉酚在医药和农业等领域具有巨大的应用潜力，对棉酚的开发研究具有广阔的前景。其中，在医药方面，棉酚在临床上用于子宫肌瘤、子宫内膜异位症、功能性子宫出血等妇科疾病。此外，棉酚是原癌基因APE1和BCL-2家族蛋白的天然抑制剂，具有抑制乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症的作用，其中，棉酚联合紫杉醇和顺铂等治疗方案已通过临床3期实验。以上研究说明棉酚成药性好、药效稳定，是临床上的“老药”。
自2019年12月以来，新型冠状病毒(新冠病毒，SARS-COV-2)的暴发使全球陷入了前所未有的巨大危机。新冠病毒是一种单股正链RNA病毒，其在人体内的传播和复制过程中有众多人体蛋白和新冠自身蛋白的参与。新冠病毒通过ACE2或 TMPRSS2进入细胞并释放病毒基因组，先翻译出多聚蛋白ORF1a和ORF1ab，多聚蛋白经PLpro(NSP3)和Mpro(NSP5)切割后，加工成16个具有不同功能的非结构蛋白，因此抑制PLpro和MPro能够有效抑制病毒的复制。此外，多聚蛋白一经切割之后，即可形成以RdRp(NSP12)为核心、以非结构蛋白7(NSP7)和非结构蛋白8 (NSP8)为辅助因子的转录复制机器，该转录复制机器直接协助病毒基因组进行复制和转录，对病毒的生命周期至关重要，因此，RdRp也是作为药物设计的重要靶点；经转录和复制后的新冠病毒基因组，可在细胞机器及其它病毒蛋白如解旋酶、核酸外切酶、核酸内切酶、甲基转移酶等的协助下组装出更多病毒，进而感染其它细胞。新冠病毒在复制过程中涉及到多种病毒蛋白，靶向抑制一种蛋白的药物往往由于病毒的快速变异而失效，不能解决病毒防控的根本问题。鉴于PLpro、MPro、RdRp、解旋酶、核酸外切酶、核酸内切酶、甲基转移酶等在新冠病毒复制过程中的关键作用，推测筛选和设计能够多靶点抑制这些关键病毒蛋白的药物可以在病毒和药物的军备竞赛过程中取得优势，并有可能通过“一药多靶”、使新冠病毒“绝育”。以新冠病毒为代表的RNA病毒属于高致病性、高突变率病毒，防控困难、危害巨大，因此，以新冠病毒为模式，以RNA病毒共有的保守功能蛋白为靶标如PLpro、MPro、RdRp、解旋酶、核酸外切酶、核酸内切酶、甲基转移酶等进行药物开发，筛选和鉴定“一药多靶”、“绝育攻击”和抗毒谱广的药物具有重大的科学、经济和社会意义，同时，鉴于新冠病毒及其类似RNA病毒的复制机制高度保守，研究结果也为抗RNA病毒提供了关键共性技术平台、模式系统和理论依据。
目前，大多数研究抗病毒药物多是基于单靶点机制，面对复杂易变的新型冠状病毒及其类似RNA病毒，单靶点药物很容易失效，因此，研发新型双靶点或多靶点抗病毒药物可能是目前应对病毒变异的有效途径。
发明内容
本发明一个目的是提供棉酚或其衍生类似物的用途。
本发明提供的棉酚或其衍生类似物在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：
1)治疗或预防新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒引发疾病；
2)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染引发的疾病；
3)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制引发的疾病；
4)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染；
5)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制；
6)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒中相关蛋白活性。
上述应用中，
所述相关蛋白包括木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、RNA 依赖性RNA聚合酶(NSP12)、解旋酶(NSP13)、核酸外切酶(NSP14)、核酸内切酶(NSP15)和甲基转移酶(NSP16)中至少一种；
或，所述与新型冠状病毒类似的RNA病毒为含有木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、RNA依赖性RNA聚合酶(NSP12，RdRp)、解旋酶(NSP13， helicase)、核酸外切酶(NSP14，3'-to-5'exonuclease)、核酸内切酶(NSP15，endoRNAse) 和甲基转移酶(NSP16，2'-O-ribose methyltransferase)中至少一种蛋白的RNA病毒。
上述应用中，
所述与新型冠状病毒类似的RNA病毒为传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、人类冠状病毒229E、人类冠状病毒NL63、人类冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合症病毒、MERS冠状病毒和/或扁颅蝠冠状病毒HKU4。
上述应用中，
所述棉酚为左旋棉酚、右旋棉酚、消旋棉酚或醋酸棉酚；
所述棉酚的衍生类似物为以棉酚为母核结构衍生出的化合物。
上述应用中，
所述治疗或预防新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒引发疾病是通过如下任一种实现：
1)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染；
2)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制；
3)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒中的相关蛋白活性；
4)结合新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒中的相关蛋白；
所述相关蛋白包括木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、RNA 依赖性RNA聚合酶(NSP12)、解旋酶(NSP13)、核酸外切酶(NSP14)、核酸内切酶(NSP15)和甲基转移酶(NSP16)中至少一种。
本发明还有一个目的是提供一种产品，为双靶点或多靶点抗病毒药物；其活性成分为棉酚或其衍生类似物。
本发明提供的产品，具有如下至少一种功能：
1)治疗或预防新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒引发疾病；
2)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染引发的疾病；
3)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制引发的疾病；
4)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染；
5)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制；
6)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒中相关蛋白活性；
7)结合新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒中的相关蛋白；
所述相关蛋白包括木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、RNA 依赖性RNA聚合酶(NSP12)、解旋酶(NSP13)、核酸外切酶(NSP14)、核酸内切酶(NSP15)和甲基转移酶(NSP16)中至少一种。
上述产品还包括药学上可接受的辅料。
本发明的产品可以配制成各种适合的药物制剂形式。可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等或注射给药的粉针剂、溶液剂。
上述产品的剂型为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。
上述产品在制备具有如下至少一种功能产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)治疗或预防新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒引发疾病；
2)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染引发的疾病；
3)治疗或预防由于新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制引发的疾病；
4)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒感染；
5)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒复制；
6)抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒中相关蛋白活性。
本发明还可以提供如下方法：
本发明提供了一种治疗或预防新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒引发疾病的方法，为将棉酚或其衍生类似物或活性成分为棉酚或其衍生类似物的产品作为药物作用于细胞或动物或人，实现治疗或预防新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒引发疾病。
本发明提供了一种抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒相关蛋白活性的方法，包括如下步骤：将棉酚或其衍生类似物或活性成分为棉酚或其衍生类似物的产品作用于蛋白或含有该蛋白的细胞或活体动物或人，实现抑制新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒中相关蛋白活性；
所述相关蛋白包括病毒木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、 RNA依赖性RNA聚合酶(NSP12)、解旋酶(NSP13)、核酸外切酶(NSP14)、核酸内切酶(NSP15)和甲基转移酶(NSP16)中至少一种。
本发明提供了一种结合新型冠状病毒或与其类似的RNA病毒相关蛋白的方法，包括如下步骤：将棉酚或其衍生类似物或活性成分为棉酚或其衍生类似物的产品作用于蛋白或含有该蛋白的细胞或活体动物或人，实现结合新型冠状病毒或与其类似的 RNA病毒中相关蛋白；
所述相关蛋白包括病毒木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、 RNA依赖性RNA聚合酶(NSP12)、解旋酶(NSP13)、核酸外切酶(NSP14)、核酸内切酶(NSP15)和甲基转移酶(NSP16)中至少一种。
上述中，所述与新型冠状病毒类似的RNA病毒为含有木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、RNA依赖性RNA聚合酶(NSP12，RdRp)、解旋酶(NSP13，helicase)、核酸外切酶(NSP14，3'-to-5'exonuclease)、核酸内切酶(NSP15， endoRNAse)和甲基转移酶(NSP16，2'-O-ribose methyltransferase)中至少一种蛋白的RNA病毒。
上述中，所述与新型冠状病毒类似的RNA病毒为传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、人类冠状病毒229E、人类冠状病毒NL63、人类冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合症病毒、MERS冠状病毒和/或扁颅蝠冠状病毒HKU4。
上述中，所述棉酚为左旋棉酚、右旋棉酚、消旋棉酚或醋酸棉酚；
所述棉酚的衍生类似物为以棉酚为母核结构衍生出的化合物。
上述中，所述棉酚或其衍生类似物或所述产品作用于细胞时，其活性成分的使用浓度不超过50μM；研究发现，棉酚对有机体细胞的最大无毒浓度是50μM，因此在实际应用中，为了避免产生细胞毒性，棉酚在细胞水平上的应用浓度应当控制在50μM 以内。
或，所述棉酚或其衍生类似物或所述产品作用于活体动物或人时，其活性成分的使用浓度不超过50mg/kg。
作为优选，在上述的棉酚在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的棉酚在细胞水平上的应用浓度为0.05-50μM。
作为进一步优选，在上述的棉酚在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的棉酚在细胞水平上的应用浓度为1-50μM。
作为更优选，在上述的棉酚在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的棉酚在细胞水平上的应用浓度为5-25μM。
作为最优选，在上述的棉酚在制备抗新型冠状病毒药中的应用中，所述的棉酚在细胞水平上的应用浓度为25μM。
在上述制备抗新型冠状病毒药物的应用中，所述的棉酚在细胞水平上的应用浓度不超过50μM。
本发明通过计算机高通量筛选、抗病毒实验以及结构生物学表征等方式，发现棉酚可以靶向结合或抑制多个新冠蛋白，包括与病毒复制息息相关的Mpro、PLpro以及RdRp三种关键蛋白，进而高效抑制新冠病毒的复制。本发明筛选到的新型抗新冠病毒天然产物可以高效抑制体外和体内新冠病毒的复制。
本发明主要特点如下：
1、本发明要解决的技术问题一是克服现有抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物类型的不足和单一，旨在针对当前疫情的急迫性探究抗SARS-CoV-2的药物，同时，本发明要解决的技术问题二是研究广谱的抗新型冠状病毒及其类似RNA病毒及其类似未知RNA病毒的药物。
2、本发明首次将棉酚应用于治疗由新型冠状病毒引起的感染中，研究发现，棉酚能够有效抑制新型冠状病毒在细胞内和动物体内的增殖，因此能够用于治疗由新型冠状病毒感染引起的相关疾病。
3、本发明首次将棉酚与新型冠状病毒及其类似RNA病毒的Mpro蛋白进行对接，发现棉酚具有靶向结合多种RNA病毒中Mpro的能力，因此能够用于抑制相关新型冠状病毒类似RNA病毒并用于治疗由这些病毒感染引起的疾病。
4、本发明人经过大量研究发现棉酚可以结合或抑制新型冠状病毒的主蛋白酶(Mpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)以及RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，能够通过多靶点机制抑制病毒复制，棉酚在细胞水平上抗新冠病毒的EC50＝0.21μM。
5、新型冠状病毒属于高致病性冠状病毒，其复制机制与其它类似RNA病毒高度保守，尤其是病毒的主蛋白酶(Mpro)和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)等，本发明将棉酚与传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、人类冠状病毒229E、人类冠状病毒NL63、人类冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合症病毒、MERS冠状病毒、扁颅蝠冠状病毒HKU4等含有新冠病毒类似相关蛋白的RNA病毒的Mpro蛋白进行分子对接，发现棉酚也具有抑制这些病毒Mpro蛋白的潜在能力，为抗新冠病毒类似RNA病毒提供了理论依据。
与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
棉酚能够通过抑制新冠病毒的主蛋白酶(Mpro)、木瓜蛋白酶(PLpro)和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)等，高效抑制病毒的复制，从而达到预防和治疗新型冠状病毒感染的作用。通过分子对接发现，棉酚对其它新冠病毒类似RNA病毒的Mpro也具有较低的结合能，说明棉酚具有抑制和新型冠状病毒类似RNA病毒的潜在能力。
本发明公开了棉花重要天然产物棉酚(Gossypol，GOS1)及其衍生类似物在制备抗新型冠状病毒及其类似RNA病毒药物中的应用。本发明研究显示，棉酚及其衍生类似物对新型冠状病毒及其类似RNA病毒具有明确显著的抗病毒作用，为新型冠状病毒及其类似RNA病毒的防控和治疗提供了一种新型药物选择。此外，新型冠状病毒及其类似RNA病毒复杂多变，单靶点药物很容易失效，本发明通过分子对接、酶学实验及抗病毒实验等方法发现棉酚及其衍生类似物通过靶向抑制与病毒复制息息相关的木瓜样蛋白酶(NSP3，PLpro)、主蛋白酶(NSP5，Mpro)、RNA依赖性RNA聚合酶(NSP12，RdRp)、解旋酶(NSP13，helicase)、核酸外切酶(NSP14，3'-to-5' exonuclease)、核酸内切酶(NSP15，endoRNAse)、甲基转移酶(NSP16，2'-O-ribose methyltransferase)等蛋白，从而高效抑制新型冠状病毒及其类似RNA病毒的复制。本研究与传统的抗病毒药物相比，可高效抑制新型冠状病毒及其类似RNA病毒，可实现对细胞和小鼠体内新冠病毒的高效抑制。另外，该方案为老药新用途，棉酚及其类似衍生物是现有被广泛应用的常见药物，药效稳定、药理清晰、安全可靠，可以快速应用于临床，对当前新型冠状肺炎疫情的预防与治疗，具有重大的应用潜力和价值。
附图说明
图1为棉酚、棉纤维素、黄芩素、棉花素和阿魏酸与新型冠状病毒Mpro活性口袋的对接情况(A-E)和棉酚与Mpro氨基酸残基的相互作用力分析(F)，其中F图中虚线代表氢键。
图2为消旋棉酚(A)、醋酸棉酚(B)、左旋棉酚(C)、棉花素(D)、棉纤维素(E)、阿魏酸(F)和黄芩素(G)对新型冠状病毒Mpro活性的抑制研究。
图3为消旋棉酚(A)、醋酸棉酚(B)、左旋棉酚(C)和棉花素(D)对Vero E6 细胞中新型冠状病毒的抑制作用及其对Vero E6细胞活力的影响；图的左右Y轴分别表示药物对病毒的平均抑制率和细胞活力。
图4为消旋棉酚(A)、醋酸棉酚(B)及左旋棉酚(C)对新型冠状病毒PLpro 活性的抑制研究。
图5为消旋棉酚与RdRp的结构生物学解析，其中，圆圈标记的代表棉酚的密度。
图6为消旋棉酚对小鼠模型中鼻甲和肺部组织病毒的清除效果。
图7为棉酚与传染性支气管炎病毒(A)、猪传染性胃肠炎病毒(B)、人类冠状病毒229E(C)、人类冠状病毒NL63(D)、人类冠状病毒HKU1(E)、严重急性呼吸综合症病毒(F)、MERS冠状病毒(G)、扁颅蝠冠状病毒HKU4(H)等新型冠状病毒类似RNA病毒的Mpro的分子对接情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
棉酚在市面上通常存在消旋棉酚、左旋棉酚(AT101)和醋酸棉酚等几种形式，将三种棉酚均进行研究。
消旋棉酚(货号：G133787)、左旋棉酚(货号：A129929)、醋酸棉酚(货号：G107460)、黄芩素(货号：B107323)、阿魏酸(货号：F103702)和棉籽糖(货号：IR0260)标准品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，棉花素(货号：ZT-30010)和棉纤维素 (货号：ZT-60362)购自上海甄准生物科技有限公司，二甲基亚砜(DMSO，货号： D8371)购自北京索莱宝科技有限公司。
PEG300(货号：IP9020)、PBS缓冲溶液(货号：P1020)购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1、用于抗新冠病毒的药物筛选
1、基于Mpro的高通量计算机筛选
抗新冠病毒天然产物的高通量计算机筛选。实验以新型冠状病毒Mpro为靶标蛋白，其三维结构数据来源于PDB数据库(PDB ID：6LU7)。采用AutoDock Vina、PyRx 等软件计算；PyMol等软件进行可视化分析；
步骤如下：(1)建立具有特色的棉花天然产物小分子数据库。(2)抗新冠病毒天然产物的计算机筛选。从新冠病毒药物筛选的常用靶点Mpro入手，使用天然产物数据库中的小分子与Mpro进行分子对接，黄芩素作为阳性对照也进行研究。根据结合能大小判断天然产物和Mpro的结合能力。
2、高通量筛选结果分析
图1A-图1E为筛选小分子与Mpro的结合情况，可以看出，棉酚(A)、棉纤维素 (B)、黄芩素(C)、棉花素(D)和阿魏酸(E)均能够与Mpro蛋白酶的底物结合位点相结合，结合能分别为-9.6kcal/mol、-8.3kcal/mol、-7.8kcal/mol、-7.5kcal/mol、-5.3 kcal/mol。棉子糖与Mpro的亲和力较弱，结合能大于-5.0kcal/mol。
图1F为棉酚与Mpro氨基酸残基的相互作用力，可以看出棉酚的活性羟基和醛基与Mpro的7个活性氨基酸残基如C145、G143、S144、H163、T190、Q192、R188等形成11个氢键，且覆盖Mpro的催化残基H41和C145，表明棉酚可能是极具优势的 Mpro抑制剂。
最终，根据化合物的结合能及其功效，筛选出结合能小于-5.0kcal/mol的小分子如棉酚、棉花素、棉纤维素、黄芩素、阿魏酸进行下一步生化实验验证，同时，采用结合能大于-5.0kcal/mol的天然产物棉子糖作为阴性对照进行分析。
实施例2、候选天然产物对Mpro的抑制分析
根据文献(Wrapp,D.；Wang,N.S.；Corbett,K.S.；Goldsmith,J.A.；Hsieh,C. L.；Abiona,O.；Graham,B.S.；McLellan,J.S.,Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spikein the prefusion conformation.Science 2020,367(6483),1260-1263.)描述的方法，采用原核表达的方式获取新冠病毒Mpro蛋白酶(NCBI参考序列：YP_009742612.1)，将获得的新冠病毒Mpro蛋白酶用于天然产物的抑制分析。根据Mpro可识别并切割的氨基酸序列设反应荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(由南京肽业生物科技有限公司合成)。
消旋棉酚对Mpro的抑制实验利用荧光共振能量转移底物(FRET)(由南京肽业生物科技有限公司合成)进行，具体如下：
加入消旋棉酚的反应体系：向50mM Tris-HCl(pH 7.3)和1mM EDTA的缓冲体系中加入Mpro(终浓度100nM)和溶于DMSO的不同浓度的消旋棉酚，在30℃下孵育30min后，向反应液中加入荧光底物(终浓度20μM)，立即采用Fluoraskan Ascent 荧光仪测定底物的荧光强度，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm，每隔 30s测定一次荧光强度，连续测定1h。采用前10min荧光值和时间变化计算初始反应速率，即酶催化反应过程中，单位时间内产物生成的量。
只加入DMSO的反应体系：与加入消旋棉酚的反应体系相比，区别仅在于不加入消旋棉酚。
将加入消旋棉酚的反应体系的初始反应速率记为Vx，只加入DMSO的反应体系的初始反应速率记为V0。消旋棉酚对Mpro的抑制率为Vx/V0×100％。
其他天然产物醋酸棉酚、左旋棉酚、棉花素、棉纤维素、阿魏酸和黄芩素对Mpro 的抑制实验按照消旋棉酚抑制Mpro的实验方式进行。
候选天然产物对Mpro的抑制结果如图2所示，A-G分别为消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚、棉花素、棉纤维素、阿魏酸和黄芩素对新型冠状病毒Mpro蛋白的抑制活性。可以看出，三种不同形式的棉酚均对Mpro具有较好的抑制效果，半抑制浓度(IC50) 在1.59μM-1.74μM之间，说明不同形式存在的棉酚对Mpro的抑制效果没有明显差别 (图2A-C)。棉花素(D)和棉纤维素(E)对Mpro也具有较好的抑制效果，IC50分别为7.16μM和4.49μM。阿魏酸对Mpro的抑制能力较弱，IC50为24.72μM(图2F)。
阳性对照黄芩素对Mpro也展现出较好的抑制效果，IC50低至0.64μM(图2G)。
阴性对照棉籽糖对Mpro几乎没有抑制活性。
Mpro的抑制实验进一步筛选了对Mpro具有较高抑制效果的候选产物为消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚、棉花素、棉纤维素、阿魏酸和黄芩素，且抑制效果与虚拟筛选的结果相一致，表明了虚拟筛选的可靠性。
实施例3、候选天然产物的抗新冠病毒效果分析
1、抗病毒天然产物的初步筛选
采用qRT-PCR的方式检测候选天然产物的抗病毒活性，整个实验操作均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P4实验室进行，具体如下：
处理组：将1×104个VERO E6(Vero E6 (African green monkey kidney；ATCCCRL-1586))种入24孔板中，在37℃下培养20-24 h。将消旋棉酚溶于DMSO中，加入含有Vero E6细胞的培养皿中处理1h(消旋棉酚工作浓度为50μM)，然后用MOI为0.005的SARS-CoV-2/HRB26/human/2020/CHN (HRB26,GISAID access no.EPI_ISL_459909)新型冠状病毒(Wang,J.L.；Shuai,L.； Wang,C.；Liu,R.Q.；He,X.J.；Zhang,X.F.；Sun,Z.R.；Shan,D.；Ge,J.Y.； Wang,X.J.；Hua,R.H.；Zhong,G.X.；Wen,Z.Y.；Bu,Z.G.,Mouse-adapted SARS-CoV-2replicates efficiently in the upper and lower respiratory tract of BALB/c and C57BL/6J mice.Protein Cell 2020,11(10),776-782.)感染细胞。在37℃下孵育1h后，采用PBS洗涤细胞，加入含有50μM消旋棉酚/DMSO的新鲜培养基(含有10％的胎牛血清(Thermo Scientific,USA)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Thermo Scientific,USA))，继续培养细胞24h后，得到培养产物。
对照组：与处理组不同的是仅不加入消旋棉酚。
按照文献(Wang，J.L.；Shuai，L.；Wang，C.；Liu，R.Q.；He，X.J.；Zhang，X. F.；Sun,Z.R.；Shan,D.；Ge,J.Y.；Wang,X.J.；Hua,R.H.；Zhong,G.X.；Wen, Z.Y.；Bu,Z.G.,Mouse-adapted SARS-CoV-2replicates efficiently in the upper and lower respiratorytract of BALB/c and C57BL/6J mice.Protein Cell 2020,11(10),776-782.)方式提取培养产物中病毒RNA并采用新冠病毒中N基因特异性引物进行qRT-PCR实验，获得病毒载量。
抑制病毒能力％计算公式＝对照组病毒载量/处理组病毒载量*100％
其他天然产物的抗病毒筛选方式与消旋棉酚相同。
初步筛选的抗病毒结果如表1所示，可以看出三种不同形式的棉酚和棉花素等对新型冠状病毒展现出较好的抑制效果。黄芩素、棉纤维素、阿魏酸和棉籽糖等对细胞水平病毒的复制能力较弱。
因此，在后续的研究中，仅采用消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚和棉花素在细胞水平进行抑制新冠病毒的深入分析。
2、消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚和棉花素在细胞水平抗新冠病毒的深入分析
鉴于三种不同形式的棉酚和棉花素对新型冠状病毒良好的抗病毒效果，对其进行深入的抗病毒分析。
处理组：将1×104个VERO E6(African green monkey kidney,ATCC))种入24孔板中，在37℃下培养20-24h。将消旋棉酚溶于DMSO中，加入含有Vero E6细胞的培养皿中处理1h(消旋棉酚工作浓度分别0.062μM、0.21μM、0.62μM、1.85μM、 5.56μM、10μM和16.67μM)，然后用MOI为0.005的HRB26新型冠状病毒感染细胞。在37℃下孵育1h后，采用PBS洗涤细胞，加入含有对应不同工作浓度棉酚/DMSO 的新鲜培养基，继续培养细胞24h后，得到培养产物。提取培养产物中病毒RNA作为模板，采用新冠病毒的特定引物进行qRT-PCR实验。与上述1的方法基本相同。
对照组：与处理组不同的是仅不加入消旋棉酚。
醋酸棉酚和左旋棉酚抗病毒的深入研究与消旋棉酚相同。
结果如图3所示。
3、细胞活力测试
使用Cell Titer-Glo试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)按照说明测定细胞活力：
消旋棉酚处理细胞：将Vero E6细胞接种在96孔板中，每孔中5X103细胞，12-16 h后，再加入1ul不同浓度的溶于DMSO的消旋棉酚。
DMSO处理细胞：将Vero E6细胞接种在96孔板中，每孔中5X103细胞，12-16h 后，再加入1ulDMSO。
24h后，向每个孔中加入Cell Titer-Glo试剂。用GloMax 96酶标仪(美国麦迪逊Promega公司)测定发光值。
细胞相对活力(％)＝消旋棉酚处理细胞的发光值/DMSO处理细胞的发光值*100％
消旋棉酚、醋酸棉酚和左旋棉酚的抗病毒及细胞毒性实验结果如图3所示，A-D 分别为消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚和棉花素对Vero E6细胞中新型冠状病毒的抑制分析及对Vero E6细胞活力的影响。图的左右Y轴分别表示药物对病毒的平均抑制率和细胞活力；可以看出，消旋棉酚在较低浓度时就表现出良好的抑制新冠病毒的能力，EC50低至0.21μM(图3A)。此外，在10μM浓度时，消旋棉酚对新冠病毒的抑制率接近于100％，且未对细胞活力产生明显的影响，说明消旋棉酚可以高效抑制细胞中新冠病毒的复制。醋酸棉酚和左旋棉酚对病毒的抑制效果与消旋棉酚类似，EC50 分别为0.79μM和1.19μM，且在有效的抗病毒浓度范围内未发现明显的细胞毒性(图 3B和3C)。棉花素也对细胞中的新冠病毒展现出一定的抑制能力(图3D，EC50＝33.22 μM)，但是，棉花素对Vero E6的细胞活力产生了明显的影响，说明棉花素具有较大的细胞毒性，在后续研究中将被舍弃。
实施例4、分子对接的方式鉴定棉酚靶向结合的其他新冠蛋白
通过PDB数据库(https://www1.rcsb.org/)下载新冠病毒的刺突蛋白(PDB：6VW1)、核衣壳蛋白(PDB：6M3M)、包膜蛋白(PDB：7K3G)、非结构蛋白1(NSP1，PDB： 7K3N)、非结构蛋白2(NSP2，PDB：7MSW)、木瓜样蛋白(PLpro，PDB：6WX4)、 NSP7-NSP8-NSP12(RdRp复合物，PDB：7BV2)、非结构蛋白9(NSP9，PDB：6WXD)、非结构蛋白10(NSP10，PDB：6WQ3)、解旋酶(NSP13，PDB：5RL6)、核酸内切酶(NSP15，PDB：6WXC)、甲基转移酶(NSP16，PDB：6WQ3)、ORF3a(PDB： 6XDC)、ORF7a(PDB：6W37)和ORF8(PDB：7JX6)的结构。新冠病毒核酸外切酶(NSP14)和SARS病毒核酸外切酶高度同源，采用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)在线软件根据SARS病毒核酸外切酶(PDB：5C8S) 构建新冠病毒核酸外切酶的结构。以棉酚为配体，以新冠蛋白的三维结构为受体，采用Autodock软件进行分子对接。鉴于BCL-2(PDB：4AQ3)和BCL-XL(PDB：1PQ1) 是棉酚可抑制的已知靶点，以它们与棉酚的结合能为对照分析棉酚对新冠蛋白的抑制能力。
棉酚与新冠蛋白、BCL-2、BCL-XL的对接结果如表1所示，PLpro、RdRp复合物、非结构蛋白13、非结构蛋白14、非结构蛋白15和非结构蛋白16与棉酚的结合能分别为-6.8kcal/mol、-8.7kcal/mol、-7.8kcal/mol、-10.4kcal/mol、-7.8kcal/mol和-7.2 kcal/mol，均小于棉酚与BCL-2和BCL-XL的结合能(分别为-6.4kcal/mol和-6.5 kcal/mol)，说明这些新冠蛋白与棉酚结合的可能性较大，其他新冠蛋白与棉酚结合能大于-5.0kcal/mol，与棉酚结合的可能性相对较小。
基于以上结果，鉴于PLpro和RdRp在新冠病毒复制过程中的重要作用，对这两个蛋白进行深入研究。
表1为棉酚与多个新冠蛋白分子对接的结合能
实施例5、消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚对新冠病毒蛋白PLpro的抑制分析
根据文献(Li,J.；Zhou,X.L.；Zhang,Y.；Zhong,F.L.；Lin,C.；McCormick,P. J.；Jiang,F.；Luo,J.；Zhou,H.；Wang,Q.S.；Fu,Y.；Duan,J.J.；Zhang,J.,Crystal structureof SARS-CoV-2main protease in complex with the natural product inhibitorshikonin illuminates a unique binding mode.Sci.Bull.2021,66(7),661-663.)描述的方法，采用原核表达的方式获取新冠病毒PLpro蛋白酶(YP_009725299.1， Glu1564-Val1880)，将获得的新冠病毒PLpro蛋白酶用于消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚对PLpro的抑制分析。
棉酚对PLpro的抑制实验利用荧光底物Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC(由南京肽业生物科技有限公司合成)进行，激发光和发射光的波长分别为340nm和450nm。
加入消旋棉酚的反应体系：用于反应的缓冲体系是50mM HEPES(pH 7.4)、0.01％Triton X-100(v/v)、0.1mg/ml BSA、2mM DTT，向缓冲体系中加入PLpro蛋白(终浓度50nM)和DMSO或溶于DMSO的不同浓度的消旋棉酚，在30℃孵育30min后，加入荧光底物(终浓度50μM)，每隔30s测定一次荧光强度，连续测定1h。采用前10min荧光值和时间变化计算初始反应速率，即酶催化反应过程中，单位时间内产物生成的量。
将加入消旋棉酚的反应体系的初始反应速率记为Vx，只加入DMSO的反应体系的初始反应速率记为V0。消旋棉酚对PLpro的抑制率为Vx/V0×100％。
醋酸棉酚和左旋棉酚对PLpro的抑制实验操作方式与消旋棉酚相同。
消旋棉酚、醋酸棉酚、左旋棉酚对PLpro的抑制效果结果如图4A-4C所示，可以看出，消旋棉酚、左旋棉酚和醋酸棉酚均对PLpro有一定的抑制效果。
实施例6、冷冻电镜法解析RdRp与棉酚的复合物结构
根据文献(Yin,W.C.；Mao,C.Y.；Luan,X.D.；Shen,D.D.；Shen,Q.Y.；Su, H.X.；Wang,X.X.；Zhou,F.L.；Zhao,W.F.；Gao,M.Q.；Chang,S.H.；Xie,Y. C.；Tian,G.H.；Jiang,H.W.；Tao,S.C.；Shen,J.S.；Jiang,Y.；Jiang,H.L.；Xu, Y.C.；Zhang,S.Y.；Zhang,Y.；Xu,H.E.,Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase fromSARS-CoV-2by remdesivir.Science 2020,368 (6498),1499-1504.)的方式表达NSP7-NSP8-NSP12复合物(RdRp复合物)。
将0.75mg/ml RdRp复合物与消旋棉酚(货号：G133787，阿拉丁)按照质量浓度比为1:10-1:20的比例混合，在4℃孵育0.5h，得到消旋棉酚-RdRp复合物。将3μL 消旋棉酚-RdRp复合物置于还原氧化石墨烯载网(Quantifoil 300mesh Au R1.2/1.3，RGO support，由水木未来(北京)科技有限公司提供)上，然后用FEI Vitrobot Mark IV 浸入液体乙烷中冷冻。利用300kV Titan Krios G3i收集冷冻样品数据，采用RELION 3.1 对数据进行处理得到高分辨率的电子密度图并搭建复合物的原子结构。
结果如图5所示，在消旋棉酚-RdRp复合物中发现关键成分棉酚的清晰密度(如图中的圆圈)，说明消旋棉酚能够与RdRp复合物以2:1的比例结合。
实施例7、消旋棉酚对新冠肺炎小鼠模型的体内抗病毒效果分析
1、对小鼠模型进行给药和攻毒
取4-6周龄BALB/c雌性小鼠，分为如下2组：
消旋棉酚(GOS)组：首次给药时，将10mg消旋棉酚溶于1ml PEG300：PBS 缓冲溶液：DMSO(体积比48:42:10)的溶剂载体中，采用肌肉注射方式给药，注射 100μL，消旋棉酚的初始给药剂量为50mg/kg；之后每天将5mg消旋棉酚溶于1ml PEG300：PBS缓冲溶液：DMSO(体积比48:42:10)的溶剂载体中，肌肉注射100μL，注射剂量为25mg/kg。
CK组：采用肌肉注射方式注射100μL溶剂载体PEG300：PBS缓冲溶液：DMSO (48:42:10)。
给药1h后，每只小鼠鼻内接种50μl 103.6PFU小鼠适应性新冠病毒毒株HRB26M(Wang,J.L.；Shuai,L.；Wang,C.；Liu,R.Q.；He,X.J.；Zhang,X.F.；Sun,Z. R.；Shan,D.；Ge,J.Y.；Wang,X.J.；Hua,R.H.；Zhong,G.X.；Wen,Z.Y.；Bu,Z. G.,Mouse-adapted SARS-CoV-2replicates efficiently in the upper and lower respiratory tract of BALB/cand C57BL/6J mice.Protein Cell 2020,11(10),776-782.)。
在给药的第3天(以肌肉注射第一天记作给药第0天)处死小鼠，收集鼻甲和肺组织。
2、小鼠鼻甲和肺组织病毒复制情况
小鼠提取各组小鼠鼻甲和肺部的病毒RNA并采用qRT-PCR检测鼻甲和肺部的病毒RNA拷贝数。该部分实验方式与实施例3相同。
结果如图6所示，CK组代表只采用溶剂处理组小鼠，GOS组代表注射消旋棉酚的处理组小鼠，可以看出，注射消旋棉酚后，小鼠在鼻甲和肺部组织的拷贝数均有显著下降(p<0.05)。
实施例8、分子对接的方式鉴定棉酚靶向抑制的新型冠状病毒类似RNA病毒
鉴于Mpro蛋白酶在新型冠状病毒类似RNA病毒中的高度保守性及其在病毒复制过程中的不可或缺性，以棉酚为配体，以传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、人类冠状病毒229E、人类冠状病毒NL63、人类冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合症病毒、MERS冠状病毒、扁颅蝠冠状病毒HKU4等新型冠状病毒类似RNA病毒的 Mpro蛋白为受体采用Autoduck软件进行分子对接，这些病毒Mpro的三维结构数据来源于PDB数据库，PDB编号分别为2Q6D、1P9U、1P9S、6FV2、3D23、1UJ1、4WME、 2YNA。
棉酚与上述病毒Mpro蛋白的对接结果如表2和图7所示。
表2为棉酚与新型冠状病毒类似RNA病毒中Mpro蛋白的分子对接及结合能。
图7中，A-H分别代表传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、人类冠状病毒229E、人类冠状病毒NL63、人类冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合症病毒、MERS 冠状病毒、扁颅蝠冠状病毒HKU4这些新型冠状病毒类似RNA病毒的Mpro的分子对接情况；可以看出，棉酚均能很好的对接到以上病毒主蛋白酶的活性口袋，说明棉酚具有抑制以上病毒的潜在能力。
以上所述仅为本发明的主要的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院棉花研究所
<120> 棉酚及其衍生类似物在制备抗新型冠状病毒及其类似RNA病毒产品的应用
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (4)
1.棉酚在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：
1）抑制新型冠状病毒感染；
2）抑制新型冠状病毒复制。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述抑制新型冠状病毒感染或抑制新型冠状病毒复制为抑制新型冠状病毒中蛋白活性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述蛋白包括木瓜样蛋白酶、主蛋白酶、RNA依赖性RNA聚合酶、解旋酶、核酸外切酶、核酸内切酶和甲基转移酶中至少一种。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述棉酚为左旋棉酚、右旋棉酚、消旋棉酚或醋酸棉酚。
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