CN103156830A - 芦荟大黄素在抗sars冠状病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了芦荟大黄素在制备预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用，其中所述芦荟大黄素具有下列结构式：

芦荟大黄素具有抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的作用，其IC₅₀值为95μM。

Description

芦荟大黄素在抗SARS冠状病毒感染中的应用

技术领域

本发明涉及药学领域，具体而言，涉及蒽醌类化合物芦荟大黄素的应用。

背景技术

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)又称传染性非典型肺炎，是一种严重的急性呼吸系统传染病。SARS病原体是冠状病毒属的一种病毒(Peiris J et al.Lancet，2003，361：1319-1325)。冠状病毒属隶属于冠状病毒科，冠状病毒是正链RNA病毒，在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的(Siddell，S.G et al.Coronaviruses，toroviruses and arteriviruses.in Topley & Wilson′s Microbiology and Microbia Infections，10^th edition，Vol.Virology(eds.Mahy，B.W.J.& ter Meulen，V.)823-856(Hodder Arnold.London，2005))。这个属含有约26个种；按照它们的自然宿主、基因序列以及血清型关系，这个属又可以被分为三个组群：其中第一组群有猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)等；第二组群有SARS冠状病毒等；第三组群有禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，AIBV)等(Spaan，W.J.M.and Cavanagh，D.Coronaviridae.in Virus taxonomy，VIIIth Report of the ICTV.945-62(Elsevier-Academic Press.，London，2004)。

SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla和pplab(Ziebuhr，Snijder et al.2000；Thiel，Herold et al.2001；Anand，Yang et al.2005；Ziebuhr 2005)，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制功能(Ziebuhr，Snijder et al.2000；Anand，Yang et al.2005；Bartlam，Yang et al.2005)，SARS冠状病毒主要蛋白酶(简称主蛋白酶，main protease)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。

天然产物又称次级代谢产物，具有结构多样性和生物活性多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ，Gragg GM，Snader KM.Nat Prod Rep，2000，17(3)：215-234；Lee K-H.J Nat Prod.2004，67(2)：273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是药物小分子化合物的一个巨大的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。

芦荟大黄素(Aloeemodin)为大黄的抗菌有效成分，是一种橙色针状结晶(甲苯)或土黄色结晶粉末，可以从芦荟中提取得到，具有抗肿瘤活性、抗菌活性、免疫抑制作用以及泻下作用。现广泛用作药品、化妆品原料。李建生等(CN101342161)公开了大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以大黄素或者芦荟大黄素为有效成分，可制成片剂、胶囊剂、针剂(注射液)，用于改善脑缺血后的神经症状，减轻脑组织水肿，减小脑梗塞面积，对缺血性脑损伤具有明显的保护作用。郭瑶等(CN1836521)公开了芦荟大黄素的抗紫外线辐射用途，从芦荟叶中分离提取出芦荟大黄素，芦荟大黄素可以吸收消耗一部分紫外线的能量，减少了紫外线对生物体本身的伤害，从而可将其用于动植物体抗紫外线辐射。朱寿会等(CN198595)公开了植物中的蒽醌类衍生物在抗流感、禽流感病毒(H5N1)中的应用；所述蒽醌类衍生物包括大黄浸膏中所包含的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸。实验证明，大黄浸膏对流感病毒和禽流感病毒繁殖的抑制作用明显，试验重复四次，结果均相同，因此，可将大黄浸膏中所含有的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸作为有效成分制备人用治流感药物或人用治禽流感药物，或禽用治禽流感药物，药物的剂型可以是浸膏剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂和注射剂或其它剂型或食品。然而，尚未见到芦荟大黄素在抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性中的应用。

发明内容

本发明提供了芦荟大黄素在制备用于预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用，其中，所述芦荟大黄素具有下列结构式：

在上述应用中，所述芦荟大黄素的分子式为C₁₅H₁₀O₅，分子量为270.24。

在上述应用中，所述芦荟大黄素可以通过本领域已知的各种方法或者变通方法从植物中分离提取、合成或者半合成的方法制备得到，也可以直接商购获得。

本发明还提供了一种用于制备预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物组合物，所述药物组合物中包含作为活性成分的芦荟大黄素，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

将作为活性成分的芦荟大黄素与药学上可接受的载体或赋形剂混合后，按相应的常规药物制剂方法，可以制备抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性、预防和/或治疗SARS冠状病毒感染的药物。例如，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用辅助添加成分混合后，按常规的操作方法和过程，可以制成为片剂、丸剂、胶囊剂或多种相应的缓释剂、控释剂等固体口服制剂形式的药物；与常规的增溶剂、乳化剂、润饰剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合后，按相应的常规方法，可以制备成为合剂、糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；与常规的悬浮剂、稳定剂、分散剂或调节溶液渗透压剂混合，按相应的常规方法，配置成注射液。

经药理活性测试，芦荟大黄素对SARS冠状病毒主蛋白酶具有良好的抑制作用，IC₅₀值为95μM。表明芦荟大黄素可以用作SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，从而可以预防或者治疗SARS冠状病毒感染。

附图说明

图1示出了芦荟大黄素在500μg/mL的终浓度下对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性曲线。

图2示出了芦荟大黄素对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性IC₅₀曲线图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。

药理活性测试部分

1.SARS冠状病毒主蛋白酶的表达和纯化

根据文献(Yang H et al.Proc Natl Acad Sci.2003 Nov；100(23)：13190-5)进行SARS冠状病毒主蛋白酶的表达和纯化。具体方法如下：

1.1SARS冠状病毒主蛋白酶的表达载体的构建，具体步骤包括：

a.利用北京华大基因中心提供的编号为BJ01的SARS病毒毒株的cDNA文库，用PCR技术进行体外扩增；

正向引物：5′-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3′

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3′

b.经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小为1kb左右的片段；

c.将回收片段与T载体进行连接，然后用连接产物转化大肠肝菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；

d.从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒(博大泰克公司B型质粒小量快速提取试剂盒)提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收大小约为1kb左右的目标基因片段；

e.将目标载体pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；

f.将d和e获得的片段连接(将酶切回收后的目标基因片断和目标载体片段按照摩尔数3∶1～6∶1的比率混合，按照Takara DNA Ligation的要求在16℃反应30分钟～18小时)，转化大肠肝菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选到的阳性克隆，用于鉴定和测序。测序结果表明，SARS冠状病毒的主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-4T-1载体中。

1.2SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化，具体步骤包括：

a.将上述步骤1.1中得到的含有编码SARS冠状病毒主蛋白酶基因的pGEX-4T-1载体转化Escherichia coli BL21(DE3)的菌株，并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆；

b.在a中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入1L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入1mM左右的IPTG，在16℃培养12小时左右；

c.5000～8000rpm离心10～15min收集细胞，然后冰浴超声破菌20～30min；破菌液13000rpm～15000rpm离心20～40min后收集上清液；

d.将上清液加入PBS预平衡的GST亲和层析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20～30个柱床体积去除杂蛋白。最后加入2mL 0.1mg/mL左右的人类鼻病毒3C蛋白酶，在4℃酶切12～20小时，之后收集SARS冠状病毒主蛋白酶；

e.将上一步骤d中获得的SARS冠状病毒主蛋白酶再用Mono Q(GE公司)阴离子交换层析进行纯化，便可得到纯度较高的SARS冠状病毒主蛋白酶。

2.SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法

本发明所采用的筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法是饶子和等在CN101418334A中公开的筛选方法，具体方法如下：

SARS冠状病毒主蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度大于95％，上海吉尔生化有限公司)来完成的。该荧光底物的氨基酸序列来源于SARS冠状病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。

用于荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm。

在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠状病毒主蛋白酶(终浓度0.5μM)，加入化合物的DMSO溶解物(使其终浓度为：500μg/mL，底物浓度为20μM，298K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2，终浓度20μM)。设定阴性对照：不加入化合物，其余条件相同。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数，共测定10个点。以时间为X轴，荧光值为Y轴作图得到酶活动力学曲线。通过图上前两个点的数值计算斜率便可得到反应的初速度V，将阴性对照的反应初速度定义为V₀，加入化合物的反应初速度定义为V_i，从而计算出加入相应化合物后主蛋白酶的剩余活性(V_i/V₀)，相应化合物的抑制率则为(1-V_i/V₀)。当主蛋白酶的剩余活性小于20％(或抑制率大于80％)时，将进一步测定该化合物的IC₅₀值。

3.化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的IC₅₀值的测定

将化合物分别用95％的DMSO溶解成50mg/mL的溶液。取10μL的上述溶液用95％的DMSO进行2倍的梯度稀释，共稀释成12个左右的样品溶液。用上述测定方法测试不同化合浓度下主蛋白酶的剩余活性。将稀释的化合物浓度除以相应化合物的分子量并取以10为底的对数值作为X轴，对应的剩余活性值为Y轴，用GraphPad Prism 5(GraphPad software公司)作图并计算出相应的IC₅₀值。

下列实施例仅用于举例说明本发明，对本发明没有任何限制。

实施例1芦荟大黄素对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的测定

将5.00mg芦荟大黄素(购自成都曼斯特对照品有限公司，HPLC分析含量＞98％)完全溶解于100.00μL的95％DMSO中，配制成浓度为50.00mg/mL的标准溶液，采用上面药理活性测试部分中第2部分的筛选方法进行测定，平行重复3次，以时间为X轴，荧光值为Y轴作图得到芦荟大黄素对SRAS主蛋白酶的抑制活性曲线，见图1，根据该曲线测定SARS冠状病毒主蛋白酶的剩余活性为-0.34％。

取10.00μL的芦荟大黄素标准溶液用95％的DMSO进行2倍量递增的梯度稀释，稀释成待测溶液，浓度分别为50.0mg/mL、25.0mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.13mg/mL、1.56mg/mL、0.781mg/mL、0.391mg/mL、0.195mg/mL、0.0977mg/mL、0.0488mg/mL和0.0244mg/mL。采用上述的测定方法，测量以上待测溶液对SRAS主蛋白酶的抑制活性曲线，并计算其剩余活性。将稀释的化合物浓度除以相应化合物的分子量并取以10为底的对数值作为X轴，对应的剩余活性为Y轴，用GraphPad Prism 5作图并计算出相应的IC₅₀值。IC₅₀值为95μM，曲线图见图2。

根据上述实施例，可以了解芦荟大黄素具有很好地抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的作用。鉴于此，芦荟大黄素可以作为抑制SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，预防或治疗SARS冠状病毒感染。

为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。

Claims (6)

1.芦荟大黄素在制备用于预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述芦荟大黄素用于制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述芦荟大黄素具有下列结构式：

4.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述芦荟大黄素的分子式为C₁₅H₁₀O₅，分子量为270.24。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述芦荟大黄素采用从植物中分离提取或者合成或半合成的方法获得。

6.根据权利要求2所述的应用，其中，所述芦荟大黄素抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的IC₅₀值为95μM。

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