JP2023527706A - タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、抗ウイルス薬物の製造における使用 - Google Patents
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Abstract
タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、抗ウイルス薬物の製造における使用を開示する。初めてタンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の薬物の製造における使用を提出し、慢性基礎疾患が存在する新型コロナ感染者の新たな治療手段を提供し、この使用はタンジン活性成分の使用範囲を拡大し、特に全世界ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が流行する状況において、新型コロナウイルス感染による肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）を治療するために新しい薬物を提供する。【選択図】【図１】
Description
本発明は医薬技術分野に関し、具体的にタンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、抗ウイルス薬物の製造における使用に関する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入によって引き起こされた新型コロナウイルス肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）は世界中で発生しており、その非常に強い感染率と非常に長い潜伏期間で、世界で最も重要な公衆衛生上の脅威となっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はコロナウイルスのβ属に属し、線形一本鎖ＲＮＡウイルス（ｓｓＲＮＡ）である。そのゲノム配列は全長約３０ｋｂで、全部で１０個の遺伝子を含み、それぞれＯＲＦ１ａｂ、Ｓ、ＯＲＦ３ａ、Ｅ、Ｍ、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ８、Ｎ、ＯＲＦ１０である．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が宿主細胞に入るのは膜貫通型Ｓ糖タンパク質（Ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ）によって媒介され、ウイルス感染の鍵であり、そのため、このＳタンパク質構造の研究を展開するのは薬物開発のはじめてのステップである。Ｓタンパク質は、宿主細胞プロテアーゼの作用下でＳ１およびＳ２に切断され、Ｓ１は、宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と結合してウイルスの侵入を媒介し、Ｓ２イリデンは、ウイルスおよび細胞膜融合に関与する。現在、Ｓ２タンパク質は、少なくとも３つのコンホメーション、すなわち、融合前の天然コンフォメーション、ヘアピン前の中間コンフォメーション、および融合後のヘアピンコンホメーションを有し、これらの異なるコンフォメーションによって、ウイルスと標的細胞との融合が駆動されると考えられている。したがって、Ｓタンパク質抑制剤は、ウイルスが宿主細胞に入るのを阻止でき、Ｓ１およびＳ２イリデンは、抗ウイルス薬物スクリーニングの標的とすることができる。現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特効薬はなく、認可された市販薬もなく、天然物由来のＳタンパク質を標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入抑制剤は報告されていない。
タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）は、シソ科セージ属の多年生直立草本植物であり、その根と根茎は共に薬に入れることができ、すでに分離した化合物の特徴と理化学性質によって、脂溶性タンシノン類化合物と水溶性フェノール酸類化合物の２種類に分けられる。
タンジン水溶性フェノール酸類成分は主に抗酸化作用を表現し、サルビアノリック酸Ｂ（Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ）は現在知られている抗酸化活性が最も強い天然産物の一つであり、酸素フリーラジカルを消去し、脂質過酸化反応を抑制することができ、同時に血小板凝集を抑制し、血栓形成を抑制し、心臓、脳、肝臓、腎臓などの器官に重要な薬理作用を有する。２０１３年、饒子和らは中国特許ＣＮ１０３１２７０５０Ａにサルビアノール酸Ｂの抗Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス薬物の製造における使用を開示したが、そのメカニズムはサルビアノール酸ＢがＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼイリデンＰＡＮタンパク質の活性を効果的に抑制し、それによりＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの複製を抑制し、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼ亜型ＰＡイリデンＮ末端ヌクレオチド配列で表現されたＰＡＮタンパク質をターゲットタンパク質として選択した。
ダンシェンス（Ｓａｌｖｉａｎｉｃ ａｃｉｄ Ａ）はタンジンの水溶性成分における主要な薬効成分の一つであり、１９８０年にタンジンから分離したフェノール性芳香族酸類化合物であり、別名はタンジン酸甲とも呼ばれ、タンジン素の薬理作用に対する研究は主にその心血管活性特徴と作用機序の研究に集中している。それは、冠状動脈の拡張、抗血小板凝集、酸素フリーラジカルの除去、記憶障害の改善などの作用を有する。
サルビアノール酸Ｃはタンジン中の含有量が低く、薬理作用の研究が少ない。サルビアノリン酸Ｃ（Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ）は抗酸化、抗肝損傷、抗腫瘍及び抗血栓などの方面において強い薬理作用を有する。２０１６年に、王躍飛らは特許ＣＮ１０６５９６４３２Ａでサルビアノール酸Ｃのラジカル除去活性を開示した。２０１７年に、杜冠華らはＣＮ１０９９８５０３３Ａに抗脳卒中薬物の製造におけるサルビアノール酸Ｃの使用を開示した。２０１９年に範勇輝らは特許ＣＮ１１０１０１６９３Ａでサルビアノール酸Ｃの虚血脳組織損傷保護薬物の製造における使用を開示した。２０１９年に、唐紅進らは特許ＣＮ１０９８２０８８９Ａでサルビアノール酸Ｃの蛋白チロシンホスファターゼ１Ｂ抑制剤および２型糖尿病の予防および／または治療薬物の製造における使用を開示した。
脂溶性タンシノン類化合物はその本質が脂溶性ジテルペンキノン類化合物であり、現在分離されているタンシノン類化合物は主にジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、イソクリプトタンシノン、タンシノンＡ、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩＩＢなど１０種類余りのタンシノン単体である。
以上の数種類のタンジン活性成分は水溶性フェノール酸類化合物或いは脂溶性タンシノン類化合物を含むは、コロナウイルス肺炎を治療する薬物の製造に用いる関連使用の報告がない。
本発明の目的は、タンジン活性成分の新規使用を提供することである。
本発明の他の目的は、新規な抗ウイルス薬物を提供することである。
タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、抗ウイルス薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩ（Ｄｉｈｙｄｒｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ Ｉ、 ＤＨＴ）またはジヒドロタンシノンＩ類似体であり、
前記ダンシェンスの分子式はＣ９Ｈ１０Ｏ５で、分子量は１９８．１７で、構造式は
である。
前記ダンシェンスの分子式はＣ９Ｈ１０Ｏ５で、分子量は１９８．１７で、構造式は
前記サルビアノール酸Ｂの分子式はＣ３６Ｈ３０Ｏ１６で、分子量は７１８．５９で、構造式は
である。
前記サルビアノール酸Ｃの分子式はＣ２６Ｈ２０Ｏ１０であり、分子量は４９２．４３であり、構造式は
である。
前記ジヒドロタンシノンＩの分子式はＣ１８Ｈ１４Ｏ３であり、分子量は２７８．３１であり、構造式は
である。
タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である。
好ましくは、本発明において、前記ジヒドロタンシノンＩ類似体は、好ましくはタンシノンＡ（Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ Ａ、Ｔ－Ａ）またはクリプトタンシノン（Ｃｒｙｐｔｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ，Ｃｒｙ－Ｔ）である。
発明者らは、サルビアノール酸Ｂが非コロナウイルスやコロナウイルスに対して一定の抑制効果があることを見出した。好ましくは、前記タンジン活性成分がサルビアノール酸Ｂである場合、前記ウイルスはＨＩＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶであることが好ましい。
発明者らは、ダンシェンス、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩ或いはジヒドロタンシノンＩ類似体がコロナウイルスに対して明らかな抑制効果があることを発見した。好ましくは、前記タンジン活性成分がダンシェンス、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスは好ましくはコロナウイルスである。
特に、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体は、様々なコロナウイルスに対して顕著な抑制作用を有することを見出した。したがって、前記タンジン活性成分がジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスは好ましくはＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または中東呼吸器症候群コロナウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶである。
実験により、本発明によるタンジン活性成分は、新型コロナウイルスを引き起こすウイルスに対して顕著な抑制作用を有することが証明され、したがって、最も好ましくは、本発明において、前記ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が最も好ましい。
タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、ウイルスＳタンパク質媒介性ウイルス－細胞融合を抑制する薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はサルビアノール酸Ｂである。
タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、ウイルスＳタンパク質Ｓ２イリデンの融合領域ＨＲ１、ＨＲ２がヘキサヘリックス構造を形成するのを抑制する薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はサルビアノール酸Ｂである。
上記使用に基づき、タンジン活性成分と薬学的に許容される補助材料を組み合わせて抗ウイルス医薬組成物を製造することができる。
抗ウイルス医薬組成物であって、活性成分としてのタンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩を含み、前記タンジン活性成分はダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である。
ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する医薬組成物であって、活性成分としてのタンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩を含み、前記タンジン活性成分はダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロサルタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である。
好ましくは、前記タンジン活性成分がサルビアノール酸Ｂである場合、前記ウイルスはＨＩＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶであることが好ましい。
好ましくは、前記タンジン活性成分がダンシェンス、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスは好ましくはコロナウイルスである。
好ましくは、前記タンジン活性成分がジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスはＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶである。
最も好ましくは、前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
本発明に記載の医薬組成物の剤形は、通常の剤形であってもよい。好ましくは、前記医薬組成物は、注射製剤または経口製剤である。
より好ましくは、前記医薬組成物は、処方製剤注射剤、処方製剤錠剤、処方製剤カプセル剤、処方製剤丸剤または処方製剤ドロップ剤である。
前記経口製剤は、経口カプセル、錠剤、経口液であってもよい。
ウイルスＳタンパク質媒介性ウイルス細胞融合を抑制する医薬組成物であって、活性成分としてのサルビアノール酸Ｂまたはその医薬的に許容される塩を含む。
ウイルスＳタンパク質Ｓ２イリデンの融合領域ＨＲ１、ＨＲ２がヘキサヘリックス構造を形成するのを抑制する薬物組成物であって、活性成分としてのサルビアノール酸Ｂまたはその医薬的に許容される塩を含む。
好ましくは、前記ウイルスはＨＩＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶである。
好ましくは、前記医薬組成物は、注射製剤または経口製剤である。
好ましくは、前記医薬組成物は、処方製剤注射剤、処方製剤錠剤、処方製剤カプセル剤、処方製剤丸剤または処方製剤ドロップ剤である。
本発明は以下の有益な効果を有する：
本発明は初めてタンジン活性成分、例えばダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体またはその医薬的に許容される塩の、抗ウイルス薬物の製造における使用を発見した。この使用はタンジン活性成分の使用範囲を拡大し、特に抗コロナウイルス薬物の製造に適し、全世界で新型コロナウイルスが流行する状況において、本発明は臨床漢方薬による新型コロナウイルス肺炎の治療にある程度の実行可能性根拠を提供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を抑制して新しい薬物を提供する。
本発明は初めてタンジン活性成分、例えばダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体またはその医薬的に許容される塩の、抗ウイルス薬物の製造における使用を発見した。この使用はタンジン活性成分の使用範囲を拡大し、特に抗コロナウイルス薬物の製造に適し、全世界で新型コロナウイルスが流行する状況において、本発明は臨床漢方薬による新型コロナウイルス肺炎の治療にある程度の実行可能性根拠を提供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を抑制して新しい薬物を提供する。
ダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ自身もいくつかの慢性基礎疾患の治療薬物とすることができ、例えばサルビアノール酸Ｂはアテローム性動脈硬化症などの心脳血管方面の慢性基礎疾患の患者に適用することができ、したがって、本発明の薬物は慢性基礎疾患を持つ新型コロナウイルス感染者に、より安全な治療手段を提供することができる。
実験により、ダンシェンスは体外培養細胞Ｖｅｒｏ－Ｅ６でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有効に抑制でき、その半数有効濃度ＥＣ５０は１．０７μＭである。ダンシェンスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入段階を抑制するために用いられ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞への感染を抑制することができ、その半数抑制濃度ＩＣ５０は２．７０μＭである。ダンシェンスは有効濃度範囲で明らかな細胞毒性を示さない。
実験により分かるように、サルビアノール酸Ｂは体外培養細胞Ｖｅｒｏ－Ｅ６感染モデルにおいて、サルビアノール酸Ｂの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性の半数有効濃度ＥＣ５０は５５．４７μＭであり、サルビアノール酸ＢはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入段階の抑制に作用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス活性を抑制でき、ＩＣ５０は０．４１６μＭである。サルビアノール酸Ｂは有効濃度範囲で明らかな細胞毒性は認められない。
実験によりわかるように、サルビアノール酸Ｃは体外培養細胞Ｖｅｒｏ－Ｅ６でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を抑制し、その半数有効濃度ＥＣ５０は３．４１μＭである。サルビアノール酸ＣはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入段階を抑制するために用いられ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞への感染を抑制することができ、その半数有効抑制濃度ＩＣ５０は５．９０μＭである。サルビアノール酸Ｃは、有効濃度範囲で明らかな細胞毒性を示さない。
実験によりわかるように、ジヒドロタンシノンＩは体外培養細胞Ｖｅｒｏ－Ｅ６においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有効に抑制でき、その半数有効濃度ＥＣ５０は０．６４μＭである。ジヒドロタンシノンＩはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入段階を抑制するために用いられ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞への感染を抑制することができ、その半数抑制濃度ＩＣ５０は０．６８μＭである。また、タンシノンＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抑制のＥＣ５０は２．９８μＭである。クリプトタンシノンによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抑制のＥＣ５０は１．４６μＭである。前記ジヒドロタンシノンＩ、タンシノンＡとクリプトタンシノンは有効濃度範囲内で明らかな細胞毒性がない。
以上の実験結果から、本発明の前記タンジン活性成分は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬物の製造に用いることができ、本発明は大きな臨床使用価値を有することがわかる。
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本発明の内容をよりよく理解するために、以下、図面及び実施方法を参照して、本発明の概要をさらに説明するが、本発明の保護内容は以下の実施例に限定されるものではない。
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明の技術分野に属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用する用語は、特定の実施例を説明することを目的としており、本発明を限定するものではない。
以下の実施例は主にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の生毒とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの体外細胞感染モデルを構築することによって、ダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロサルタンシノンＩおよびその類似体の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の活性を評価して、そしてダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩとその類似体が抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の標的細胞への感染の能力を有することを証明し、ダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩおよびその類似体の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬物の製造における使用を提供する。さらに、サルビアノール酸Ｂによる、標的細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抑制は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質Ｓ２イリデンのヘキサヘリックスコンホメーションの変化を抑制することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質媒介性ウイルス－細胞融合を抑制することが示された。
本発明が採用するＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ細胞はアメリカのＡＴＣＣから購入し、安定にヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体蛋白ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）は本機構により構築して保存する。
本発明の実施例で使用した細胞増殖培地は、総体積の１０％ウシ胎児血清および総体積の１％のアンピシン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ基本培地からなり、４℃で保存し、使用前に３７℃の水浴で予熱する。
本発明の実施例に用いるダンシェンスは上海陶素生物化学科技有限公司から購入し、純度＞９９％である。
本発明の実施例に用いるサルビアノール酸Ｂは上海陶素生物化学科技有限公司から購入し、純度は＞９９％である。
本発明の実施例に用いるサルビアノール酸Ｃは上海陶素生物化学科技有限公司から購入し、純度＞９９％である。
本発明の実施例において採用するジヒドロタンシノンＩ、タンシノンＡ、クリプトタンシノンは上海陶素生物化学科技有限公司から購入し、純度＞９９％である。
本発明の実施例に用いるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、武漢ウイルス研究所によって感染者から単離され、増幅されて保存される。
本発明の実施例において偽ウイルス包装プラスミドおよびその由来は以下のとおりである：偽ウイルス包装骨格プラスミドｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－は南方医科大学に同定保存され、すでに公開した最適化後の全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質コアプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅは上海復旦大学陸路教授から贈呈された。
本発明の実施例に用いる単一ルシフェラーゼ検出キットは、米国ＰＲＯＭＥＧＡ社から購入され、細胞溶解物およびルシフェラーゼ反応基質を含む。
本発明の実施例に用いるＴａｋａｒａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ、Ｔａｋａｒａ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） ＩＩＴｌｉＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓは、すべてＴａｋａｒａから購入した。
薬理実験部分
実施例１ ダンシェンスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性測定
１、薬物抑制活性試験：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
実施例１ ダンシェンスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性測定
１、薬物抑制活性試験：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
２）薬剤前孵化：総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で薬物を希釈する。薬物の初期濃度を５０μＭ（溶媒はＤＭＳＯ）に設定し、３倍比で薬物を希釈し、各濃度に３つのマルチウェルを設置し、合計９つの薬物勾配（５０、１６．７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７、０．０２３、０．００８μＭ）を設定する。溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を対照群として設置し、対照群は総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈し、薬物に同体積のジメチルスルホキシドを与える。細胞上清除去後１）の４８ウェルプレート中の実験群は各ウェルに１００μＬの希釈後の薬物を添加し、対照群は１００μＬの希釈後のＤＭＳＯを添加し、３７℃で１ｈインキュベートする。
３）ウイルス感染：４８ウェルプレートに１ウェルあたり５μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス希釈液（感染多重ＭＯＩ＝０．０５）を加え、３７℃で１ｈインキュベートする。感染上清を十分に除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄する。２００μＬの対応する薬物含有培地をウェルに添加し、培養を２４ｈ継続し、１５０μＬの細胞培養上清を採取して試験に備える。ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてウイルスコピー数を測定する。
４）ウイルスＲＮＡ抽出の具体的な操作方法はＴａｋａｒａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ９７６６）を参照する。
ａ． ウイルス溶解：１５０μＬの細胞培養上清に５０μＬのＰＢＳ（ＰＨ７．４）溶液を加えて２００μＬにする。２００μＬのＶＧＢ緩衝液、２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、および１．０μＬのＣａｒｒｉｅｒ ＲＮＡを加え、十分に混合し、５６℃の水浴で１０分間完全に溶解する。溶解液に無水エタノール２００μＬを加え、十分に吸引混合する。
ｂ． カラム通過：Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置き、溶液をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｃ． 洗浄１：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬのＲＷＡ緩衝液を加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｄ． 洗浄２：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに７００μＬのＲＷＢ緩衝液を加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。（ＲＷＢ緩衝液に指定体積の１００％エタノールを添加する）。ＲＷＢ緩衝液をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ管壁のまわり加える。
ｅ． 手順ｄを繰り返す。
ｆ． Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置き、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
ｇ． 溶出：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ ｍＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅに置き、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ膜の中央に３０ μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏを加え、室温で５分間静置する。１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＲＮＡを溶出する。
５）ウイルスＲＮＡ逆転写の具体的な操作方法はＴａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０４７Ａ）を参照する。
ａ． 溶出液中の （＠）ゲノムＤＮＡの除去：以下のように氷上で反応系を調製する。
試料を４２℃で２分間反応させる。
ｂ． 逆転写反応：
試料を３７℃で１５分間インキュベートし、次いで８５℃で５秒間加熱する。
６）ｑＰＣＲによるウイルスコピー数の検出：Ｔａｋａｒａ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） ＩＩ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ，Ｃｏｄｅ，Ｎｏ． ＲＲ８２０Ａ）を参照（検量線法：既知コピー数のＲＢＤプラスミドを標準品とし、特異的プライマーでＲＢＤを標的とする）。氷上に反応系を以下のように調製する。
プライマー配列は以下の通りである。
ＲＢＤ上流プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
検査：ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置
予備変性：９５℃、３０秒、１サイクル；ＰＣＲ増幅：９５℃、５秒、４０サイクル；焼きなまし：６０℃、３０～３４秒、記録する。
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
検査：ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置
予備変性：９５℃、３０秒、１サイクル；ＰＣＲ増幅：９５℃、５秒、４０サイクル；焼きなまし：６０℃、３０～３４秒、記録する。
２、結果：図１に示す。
検量線から、試料当たりのコピー数を算出する。ＤＭＳＯ群のコピー数を基準として薬物処置群の抑制率を計算する。そして、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてダンシェンス（ＤＳＳ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性に作用する半数有効濃度ＥＣ５０が１．０７μＭであると計算する。
実施例２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 偽ウイルス侵入に対するサタンシンの抑制活性測定
１、方法：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクションの前半ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に添加し、均質に混合し、室温で１０分間インキュベートし、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に均一に添加する。３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
１、方法：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクションの前半ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に添加し、均質に混合し、室温で１０分間インキュベートし、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に均一に添加する。３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
２）偽ウイルス抑制実験：
対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０＾４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０＾４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
薬物の初期濃度を４０μＭに設定し、総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、それぞれ４０、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６２５μＭの９つの濃度勾配に２倍比で希釈する。各ウェル体積を６０μＬにし、各濃度に３つのマルチウェルを設け、ＤＭＳＯ溶媒対照群を設置する。６０μＬの偽ウイルス溶液を希釈した薬物に添加し、室温で３０分間作用させ、１００μＬ／ウェルをＡＣＥ２／２９３Ｔ細胞に添加し、３７℃で４８ｈインキュベートする。培地を除去し、細胞を１００μＬ／ウェルの無菌ＰＢＳ（ＰＨ７．４）で１回洗浄し、ウェルあたり１×細胞溶解液５０μＬを加え、室温で１５分間振盪溶解する。４０μＬ／ウェルの溶解上清を９６ウェル白色酵素プレートに移し、単一ルシフェラーゼ検出キットの説明書に従って等体積希釈後のルシフェラーゼ基質を加え、直ちにマイクロプレートリーダーで蛍光値を測定し、蛍光値の大きさによって、ダンシェンスがウイルスの吸着侵入を抑制する活性を判断する。蛍光値と薬物濃度との対応関係から抑制率を算出し、プロットし、ダンシェンスの半数抑制濃度ＩＣ５０を算出する。
２、結果：図２に示す。
２、結果：図２に示す。
ＤＭＳＯ溶媒群を対照として、薬物処置群の抑制率を蛍光値から算出する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてダンシェンス（ＤＳＳ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する半数抑制濃度ＩＣ５０は２．７０μＭであると計算する。
実施例３ ダンシェンスの細胞毒性検査
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、一晩培養する。
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、一晩培養する。
２）薬物濃度設計：
投与前に総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で９つの濃度勾配に２倍比で希釈し、薬物の初期濃度を２００μＭ（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１２５μＭ）に設定し、ウェルごとに希釈後の１００μＬの薬物をそれぞれ１）の９６ウェルプレートのＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に加え、各ウェルの最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
投与前に総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で９つの濃度勾配に２倍比で希釈し、薬物の初期濃度を２００μＭ（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１２５μＭ）に設定し、ウェルごとに希釈後の１００μＬの薬物をそれぞれ１）の９６ウェルプレートのＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に加え、各ウェルの最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
３）吸光度を測定する：
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
４）測定されたＯＤ値から、対照群と比較して、各濃度の薬物によるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞の生存率をそれぞれ算出する。
２、結果：図３、４に示すとおりである。
２、結果：図３、４に示すとおりである。
ダンシェンス（ＤＳＳ）は、２００μＭおよび有効濃度範囲において、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞（図３）、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞（図４）に対して明らかな毒性効果を示さない。
実施例４ サルビアノール酸ＢのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性測定
１、方法：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を４８ウェルプレートに接種し、３＊１０＾５細胞／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
１、方法：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を４８ウェルプレートに接種し、３＊１０＾５細胞／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
２）薬剤前孵化：総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で薬物を希釈する。サルビアノール酸Ｂの初期濃度を２００μＭ（溶媒はＤＭＳＯ）に設定し、３倍比で薬物を希釈し、各濃度薬物に３つのマルチウェルを設置し、合計７つの薬物勾配２００、６６．６７、２２．２２、７．４１、２．４７、０．８２、０．２７μＭ）を設定する。溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を対照群として設置し、対照群は総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈し、薬物に同体積のジメチルスルホキシドを与える。細胞上清除去後１）の４８ウェルプレート中の実験群は各ウェルに１００μＬの希釈後の薬物を添加し、対照群は１００μＬの希釈後のＤＭＳＯを添加し、３７℃で１ｈインキュベートする。
３）ウイルス感染：４８ウェルプレートに１ウェルあたり５μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス希釈液（感染多重ＭＯＩ＝０．０５）を加え、細胞を３７℃で１ｈインキュベートする。
４）液体交換：感染物上清を十分に除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄する。ウェルあたり２００μＬの対応する濃度の薬物含有培地を再び添加し、３７℃で２４ｈ培養し続けた後、１５０μＬの細胞培養上清を採取して試験に備える。ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて上清中のウイルスコピー数を測定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する薬物の生毒耐性を評価する。
５）ウイルスＲＮＡ抽出の具体的な操作方法はＴａｋａｒａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ９７６６）を参照する。
ａ）溶解：１５０μＬの細胞培養上清に５０μＬのＰＢＳ（ＰＨ７．４）溶液を加えて２００μＬにする。その後、２００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＶＧＢ、２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、および１．０μＬのＣａｒｒｉｅｒ ＲＮＡを加え、十分に混合し、５６℃の水浴で１０分間完全に溶解する。溶解液に無水エタノール２００μＬを加え、十分に吸引混合する。
ｂ）Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置き、溶液をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｃ）５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷＡをＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｄ）７００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷＢをＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＢには指定体積の１００％エタノールが添加されている）。Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＢをＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ管壁のまわりに加え、これは管壁に付着した塩分を完全に洗い流すのを助ける。
ｅ） 手順ｄを繰り返す。
ｆ） Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置きに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｇ）：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ ｍＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅに置き、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ膜の中央に３０ μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏを加え、室温で５分間静置する。１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＲＮＡを溶出する。
６）ウイルスＲＮＡ逆転写の具体的な操作方法はＴａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ，Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０４７Ａを参照する。
ａ）ゲノムＤＮＡ除 （＠）去反応：以下の成分で氷上に反応混合液を調製する。
試料を４２℃で ２分間反応させる。
ｂ）逆転写反応系：氷上調製
試料を３７℃で１５分間インキュベートし、次いで８５℃で５秒間加熱する。
７）ｑＰＣＲによるウイルスコピー数の検出：Ｔａｋａｒａ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） ＩＩ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ，Ｃｏｄｅ，Ｎｏ． ＲＲ８２０Ａ）を参照（検量線法：既知コピー数のＲＢＤプラスミドを標準品とし、特異的プライマーでＲＢＤを標的とする）。氷上に反応液を以下のように調製する。
プライマー配列は以下の通りである。
ＲＢＤ上流プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
２段階ＰＣＲ増幅標準プログラムに従い、ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置で検査を完了する。
Ｓｔａｇｅ １： 予備変性、Ｒｅｐｓ： １ サイクル、９５℃、 ３０ｓ；
Ｓｔａｇｅ２：ＰＣＲ反応、Ｒｅｐｓ：４０サイクル、９５℃、５ｓ；
焼きなまし：６０℃、３０～３４秒。
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
２段階ＰＣＲ増幅標準プログラムに従い、ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置で検査を完了する。
Ｓｔａｇｅ １： 予備変性、Ｒｅｐｓ： １ サイクル、９５℃、 ３０ｓ；
Ｓｔａｇｅ２：ＰＣＲ反応、Ｒｅｐｓ：４０サイクル、９５℃、５ｓ；
焼きなまし：６０℃、３０～３４秒。
２、結果：図５に示す。
検量線から、試料当たりのコピー数を算出する。ＤＭＳＯ群のコピー数を基準として薬物処置群の抑制率を計算する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、サルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性の半数有効濃度ＥＣ５０は５５．４７μＭであると計算する。
実施例５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス侵入に対するサルビアノール酸Ｂの抑制活性測定：
１、方法：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ）偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクション前の１ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に加え、かつ均一に混合し、室温で１５分間インキュベートし、均一にＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に添加し、３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
１、方法：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ）偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクション前の１ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に加え、かつ均一に混合し、室温で１５分間インキュベートし、均一にＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に添加し、３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
２）偽ウイルス抑制実験：
薬物と偽ウイルス作用：対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
薬物と偽ウイルス作用：対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
サルビアノール酸Ｂの初期濃度を２０μＭに設定し、総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で８つの濃度勾配（２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６２５μＭ）に２倍比で希釈し、ウェルあたりに６０μＬであり、各濃度は３つのマルチウェルであり、ＤＭＳＯ溶媒対照群を設置する。６０の偽ウイルス溶液を希釈した薬物に添加し、均一に混合して室温で３０分間作用させ、１００μＬ／ウェルをＡＣＥ２／２９３Ｔ細胞に添加し、３７℃で４８ｈインキュベートする。
測定：培地を除去し、細胞を２００μＬ／ウェルの無菌ＰＢＳ（ＰＨ７．４）で１回洗浄し、ウェルあたり１×細胞溶解物４０μＬを加え、室温で１５分間振盪溶解する。３０μＬ／ウェルの溶解上清を９６ウェル白色酵素プレートに移し、単一ルシフェラーゼ検出キットの説明書に従って等体積希釈後のルシフェラーゼ基質を加え、直ちにマイクロプレートリーダーで蛍光値を測定し、蛍光値の大きさによって、ダンシェンスがウイルスの吸着侵入を抑制する活性を判断する。蛍光値と薬物濃度との対応関係から抑制率を算出し、プロットし、サルビアノール酸Ｂの半数抑制濃度ＩＣ５０を算出する。
２、結果：図６に示す。
２、結果：図６に示す。
ＤＭＳＯ溶媒群を対照として、薬物処置群の抑制率を蛍光値から算出する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてサルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する半数抑制濃度ＩＣ５０は０．４１６μＭであると計算する。
実施例６：サルビアノール酸Ｂが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲ１Ｐ、ＨＲ２Ｐによるヘキサヘリックス（６－ＨＢ）：α－へリックスコンホメーションの形成を抑制する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染過程において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質Ｓ２イリデンのＨＲ１、ＨＲ２は自発的に重合してα－螺旋構造を持つヘキサヘリックス（６－ＨＢ）構造を形成し、それによってウイルスと標的細胞の膜融合を促進し、さらにウイルスが細胞への侵入を促進する。６－ＨＢコア領域に位置するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲ１Ｐ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲ２Ｐポリペプチドをインビトロで合成し、サルビアノール酸Ｂが６－ＨＢに作用するかどうかを観察する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲ１Ｐアミノ酸配列は以下の通りである：ＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＲ２Ｐアミノ酸配列は以下の通りである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＲ２Ｐアミノ酸配列は以下の通りである。
ＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
円形ダイクロイズム（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ、ＣＤ）は非対称分子の左、右円偏光に対する吸光度の違いを利用してタンパク質の二次構造（α－ヘリックス、β－折り畳みまたはランダムコイル）を分析し、α－ヘリックスのＣＤスペクトル値は２０８ｎｍと２２２ｎｍに２つの負のピークがあり、１００％のα－ヘリックスはＣＤスペクトルの２２２ｎｍで－３３０００の吸収ピークを示すので、１つのタンパク質分子中のα－へリックス構造の占有率はＸα ＝（－［θ］２２２）／－３３０００で計算することができる。
円形ダイクロイズム（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ、ＣＤ）は非対称分子の左、右円偏光に対する吸光度の違いを利用してタンパク質の二次構造（α－ヘリックス、β－折り畳みまたはランダムコイル）を分析し、α－ヘリックスのＣＤスペクトル値は２０８ｎｍと２２２ｎｍに２つの負のピークがあり、１００％のα－ヘリックスはＣＤスペクトルの２２２ｎｍで－３３０００の吸収ピークを示すので、１つのタンパク質分子中のα－へリックス構造の占有率はＸα ＝（－［θ］２２２）／－３３０００で計算することができる。
１、方法：
１）試料準備：
ＨＲ１ＰおよびＨＲ２Ｐポリペプチドは、５０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液を用いて１０μＭ作動液として調製する。
１）試料準備：
ＨＲ１ＰおよびＨＲ２Ｐポリペプチドは、５０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液を用いて１０μＭ作動液として調製する。
システム構成：０．１５μＬの標準濃度５ ｍＭサルビアノール酸Ｂに１５０μＬのＨＲ１Ｐ（１０μＭ）を加え、均一に混合し、対照群は１５０μＬのＨＲ１Ｐ（１０μＭ）と０．１５μＬのＤＭＳＯと混合し、室温で３０分間作用させ、１５０μＬのＨＲ２Ｐ（１０μＭ）を加え、室温で継続して３０分間インキュベートする。
２）円二分光計のパラメータ設定（静的スペクトル）：
検査温度： ４ ℃、走査波長範囲： １９０～２６０ ｎｍ、帯域幅： ２ｎｍ、ステップ： １ｎｍ、時間／ドット： ０．５秒。
検査温度： ４ ℃、走査波長範囲： １９０～２６０ ｎｍ、帯域幅： ２ｎｍ、ステップ： １ｎｍ、時間／ドット： ０．５秒。
３）試料検査：
試料を１ｍｍ光路キュベットに添加し、ＣＤ波長スキャンを実施し、ＣＤシグナル［θ］値を保存し、ＣＤ曲線を作成し、［θ］２２２値からα－ヘリックス百分率を計算する。
試料を１ｍｍ光路キュベットに添加し、ＣＤ波長スキャンを実施し、ＣＤシグナル［θ］値を保存し、ＣＤ曲線を作成し、［θ］２２２値からα－ヘリックス百分率を計算する。
２、結果：図７に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲ１Ｐは、ＨＲ２Ｐと結合してα－ヘリックスを形成し、そのＣＤスペクトル値（縦座標）は、２０８ｎｍおよび２２２ｎｍに２つの負のピークを有する。１０μＭのＨＲ１ＰとＨＲ２Ｐは結合し、α－ヘリックスのパーセンテージは６０．６７％であり、５μＭのサルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）の投与後、ＨＲ１Ｐ、ＨＲ２Ｐは結合し、α－ヘリックスの百分率は２２．２４％に低下する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲ１Ｐは、ＨＲ２Ｐと結合してα－ヘリックスを形成し、そのＣＤスペクトル値（縦座標）は、２０８ｎｍおよび２２２ｎｍに２つの負のピークを有する。１０μＭのＨＲ１ＰとＨＲ２Ｐは結合し、α－ヘリックスのパーセンテージは６０．６７％であり、５μＭのサルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）の投与後、ＨＲ１Ｐ、ＨＲ２Ｐは結合し、α－ヘリックスの百分率は２２．２４％に低下する。
実施例７ サルビアノール酸Ｂの細胞毒性測定
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、細胞培養インキュベーター中において３７℃で一晩培養する。
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、細胞培養インキュベーター中において３７℃で一晩培養する。
２）薬物濃度設計：
総体積の２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で投与前に、２倍比で８つの濃度勾配に希釈する。
総体積の２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で投与前に、２倍比で８つの濃度勾配に希釈する。
Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞：初期濃度を２００μＭ（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５μＭ）に設定し、ウェルごとに希釈した１００μＬの薬剤を１）の９６ウェルプレート中のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に加え、ウェルあたり最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞：初期濃度を１００μＭ（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１２５μＭ）に設定し、ウェルごとに希釈した薬物１００μＬを１）の９６ウェルプレート中の、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に加え、ウェルあたり最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
３）吸光度を測定する：
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
４）測定されたＯＤ値から、対照群と比較して、各濃度の薬物によるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞の生存率をそれぞれ算出する。
２、結果：図８、９に示すとおりである。
サルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）は、２００μＭおよび有効濃度範囲において、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に対して明らかな毒性効果を示さない（図８）。サルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）は、１００μＭおよび有効濃度範囲で２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に対して明らかな毒性効果を有しない（図９）。
サルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）は、２００μＭおよび有効濃度範囲において、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に対して明らかな毒性効果を示さない（図８）。サルビアノール酸Ｂ（Ｓａｌ－Ｂ）は、１００μＭおよび有効濃度範囲で２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に対して明らかな毒性効果を有しない（図９）。
実施例８ サルビアノール酸ＣのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性測定
１． 薬物によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抑制の活性測定
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を４８ウェルプレートに接種し、３＊１０＾５細胞／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
１． 薬物によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抑制の活性測定
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を４８ウェルプレートに接種し、３＊１０＾５細胞／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
２）薬剤前孵化：総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で薬物を希釈する。薬物の初期濃度を５０μＭ（溶媒はＤＭＳＯ）に設定し、３倍比で薬物を希釈し、各濃度に３つのマルチウェルを設置し、合計９つの薬物勾配（それぞれ５０、１６．７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７、０．０２３、０．００８μＭ）を設定する。溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を対照群として設置し、対照群は総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈し、薬物に同体積のジメチルスルホキシドを与える。細胞上清除去後１）の４８ウェルプレート中の実験群は各ウェルに１００μＬの希釈後の薬物を添加し、対照群は１００μＬの希釈後のＤＭＳＯを添加し、３７℃で１ｈインキュベートする。
３）ウイルス感染：４８ウェルプレートに１ウェルあたり５μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス希釈液（感染多重ＭＯＩ＝０．０５）を加え、細胞を３７℃で１ｈインキュベートする。
４）液体交換：感染物上清を十分に除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄する。２００μＬの対応する薬物含有培地をウェルに添加し、培養を２４ｈ継続し、１５０μＬの細胞培養上清を採取して試験に備える。ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてウイルスコピー数を測定する。
５）ウイルスＲＮＡ抽出の具体的な操作方法はＴａｋａｒａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ９７６６）を（参照する。
ａ）溶解：１５０μＬの細胞培養上清に５０μＬのＰＢＳ（ＰＨ７．４）溶液を加えて２００μＬにする。その後、２００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＶＧＢ、２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、および１．０μＬのＣａｒｒｉｅｒ ＲＮＡを加え、十分に混合し、５６℃の水浴で１０分間完全に溶解する。溶解液に無水エタノール２００μＬを加え、十分に吸引混合する。
ｂ）Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置き、溶液をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｃ）５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷＡをＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに添加し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｄ）７００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷＢをＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＢには指定体積の１００％エタノールが添加されている）。Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＢをＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ管壁のまわりに加え、これは管壁に付着した塩分を完全に洗い流すのを助ける。
ｅ） 手順ｄを繰り返す。
ｆ） Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置きに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｇ）：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ ｍＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅに置き、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ膜の中央に３０ μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏを加え、室温で５分間静置する。１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＲＮＡを溶出する。
６）ウイルスＲＮＡ逆転写の具体的な操作方法（Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ ＥｒａｓｅｒＣｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０４７Ａを参照）。
ａ）ゲノムＤＮＡ除去反応：以下の成分で氷上に反応混合液を調製する。
反応プログラム：４２℃、２分。
ｂ）逆転写反応系：氷上調製
反応プログラム：３７℃、１５分；８５℃、５秒。
７）ｑＰＣＲによるウイルスコピー数の検出：Ｔａｋａｒａ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） ＩＩ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ，Ｃｏｄｅ，Ｎｏ． ＲＲ８２０Ａ）を参照（検量線法：既知コピー数のＲＢＤプラスミドを標準品とし、特異的プライマーでＲＢＤを標的とする）。氷上に反応液を以下のように調製する。
プライマー配列は以下の通りである。
ＲＢＤ上流プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置で検出を完了：
Ｓｔａｇｅ １： 予備変性、Ｒｅｐｓ： １ サイクル、９５℃、 ３０ｓ；
Ｓｔａｇｅ２：ＰＣＲ反応、Ｒｅｐｓ：４０サイクル、９５℃、５ｓ；
焼きなまし：６０℃、３０～３４秒。
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置で検出を完了：
Ｓｔａｇｅ １： 予備変性、Ｒｅｐｓ： １ サイクル、９５℃、 ３０ｓ；
Ｓｔａｇｅ２：ＰＣＲ反応、Ｒｅｐｓ：４０サイクル、９５℃、５ｓ；
焼きなまし：６０℃、３０～３４秒。
２、結果：図１０に示す。
検量線から、試料当たりのコピー数を算出する。ＤＭＳＯ群のコピー数を基準として薬物処置群の抑制率を計算する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、サルチル酸Ｃ（Ｓａｌ－Ｃ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に作用する半数有効濃度ＥＣ５０は３．４１μＭであると計算する。
実施例９ サルビアノール酸ＣのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 偽ウイルス侵入に対する抑制活性測定
１、方法：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクション前の１ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に加え、かつ均一に混合し、室温で１５分間インキュベートし、均一にＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に添加し、３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
１、方法：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクション前の１ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に加え、かつ均一に混合し、室温で１５分間インキュベートし、均一にＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に添加し、３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
２）偽ウイルス抑制実験：
対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０＾４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０＾４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
薬物の初期濃度を２０μＭに設定し、総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で９つの濃度勾配（２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６２５、０．０７８１３μＭ）に２倍比で希釈し、ウェルあたりに６０μＬであり、各濃度は３つのマルチウェルであり、ＤＭＳＯ溶媒対照群を設置する。６０の偽ウイルス溶液を希釈した薬物に添加し、均一に混合して室温で３０分間作用させ、１００μＬ／ウェルをＡＣＥ２／２９３Ｔ細胞に添加し、３７℃で４８ｈインキュベートする。培地を除去し、細胞を１００μＬ／ウェルの無菌ＰＢＳ（ＰＨ７．４）で１回洗浄し、ウェルあたり１×細胞溶解液５０μＬを加え、室温で１５分間振盪溶解する。４０μＬ／ウェルの溶解上清を９６ウェル白色酵素プレートに移し、単一ルシフェラーゼ検出キットの説明書に従って等体積希釈後のルシフェラーゼ基質を加え、直ちにマイクロプレートリーダーで蛍光値を測定し、蛍光値の大きさによって、ダンシェンスがウイルスの吸着侵入を抑制する活性を判断する。蛍光値と薬物濃度との対応関係から抑制率を算出し、薬物の半抑制濃度ＩＣ５０をプロットして算出する。
２、結果：図１１に示す。
ＤＭＳＯ溶媒群を対照として、薬物処置群の抑制率を蛍光値から算出する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率によって、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてサルビアノール酸Ｃ（Ｓａｌ－Ｃ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する半数抑制濃度ＩＣ５０は５．９０μＭであると計算する。
ＤＭＳＯ溶媒群を対照として、薬物処置群の抑制率を蛍光値から算出する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率によって、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてサルビアノール酸Ｃ（Ｓａｌ－Ｃ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する半数抑制濃度ＩＣ５０は５．９０μＭであると計算する。
実施例１０ サルビアノール酸Ｃの細胞毒性測定
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、一晩培養する。
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、一晩培養する。
２）薬物濃度設計：
投与前に総体積の２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で、９つの濃度勾配に２倍比で希釈し、初期濃度を２００μＭ（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１２５μＭ）に設定し、ウェルごとに希釈した１００μＬの薬剤を１）の９６ウェルプレート中のＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に加え、ウェルあたり最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
投与前に総体積の２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で、９つの濃度勾配に２倍比で希釈し、初期濃度を２００μＭ（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１２５μＭ）に設定し、ウェルごとに希釈した１００μＬの薬剤を１）の９６ウェルプレート中のＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に加え、ウェルあたり最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
３）吸光度を測定する：
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
４）測定されたＯＤ値から、対照群と比較して、各濃度の薬物によるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞の生存率をそれぞれ算出する。
２、結果：図１２、１３に示すとおりである。
サルビアノール酸Ｃ（Ｓａｌ－Ｃ）は、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞（図１２）、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞（図１３）に対して、２００μＭおよび有効濃度範囲において明らかな毒性効果を有しない。
実施例１１：ジヒドロタンシノンＩによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のインビトロ抑制活性測定。
１、薬物抑制活性試験：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
２）薬剤前孵化：総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で薬物を希釈する。薬物の初期濃度を１０μＭ（溶媒はＤＭＳＯ）に設定し、３倍比で薬物を希釈し、各濃度に３つのマルチウェルを設置し、合計６つの薬物勾配（１０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１２、０．０４μＭ）を設定する。溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を対照群として設置し、対照群は総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈し、薬物に同体積のジメチルスルホキシドを与える。細胞上清除去後１）の４８ウェルプレート中の実験群は各ウェルに１００μＬの希釈後の薬物を添加し、対照群は１００μＬの希釈後のＤＭＳＯを添加し、３７℃で１ｈインキュベートする。
３）ウイルス感染：４８ウェルプレートに１ウェルあたり５μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス希釈液（感染多重ＭＯＩ＝０．０５）を加え、３７℃で１ｈインキュベートする。感染上清を十分に除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄する。２００μＬの対応する薬物含有培地をウェルに添加し、培養を２４ｈ継続し、１５０μＬの細胞培養上清を採取して試験に備える。ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてウイルスコピー数を測定する。
４）ウイルスＲＮＡ抽出の具体的な操作方法はＴａｋａｒａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ９７６６）を参照する。
ａ． ウイルス溶解：１５０μＬの細胞培養上清に５０μＬのＰＢＳ（ＰＨ７．４）溶液を加えて２００μＬにする。２００μＬのＶＧＢ緩衝液、２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、および１．０μＬのＣａｒｒｉｅｒ ＲＮＡを加え、十分に混合し、５６℃の水浴で１０分間完全に溶解する。溶解液に無水エタノール２００μＬを加え、十分に吸引混合する。
ｂ． カラム通過：Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置き、溶液をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｃ． 洗浄１：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬのＲＷＡ緩衝液を加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。
ｄ． 洗浄２：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに７００μＬのＲＷＢ緩衝液を加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を廃棄する。（ＲＷＢ緩衝液に指定体積の１００％エタノールを添加する）。ＲＷＢ緩衝液をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ管壁のまわり加える。
ｅ． 手順ｄを繰り返す。
ｆ． Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ上に置き、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
ｇ． 溶出：Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ ｍＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅに置き、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ膜の中央に３０ μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏを加え、室温で５分間静置する。１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＲＮＡを溶出する。
５）ウイルスＲＮＡ逆転写の具体的な操作方法はＴａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０４７Ａ）を参照する。
ａ． 溶出液中のゲノムＤＮＡの除去：以下のように氷上で反応系を調製する。
試料を４２℃で２分間反応させる。
ｂ． 逆転写反応：
試料を３７℃で１５分間インキュベートし、次いで８５℃で５秒間加熱する。
６）ｑＰＣＲによるウイルスコピー数の検出：Ｔａｋａｒａ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） ＩＩ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ，Ｃｏｄｅ，Ｎｏ． ＲＲ８２０Ａ）を参照（検量線法：既知コピー数のＲＢＤプラスミドを標準品とし、特異的プライマーでＲＢＤを標的とする）。氷上に反応系を以下のように調製する。
プライマー配列は以下の通りである。
ＲＢＤ上流プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧ
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ
検査：ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置
予備変性：９５℃、３０秒、１サイクル；ＰＣＲ増幅：９５℃、５秒、４０サイクル；焼きなまし：６０℃、３０～３４秒、記録する。
ＲＢＤ下流プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ
検査：ＡＢＩ７５００定量ＰＣＲ装置
予備変性：９５℃、３０秒、１サイクル；ＰＣＲ増幅：９５℃、５秒、４０サイクル；焼きなまし：６０℃、３０～３４秒、記録する。
２、結果：図１４に示す。
検量線から、試料当たりのコピー数を算出する。ＤＭＳＯ群のコピー数を基準として薬物処置群の抑制率を計算する。そして、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてジヒドロタンシノンＩ（ＤＨＴ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性に作用する半数有効濃度ＥＣ５０が０．６４μＭであると計算する。
実施例１２ タンシノンＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性測定
１、薬物抑制活性実験方法：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
１、薬物抑制活性実験方法：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
２）薬剤前孵化：総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で薬物を希釈する。薬物の初期濃度を１００μＭ（溶媒はＤＭＳＯ）に設定し、３倍比で薬物を希釈し、各濃度に３つのマルチウェルを設置し、合計６つの薬物勾配（１００、３３．３３、１１．１１、３．７０、１．２３、０．４１μＭ）を設定する。溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を対照群として設置し、対照群は総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈し、薬物に同体積のジメチルスルホキシドを与える。細胞上清除去後１）の４８ウェルプレート中の実験群は各ウェルに１００μＬの希釈後の薬物を添加し、対照群は１００μＬの希釈後のＤＭＳＯを添加し、３７℃で１ｈインキュベートする。
３）、４）、５）、６）、７）は実施例１１と同じである。
２、結果：図１５に示す。
検量線から、試料当たりのコピー数を算出する。ＤＭＳＯ群のコピー数を基準として薬物処置群の抑制率を計算する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてタンシノンＡ（Ｔ－Ａ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性に作用する半数有効濃度ＥＣ５０が２．９８μＭであると計算する。
実施例１３ ダンシェンスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性測定。
１、薬物抑制活性実験方法：
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
１）対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞、３＊１０＾５個細胞／ウェルを４８ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
２）薬剤前孵化：総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で薬物を希釈する。薬物の初期濃度を１００μＭ（溶媒はＤＭＳＯ）に設定し、３倍比で薬物を希釈し、各濃度に３つのマルチウェルを設置し、合計６つの薬物勾配（１００、３３．３３、１１．１１、３．７０、１．２３、０．４１μＭ）を設定する。溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を対照群として設置し、対照群は総体積２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈し、薬物に同体積のジメチルスルホキシドを与える。細胞上清除去後１）の４８ウェルプレート中の実験群は各ウェルに１００μＬの希釈後の薬物を添加し、対照群は１００μＬの希釈後のＤＭＳＯを添加し、３７℃で１ｈインキュベートする。
３）、４）、５）、６）、７）は実施例１１と同じである。
２、結果：図１６に示す。
検量線から、試料当たりのコピー数を算出する。ＤＭＳＯ群のコピー数を基準として薬物処置群の抑制率を計算する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてクリプトタンシノン（Ｃｒｙ－Ｔ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性に作用する半数有効濃度ＥＣ５０が１．４６μＭであると計算する。
実施例１４ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 偽ウイルス侵入に対するジヒドロタンシノンＩの抑制活性測定。
１、方法：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期の２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクション前の０．５ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に添加し、均質に混合し、室温で１０分間インキュベートし、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に均一に添加する。３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスパッケージ：
対数増殖期の２９３Ｔ細胞４＊１０＾５個／ｍＬ、２ ｍＬ／ウェルを６ウェルプレートに均一に接種する。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で２４ｈ間インキュベートする。トランスフェクション前の０．５ｈに新鮮な培地を交換し、それぞれ１００μＬの空白ＤＭＥＭ培地を用いてプラスミド希釈液及びトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＪｅｔ）希釈液を調製し、各ウェルの配合割合は以下の通りである（プラスミドＤＮＡはエンドトキシン除去抽出キットを用いて抽出する必要がある）：
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－ １０００ ｎｇ
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ ５００ ｎｇ
ＰｏｌｙＪｅｔ ６ μＬ
具体的な調合方法は以下のとおりである：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－プラスミドとｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｉｐｋｅプラスミドを同時に１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地に加え、ＰｏｌｙＪｅｔは１００ μＬのブランクＤＭＥＭ培地で希釈して均一に混合する。ＰｏｌｙＪｅｔ希釈液をプラスミド希釈液に添加し、均質に混合し、室温で１０分間インキュベートし、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に均一に添加する。３７℃で４８ｈ培養した後、上清ウイルス液を収集し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５μｍ無菌フィルターで濾過し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを得る。
２）偽ウイルス抑制実験：
対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０＾４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
対数増殖期にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体ＡＣＥ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）を採取し、１＊１０＾４個／ウェルで９６ウェル細胞プレートに均等に敷く。細胞培養インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養する。
ジヒドロタンシノンＩの初期濃度を２．５μＭに設定し、総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、それぞれ２．５０、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、０．０７８、０．０３９、０．０２０μＭの８つの濃度勾配に２倍比で希釈する。各ウェル体積を６０μＬにし、各濃度に３つのマルチウェルを設け、ＤＭＳＯ溶媒対照群を設置する。６０μＬの偽ウイルス液を希釈した薬物に添加し、均一に混合して室温で３０分間作用させ、１００μＬ／ウェルを２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に添加し、３７℃で４８ｈインキュベートする。培地を除去し、細胞を１００μＬ／ウェルの無菌ＰＢＳ（ＰＨ７．４）で１回洗浄し、ウェルあたり１×細胞溶解液５０μＬを加え、室温で１５分間振盪溶解する。４０μＬ／ウェルの溶解上清を９６ウェル白色酵素プレートに移し、単一ルシフェラーゼ検出キットの説明書に従って等体積希釈後のルシフェラーゼ基質を加え、直ちにマイクロプレートリーダーで蛍光値を測定し、蛍光値の大きさによって、ジヒドロタンシノンＩがウイルスの吸着侵入を抑制する活性を判断する。蛍光値と薬物濃度との対応関係から抑制率を算出し、プロットし、ジヒドロタンシノンＩの半数抑制濃度ＩＣ５０を算出する。
２、結果：図１７に示す。
ＤＭＳＯ溶媒群を対照として、薬物処置群の抑制率を蛍光値から算出する。また、異なる濃度の薬物処置群の抑制率に基づき、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを用いて、薬物抑制率曲線を近似し、そしてジヒドロタンシノンＩ（ＤＨＴ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する半数抑制濃度ＩＣ５０は０．６８μＭであると計算する。
実施例１５ ジヒドロタンシノンＩ、タンシノンＡ、クリプトタンシノンの細胞毒性測定
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、一晩培養する。
１、方法：
１） 細胞接種：
対数増殖期にあるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を、細胞密度を１＊１０＾４個／ウェルに調整し、それぞれ１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、一晩培養する。
２）薬物濃度設計：
Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞：投与前に総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、８つの濃度勾配に３倍比で希釈し、ジヒドロタンシノンＩの初期濃度を５０μＭ（５０、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７、０．０２μＭ）に設定し、タンシノンＡの初期濃度を１００μＭ（１００、５０、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７μＭ）に設定し、クリプトタンシノンの初期濃度を１００μＭ（１００、５０、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７μＭ）に設定し、ウェルあたり１００μＬの希釈された薬物を、１）の９６ウェルプレート中のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に加え、ウェルあたり最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞：投与前に総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、８つの濃度勾配に３倍比で希釈し、ジヒドロタンシノンＩの初期濃度を５０μＭ（５０、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７、０．０２μＭ）に設定し、タンシノンＡの初期濃度を１００μＭ（１００、５０、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７μＭ）に設定し、クリプトタンシノンの初期濃度を１００μＭ（１００、５０、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０７μＭ）に設定し、ウェルあたり１００μＬの希釈された薬物を、１）の９６ウェルプレート中のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に加え、ウェルあたり最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞：投与前に総体積２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、８つの濃度勾配に２倍比で希釈し、ジヒドロタンシノンＩの初期濃度は１０μＭ（１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、０．０８μＭ）に設定する。ウェルごとに１００μＬの希釈された薬物を、１）の９６ウェルプレート中の２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に加え、ウェルあたり最終体積は２００μＬである。薬物濃度あたり３つのマルチウェルを設置する。ＤＭＳＯ溶媒処置群をブランク対照とする。
３）吸光度を測定する：
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
インキュベーター中で４８ｈインキュベーションした後、１０μＬのＣＣＫ－８作動溶液をウェルあたりに添加し、継続してインキュベーターで３ｈインキュベートする。マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
４）測定されたＯＤ値から、対照群と比較して、各濃度の薬物によるＶｅｒｏ－Ｅ６、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞の生存率をそれぞれ算出する。
２、結果：
図１８に示すように、ジヒドロタンシノンＩ（ＤＨＴ）は、有効濃度範囲１０μＭにおいて、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に対して明らかな毒性効果を示さない。
図１８に示すように、ジヒドロタンシノンＩ（ＤＨＴ）は、有効濃度範囲１０μＭにおいて、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に対して明らかな毒性効果を示さない。
図１９に示すように、ジヒドロタンシノンＩ（ＤＨＴ）は、２．５μＭ有効濃度範囲で２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に明らかな毒性効果を示さない。
図２０に示すように、タンシノンＡ（Ｔ－Ａ）は、有効濃度範囲１００μＭにおいて、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に対して明らかな毒性効果を有さない。
図２１に示すように、クリプトダノン（Ｃｒｙ－Ｔ）は、１００μＭ有効濃度範囲において、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に対して明らかな毒性効果を示さない。
上記は、本発明の特定の実施形態にすぎず、全ての実施形態ではなく、当業者が本発明の説明を読むことによって本発明の技術的解決手段に対してとる均等な変形は、本発明の特許請求の範囲によって包含される。
Claims (22)
- タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、抗ウイルス薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体であることを特徴とする、使用。
- タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体であることを特徴とする、使用。
- 前記ジヒドロタンシノンＩ類似体はタンシノンＡまたはクリプトダシノンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
- 前記タンジン活性成分がサルビアノール酸Ｂである場合、前記ウイルスはＨＩＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
- 前記タンジン活性成分がダンシェンス、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロサルタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスはコロナウイルスであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
- 前記タンジン活性成分がジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスはＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
- 前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
- タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、ウイルスＳタンパク質媒介性ウイルス－細胞融合を抑制する薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はサルビアノール酸Ｂであることを特徴とする、使用。
- タンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩の、、ウイルスＳタンパク質Ｓ２イリデンの融合領域ＨＲ１、ＨＲ２がヘキサヘリックス構造を形成するのを抑制する薬物の製造における使用であって、前記タンジン活性成分はサルビアノール酸Ｂであることを特徴とする、使用。
- 抗ウイルス医薬組成物であって、活性成分としてのタンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩を含み、前記タンジン活性成分はダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体であることを特徴とする抗ウイルス医薬組成物。
- ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する医薬組成物であって、活性成分としてのタンジン活性成分またはその医薬的に許容される塩を含み、前記タンジン活性成分は、ダンシェンス、サルビアノール酸Ｂ、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロサルタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体であることを特徴とする、ウイルスの標的細胞への侵入を抑制する医薬組成物。
- 前記タンジン活性成分がサルビアノール酸Ｂである場合、前記ウイルスはＨＩＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
- 前記タンジン活性成分がダンシェンス、サルビアノール酸Ｃ、ジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスはコロナウイルスであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
- 前記タンジン活性成分がジヒドロタンシノンＩまたはジヒドロタンシノンＩ類似体である場合、前記ウイルスはＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶであることを特徴とする請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であることを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
- 注射製剤または経口製剤であることを特徴とする請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
- 処方製剤注射剤、処方製剤錠剤、処方製剤カプセル剤、処方製剤丸剤または処方製剤ドロップ剤であることを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。
- 活性成分としてのサルビアノール酸Ｂまたはその医薬的に許容される塩を含むことを特徴とする、ウイルスＳタンパク質媒介性ウイルス－細胞融合を抑制する医薬組成物。
- 活性成分としてのサルビアノール酸Ｂ又はその医薬的に許容される塩を含むことを特徴とする、ウイルスＳタンパク質Ｓ２イリデン融合領域ＨＲ１、ＨＲ２がヘキサヘリックス構造を形成するのを抑制する医薬組成物。
- 前記ウイルスはＨＩＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶであることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
- 注射製剤または経口製剤であることを特徴とする請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
- 処方製剤注射剤、処方製剤錠剤、処方製剤カプセル剤、処方製剤丸剤または処方製剤ドロップ剤であることを特徴とする請求項２１に記載の医薬組成物。
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