CN114224896A

CN114224896A - 病毒感染症的预防和早期治疗用组合物

Info

Publication number: CN114224896A
Application number: CN202111648241.3A
Authority: CN
Inventors: 步志高; 王金良; 温志远; 钟功勋; 帅磊; 王翀
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-03-25

Abstract

本发明提供对病毒感染症的预防或者早期治疗有效的组合物，所述组合物含有地尔硫卓(diltiazem)及其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物等衍生物。其中病毒感染症所感染的病毒是指对钙离子通道抑制剂敏感的病毒，这类病毒包括但不限于HIV病毒、AIDS病毒、肠道病毒、流感病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、腺病毒、疱疹病毒如带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒、冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(简称SARS病毒)如SARS‑COV 1；SARS‑COV 2病毒；MERS‑CoV病毒。

Description

病毒感染症的预防和早期治疗用组合物

技术领域

本发明涉及病毒感染的预防和早期治疗用药物组合物，具体涉及钙离子通道抑制剂在病毒感染的预防和早期治疗中的用途及治疗方法。

背景技术

世界卫生组织数据显示，截至2021年12月8日，COVID-19大流行已导致全球超过2.66亿例确诊病例，约520万人死亡。一种命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的新型冠状病毒是该疾病的病原。SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，是具有囊膜的单股正链RNA病毒。SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)负责与细胞受体结合，随后病毒进入宿主细胞。SARS-CoV-2 S蛋白由S1和S2结构域组成。S1包含与特定受体结合的受体结合域(RBD)。S2结构域上的融合肽，负责病毒囊膜与细胞膜的融合。血管紧张素转换酶2(angiotensin-convert enzyme 2,ACE2)是公认的SARS-CoV-2细胞受体。最近多篇研究发现还存在其他影响SARS-CoV-2感染的潜在受体和内化宿主分子[Hoffmann M,Kleine-Weber H,SchroederS,Kruger N,Herrler T,Erichsen S,et al.SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven ProteaseInhibitor.Cell.2020；181(2):271-80；Wang S,Qiu ZY,Hou YN,Deng XY,Xu W,Zheng TT,et al.AXL is a candidate receptor for SARS-CoV-2 that promotes infection ofpulmonary and bronchial epithelial cells.Cell Res.2021]。SARS-CoV-2与细胞表面受体结合后，通过受体介导的内吞途径或跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)介导的直接膜融合进入细胞。SARS-CoV-2变异体的不断出现以及接种人群中突破性感染病例的不断增加表明，急需一种能有效抑制新冠病毒感染的特效药。病毒入侵是感染的早期阶段，也是抗病毒药物研发针对的重要阶段。探究受体识别、细胞吸附和内化的潜在作用机制，对阻断病毒早期感染的抗病毒药物的研发至关重要。

钙离子和钙离子通道在多种病毒的感染中均发挥重要[Chen X,Cao R,ZhongW.Host Calcium Channels and Pumps in Viral Infections.Cells.2019；9(1).]，如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)[Lai AL,Millet JK,Daniel S,Freed JH,Whittaker GR.The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite FusionPlatform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.J MolBiol.2017；429(24):3875-92]和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)[Straus MR,TangT,Lai AL,Flegel A,Bidon M,Freed JH,et al.Ca(2+)Ions Promote Fusion of MiddleEast Respiratory Syndrome Coronavirus with Host Cells and IncreaseInfectivity.J Virol.2020；94(13)]。电压依赖性钙离子通道(VDCC)是经典的细胞膜钙离子通道[Berridge MJ,Bootman MD,Roderick HL.Calcium signalling:dynamics,homeostasis and remodelling.Nat Rev Mol Cell Biol.2003；4(7):517-29]。VDCCs分为三个不同的家族：(i)L型钙离子通道；(ii)P/Q型、N型和R型钙离子通道；(iii)T型钙离子通道。VDCC会影响多种病毒在细胞上的吸附和内化过程。例如，钙离子电压门控通道亚基α1S介导新世界沙粒病毒的结合和内化；L型钙离子通道抑制剂盐酸贝尼地平(benidipinehydrochloride)通过抑制病毒内化和减少病毒感染复制来抑制血小板减少综合征病毒(thrombocytopenia syndrome virus)感染。

地尔硫卓(diltiazem)，是一种L型钙离子通道Ca_v1.2成孔亚基(Ca_v1.2α_1c)的抑制剂，可抑制Ca_v1.2α_1c通道激活。我们的研究表明，Cav1.2α1c是抗病毒药物研发的又一靶点，尤其针对SARS样病毒在细胞上的吸附和内化并降低病毒感染。

发明内容

本发明以提供对病毒感染症的预防或者早期治疗有效的组合物为目的。

本发明涉及以下(1)-(10)项的具体目标。

(1)病毒感染症的预防或者早期治疗用组合物，所述组合物含有地尔硫卓(diltiazem)及其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物等衍生物。

(2)、在上述(1)所述的组合物中，进一步含有一种或多种第二治疗剂，所述第二治疗剂优选是另一种抗病毒药物，该所述抗病毒药物是化学药物、抗体类药物、蛋白类药物、或灭活病毒类药物等生物药物。

(3)、在上述(1)-(2)任一项中记载的组合物，其中病毒感染症所感染的病毒是指对钙离子通道抑制剂敏感的病毒，这类病毒包括但不限于HIV病毒、AIDS病毒、肠道病毒、流感病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、腺病毒、疱疹病毒如带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒、冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(简称SARS病毒)如SARS-COV 1；SARS-COV 2病毒；MERS-CoV病毒。

(4)、在上述(1)-(3)任一项中记载的组合物，该组合物是医药类产品。

(5)、在上述(1)-(4)任一项中记载的组合物，其中，该医药类产品是口服剂、注射剂、局部施用剂、鼻气雾剂或者吸入制剂。

(6)、在上述(1)-(5)任一项中记载的组合物，该组合物与需要抑制或阻滞的非人的哺乳动物的兽医疗法联用，特别是病毒感染，这类病毒包括但不限于慢病毒感染、如马传染性贫血病毒、山羊关节炎病毒、绵羊髓鞘脱落病毒或绵羊慢性进行性肺炎病毒；或反转录病毒，如猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒或犬免疫缺陷病毒、或其他反转录病毒感染；非洲猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒、新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、口蹄疫病毒、塞内卡病毒、猪繁殖与呼吸系统障碍综合征病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒或伪狂犬病毒等。

(7)、在上述(1)-(6)任一项中记载的组合物，该组合物是食品、饲料、食品添加剂或饲料添加剂。

(8)、哺乳动物的属于对钙离子通道阻滞剂敏感的病毒的病毒感染症的预防或早期治疗方法，该方法以含有有效量的地尔硫卓(diltiazem)及其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物等衍生物的药物施用于所述感染的哺乳动物为特征。

(9)、在上述(8)中记载的预防或治疗方法，其中所述病毒是指HIV病毒、AIDS病毒、肠道病毒、流感病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、腺病毒、疱疹病毒如带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒、冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(简称SARS病毒)如SARS-COV 1；SARS-COV 2病毒；MERS-CoV病毒。

(10)、有效量的地尔硫卓(diltiazem)及其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物等衍生物在用于制备预防或早期治疗对钙离子通道阻滞剂敏感的病毒的病毒感染症的药物中的用途。所述对钙离子通道阻滞剂敏感的病毒包括但不限于HIV病毒、AIDS病毒、肠道病毒、流感病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、腺病毒、疱疹病毒如带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒、冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(简称SARS病毒)如SARS-COV 1；SARS-COV 2病毒；MERS-CoV病毒。

本发明的组合物可以是单独含有地尔硫卓或者是其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物等衍生物，也可以是含有地尔硫卓或者是其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物等衍生物和第二治疗剂。

作为地尔硫卓药学上允许的盐保持了该化合物的生物性质，而且它无毒的或在其它方面也适合药用。这样的盐可以源自本领域熟知的各种有机和无机反离子。这样的盐包括：(1)与有机或无机酸形成的酸加成盐，这些酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎尼酸、粘康酸等酸；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子(a)被金属离子置换，所述金属离子为例如碱金属离子、碱土离子或铝离子，或者碱金属或碱土金属氢氧化物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌和氢氧化钡，氨水；或(b)与有机碱配位所形成的盐，所述有机碱味例如脂肪族、脂环族或芳香族的有机胺，例如氨水、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苯甲基乙烯-二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苯甲基苯乙胺、N-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等。

仅仅作为举例，盐进一步包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等，而且当化合物包含碱性官能团时，包括无毒的有机或无机酸的盐，例如，氢卤化物例如盐酸盐和氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊基丙酸盐、乙醇酸盐、戊二酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、山梨酸盐、抗坏血酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、苦味酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、月桂酸盐、甲烷磺酸盐(甲磺酸盐)、乙烷磺酸盐、1，2-乙烷-二磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、苯磺酸盐(苯磺酸盐)、4-氯苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲苯磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸盐、葡庚糖酸盐、3-苯基丙酸盐、三甲基乙酸盐、叔丁基乙酸盐、月桂基硫酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、羟基萘酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、环己基氨基磺酸盐、奎尼酸盐、粘康酸盐等。

就本发明所用的地尔硫卓化合物可以是纯的”或“纯化的”，该术语的含义是包括含有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％至100％重量所述化合物的组合物，剩余部分包含其它化学种类或非对映异构体。当用于手性地尔硫卓时，术语“纯的”指该手性地尔硫卓的对映异构体或非对映异构体基本不含其相反的对映异构体或非对映异构体(即，对映异构体或非对映异构体过量)。例如，化合物的纯的“R”形式基本不含该化合物的“S”形式，因此，是“R”形式对映异构体或非对映异构体过量。术语“对映异构体或非对映异构体纯的”或“纯的对映异构体或非对映异构体”表示该化合物包含过量的对映异构体或非对映异构体，例如超过75％重量、超过80％重量、超过85％重量、超过90％重量、超过91％重量、超过92％重量、超过93％重量、超过94％重量、超过95％重量、超过96％重量、超过97％重量、超过98％重量、超过98.5％重量、超过99％重量、超过99.2％重量、超过99.5％重量、超过99.6％重量、超过99.7％重量、超过99.8％重量、或超过99.9％重量的所述对映异构体或非对映异构体。在一些实施方案中，所述重量基于所述地尔硫卓的总重，即，地尔硫卓的所有对映异构体或非对映异构体。在一些实施方案中，一种对映异构体或非对映异构体可以是30-80％过量，或30-70％、30-60％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％过量，或这之间的任何百分比过量。

“溶剂化物”包括本发明提供的地尔硫卓或其盐，进一步包含通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量量的溶剂。当溶剂是水时，该溶剂化物是水合物。

本发明的使用者包括病毒可以在其中复制的任何单细胞或多细胞生物，包括细胞系和动物，优选人。或者，使用者可以是携带一部分病毒基因组，它的复制或功能可以被本发明的化合物改变。本发明的使用者具体地包括被感染的细胞、被全部或部分病毒科基因组转染的细胞、和动物，特别是灵长目动物(包括黑猩猩)和人。在本发明的绝大多数动物应用中，宿主是人类患者。但是，在一些病症中，本发明明确地预期了兽医应用(例如黑猩猩)。

本文使用的术语“个体”和“患者”在本文中可互换使用。术语“个体”指动物例如哺乳动物，包括非灵长目动物(例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长目动物(例如，猴例如食蟹猴、黑猩猩和人)，例如人。在一个实施方案中，个体是当前的丙肝感染治疗难治的或无反应的。

“治疗有效量”包括化合物或组合物的量，当对个体施用以治疗疾病时，该量足以实现对疾病的治疗。“治疗有效量”可以根据化合物、疾病及其严重程度、以及待接受治疗的个体的年龄、体重等因素变化。

在一个实施方案中，任何疾病或病症的“治疗”，指改善个体中存在的疾病或病症。在另一实施方案中，“治疗”包括改善至少一个身体参数，它可能是个体本身难以察觉的。在又一个实施方案中，“治疗”包括身体上(例如可辨别症状的稳定)或生理上(例如身体参数的稳定)或两方面同时缓和疾病或病症。在又一个实施方案中，“治疗”包括延迟疾病或病症的发作。

本文使用的术语“预防剂”用于指可用于预防病症或其一种或多种症状的任何药剂。在一些实施方案中，术语“预防剂”包括本发明提供的化合物。

本文使用的词组“预防有效量”包括治疗(例如预防剂)的量，它足以防止或减轻与病症相关的一种或多种症状的发展、复发或发作，或者提高或改进另一种治疗(例如另一种预防剂)的预防效果。

本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物可以与另一种治疗剂组合或交替施用，所述活性化合物的施用剂量由本领域技术人员选择。例如，施用的剂量将取决于药物的吸收、失活和排泄速率，以及本领域技术人员已知的其它因素。应当注意到，剂量值也将随着待被减轻的状况的严重程度而变化。应当进一步理解，对于任何特定的个体，具体剂量方案和时间表应当依照个人需要和施用或监督施用组合物的人的专业判断随时间而调节。

在一些实施方案中，本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物可以与一种或多种第二治疗剂组合施用。可以使用的第二治疗剂包括但不限于2′-氟核苷酸、1-氨基-烷基环己烷、烷基脂类、鲨烯、金刚烷胺、苯二甲酰胺、多聚腺苷酸衍生物、2′，3′-二脱氧肌苷、苯并咪唑、Intron A、派罗欣、利巴韦林、左旋韦林7-去氮-MK-0608、4′-叠氮胞苷、苯并咪唑5-甲酰胺衍生物、吲哚-N-乙酰胺衍生物、苯并噻二嗪衍生物、噻吩-2-羧酸衍生物、二氢吡喃酮衍生物、四氢呋喃吲哚乙酸衍生物和一系列5-羟基-3(2H)-哒嗪酮类、环孢菌素、西戈斯韦、阿霉素、PI-88、金刚烷胺、瑞德西韦、洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、阿比多尔、奥司他韦和法匹拉韦。

药物组合物和施用方法

本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物可以用本领域已知的方法配制成药物组合物。

在一些实施方案中，第二治疗剂可以和本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物一起配制或包装。当然，仅仅在根据本领域技术人员的判断这样的组合制剂不应当干扰任一药剂的活性或施用方法时，才将第二治疗剂和本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物一起配制。在一些实施方案中，本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物和第二治疗剂分开配制。为了本领域专业技术人员的方便，这些药剂可以被包装到一起，或分开包装。

在临床实践中，本发明提供的活性剂可以通过任何常规途径施用，特别是口服、肠胃外、直肠或通过吸入(例如以气溶胶形式)施用。在一些实施方案中，口服施用本发明提供的化合物。

可以使用片剂、丸剂、硬明胶胶囊、粉末或颗粒作为供口服施用的固体组合物。在这些组合物中，活性产物与一种或多种惰性稀释剂或佐剂例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。

这些组合物可以包含稀释剂以外的物质，例如润滑剂，例如硬脂酸镁，或者旨在控制释放的包衣。

可以使用包含惰性稀释剂(例如水或液体石蜡)的药学上可接受的溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂作为供口服施用的液体组合物。这些组合物也可以包含稀释剂以外的物质，例如润湿剂、甜味剂或调味剂。

供肠胃外施用的组合物可以是乳液或无菌溶液。可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油特别是橄榄油、或者可注射的有机酯例如油酸乙酯作为溶剂或运载体。这些组合物也可以包含佐剂，特别是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。可以用数种方式进行灭菌，例如使用细菌过滤器、通过辐照、或通过加热。它们也可以被制备成无菌固体组合物形式，其可以在使用时溶于无菌水或其它任何可注射的无菌介质中。

供直肠施用的组合物是栓剂或直肠胶囊，除了活性主成分之外，其还包含赋形剂，例如可可黄油、半合成的甘油酯或聚乙二醇。

组合物也可以是气溶胶。当以液体气溶胶形式使用时，该组合物可以是稳定的无菌溶液或固体组合物，该固体组合物在使用时溶于在无热原的无菌水、盐水、或其它任何药学上可接受的运载体中。当以供直接吸入的干气溶胶的形式使用时，活性主成分被精细分开，并与水溶性的固体稀释剂或运载体例如葡聚糖、甘露醇或乳糖组合。

在一个实施方案中，本发明提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本发明提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防或治疗剂(例如，本发明文提供的化合物，或其它预防或治疗剂)和通常一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在具体实施方案中和在上下文中，术语“载体”包括与治疗剂一同施用的稀释剂、佐剂(例如Freund′s佐剂(完全的和不完全的))、赋形剂、或运载体。这些药学上的载体可以是无菌液体例如水和油，包括石油、动物油、蔬菜油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水可以用作载体。盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是对于可注射的溶液。

典型的药物组合物和剂型包含一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是制药领域技术人员熟知的，而且合适的赋形剂的非限制性例子包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。特定的赋形剂是否适合加入药物组合物或剂型，取决于本领域中熟知的多种因素，包括但不限于将剂型施用于个体的方式和剂型中的具体活性成分。组合物或单一单位剂型，如果需要，也可以包含少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。

药物组合物和单一单位剂型可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。口服制剂可以包括标准载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物和剂型将包含预防或治疗有效量的预防或治疗剂，与合适量的载体，从而提供对个体恰当的施用形式。制剂应当适合施用模式。在某些实施方案中，药物组合物或单一单位剂型是无菌的，而且处于向个体施用的合适形式，所述个体例如动物个体，例如哺乳动物个体，例如人类个体。

配制药物组合物以和其预期施用途径相容。施用途径的例子包括但不限于肠胃外施用，例如，静脉内、皮内、皮下、肌肉内、皮下、口服、口颊、舌下、吸入、鼻内、透皮、表面、透黏膜、肿瘤内、滑膜内和直肠施用。在具体的实施方案中，组合物依照常规过程配制为适合对人静脉内、皮下、肌肉内、口服、鼻内或表面施用的药物组合物。在实施方案中，药物组合物依照常规过程配制用于对人皮下施用。通常，供静脉内施用的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。在必要时，组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉剂例如lignocamne，以减轻注射部位的疼痛。

剂型的例子包括但不限于：片剂；囊片；胶囊例如软弹性明胶胶囊；扁囊剂；糖锭；锭剂；分散剂；栓剂；油膏；糊剂(敷剂)；软膏；粉末；敷料剂；乳膏；膏药；溶液；贴片；气溶胶(例如鼻喷雾剂或吸入剂)；凝胶；适合对个体口服或粘膜施用的液体剂型，包括悬浮液(例如水或非水液体的悬浮液、水包油乳液、或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适合对个体肠胃外施用的液体剂型；和无菌固体(例如结晶或无定形固体)，它们可以被重配，以提供适合对个体肠胃外施用的液体剂型。

典型的剂型包含本发明提供的活性化合物地尔硫卓或者它的药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，范围在每天约0.1mg到约1000mg内，作为单一的一天一次剂量在早上施用，或作为分开的剂量在一天期间与食物一起服用。特定的剂型可以含有大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、100、200、250、500或1000mg的活性化合物。

剂量和单位剂型

在人类治疗学中，医生将依照预防或治疗性治疗并依照年龄、体重、感染阶段和待被治疗的个体特有的其它因素来确定他认为最合适的剂量。在一些实施方案中，剂量为成人每天约1到约1000mg、或成人每天约5到约250mg、或成人每天约10到50mg。在一些实施方案中，剂量是每个成年人每天约5到约400mg或每天25到200mg。在一些实施方案中，也预期每天约50到约500mg的给药速率。

在进一步的方面，提供了治疗或预防个体中病毒感染的方法，所述方法通过对由此需要的个体施用有效量的本文提供的活性化合物地尔硫卓或其药学上可接受的盐。将在预防或治疗病症或其一种或多种症状中有效的化合物或组合物的量将随疾病或病况的性质和严重程度、以及活性成分施用途径而变化。频率和剂量也将依照每个个体特有的因素，根据施用的具体治疗(如治疗或预防剂)，病症、疾病或状况的严重程度，施用途径，以及个体的年龄、身体、重量、反应和过去的病史而变化。有效剂量可以由源自体外或动物模型实验系统的剂量应答曲线外推得到。

在一些实施方案中，本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物和第二药剂以一定的次序在一定的时间间隔内对患者例如哺乳动物例如人施用，使得本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物可以与其它药剂一起作用，这与它们用别的方法施用相比，提供了增强的益处。例如，第二活性剂可以在同一时间施用或依序以任何次序在不同时间点施用；但是，如果没有在同一时间施用，它们应当在时间上充分接近地施用从而提供所需的治疗或预防效果。在一个实施方案中，本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物和第二活性剂在重叠的时间发挥它们的效果。各个第二活性剂可以用任何适当的形式和通过任何合适的途径分开施用。在其它实施方案中，本发明提供的活性化合物地尔硫卓及其衍生物在施用第二活性剂之前、同时或之后施用。

附图说明

图1：地尔硫卓抑制细胞内SARS-CoV-2感染

(A)不同浓度的DMSO或药物小分子在Vero-E6细胞上作用1h后，感染HRB25(M.O.I.＝0.01)，感染24h后收集细胞上清进行蚀斑检测。PFU,蚀斑形成单位。(B)不同浓度的药物小分子作用Vero-E6细胞后的细胞活力测定。(C)用不同浓度的地尔硫卓或水处理Vero-E6细胞，检测CC50。CC50:50％细胞毒性浓度。(D和E)地尔硫卓对HRB25感染的IC50。不同浓度的地尔硫卓或水处理Vero-E6细胞1h后,感染HRB25(M.O.I.＝0.01),感染后24h收集细胞上清，分别利用qPCR和蚀斑实验测定病毒RNA拷贝数(D)和病毒滴度(E)。IC50:50％的抑制浓度。(F和G)地尔硫卓处理Vero-E6细胞1h后，用M.O.I.为0.01(F)或5(G)的HRB25感染Vero-E6细胞，在指定的时间点收集细胞上清进行蚀斑检测。(H和I)地尔硫卓处理BEAS-2B细胞(H)或Calu-3细胞(I)1h后，用HRB25(M.O.I.＝5)感染细胞，24h后用qPCR检测细胞裂解液中的病毒RNA水平。图示数据为三次独立重复实验的means±SDs。采用双尾不成对学生t检验进行统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2：地尔硫卓在体外抑制SARS-CoV-2早期感染

(A和B)地尔硫卓与Vero-E6细胞(A)和Calu-3细胞(B)一起孵育1h，然后分别以M.O.I.为5和M.O.I.为10感染HRB25。在感染后指定的时间点收集细胞，用qPCR检测细胞裂解液中的病毒RNA水平。(C)用不同浓度的地尔硫卓处理Calu-3细胞后检测细胞活力。(D)用地尔硫卓或瑞德西韦处理Vero-E6细胞1h后,感染HRB25(M.O.I.＝5)。病毒中和试验：在4℃条件下HRB25(M.O.I.＝5)与中和抗体(20μg/ml)孵育1h,然后用该混合物感染Vero-E6细胞。在细胞感染后指定的时间点，用qPCR检测细胞裂解液中的病毒RNA水平。(E)用HRB25(M.O.I.＝5)感染Vero-E6细胞，在感染后-1h、1h、2h分别加入地尔硫卓。用qPCR检测感染后6h细胞裂解液中的病毒RNA水平。(F)用HRB25(M.O.I.＝5)感染Vero-E6细胞，感染6h后加入地尔硫卓和E64D。感染后24h收集细胞上清液进行病毒蚀斑实验。图示数据为三次独立重复实验的means±SDs。采用双尾非配对Student’s t-test进行统计分析。统计显著性：ns，无显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图3：地尔硫卓抑制SARS-CoV-2的吸附

(A)流式细胞实验检测不同细胞表面ACE2的表达。(B)裂解细胞后，通过qPCR检测ACE2的mRNA的拷贝数。(C)病毒吸附实验示意图。(D)将地尔硫卓预处理的细胞与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃孵育1h，然后通过qPCR检测细胞裂解液中的病毒RNA水平。(E)地尔硫卓预处理的Vero-E6细胞与HRB25(M.O.I.＝10、1、0.1或0.01)在4℃孵育1h。用qPCR检测细胞裂解液中的病毒RNA水平。(F)按照(C)实验将病毒吸附到Vero-E6细胞上后，进行免疫荧光实验。细胞与兔源抗SARS-CoV-2核衣壳单克隆抗体孵育，用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG(绿色)观察。细胞核用Hoechst 33342染色。挑选代表性的图片。每个样品至少统计110个细胞的荧光强度。(G)按(E)处理HEK293T细胞并检测。图示数据代表三次独立的实验或重复的means±SDs。采用双尾非配对Student’s t-test进行统计分析。统计显著性：ns，无显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图4：地尔硫卓降低细胞表面ACE2的表达

(A和B)用地尔硫卓预处理Vero-E6细胞后，分别用western blotting(A)和流式细胞实验(B)检测细胞表面和全细胞中ACE2的表达。(C和D)地尔硫卓处理的Vero-E6细胞、Vero-E6-ACE2细胞(C)、A549细胞或A549-ACE2细胞(D)与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h，然后用PBS洗涤。用qPCR检测细胞裂解液中病毒的RNA水平。通过western blotting确认外源ACE2的表达。(E)用HRB25感染地尔硫卓处理的Vero-E6-ACE2细胞(M.O.I.＝0.01)，在感染24h后收集细胞上清进行病毒蚀斑实验。图示数据为三次重复实验的means±SDs。采用双尾非配对Student’s t-test进行统计分析。统计显著性：ns，无显著性，**p<0.01，***p<0.001。

图5.地尔硫卓抑制SARS-CoV-2内化

(A)Vero-E6-ACE2细胞和HEK293T细胞与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h，然后用酸性缓冲液/胰蛋白酶清洗去除细胞表面结合的病毒粒子，然后裂解细胞，用qPCR检测SARS-CoV-2的RNA水平。(B和C)地尔硫卓处理的细胞与HRB25(M.O.I.＝1或10)在4℃下孵育1h，用PBS洗涤，然后转移到37℃内化1h,1h后用PBS(B)或酸缓冲/胰蛋白酶(C)洗涤细胞，最后裂解细胞，用qPCR检测吸附到细胞上(B)或内化进细胞(C)的SARS-CoV-2。(D)用DMSO,E64D,camostat mesylate或地尔硫卓预处理瞬时表达ACE2和TMPRSS2的HEK293T细胞，1h后感染HRB25(M.O.I.＝5)，感染后6h用qPCR检测细胞裂解液中病毒的RNA水平。(E)SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞融合实验示意图。(F)DMSO、camostat mesylate或地尔硫卓处理细胞后细胞融合的代表性图像。4×:1000μm,10×:400μm,20×:200μm。图示数据为三次重复实验的means±SDs。采用双尾非配对Student’s t-test进行统计分析。统计显著性：ns，无显著性，**p<0.01，***p<0.001。

图6.沉默Ca_v1.2α_1c表达抑制SARS-CoV-2的吸附和内化

(A)用qPCR检测siRNA转染细胞中CACNA1C mRNA的水平。siControl,阴性对照。siCACNA1C,CACNA1C mRNA特异性的siRNA。(B)用HRB25感染siCACNA1C转染的Vero-E6细胞(M.O.I.＝0.01)，感染24h后收集细胞上清进行病毒蚀斑实验。(C)siCACNA1C转染的细胞与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h。用qPCR检测细胞裂解液中病毒的RNA水平。(D和E)分别用western blotting(D)和流式细胞实验(E)检测siCACNA1C转染的Vero-E6细胞表面和全细胞中ACE2的表达。(F)用qPCR检测siRNA转染细胞中CACNA1C mRNA水平。(G)siCACNA1C转染的细胞与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h,PBS洗涤。用qPCR检测细胞裂解液中的病毒RNA水平。(H)用HRB25(M.O.I.＝0.01)感染siCACNA1C转染的Vero-E6-ACE2细胞，24h后取上清液进行病毒蚀斑实验。(I和J)siCACNA1C转染的细胞与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃孵育1h，PBS洗涤,然后转移到37℃，1h后细胞用PBS(I)或酸缓冲液/胰蛋白酶(J)洗涤，最后裂解细胞，用qPCR检测吸附到细胞上(I)或内化进入细胞(J)中的SARS-CoV-2。(K)用DMSO,E64D，camostat mesylate或地尔硫卓预处理瞬时表达ACE2和TMPRSS2的siCACNA1C转染的HEK293T细胞，1h后，感染HRB25(M.O.I.＝5)，感染后6h用qPCR检测细胞裂解液中病毒RNA水平。图示数据为三次重复实验的means±SDs。采用双尾非配对Student’s t-test进行统计分析。统计显著性：ns，无显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7.Ca_v1.2α_1c与SARS-CoV-2 S蛋白和ACE2相互作用并共定位

(A)Ca_v1.2α_1c-Flag和SARS-CoV-2 S-Myc共转染进HEK293细胞，使用抗flag琼脂糖珠进行免疫沉淀(IP)。(B)Ca_v1.2α_1c-Flag与SARS-CoV-2 S蛋白截断突变体SARS-CoV-2 S1-Myc的免疫共沉淀。(C)SARS-CoV-2 S蛋白截断突变体SARS-CoV-2 RBD-Myc与Ca_v1.2α_1c-Flag和ACE2-Flag的免疫共沉淀。(D)将纯化的可溶性his标记的SARS-CoV-2 S1蛋白与转染Ca_v1.2α_1c-Flag的HEK293细胞裂解液混合孵育，用抗flag琼脂糖珠进行pulldown实验。(E)Ca_v1.2α_1c-Flag和ACE2-Myc的免疫共沉淀。(F、G)免疫荧光检测共定位。Ca_v1.2α_1c-Flag转染Vero-E6细胞24h后，与SARS-CoV-2(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h，用Imaris软件分析3个单一荧光通道的图像。箭头表示Ca_v1.2α_1c-Flag(绿色)、ACE2(紫色)和SARS-CoV-2核衣壳蛋白(红色)(F)的典型共定位。(G)三维图像展示代表性的共定位图片。

图8.地尔硫卓抑制SARS-CoV-2在小鼠肺脏中的复制

(A、B)地尔硫卓对小鼠适应株HRB26M感染Vero-E6细胞的IC50。不同浓度的地尔硫卓在37℃条件下预处理Vero-E6细胞1h后，感染HRB26M(M.O.I.＝0.01),感染后24h收集细胞上清通过qPCR和蚀斑实验检测病毒RNA拷贝数(A)和病毒滴度(B)。(C)BALB/c小鼠(白色)和K18-hACE2小鼠(黑色)体内实验技术路线。(D和E)在HRB26M感染前1小时给小鼠肌肉注射地尔硫卓(5mg/kg)。用qPCR(D)和蚀斑法(E)分别测定小鼠(n＝9)肺内感染的病毒。(F)采用免疫组化法检测小鼠肺部的病毒抗原。红色箭头表示具有代表性的病毒抗原信号。(G和H)在小鼠感染HRB26M 6h后，肌肉注射地尔硫卓(5mg/kg)。用qPCR(G)和蚀斑法(H)分别测定小鼠(n＝6)肺内感染的病毒。(I和J)在HRB26M感染前1h给小鼠鼻内接种地尔硫卓(0.01mg/kg)。用qPCR(I)和蚀斑法(J)分别测定小鼠(n＝6)肺内感染的病毒。(K和L)K18-hACE2小鼠在HRB25感染前1h肌肉注射地尔硫卓(5mg/kg)。监测感染后12天内小鼠(n＝9)的存活率(K)和体重变化(L)。水平虚线表示检测的阈值。图D和图E所示数据为三个独立实验之和，图G-L为两个独立实验之和。图示数据为三次重复实验的means±SDs。采用双尾非配对Student’st-test进行统计分析。统计显著性：*p<0.05，***p<0.001。

图9：BAPTA-AM对SARS-CoV-2细胞吸附和内化无影响

(A和B)Vero-E6细胞(A)和A549细胞(B)分别用地尔硫卓或BAPTA-AM处理1h，然后与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h，通过qPCR检测细胞裂解液中的病毒RNA水平。(C)HRB25感染BAPTA-AM处理过的Vero-E6细胞(M.O.I.＝0.01)，感染24h后收集上清液进行蚀斑检测。统计显著性：ns，无显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图10：BAPTA-AM不影响细胞表面对ACE2的表达

用BAPTA-AM处理Vero-E6细胞1h后，采用流式细胞实验检测细胞表面和全细胞中ACE2的表达情况。

具体实施方式

通过以下实验来证明本发明活性化合物地尔硫卓对病毒的抑制作用。

实施例1：实验所用材料和方法

细胞系

HEK293细胞(ATCC、CRL-1573)、HEK293T细胞(ATCC、CRL-3216)、A549细胞(ATCC、CCL-185)、Vero-E6细胞(ATCC、CRL-1586)和HeLa细胞(ATCC-CCL-2)在含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养。Calu-3细胞(ATCC、HTB-55)在MEM培养基中生长，该培养基含有10％FBS、1％青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和0.1mM非必需氨基酸。BEAS-2B细胞获自昆明细胞库，并在支气管上皮细胞生长基础培养基(Lonza，Switzerland)中生长。Vero-E6细胞和表达人ACE2的A549细胞(Vero-E6-ACE2细胞，A549-ACE2细胞)是通过转导表达ACE2的慢病毒载体，并用嘌呤霉素筛选产生的，筛选后，细胞随后用嘌呤霉素维持。所有细胞均在含5％CO₂的37℃温箱中培养。

病毒

SARS-CoV-2/HRB25/human/2020/CHN(HRB25，GISAID号EPI_ISL_467430)，小鼠适应SARS-CoV-2/HRB26/human/2020/CHN(HRB26M，GISAID号EPI_ISL_459910)由哈尔滨兽医研究所保存[Wu S,Zhong G,Zhang J,Shuai L,Zhang Z,Wen Z,et al.A single dose ofan adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2challenge.Nat Commun.2020；11(1):4081.doi:10.1038/s41467-020-17972-1.PubMedPMID:32796842；PubMed Central PMCID:PMCPMC7427994；Wang J,Shuai L,Wang C,Liu R,He X,Zhang X,et al.Mouse-adapted SARS-CoV-2replicates efficiently in theupper and lower respiratory tract of BALB/c and C57BL/6J mice.ProteinCell.2020；11(10):776-82.doi:10.1007/s13238-020-00767-x.PubMed PMID:32749592；PubMed Central PMCID:PMCPMC7401472.]。所有关于传染性SARS-CoV-2的实验均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的生物安全4级和动物生物安全4级设施中进行。

小鼠

所有6-8周龄雌性BALB/c小鼠均购自北京维通利华实验动物技术公司。人ACE2转基因C57BL/6J(K18-hACE2)小鼠购自江苏集萃药康公司。小鼠在常规条件下饲养在中国农业农村部批准使用的中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的动物生物安全4级设施中。所有小鼠实验均严格按照中华人民共和国科学技术部实验动物护理和使用指南中的建议进行。该协议得到了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物实验伦理委员会的批准。

质粒

SARS-CoV-2 S(GenBank：MN908947.3)、S1亚基(aa 14-685)和RBD(aa 331-524)被克隆到pCAGGS-Myc载体中。将人Ca_v1.2α_1c、ACE2和TMPRSS2cDNA分别克隆到pCAGGS-Flag载体中并通过测序分析确认。

为构建双分子荧光互补系统表达载体，ACE2的C端与绿色荧光蛋白Venus(ACE2-VN)的N端2-173个氨基酸、SARS-CoV-2 S的C端与Venus的C端154-238个氨基酸(SARS-CoV-2S-VC)融合。

病毒蚀斑实验

将连续稀释的细胞感染上清或动物组织上清液加入Vero-E6细胞中，37℃感染1小时。然后洗涤细胞并在其上覆盖营养琼脂，然后在37℃下孵育。培养48h后，用结晶紫对细胞进行染色并计算蚀斑数目。

荧光定量PCR(qPCR)

用TRIzol法分离提取RNA，取1μg RNA进行反转录，在使用SYBR染料进行qPCR上。ACE2 mRNA拷贝数是根据将ACE2质粒10倍逐步稀释获得的标准曲线计算的。使用2^-ΔΔCt方法[64]计算细胞中病毒RNA(该病毒引物可以有效检测基因组RNA或亚基因组RNA)或CACNA1CmRNA的相对表达水平。基因的循环CT值减去相应内参基因28S rRNA或β-actin的CT值。

病毒感染实验

用100μL病毒感染细胞，并在37℃下感染1h。然后用2％FBS洗涤细胞3次，加入500μL 2％FBS。随后进行了进一步的研究。

细胞活力测定

按照Cell Titer-Glo试剂盒(Promega)说明书检测细胞活力。GraphPad Prism软件(7.0版)用于计算CC₅₀浓度。

筛选试验

用DMSO、地尔硫卓(1μM、10μM、100μM；Sigma)、硝苯地平(10μM、100μM、300μM；Sigma)、乙琥胺(10μM、100μM、300μM)或ω-芋螺毒素MVIIC(10nM,100nM,500nM；APExBIO)分别在37℃下按指定浓度处理预处理Vero-E6细胞1h，然后用HRB25(M.O.I.＝0.01)感染细胞1h。抑制剂在整个感染过程中都存在。在感染后24h，通过病毒蚀斑实验检测病毒滴度。地尔硫卓的IC₅₀实验也按同样方法进行。

药物添加实验

HRB25(M.O.I.＝5)在37℃感染Vero-E6细胞1h。DMEM洗3遍，在感染后-1h、1h和2h加入地尔硫卓(150μM)。在感染6h通过qPCR检测细胞裂解物中的病毒RNA水平。

为检测地尔硫卓是否抑制SARS-CoV-2感染的晚期阶段，在感染后6h将地尔硫卓(150μM)和E64D(100μM)加入到Vero-E6细胞中，培养24h后，通过病毒蚀斑实验检测病毒滴度。

抑制剂实验

用HRB25感染地尔硫卓处理的Vero-E6细胞、BEAS-2B细胞或Calu-3细胞。地尔硫卓在整个病毒感染期间都存在。在感染后24h或48h通过病毒蚀斑实验或qPCR检测上清液中的病毒滴度或细胞裂解物中相对于β-actin(Vero-E6细胞)或28S rRNA(BEAS-2B细胞、Calu-3细胞)的病毒RNA水平。BAPTA-AM(25μM)抑制实验方法同上。

用地尔硫卓(150μM)在37℃下预处理细胞1h，然后进行病毒感染实验。HRB25(M.O.I.＝5)在37℃下感染Vero-E6细胞1h。HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下感染Calu-3细胞1h。地尔硫卓在整个病毒感染期间都存在。在感染后1h、6h、12h和24h，通过qPCR测量细胞裂解物中相对于β-actin(Vero-E6细胞)或28S rRNA(Calu-3细胞)的病毒RNA水平。

用地尔硫卓(150μM)和瑞德西韦(10μM)在37℃下预处理Vero-E6细胞1h，然后用HRB25(M.O.I.＝5)在37℃下感染1h。洗涤细胞后，加入含有指定抑制剂的培养基。在感染后1h和6h通过qPCR测量细胞裂解物中的病毒RNA水平。

在HEK293T细胞中共转染ACE2-Flag和TMPRSS2-Flag质粒。随后在37℃下用DMSO、camostat mesylate(100μM)、E64D(100μM)或地尔硫卓(150μM)预处理细胞1h，然后用HRB25(M.O.I.＝5)在37℃下感染1h。抑制剂在整个感染过程中都存在于培养基中。在感染后6h通过qPCR检测细胞裂解物中的病毒RNA水平。在沉默CACNA1C病毒表达的HEK293T-ACE2/TMPRSS2细胞中按上述方法进行抑制剂实验。

病毒中和试验

HRB25(M.O.I.＝5)与中和抗体(4A8)(20μg/mL)(56)或同种型IgG(20μg/mL)在4℃混合1h。然后，将Vero-E6细胞与该混合物在37℃下孵育1h。在感染后1h和6h通过qPCR检测细胞裂解物中的病毒RNA水平。

流式细胞实验

为了检测细胞表面ACE2的表达，将Vero-E6细胞、Calu-3细胞、A549细胞、HEK293T细胞和Hela细胞接种到6孔板上，用0.25％胰蛋白酶(不含EDTA)消化处理并收集细胞。细胞用3％多聚甲醛室温固定15min，然后用FACS洗涤缓冲液(含2％FCS的PBS)洗涤3次，与ACE2抗体(R&D system，AF933)或IgG同型对照抗体孵育2h(Abcam)。然后洗涤细胞并用驴抗山羊Alexa Fluor488抗体(Abcam)染色1h。通过使用Apogee流式细胞仪分析。

为了检测抑制剂处理后细胞中ACE2的表达，用地尔硫卓(150μM)或BAPTA-AM(25μM)预处理Vero-E6细胞1h或用沉默CACNA1C表达的Vero-E6细胞，然后按照上述方法收集细胞用0.1％皂素处理细胞20min，然后与ACE2抗体孵育以检测ACE2的表达。

病毒吸附试验

在37℃下用地尔硫卓(150μM)预处理细胞1h，然后HRB25(M.O.I.＝10、1、0.1或0.01)在4℃条件下感染细胞1h。使用预冷的PBS去除未结合的病毒粒子。然后，通过qPCR检测细胞裂解物中病毒的相对RNA水平。BAPTA-AM处理的细胞或siRNA转染的细胞按照上述方法进行病毒吸附实验。

使用间接免疫荧光实验检测病毒吸附情况，将地尔硫卓处理过的细胞与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h。PBS洗涤后，固定细胞，使用0.1％Triton X-100透化15min，1％BSA封闭30min。然后将细胞与抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体(Sino Biological)在4℃下孵育过夜。PBS洗涤后，细胞用山羊抗兔Alexa Fluor 488抗体(Thermo Fisher)染色1h。细胞核用Hoechst 33342染色。用蔡司LSM880激光扫描共聚焦显微镜进行拍摄。获得的图像的分辨率为1024×1024。使用ZEN软件统计每个样品中吸附在细胞表面的病毒离子的荧光强度，每个样品至少统计110个细胞。

病毒内化试验

用地尔硫卓(150μM)在37℃下预处理细胞1h，然后在4℃下用HRB25(M.O.I.＝1或10)感染细胞1h。使用PBS大量洗涤去除未结合的病毒粒子，随后将细胞转移至37℃内化1h。1h后，用酸性缓冲液(50mM甘氨酸，100mM NaCl，pH 3.0)洗涤细胞3次，每次3min，然后加入0.25％胰蛋白酶以去除结合到细胞表面的HRB25。用trizol裂解细胞提取总RNA，然后进行qPCR以检测内化的病毒粒子。按同样方法检测siRNA转染的细胞中病毒粒子的内化。

细胞融合实验

使用HEK293T细胞进行细胞融合实验。靶细胞和效应细胞在5cm培养皿中长至70％到80％的密度时进行转染。靶细胞共转染ACE2-VN和TMPRSS2-Flag表达质粒，效应细胞共转染SARS-CoV-2 S-VC和pCAGGS-Flag表达质粒。对于camostat mesylate融合抑制试验，在转染后6h将camostat mesylate(100μM)加入效应细胞培养基中，在转染后24h将camostatmesylate加入靶细胞中作用2h。对于地尔硫卓融合抑制试验，在转染后24h将地尔硫卓(150μM)分别加入效应细胞和靶细胞培养基中作用2h。然后将效应细胞和靶细胞分别洗涤并重悬于含有10％FBS和指定抑制剂的DMEM中，以1:1的比例混合，接种于24孔板中，37℃孵育18h后在倒置荧光显微镜下成像分析。

RNAi实验

按照Lipofectamine RNAiMAX转染试剂说明书(Thermo Fisher Scientific)在24孔板中进行siRNA转染实验。简而言之，将靶向CACNA1C的siRNA或作为control的siRNA(1μM，每孔50uL，Sigma)与70μL OptiMEM混合，随后加入0.8μL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂并混匀。在室温下孵育30min后，加入24孔板中，然后将消化并计数的细胞以每孔500μL的体积接种到siRNA包被的24孔板中。在HEK293T细胞中ACE2-Flag和TMPRSS2-Flag质粒共转染24h，然后按照上述方法进行RNAi实验。通过使用qPCR检测CACNA1C的mRNA水平。在转染后72h，用HRB25感染细胞以进行进一步研究。siRNA序列如下：siCACNA1C，有义：5'-CCUACUUCGUGUCCCUCUUdTdT-3'，反义：5'-AAGAGGGACACGAAGUAGGdTdT-3'。

蛋白质印迹

为了检测ACE2在地尔硫卓处理或siCACNA1C转染的细胞表面的表达情况，使用Minute Plasma Membrane Protein Isolation and Cell Fraction Kit(InventBiotechnologies)提取细胞膜蛋白。用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞检测细胞中总的ACE2蛋白水平。RIPA裂解的细胞样品在冰上孵育30min，然后在4℃下以12,000×g离心20min。将细胞裂解液上清中加入变性SDS凝胶上样缓冲液并水煮15min。

将制作的蛋白样品进行聚丙烯凝胶电泳实验。转膜后将蛋白质转移到PVDF膜上。用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜，随后用抗Flag抗体(Genscript)、抗Myc抗体(Genscript)、抗ACE2抗体(R&D system)、抗β-actin抗体(Zsbio)和抗-封闭带蛋白3(ZO3)抗体(abcam)检测蛋白表达。PBS洗涤后，将PVDF膜与HRP偶联的二抗一起孵育：山羊抗兔HRP(Genscript)、山羊抗小鼠HRP(Genscript)和兔抗山羊HRP(Jackson ImmunoResearch)。最后通过增强型化学发光(ECL)试剂(Merck Millipore)检测信号。

免疫共沉淀实验

将质粒转染HEK293细胞48h后，用1％NP-40PBS缓冲液4℃条件裂解细胞1h。收集上清液并与40μL Protein G琼脂糖(Roche)在4℃下混合4h，以去除上清液中的非特异性结合蛋白。洗涤后的上清液与Flag抗体偶联的琼脂糖珠(Sigma)在4℃孵育6h。通过离心分离珠子，用1％NP-40PBS缓冲液洗涤五次，最后通过蛋白质印迹检测。

Pulldown实验

将表达Ca_v1.2α_1c-Flag蛋白的HEK293细胞裂解物与Protein G琼脂糖在4℃下混合4h。然后将上清液与抗Flag抗体偶联的琼脂糖珠在4℃下混合4h。偶联后，用1％NP-40PBS缓冲液洗涤珠子3次，然后将可溶性SARS-CoV-2 S1-His纯化蛋白(10μg)与珠子在4℃下翻转混合5h，用1％NP-40PBS缓冲液洗涤5次。最后，对样品进行SDS-PAGE，并通过蛋白质印迹检测。

激光共聚焦实验

在Vero-E6细胞上，用Ca_v1.2α_1c-Flag转染24h后，HRB25(M.O.I.＝10)在冰上与细胞孵育1h后，用PBS去除未结合的病毒粒子，并用4％多聚甲醛固定细胞15min。按照先前建立的酪胺信号放大技术进行多色免疫荧光实验。本研究中使用的一抗是鼠抗Flag(Sigma)、兔抗ACE2(Abcam)和兔抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白(Sino Biological)。二抗是HRP偶联的抗兔IgG(Zsbio)和HRP偶联的抗小鼠IgG(Zsbio)。使用配备Airyscan的Zeiss LSM880激光扫描共聚焦显微镜获取图像。沿Z轴扫描24层，每层停留时间为1微秒。图像的分辨率为2048×2048。

为了量化SARS-CoV-2、ACE2和Ca_v1.2α_1c-Flag的共定位，使用Bitplane Imaris软件(Bitplane AG)的“surface model”处理单通道数据，然后合并生成图像以观察SARS-CoV-2、ACE2和Cav1.2α1c-Flag的共定位。最后通过Imaris软件生成3D渲染图像。

动物实验

用CO₂麻醉6周龄雌性BALB/c小鼠，地尔硫卓通过肌肉注射(5mg/kg)或鼻内接种(0.01mg/kg)方式给药，随后每天给药，剂量为5mg/kg或0.01mg/kg。对照组，按照同样给药方式给小鼠接种水。在给药1h，小鼠鼻内接种50μL含有30PFU的HRB26M。为了测试地尔硫卓在SARS-CoV-2感染后的治疗效果，感染HRB26M的小鼠在感染后6h,肌肉注射地尔硫卓(5mg/kg)，然后每天给药，剂量为5mg/kg。在病毒接种后第3天，将小鼠安乐死并收集小鼠肺脏进行qPCR、病毒蚀斑或免疫组织化学实验。

为了检查地尔硫卓在致死小鼠模型中的保护作用，人ACE2转基因C57BL/6J小鼠(K18-hACE2)肌肉内接种地尔硫卓(5mg/kg)或水。1h后，小鼠鼻内接种50μL含有100PFU的HRB25，然后每天给药，剂量为5mg/kg，并连续给药2天。随后观察检测12天内小鼠的存活率和体重变化。

免疫组织化学(IHC)检测

。使用兔抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体(Frdbio)和HRP偶联的抗兔IgG二抗(Sigma)进行该实验。免疫染色用DAB显色并用苏木精复染。

统计分析

统计数据代表三次独立实验或重复的平均值。使用非配对的双尾Student’s t-test，在Microsoft Excel中对数据进行统计分析。显著性水平：ns，不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

实施例2：实验结果

地尔硫卓抑制细胞中SARS-CoV-2的感染

为了测试SARS-CoV-2感染是否需要VDCCs，我们选择了四种不同钙离子通道的抑制剂(地尔硫卓和nifedipine，抑制L型钙离子通道；ω-芋螺毒素MVIIC(ω-ConotoxinMVIIC)，抑制P/Q-和N型钙离子通道和乙琥胺(ethosuximide)，抑制T型钙离子通道，在Vero-E6细胞中进行筛选试验，以寻找抗SARS-CoV-2感染的潜在药物。首先，将不同浓度的药物加入Vero-E6细胞中，在37℃条件下作用1h，然后用从人体中分离出的SARS-CoV-2HRB25(M.O.I.＝0.01)感染细胞。在感染24h后，通过病毒蚀斑实验检测细胞上清中的病毒滴度。结果表明地尔硫卓处理显著抑制HRB25在Vero-E6细胞上的感染，并且在该使用浓度下，地尔硫卓处理细胞无毒性作用(图1A和1B)。在Vero-E6细胞中地尔硫卓的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)为279.2μM(图1C)。通过qPCR和病毒蚀斑实验检测病毒的RNA拷贝数和病毒滴度，结果表明在Vero-E6细胞上地尔硫卓抑制HRB25感染的最大半数抑制浓度(IC₅₀)分别为11.99μM和9.511μM(图1D和1E)。我们还通过病毒蚀斑实验证明，在感染后48h地尔硫卓仍能显著抑制SARS-CoV-2的感染(图1F)。然后我们用高剂量的病毒(M.O.I.＝5)感染地尔硫卓处理的Vero-E6细胞，结果表明，在高M.O.I.感染的情况下，地尔硫卓仍能显著抑制HRB25的感染(图1G)。我们进一步检测地尔硫卓能否抑制SARS-CoV-2感染人气道上皮细胞(BEAS-2B细胞和Calu-3细胞)，qPCR结果表明，在感染后24h,地尔硫卓显著抑制两种细胞中HRB25的感染(图1H和1I)。

地尔硫卓影响SARS-CoV-2感染的早期阶段

Vero-E6细胞用150μM的地尔硫卓处理1h，然后用HRB25(M.O.I.＝5)感染细胞。在感染后1h、6h、12h和24h，通过qPCR检测细胞裂解物中病毒的相对RNA水平。结果显示，与对照细胞(0μM)相比，早在感染后1h，地尔硫卓就能显著降低病毒RNA水平，表明地尔硫卓抑制SARS-CoV-2感染的早期阶段(图2A)。随后，我们在Calu-3细胞中进行以上实验，结果发现地尔硫卓早在感染后1小时就显著降低细胞中病毒的RNA水平(图2B和2C)。

然后，我们使用抗SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体和抑制SARS-CoV-2复制的瑞德西韦作为阳性对照，在感染1h和6h后，检测细胞裂解物中病毒的RNA水平。结果显示，在感染后1h和6h中和抗体或地尔硫卓处理显著降低病毒的RNA水平，而瑞德西韦只在感染后6h降低病毒RNA水平(图2D)，这表明地尔硫卓抑制SARS-CoV-2感染的早期阶段。

我们还进行了药物添加实验，来进一步验证地尔硫卓是否抑制SARS-CoV-2感染的早期阶段。我们分别在HRB25(M.O.I.＝5)感染后-1h、1h和2h用地尔硫卓处理细胞。在感染后6h使用qPCR检测细胞裂解物中病毒的RNA水平。结果表明，与对照的病毒RNA水平相比，在感染后-1h、1h或2h添加地尔硫卓显著降低病毒的RNA水平，尽管感染后2h的抑制效果小于-1h和1h的抑制效果(图2E)。这些结果证实地尔硫卓影响SARS-CoV-2感染的早期阶段。为了测试地尔硫卓是否在SARS-CoV-2感染Vero-E6细胞的晚期阶段起作用，我们在感染后6h加入地尔硫卓和E64D(E64D抑制组织蛋白酶L，防止子代病毒的感染)，通过病毒蚀斑实验检测感染24h后病毒的滴度。结果表明，地尔硫卓处理细胞的病毒滴度与对照细胞一样，表明地尔硫卓不影响SARS-CoV-2感染的晚期阶段(图2F)。

地尔硫卓抑制SARS-CoV-2在细胞上的吸附

SARS-CoV-2感染的第一步是通过S蛋白吸附在细胞表面。为了确定地尔硫卓是否抑制SARS-CoV-2的吸附，我们在高水平表达ACE2的Vero-E6细胞或Calu-3细胞以及低水平表达ACE2的Hela细胞、A549细胞或HEK293T细胞中进行病毒吸附实验(图3A和3B)。地尔硫卓处理的细胞与HRB25(M.O.I.＝10)在4℃下孵育1h，随后用预冷的PBS洗涤以除去未与细胞结合的病毒离子，然后用trizol裂解细胞，通过qPCR检测细胞裂解物中病毒的相对RNA水平(图3C)。我们发现，与对照细胞的病毒RNA水平相比，地尔硫卓处理后，Vero-E6细胞、Calu-3细胞、Hela细胞或A549细胞中病毒的RNA水平显著降低，表明地尔硫卓抑制SARS-CoV-2的吸附(图3D)。为了排除病毒感染剂量的影响，我们用不同剂量(M.O.I.为10，1，0.1，0.01)的病毒粒子进行上述病毒吸附实验。结果表明，在Vero-E6细胞上用不同剂量病毒进行病毒吸附实验，与对照细胞的病毒RNA水平相比，地尔硫卓处理细胞的病毒RNA水平显著降低，表明地尔硫卓抑制SARS-CoV-2的吸附与病毒粒子的感染剂量无关(图3E)。

为了进一步验证上述结果，我们进行通过显微镜的分析，观察细胞表面结合的SARS-CoV-2病毒粒子。通过上述方法在Vero-E6细胞上进行病毒吸附实验。然后用triton对细胞进行打孔处理，随后用抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的抗体进行免疫荧光实验，并计算每个细胞上结合病毒粒子的荧光强度。我们发现，地尔硫卓处理的Vero-E6细胞中SARS-CoV-2的荧光强度显著低于对照细胞(图3F)。这些数据表明地尔硫卓抑制SARS-CoV-2与Vero-E6细胞、Calu-3细胞、Hela细胞或A549细胞的结合。值得注意的是，地尔硫卓处理不影响HEK293T细胞上病毒的吸附(图3G)，表明地尔硫卓抑制SARS-CoV-2的吸附与细胞类型有关。

地尔硫卓降低细胞表面ACE2的表达

由于地尔硫卓是一种钙离子通道阻滞剂，它可以破坏细胞内的Ca²⁺水平，阻断正常的细胞功能，从而减少SARS-CoV-2的结合。为了检测地尔硫卓是否通过破坏细胞内Ca²⁺水平来抑制SARS-CoV-2结合，我们用BAPTA-AM(一种细胞内钙螯合剂)处理Vero-E6细胞和A549细胞，随后进行病毒吸附实验。我们发现BAPTA-AM处理的细胞和对照处理的细胞中病毒的RNA水平相当，表明细胞内Ca²⁺水平对SARS-CoV-2的结合没有影响(图9A和9B)。然而，BAPTA-AM可以显著抑制Vero-E6细胞中SARS-CoV-2的感染，表明细胞Ca²⁺水平可能影响病毒吸附后SARS-CoV-2的感染(图9C)。

ACE2是SARS-CoV-2结合的公认受体。我们接下来测试地尔硫卓处理是否抑制细胞表面ACE2的表达。提取地尔硫卓处理的Vero-E6细胞的细胞膜蛋白，然后进行蛋白质印迹以检测细胞表面ACE2的表达。与对照处理的细胞相比，地尔硫卓处理降低了细胞表面ACE2的表达，而ACE2的总表达量却没有变化(图4A)。流式细胞实验也进一步证明，地尔硫卓处理降低细胞表面ACE2的表达(图4B)。值得注意的是，BAPTA-AM处理对Vero-E6细胞表面ACE2的表达没有影响(图10)。

为检测过表达ACE2是否可以抵消地尔硫卓对SARS-CoV-2吸附的抑制效果，我们分别在过表达人源ACE2的Vero-E6和A549细胞系上进行病毒吸附试验，结果表明，Vero-E6-ACE2细胞或A549-ACE2细胞中病毒的RNA水平显著高于野生型细胞(图4C和4D)。地尔硫卓处理的Vero-E6-ACE2细胞或A549-ACE2细胞病毒的RNA水平与对照处理的Vero-E6-ACE2细胞或A549-ACE2细胞的病毒RNA水平相当(图4C和4D)，表明ACE2过表达可以抵消地尔硫卓对SARS-CoV-2吸附的抑制作用。这些结果表明地尔硫卓通过降低细胞表面ACE2的表达来抑制SARS-CoV-2感染。

我们还在Vero-E6-ACE2细胞上进行病毒感染实验，来检测过表达ACE2是否可以抵消地尔硫卓对SARS-CoV-2感染的抑制作用。我们发现地尔硫卓处理降低SARS-CoV-2在Vero-E6-ACE2细胞上的感染(图4E)。以上结果表明，过表达ACE2可以抵消地尔硫卓对SARS-CoV-2吸附的抑制作用，但不能抵消SARS-CoV-2吸附后的感染过程。

地尔硫卓抑制SARS-CoV-2的内化

SARS-CoV-2通过受体介导的内吞途径进入细胞，随后在核内体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶L介导下与核内体发生膜融合，或在TMPRSS2存在的情况下，通过直接膜融合进入细胞。SARS-CoV-2进入Vero-E6细胞或HEK293T细胞主要通过受体介导的内吞途径随后在核内体发生膜融合。为检测地尔硫卓是否抑制SARS-CoV-2的内化，我们进行了病毒内化试验。地尔硫卓处理的Vero-E6-ACE2细胞和HEK293T细胞分别与SARS-CoV-2(M.O.I.＝10或1)病毒粒子在4℃条件下孵育1h后，用预冷PBS洗去未结合的病毒粒子，然后将细胞转移到37℃中培养1h，以使结合的病毒粒子内化进入细胞。细胞用普通PBS处理，或用酸性缓冲液/胰蛋白酶洗涤，用trizol裂解洗涤后的细胞，通过qPCR检测细胞裂解物中SARS-CoV-2病毒的RNA水平。qPCR检测证明酸性缓冲液/胰蛋白酶洗涤可以有效去除细胞表面结合的SARS-CoV-2(图5A)。我们发现在Vero-E6-ACE2细胞和HEK293T细胞上，地尔硫卓处理显著抑制高感染剂量和低感染剂量的SARS-CoV-2内化进入细胞，而不影响病毒的吸附(图5B和5C).

在HEK293T-ACE2/TMPRSS2细胞中，SARS-CoV-2主要通过TMPRSS2依赖的膜融合进入细胞。我们进一步探究在SARS-CoV-2感染的HEK293T-ACE2/TMPRSS2细胞上，地尔硫卓是否抑制TMPRSS2介导的膜融合。细胞用DMSO、E64D、TMPRSS2抑制剂camostat mesylate或地尔硫卓处理1h，然后用HRB25(M.O.I.＝5)感染细胞。在感染后6h，通过qPCR检测细胞裂解物中病毒的RNA水平。结果显示，在感染后6h，地尔硫卓处理细胞中病毒的RNA水平显著低于DMSO处理的细胞，表明地尔硫卓在SARS-CoV-2感染期间影响TMPRSS2介导的膜融合(图5D)。

我们通过基于显微镜的实验进一步证实上述结果。我们使用双分子荧光互补系统构建了SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合系统，将荧光蛋白Venus在合适的位点切开，形成不发荧光的两个多肽(VN及VC)，分别使两个细胞各表达这两个多肽，这两个多肽仅在融合时重新形成具有活性的Venus荧光蛋白。将ACE2-VN和TMPRSS2-Flag质粒共转染的HEK293T细胞作为靶细胞，SARS-CoV-2 S-VC和pCAGGS-Flag共转染的HEK293T细胞作为效应细胞(图5E).效应细胞和靶细胞在37℃共培养18h后，在光学显微镜和荧光显微镜下可以很清晰地观察到含有多个细胞核的合胞体和绿色荧光(图5F)。与DMSO处理的细胞相比，地尔硫卓或camostat mesylate处理显著降低绿色荧光强度并抑制合胞体形成(图5F)，证明地尔硫卓在SARS-CoV-2感染期间抑制TMPRSS2依赖的膜融合。这些结果表明地尔硫卓通过影响内化来抑制SARS-CoV-2的感染。

沉默Ca_v1.2α_1c表达抑制SARS-CoV-2的吸附和内化

地尔硫卓是钙离子通道的功能性拮抗剂，主要靶向Ca_v1.2α_1c，这是一种典型的细胞膜结合蛋白，由钙离子电压门控通道亚基α_1c基因(CACNA1C)编码。为了研究地尔硫卓是否通过靶向Ca_v1.2α_1c来抑制SARS-CoV-2的感染，我们首先在Vero-E6细胞中进行了RNAi实验，以检测Ca_v1.2α_1c是否是SARS-CoV-2感染所必需的。用靶向CACNA1C的siRNA转染细胞，在转染后72h用HRB25(M.O.I.＝0.01)感染细胞。在感染后24h，通过病毒蚀斑实验检测细胞上清液中的病毒滴度。qPCR结果表明，在siCACNA1C转染后12h，Vero-E6细胞中的CACNA1C mRNA表达显著降低(图6A)。与siControl转染的细胞相比，沉默CACNA1C的表达显著降低上清液中病毒的滴度(图6B)，表明Ca_v1.2α_1c是SARS-CoV-2感染所必需的。

然后我们通过RNAi实验，以确定沉默CACNA1C的表达是否影响SARS-CoV-2的结合。qPCR结果表明，在siCACNA1C转染后24h，A549细胞或HEK293T细胞中的CACNA1C mRNA表达显著降低(图6A)。病毒吸附实验结果表明，与siControl转染细胞的病毒RNA水平相比，沉默CACNA1C表达的Vero-E6细胞或A549细胞中的病毒RNA水平显著降低(图6C)，而沉默CACNA1C表达的HEK293T细胞中的病毒RNA水平与siControl转染的细胞相当(图6C)，表明Ca_v1.2α_1c影响SARS-CoV-2的结合与细胞类型有关。

我们接下来检测沉默CACNA1C的表达是否会影响细胞表面ACE2的表达。提取siCACNA1C转染的Vero-E6细胞的细胞膜蛋白然后进行蛋白质印迹实验来检测ACE2的表达。结果表明，siCACNA1C转染的细胞表面ACE2的表达显著低于siControl转染的Vero-E6细胞；然而，ACE2在siCACNA1C转染的细胞中的总表达与siControl转染的Vero-E6细胞相当(图6D)。流式细胞实验进一步证实了这一结果(图6E)。这些结果表明沉默Ca_v1.2α_1c的表达影响细胞表面ACE2的表达。

为了检测过表达ACE2是否可以抵消沉默Ca_v1.2α_1c表达对SARS-CoV-2结合的抑制作用，我们在siCACNA1C转染的Vero-E6-ACE2细胞和A549-ACE2细胞中进行了病毒结合实验。我们首先证实，在转染后12h和24h，Vero-E6-ACE2细胞和A549-ACE2细胞中CACNA1C的mRNA水平显著降低(图6F)。病毒吸附实验表明，siCACNA1C转染的Vero-E6-ACE2细胞和A549-ACE2细胞的病毒RNA水平与siControl转染的Vero-E6-ACE2细胞和A549-ACE2细胞的病毒RNA水平相当，但显著高于siCACNA1C转染的Vero-E6细胞和A549细胞(图6G)。这些结果表明过表达ACE2可以抵消沉默Ca_v1.2α_1c表达对SARS-CoV-2细胞结合的抑制作用。

值得注意的是，siCACNA1C转染的Vero-E6-ACE2细胞上清液中的病毒滴度仍显著低siControl转染的Vero-E6-ACE2细胞(图6H)。该结果表明过表达ACE2不能抵消沉默Cav1.2α1c表达对SARS-CoV-2感染的抑制作用。随后我们检测了在Vero-E6-ACE2细胞中SARS-CoV-2的内化是否需要Ca_v1.2α_1c。我们发现沉默Ca_v1.2α_1c表达显著抑制Vero-E6-ACE2细胞中SARS-CoV-2的内化，而不抑制SARS-CoV-2的吸附(图6I和6J)。与地尔硫卓具有类似的效果，沉默Ca_v1.2α_1c表达显著抑制HEK293T细胞中SARS-CoV-2的内化，而不抑制SARS-CoV-2的吸附(图6I和6J)。我们还通过qPCR检测证实，在HEK293T-ACE2/TMPRSS2细胞上，沉默Ca_v1.2α_1c表达影响TMPRSS2介导的直接膜融合。在HEK293T-ACE2/TMPRSS2细胞中感染后6h，siCACNA1C转染细胞中的病毒RNA水平低于siControl转染细胞(图6K)。这些结果表明地尔硫卓通过靶向Ca_v1.2α_1c来抑制SARS-CoV-2的吸附和内化。

Ca_v1.2α_1c与SARS-CoV-2 S蛋白、ACE2相互作用并共定位

SARS-CoV-2 S蛋白介导SARS-CoV-2的吸附和内化。因此，我们通过免疫共沉淀试验来检测Ca_v1.2α_1c是否与SARS-CoV-2 S存在直接相互作用。在质粒转染的HEK293细胞中，Flag标记的Ca_v1.2α_1c蛋白(Ca_v1.2α_1c-Flag)与Myc标记的SARS-CoV-2 S蛋白(SARS-CoV-2S-Myc)共表达。结果表明，Ca_v1.2α_1c与SARS-CoV-2 S相互作用，但几乎不与SARS-CoV-2 S2结构域相互作用(图7A)，表明Ca_v1.2α_1c与SARS-CoV-2 S1结构域相互作用。随后，我们通过免疫共沉淀实验发现，S1和RBD都与Ca_v1.2α_1c相互作用(图7B和7C).

接下来，我们使用纯化的SARS-CoV-2 S1(SARS-CoV-2 S1-His)可溶性蛋白和Ca_v1.2α_1c-Flag转染的HEK293细胞的细胞裂解物进行了pulldown实验。Ca_v1.2α_1c成功将SARS-CoV-2 S1可溶性蛋白拉出(图7D)，表明Ca_v1.2α_1c直接与SARS-CoV-2 S1相互作用。值得注意的是，我们还发现Ca_v1.2α_1c与ACE2相互作用(图7E)。为进一步证明该互作，将病毒与细胞在4℃下孵育，然后进行免疫荧光实验，检测Ca_v1.2α_1c是否与SARS-CoV-2、ACE2在Ca_v1.2α_1c-Flag转染的Vero-E6细胞中共定位。结果表明，Ca_v1.2α_1c-Flag确实与SARS-CoV-2和ACE2共定位(图7F和7G)。

地尔硫卓抑制SARS-CoV-2在小鼠肺中的复制

最后，我们探究地尔硫卓是否能抑制SARS-CoV-2小鼠适应毒株(HRB26M)在BALB/c小鼠体内的复制。HRB26M可以在BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠的上呼吸道和下呼吸道有效复制，并在几天后被清除。我们首先证实HRB26M在Vero-E6细胞中对地尔硫卓表现出与HRB25相似的敏感性(图8A和8B)。6周龄BALB/c小鼠肌肉注射地尔硫卓，剂量为5mg/kg。1h后，小鼠鼻内感染HRB26M，剂量为30PFU。在感染后第3天，分别使用qPCR和病毒蚀斑实验检测小鼠肺中病毒RNA拷贝数和感染性病毒粒子的滴度(图8C)。与对照组小鼠相比，地尔硫卓处理小鼠肺组织中的病毒RNA拷贝数平均降低100倍，病毒滴度降低30倍(图8D和8E)。免疫组化结果进一步证实以上结果(图8F)。以上发现表明，地尔硫卓处理显著降低小鼠肺中病毒的复制。

然后我们检测地尔硫卓是否对SARS-CoV-2感染有治疗作用。感染HRB26M的小鼠在感染后6h肌肉注射地尔硫卓，剂量为5mg/kg。在感染后第3天，分别使用qPCR和病毒蚀斑实验检测小鼠肺中病毒RNA拷贝数和感染性病毒粒子的滴度。与对照组小鼠相比，地尔硫卓处理小鼠肺组织中的病毒RNA拷贝数平均降低21倍，病毒滴度降低9倍(图8G和8H)，表明地尔硫卓对SARS-CoV-2感染具有明显的治疗作用。

我们还通过鼻内给药方式检测地尔硫卓是否抑制病毒感染。6周龄BALB/c小鼠鼻内接种地尔硫卓，剂量为0.01mg/kg，1h后用HRB26M感染小鼠。在感染后第3天，分别使用qPCR和病毒蚀斑实验检测小鼠肺中病毒RNA拷贝数和感染性病毒粒子的滴度。与对照组小鼠相比，地尔硫卓处理小鼠肺组织中的病毒RNA拷贝数平均降低24倍，病毒滴度降低27倍(图8I和8J)。鼻内接种的效果与肌肉注射的效果相似。

我们进一步检查了地尔硫卓对人ACE2转基因C57BL/6J小鼠(K18-hACE2小鼠)的保护作用。K18-hACE2小鼠感染SARS-CoV-2导致体重减轻和死亡率呈剂量依赖性增加，并伴有肺部病变和免疫细胞浸润。然而，病毒感染中枢神经系统并复制被认为是导致死亡的重要因素。6周龄K18-hACE2小鼠肌肉注射地尔硫卓，剂量为5mg/kg。1h后，用100PFU剂量的HRB25鼻内感染小鼠(图8C)。观察12天内小鼠的体重变化和存活情况。感染后第3天，9只对照组小鼠中有2只死亡，其余小鼠精神萎靡并开始减轻体重(图8K和8L)。到感染后第5天，所有对照组小鼠都死于病毒感染(图8K)。地尔硫卓处理小鼠在观察期间没有显著的体重减轻，并且在感染后第3天看起来很健康(图8L)。到感染后5天，7只地尔硫卓处理的小鼠死于感染，最后有2只地尔硫卓处理的小鼠存活至观察结束(感染后12天)(图8K)。所有这些结果表明地尔硫卓是一种有效的抗SARS-CoV-2感染药物。

在上述研究中，我们示例性的证明了地尔硫卓(Ca_v1.2α_1c的抑制剂)可抑制SARS-CoV-2的吸附和内化，并减少细胞和小鼠中SARS-CoV-2的感染。在SARS-CoV-2的细胞吸附和内化方面，沉默Ca_v1.2α_1c的表达显示出与地尔硫卓治疗相似的效果。并发现Ca_v1.2α_1c与SARS-CoV-2 S蛋白、ACE2相互作用。我们的发现表明，地尔硫卓可以作为一种抗病毒药物，尤其是抗SARS-CoV-2感染的药物。

Claims

1.一种病毒感染症的预防或者早期治疗用组合物，所述组合物含有地尔硫卓(diltiazem)及其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物等衍生物。

2.如权利要求1所述的组合物，其进一步含有一种或多种第二治疗剂，所述第二治疗剂优选是另一种抗病毒药物，该所述抗病毒药物是化学药物、抗体类药物、蛋白类药物、或灭活病毒类药物等生物药物。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中病毒感染症所感染的病毒是指对钙离子通道阻滞剂敏感的病毒。

4.如权利要求1-3任一项所述的组合物，该组合物是医药类产品。

5.如权利要求4所述的组合物，其中，该医药类产品是口服剂、注射剂、局部施用剂、鼻气雾剂或者吸入制剂。

6.如权利要求1-5任一项所述的组合物，该组合物与需要抑制或阻滞的非人的哺乳动物的兽医疗法联用，特别是病毒感染。

7.如权利要求1-6任一项所述的组合物，该组合物是食品、饲料、食品添加剂或饲料添加剂。

8.有效量的地尔硫卓(diltiazem)及其药学上允许的盐、酯、水合物或溶剂合物在用于制备预防或早期治疗对钙离子通道阻滞剂敏感的病毒的病毒感染症的药物中的用途。

9.如权利要求9所述的用途，其中对钙离子通道阻滞剂敏感的病毒包括HIV病毒、AIDS病毒、肠道病毒、流感病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、腺病毒、疱疹病毒如带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒、冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(简称SARS病毒)如SARS-COV 1；SARS-COV 2病毒；MERS-CoV病毒。

10.如权利要求8或9所述的用途，其中所述对钙离子通道阻滞剂敏感的病毒为SARS-CoV-2病毒。