EA012650B1 - ПРИМЕНЕНИЕ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТА С И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИН - Google Patents

ПРИМЕНЕНИЕ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТА С И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИН Download PDF

Info

Publication number
EA012650B1
EA012650B1 EA200700725A EA200700725A EA012650B1 EA 012650 B1 EA012650 B1 EA 012650B1 EA 200700725 A EA200700725 A EA 200700725A EA 200700725 A EA200700725 A EA 200700725A EA 012650 B1 EA012650 B1 EA 012650B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nso
mea1a
cyclosporin
cells
infection
Prior art date
Application number
EA200700725A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200700725A1 (ru
Inventor
Пьетро Скальфаро
Жан-Морис Дюмон
Грегуар Вуаньо
Ролан-Ив Моверне
Original Assignee
Дебиофарм С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дебиофарм С.А. filed Critical Дебиофарм С.А.
Publication of EA200700725A1 publication Critical patent/EA200700725A1/ru
Publication of EA012650B1 publication Critical patent/EA012650B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению при лечении инфекции вирусного гепатита С (HCV) в качестве самостоятельного активного вещества или в комбинации с другим активным веществом циклоспорина, имеющего повышенную активность связывания циклофилина и, по существу, не обладающего иммуносупрессивной активностью.

Description

Настоящее изобретение относится к применению циклоспорина для лечения инфекции вируса гепатита С (йераййк С νίπικ. НСУ) и к фармацевтической композиции, включающей циклоспорин.
Предшествующий уровень техники
НСУ был клонирован и охарактеризован приблизительно 15 лет назад С1юо и др. (см. 8с1епсе 244, (1989), 359-362). НСУ принадлежит к семейству флавивирусов (ЕкпЕзлбае) и включает нуклеокапсид, покрытый оболочкой, и однонитевой геном РНК положительной полярности (см. ВабепксЫадег е! а1., Λπΐίνίπιΐ Век. 60, (2003), 91-102). НСУ передается, прежде всего, с кровью, продуктами из крови и «вертикальным переносом» в течение беременности. Введение диагностических испытаний для скрининга продуктов крови значительно уменьшило скорость распространения новой инфекции.
Однако НСУ остается серьезной медицинской проблемой. В настоящее время приблизительно 170 млн человек инфицировано НСУ. Начальное протекание инфекции обычно неострое. Однако иммунная система часто неспособна к освобождению от вируса, и люди с хроническими инфекциями подвергаются высокому риску заболевания циррозом печени и гепатоцеллюлярной карциномой (см. Роупагб е! а1., Ьаисе! 349, (1997), 825-832).
Какая-либо доступная вакцина отсутствует, а терапевтические варианты очень ограничены (см. Маппк е! а1., Ιπάίηπ 1. Оак1гоеп!его1. 20 (8ирр1. 1), (2001), С47-51; Тап е! а1., №11. Ве\'. Эгид Э1ксо\'. 1, (2002), 867-881).
Текущая терапия базируется на комбинации интерферона-альфа и рибавирина. Эта терапия вызывает устойчивый антивирусный отклик у 85-90% пациентов, инфицированных генотипами 2 и 3, но, к сожалению, только приблизительно у 45% пациентов, инфицированных наиболее распространенным генотипом 1. Кроме того, побочные эффекты существенны и включают миалгию, артралгию, головную боль, повышенную температуру, тяжелую депрессию, лейкопению и гематолитическую анемию.
Очевидно, что для лечения инфекции НСУ, особенно, например, в случае предотвращения повторения НСУ требуются дополнительные терапии с более высокой антивирусной активностью и лучшим профилем безопасности. Чтобы установить безопасный профиль, для клинического лечения инфекции НСУ особенно важны такие критерии, как низкая цитотоксичность, а также цитостатический эффект и высокий индекс селективности.
Новый подход к лечению инфекции НСУ с использованием циклоспоринов был недавно описан клиническими наблюдениями (см. Тегаока е! а1., Тгапкр1ап! Ргоа, 1988, 20, (3 кирр1. 3), 868-876, и 1поие е! а1. 1 Оак1гоеп!его1, 2003, 38, 567-572). Недавно было показано, что циклоспорин А (СкА) ингибировал ш νίΙΐΌ внутриклеточную репликацию НСУ субгеномного репликона при клинически достижимых концентрациях препарата (см. Ша!акй1 е! а1., Нера!о1оду 38, 2003, 1282-1288, и №1када\\'а е! а1., ВВВС 313, 2004, 42-47). Обе группы предположили, что анти-НСУ действие СкА не связано с иммуносупрессивной активностью, основанной на наблюдениях, сделанных с использованием соответственно иммуносупрессивного макролида, т.е. соединения, известного под названием ЕК 506, и неиммуносупрессивного производного циклоспорина А, т.е. соединения, известного под названием ΝΙΜ 811 или [Ме11е]4-СкА. Ыакада\га и др. считают, что расширение применений СкА может вызвать существенные проблемы из-за его широко известных иммуносупрессивных свойств, и полагают, что один из методов решения этой проблемы заключается в том, чтобы принять во внимание использование неиммуносупрессивных аналогов циклоспорина.
В течение последних 15 лет проводилось множество исследований в области химии лекарств с целью идентифицировать такие неиммуносупрессивные аналоги циклоспорина, и ΝΙΜ 811 является одним из самых представительных соединений, обладающим таким качеством.
Ко и др. в заявке на патент ЕР 0484281, касающейся их неиммуносупрессивных свойств, сообщали о ΝΙΜ 811, наряду с девятью другими производными циклоспорина А, и рассматривали его как являющийся потенциально полезным в лечении инфекции ВИЧ и профилактике СПИДа. Синтез этих производных включал модификацию аминокислот в положениях 4 и/или 5 циклоспорина А.
Изменяя аминокислоты в положениях 2 и/или 6 циклоспорина А, 81да1 и др. синтезировали в сумме 61 аналог циклоспорина и заметили, что такие химические модификации вызывают уменьшение иммуносупрессивной активности (см. 81да1 е! а1., 1. Ехр. Меб., 173, 1991, 619-628).
Последующие попытки модифицирования аминокислоты в положении 3 циклоспорина А с целью получения неиммуносупрессивных соединений были описаны, в частности, у Ватеге и др. в ШО 98/28328, ШО 98/28329 и ШО 98/28330.
Шепдег и др. синтезировали ряд соединений, которые отличаются от циклоспорина А в положении 3, в котором они содержат Ν-метилированную, небольшую гидрофобную или нейтральную аминокислоту, иную чем глицин, и в положении 4, в котором они содержат Ν-метилированную или Νэтилированную гидрофобную или нейтральную аминокислоту, иную чем лейцин. Указанные авторы сообщают, что эти соединения имеют высокую эффективность ингибирования репликации Н1У-1 и, по существу, не обладают иммуносупрессивной активностью (см. публикацию международной заявки ШО 00/01715 и Тейайебгоп Ьей., 41, (2000), 7193-6).
- 1 012650
Сущность изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить клинициста новой терапией при лечении инфекции НСУ, особенно, например, в случае предотвращения рецидива НСУ. Эта терапия должна предлагать более высокую антивирусную активность и лучший профиль безопасности по сравнению с уже проверенным или недавно предложенным лечением.
Авторы настоящего изобретения неожиданным образом обнаружили, что введение НСУинфицированному пациенту особого соединения, а именно [Э-МеА1а]3-[Е!Уа1]4-СкА, соответствует вышеупомянутым требованиям. Они заметили, что в дополнение к своему неиммуносупрессивному свойству |Э-МеА1а|3-|Е1Уа1|4-С'5А имеет значительно более высокое сродство к циклофилинам, чье повышенное сродство соотносится с повышенной эффективностью в отношении ингибирования репликации НСУ.
Соответственно один из объектов настоящего изобретения относится к применению [Э-МеА1а]3[Е!Уа1]4-СкА для изготовления лекарственного продукта, предназначенного для лечения инфекции НСУ у пациента.
О [Э-МеА1а]3-[Е!Уа1]4-СкА сообщали ХУепдег и др. в \УО 00/01715 и ему был приписан регистрационный номер СА8 254435-95-5. Он представляет собой циклический ундекапептид, описываемый следующей формулой:
-МеВтЬаАЬи-О-МеА1а-Е1Уа1-\/а1-Ме1.еи-А1а-(О)А1а-Ме1.еи-Ме1-еи-МеУа11 2 3 456789 10 11 где МеВт! представляет собой Ы-метил-(4В)-4-бут-2Е-ен-1-ил-4-метил-(Е)треонин, аАЬи представляет собой Ь-а-аминомасляную кислоту,
Э-МеА1а представляет собой Ν-метил-Э-аланин,
Е!Уа1 представляет собой Ν-этил-Ь-валин,
Уа1 представляет собой Ь-валин,
МеЬеи представляет собой Ν-метил-Ь-лейцин,
А1а представляет собой Ь-аланин, (Э)А1а представляет собой Ό-аланин и
МеУа1 представляет собой Ν-метил-Ь-валин.
Общепринятая нумерация положений аминокислот, в общем случае используемых в отношении циклоспорина А, показана под формулой. Это достигается путем использования сложных названий, включающих первую часть, указывающую на идентичность остатков, которые отличаются от тех же остатков в циклоспорине А с указанием их положения, и вторую часть, обозначенную как СкА, указывающую на то, что все другие остатки являются идентичными тем же остаткам в циклоспорине А. Например, [Ме11е]4-СкА представляет собой циклоспорин, который является идентичным циклоспорину А за исключением того, что МеЬеи в положении 4 заменен на Ме11е (Ν-метил-Ь-изолейцин).
Краткое описание графических материалов
Настоящее изобретение будет объясняться далее посредством следующих примеров и графических материалов, в которых фиг. 1 представляет гистограмму доза-ответ, полученную с помощью анализа люциферазы в инфицированных клетках Ний-7-Ьипе!;
фиг. 2 представляет гистограмму доза-ответ, полученную с помощью анализа люциферазы в инфицированных клетках Ний-7,5-Ьипе!;
фиг. 3 представляет кривые клиренс-ответ в инфицированных клетках Ний-9-13;
фиг. 4 отражает трехмерное представление доза-ответ в комбинации с ШЫ/[П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4СкА.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Сложившиеся медицинские применения циклоспорина А связаны со способностью этого соединения подавлять клеточный иммунный ответ путем предотвращения продуцирования и высвобождения нескольких аутокринных факторов роста Т-клетки, включая интерлейкин 2 (1Ь-2), от активизированных Т-клеток (см. Воге1 (1989) Тгапкр1ап!. Ргосееб. 21, 810-815; Кгопке е! а1. (1984) Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 81, 5214-5218; Раи1бк е! а1. (1993) Эгидк 45, 953-1040). При попадании в клетки циклоспорин А связывается с циклофилинами с высоким сродством (см. Напбксйишасйег е! а1. (1984) 8с1епсе 226, 544-547). Поскольку среди различных биологических функций они обладают активностью пептидилпролил цистранс-изомеразы (РР1аке), она может быть измерена ίη уйго (см. Рйсйег е! а1. (1989) №1Шге 337, 476-478; ТакайакЫ и др. (1989) №1Шге 337, 473-475). Критическим для иммуносупрессивного действия циклоспорина А является взаимодействие между комплексом циклофилин-циклоспорин А и кальций- и кальмодулин-зависимой серин/треонин фосфатазой 2В (кальцинейрин) (см. Наикке (1993) ΟΝ&Γ 6, 705-711, Рпебтап е! а1. (1991) Се11 66, 799-806; Ьш е! а1. (1991) Се11 66, 807-815). Образование этого тройного комплекса приводит к ингибированию активности фосфатазы кальцинейрина (см. 1аш е! а1. (1993) №Шге 365, 352-355; Као е! а1. (1997) Аппи. Неу. 1ттипо1. 15, 707-747; СгаЫгее (1999) Се11 96, 611-614). Кальцинейрин способствует селективному дефосфорилированию нуклеарного фактора активированных Т
- 2 012650 лимфоцитов (ΝΒ-АТ), который затем перемещается к ядру, где он связывается с белком активатора 1 и трансактивирует целевые гены, включая 1Ь-2 ген.
Полагают, что из-за аминокислот в положениях 3 и 4 [Э-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А обладает существенно пониженной способностью взаимодействовать с кальцинейрином, как показано транскрипционным и иммунологическим анализом, а также значительно большим сродством к циклофилинам, как показано анализом ингибирования активности пептидилпролил цис-транс-изомеразы.
Активность пептидилпролил цис-транс-изомеразы (РР1а§е) циклофилинов определяли, используя адаптированную методику от КоГгоп и др. (см. ВюсйешЩгу 30, 6127-6134 (1991); 1. Ат. СЕет. 8ос. 114, 2670-2675 (1992)). Ν-сукцинилированный А1а-А1а-Рго-Рйе-пара-нитро-анилин (δ^-ΑΑΡΒ-ρΝΑ, Васйет, ВнЬепбогГ. Швейцария) использовали в качестве субстрата. Анализ основывался на предпочтительном расщеплении химотрипсином транс-изоформы связи Ρйе-ρNΑ в тетрапептиде А1а-А1а-Рго-Р11е-]:МА. Это расщепление высвобождает фрагмент паранитроанилина, который может быть обнаружен и определен количественно при 390 нм (ε=11814 М-1см-1) (8сйи1котек1 е1 а1. (1995) Вюсйет1бгу 34, 13016-13026). цистранс-Изомеризация катализируется циклофилином (РР1а§е, ЕС 5.2.1.8). После смешения С§А или другого циклоспорина (итоговые концентрации 10-9-2х10-5 М получены из сконцентрированных в 1000 раз имеющихся в продаже растворов в этаноле) с 0,1 мкг циклофилина (81дта) в общем объеме 1,5 мл 40 мМ раствора НЕРЕ8, рН 7,9 и инкубации в течение 50 мин на льду реакционную смесь переносили в кювету, которую выдерживали при 10°С в спектрофотометре Уабап. После добавления 3,75 мг химотрипсина (70 мкл раствора химотрипсина в 10 мМ НС1) реакцию инициировали добавлением 10 мкл 3,2 мМ раствора 8ис-ΑΑΡΡ-ρNΑ в 0,5 М ЫС1/трифторэтанол. Реакцию контролировали в течение 3 мин и из полученных данных определяли начальную константу скорости. Для контроля начальную константу скорости определяли также для параллельной реакции, в которой отсутствовал циклофилин. Кривые концентрация-ответ строили для циклоспорина А и других циклоспоринов, и значения 1С50 (ИК50, 50%-ная ингибирующая концентрация) различных циклоспоринов выражали относительно ингибирующей концентрации циклоспорина А (1,0). Значение, меньшее 1, означает, что соединение имеет более высокое сродство к циклофилину, чем С§А.
Первоначально для оценки иммуносупрессивной активности циклоспоринов использовали ΝΒ-АТзависимый анализ репортера (Ваитапп е1 а1. (1992) Тгаи8р1аи1. Ргос. 24, 43-48). Т-клетки 1игка1, устойчиво трансфицированные репортерной структурой, содержащей бактериальный ген β-галактозидазы под контролем промотора 1Ь-2 гена, были получены от 6. 2епке, ΝονηΠίδ Рйагта АС, Ва§е1, Швейцария. Клетки выращивали в среде КРМ11640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной при высокой температуре, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 100 ед./мл гигромицина В. Клетки стимулировали добавлением 2,4 мкМ форбол-12-миристат-13-ацетата и 75 мкг/мл фитогемагглютинина в присутствии или в отсутствие циклоспорина А или другого циклоспорина (итоговые концентрации 10-9-2х10-5 М получены из сконцентрированных в 1000 раз имеющихся в продаже растворов в этаноле). После инкубации в течение 20 ч при 37°С клетки собирали и лизировали в 50 мМ №ьНРО4 (рН 9,0), 10 мМ КС1, 1 мМ Мд8О4, 1%-ном растворе Тгйоп Х-100, 0,5 мМ 4-этилумбеллиферил-в-Э-галактозида (81дта, Виску Швейцария). Реакция с β-галактозидазой проходила в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре. Флуоресцентный 4 метилумбеллиферон анализировали флуорометрически в надосадочной жидкости (длина волны возбуждения 355 нм; длина волны испускания 460 нм). Кривые концентрация-ответ строили для циклоспорина А и других циклоспоринов и значения 1С50 различных циклоспоринов выражали относительно соответствующего значения для циклоспорина А (1,0). Значение, большее 1, означает, что соединение является менее иммуносупрессивным, чем С§А.
Результаты, полученные в результате эксперимента, показаны в табл. 1 ниже.
Таблица 1 Циклофилинсвязывающая (РР1а§е) и иммуносупрессивная (1Ь-2) активности С§А и других циклоспоринов
Соединение РР1азе 1Ь-2
СзА 1.0 1,0
[О-МеА1а]3-[Е(Уа1р-СзА 0,3 7161
[МеНеГ-СзА 0,5 2250
Данные, приведенные в табл. 1, показали, что определенные замены в положении 4 (т.е. Уа1, 11е) значительно уменьшают иммуносупрессивную активность (измеренную как ингибирование 1Ь-2 экспрессии), а также ощутимо увеличивают циклофилинсвязывающую активность (измеренную как ингибирование РР1а§е активности циклофилина). Замещение в положении 3 приводило к дальнейшему существенному увеличению циклофилинсвязывающей активности (в 2 раза или больше; ср. [Э-МеА1а]3[Е1Уа1]4-С§А). Соединение имело более высокую циклофилинсвязывающую активность и более низкую остаточную иммуносупрессивную активность, чем [Ме11е]4-С§А, являющийся лучшим эталонным соединением, известным из литературы. Соединение [Ме11е]4-С§А также известно как ММ811.
- 3 012650
Неиммуносупрессивная активность [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А.
В подтверждающем анализе иммуносупрессивную активность СкА. [Ме11е]4-СкА и |Э-МеА1а|3[Е1Уа1]4-С§А оценивали с использованием смешанной лимфоцитной реакции. В этом анализе циклоспорины растворяли в этаноле (10 мг/мл). Смешивали свежевыделенные клетки СЭ4+ РВМСк от двух здоровых доноров с последующей инактивацией путем облучения одной из популяций (клетки стимулятора; 8). Через пять дней совместного культивирования в присутствии или в отсутствие циклоспорина (1 мкг/мл) определяли пролиферативный ответ неинактивированной популяции клетки (клетки респондера; К.) путем введения [3Н]-тимидина.
Анализ проводили перекрестно с двумя популяциями клетки. причем каждую инактивировали и стимулировали по очереди. Стимуляцию (%) клеток респондера рассчитывали по формуле процент возбуждения=100х (образец с циклоспорином-фон)/(образец без циклоспорина-фон).
«Образец» представляет собой смесь клеток респондера и стимулятора. «Фон» представляет собой контроль. в котором смешаны только клетки стимулятора. Результаты приведены в табл. 2. Они показывают. что и [Ме11е]4-СкА и [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А в значительной степени лишены иммуносупрессивной активности.
Таблица 2
Пролиферативный ответ клеток С’Э4' РВМСк в присутствии/в отсутствие циклоспоринов
Со-культура Соединение N % Стимуляции (относительный) Стандартное отклонение
К1 х 82 нет 8 100 30
К1 х 82 СзА 4 29 3
К1 х82 [Ме11е]4-СзА 4 84 13
К1 х82 [0-МеА1а]э-[Е1Уа1]4-СзА 4 75 11
Р2х81 нет 4 100 9
К2 х 81 СзА 4 9 2
К2 х 81 [Ме11е]4-СзА 4 75 9
К2 х 81 Р-МеА1а]3-[ЕЩа1]4-С5А 4 65 7
81 х82 нет 4 0 0,6
К1х82 относится к сокультуре клеток респондера от донора 1 и клеток стимулятора от донора 2.
N обозначает количество измерений.
Высокая анти-НСУ активность и низкий цитотоксический/цитостатический эффект [О-МеА1а]3[Е1Уа1]4-С§А.
Как упоминалось ранее. инфекция вирусного гепатита С (НСУ) представляет собой серьезную проблему для здоровья. потому что постоянно инфицированные пациенты подвергаются высокому риску развития хронических заболеваний печени. включая цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному. Известная из предшествующего уровня техники терапия (способы лечения) не подходит для большой части последней популяции. а также связана с существенными побочными эффектами. До недавнего времени развитию более эффективных терапий (способов лечения) препятствовало отсутствие соответствующей модели репликации НСУ ίη νίίτο. которая позволяет осуществлять скрининг потенциально активных соединений до оценки в клинических испытаниях на человеке. Это препятствие было преодолено развитием генетически измененных мини-геномов НСУ (репликонов). которые самоамплифицируются в культивируемых клетках гепатомы до высоких уровней (Ьойтапп е1 а1. 8е1епее 285. (1999). 110113). Эта система репликона НСУ быстро стала стандартным инструментом для изучения репликации НСУ. патогенеза и живучести (ВайепкеЫадег е1 а1. ΛηΙίνίΓη1 Кек. 60. (2003). 91-102). Геном НСУ состоит из однонитевой РНК. которая содержит единственную открытую рамку считывания для полипротеинов из приблизительно 3000 аминокислот. Трансляция этого полипротеина инициируется на внутреннем сайте входа в рибосому (1КЕ8). расположенном на 5' конце РНК. Полипротеин НСУ расщепляется по меньшей мере на десять белков. Они включают капсидный белок С. оболочечные белки Е1 и Е2. возможный виропориновый белок р7. неструктурные белки N82 и N83. имеющие активность серинпротеиназы. а также активность АТФазы/хеликазы. №4А. индуцирующий мембранную сеть белок Ν84Β. №5А и РНКзависимая РНК-полимераза Ν85Β. Первым успешным репликоном была бицистронная РНК. содержащая в направлении от 5' до 3' 1КЕ8 НСУ кодирующую последовательность для неомицин фосфотрансферазы. 1КЕ8 от вируса энцефалокардита и кодирующие последовательности для белков НСУ от N83 до N85. Можно показать. что после введения в клетки Ний-7 и селекции с использованием С418 (генетицин). этот репликон может автономно реплицироваться до высоких уровней (1000-5000 копий на клетку) (Ьойтапп е1 а1.. 1999). Характеристика системы показала. что эффективность репликации зависит от разрешения (пермиссивности) клетки хозяина и. что важно. от выбора адаптивных мутаций культуры клетки в кодирующих последовательностях белка НСУ. Было обнаружено. что репликация является чувствительной к интерферону-альфа. что обеспечивает свидетельство пригодности системы для скрининга лекарств. которые являются эффективными ш νινο. Также были сконструированы различные репликоны. в
- 4 012650 которых кодирующая последовательность неомицин-фосфотрансфераза была заменена, например, кодирующей последовательностью люциферазы или последовательностями, кодирующими слитый белок люцифераза-убихитин-неомицин фосфотрансфераза. Репликация последних различных репликонов может быть проанализирована с помощью подходящего анализа люциферазы, тогда как репликация прежнего репликона требует определения числа копий РНК.
^а(акй1 и др. (2003) продемонстрировали с помощью Нозерн-блоттинга и количественной КТ-РСК (полимеразной ценной реакции обратной транскриптазы), что накопление РНК НСУ в клетках МН-14, содержащих репликон НСУ, ингибируется СкА, а не иммуносупрессивным макролидом РК506 и неиммуносупрессивным производным СкА Р8С 833. Их анализы, которые включали 7-дневное воздействие активных агентов на клетки, показали, что титр РНК НСУ уменьшается примерно в 200 раз в присутствии 1 мкг/мл циклоспорина А. Они далее обнаружили, что неиммуносупрессивный циклоспорин |Ме11е|4-СкА также ингибирует репликацию НСУ. Результаты указывали на то, что [Ме11е]4-СкА примерно так же эффективен в снижении титра РНК НСУ, как и СкА.
Для того чтобы определить, имеет ли циклоспорин согласно настоящему изобретению анти-НСУ активность и, если он имеет такую активность, то какова эта активность по сравнению с активностью СкА и [Ме11е]4-СкА, были выполнены эксперименты, чтобы сравнить ингибирующие эффекты СкА, [Ме11е]4-СкА и [П-МеА1а]3-[Е(Уа1]4-СкА в системах репликона НСУ.
В анализах использовали клетки Ний 5-2, которые содержали бицистронную РНК, кодирующую слитый белок люцифераза-убихитин-неомицин фосфотрансфераза светлячка, и белки НСУ N83-5. Вирусные последовательности были получены из вируса НСУ генотипа 1Ь. Клетки выращивали в среде КРМ1 1640 (производитель 01Ьсо) с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина (производитель Ьйе Тесйпо1од1ек), 1х заменимой аминокислоты (производитель ЬИе Тесйпо1од1ек), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 250 мкг/мл 0418 (Генетицин, Оепейсш, производитель ЫГе Тесйпо1од1ек) при 37°С и 5% СО2. Для антивирусного анализа (репликации) клетки высевали при плотности 7000 клеток на лунку в 96-луночный планшет У1ете Р1а!екТМ (производитель Раскагб) в той же самой среде, за исключением 0418. После 24-часовой инкубации среду удаляли, добавляли последовательные разбавления испытуемых соединений в среде и клетки инкубировали в течение еще 72 ч.
Антивирусное действие оценивали с помощью анализа люциферазы или количественной КТ-РСК. Для выполнения анализов люциферазы среду удаляли, а клетки промывали с использованием фосфатного буфера РВ8. После лизиса в 50 мкл буфера С1о-1ук1к (производитель Рготеда) в течение 15 мин к клеточным лизатам добавляли 50 мкл реагента для анализа люциферазы 81еаб-01о Ьикйегаке Аккау Кеадеп! (производитель Рготеда). Активность люциферазы измеряли с использованием люминометра и сигнал от каждой тестовой ячейки выражали как процент от сигнала, измеренного в ячейках культур, не подвергаемых воздействию тестового соединения.
Распределение клеток и цитостатические эффекты оценивали в параллельных культурах в стандартном 96-луночном планшете (ВескФп-Оюкшкоп) с использованием МТТ анализа (СеПТйег 96К АО,|ео1К Жп-КабюасЦуе Се11 РгойГегайоп Аккау, Рготеда). В этом анализе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий (МТ8) восстанавливался биологически до формазана, который количественно определялся при 498 нм в планшет-ридере. Продуцирование формазана непосредственно связано с числом живых клеток.
В анализе КТ-РСК количественно определяли область репликонов неомицина с использованием датчиков последовательности АВ1 РК18М 7700 (Аррйеб Вюкук1етк, Рок1ег Сйу, СА). Прямыми и обратными используемыми праймерами являлись 5'-СС66СТАССТОСССАТТС-3' и 5'ССА6АТСАТССТ6АТС6АСАА6-3' соответственно. Флуорогенной пробой являлось соединение 5'АСАТС6САТС6А6С6А6САС6ТАС-3'. В качестве внутренней контрольной пробы использовалась плазмида, содержащая часть генной последовательности неомицин фосфотрансферазы.
Результаты этих экспериментов позволили вычислить для различных циклоспоринов ЕСА,, которая представляет собой эффективную концентрацию, необходимую для ингибирования репликации репликона НСУ на 50%, а также СС 50, которая представляет собой концентрацию, необходимую для ингибирования пролиферации экспоненциально растущих клеток на 50%, и индекс селективности 81, который является отношением СС50 к ЕС 50.
В табл. 3 показаны значения, полученные от клеток Ний 5-2, с использованием анализов активности люциферазы для оценки эффективности репликации и МТТ анализов для калибровки анализов люциферазы и для оценки цитостатических эффектов соединений. В соответствии с наблюдениями ^Уа(акй1 и др. (2003), обсуждаемыми выше, СкА и [Ме11е]4-СкА имели сходную анти-НСУ активность (репликацию).
Неожиданным образом, [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-СкА оказался значительно более сильнодействующим, чем СкА и [Ме11е]4-СкА. Также было отмечено, что 50%-ная цитостатическая концентрация (СС50) для [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-СкА была значительно выше, чем значения, определенные для СкА и [Ме11е]4-СкА. Соответственно, было обнаружено, что [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-СкА имеет значительно более высокий индекс селективности по сравнению с двумя другими циклоспоринами. Аналогичные эксперименты, в ко
- 5 012650 торых значения ЕС50 были получены из определений титров РНК, с использованием количественной КТРСК, привели к подобным заключениям. Значения 81, равные 45*, 73 и 625*, были получены для С'/Л. [Ме11е]4-С§А и [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А соответственно. Звездочки указывают, что представлено более низкое из двух независимо определенных значений.
Таблица 3
ЕС50, СС50 и значения 81, определенные из анализов люциферазы репликации РНК НСУ и МТТ анализов цитотоксичности в клетках Ний 5-2, включающих содержащий люциферазу мини-репликон НСУ
Соединение ЕС50 (мкг/мл) ± среднеквадратичное отклонение ССи (мкг/мл) ± среднеквадратичное отклонение Индекс селективности
СзА 0,28 ±0,13 11,6 ± 5.6 41
[Ме11е]4-СзА 0,03 ± 0,04 >27 >900
[1Э-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-СзА 0,22 14 64
Антивирусная активность [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А, измеренная в инфицированных клеткахмишенях с рекомбинантным НСУ.
Анти-НСУ активность [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С§А по сравнению с С§А далее определяли в системах культуры, приближающихся к обстановке ίη νίνο. В методе использовали клетки гепатомы (гепатоаденомы), которые были инфицированы инфекционной полноразмерной химерной структурой НСУ или тем же самым вирусом, который модифицировали, чтобы он нес ген рецептора люциферазы. После обработки инфицированных клеток с помощью циклоспорина согласно изобретению или С§А измеряли активность люциферазы, непосредственно связанную с ингибированием вирусной репликации.
Для инокуляции клеток гепатоаденомы в этих анализах использовали инфекционные вирусы полноразмерного НСУ химерного генома между штаммами НСУ 16 и ШН1 (1е1). Структуру 1е1 вируса так же изменяли, чтобы получить бицистронный геном, несущий ген репортера люциферазы (1с1-Еие). Спустя 24 и 96 ч после трансфекции транскриптов РНК геномов путем электропорации клеток Ний-7,5 собирали надосадочную жидкость клеточных культур. Надосадочную жидкость отфильтровывали (0,45 мкМ) и определяли ССГО50 (инфекционная доза клеточной культуры 50) на мл с использованием анализа ограниченного разбавления согласно Ьтбепйасй и др. (8с1епсе, 309 (2005), 623-626). ССГО50 составляли 1,3х105 для 1с1 и 4,2х103 для 1с1-Ьис.
В анализах использовали клетки Ний-7-Еипе1: или Ний-7,5 (Ьойтапп е1 а1., 8аепсе 285 (5424), (1999), 110-113). Клетки выращивали в среде Игла, модифицированной по Дальбекко (ЭЫЬессо'х тобШеб Еад1е'§ Мебшт, ЭМЕМ: производитель С1йсо), с добавленнием 10% эмбриональной бычьей сыворотки, инактивированной при высокой температуре (ЕС8) (1п1едга), 1х заменимой аминокислоты (С1йсо), 100 Ед/мл пенициллина (С1йсо), 100 мкг/мл стрептомицина (С1йсо) или 25 мкг/мл гигромицина (С1йсо) для Ний-моноклеток при 37°С и 5% СО2. Для антивирусных анализов (репликации) клетки Ний-7-Еипе1: и Ний-7,5 высевали при плотности 2х104 или 4х104 клетки на лунку 12-луночного планшета. 24 ч спустя среду заменяли на 0,5 мл вирусного материала 1с1-Ьис (12-луночный планшет) или 0,25 мл 1с1 вирусного материала (12-луночный планшет). Через 4 ч вирусный инокулят заменяли средой, содержащей различные концентрации СТА или [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А и затем инкубировали в течение еще 72 ч.
Ингибирование вирусной репликации оценивали с помощью анализа люциферазы. Для выполнения анализа люциферазы клетки собирали, промывали фосфатным буфером (РВ8) и лизировали в буфере для лизиса люциферазы (1%-ный Тритон Х-100, 25 мМ глицилглицин, 15 мМ Мд8О4, 4мМ ЕСТА и 1 мМ ΌΤΤ). Активность люциферазы светлячка измеряли согласно Кпедег и др. (1. У1го1., 75 (10), (2001), 46144624). Вкратце, после одного цикла заморозки/таяния, клетки повторно суспендировали и 100 мкл лизата клетки смешивали с 360 мкл аналитического буфера (25 мМ глицилглицина, 15 мМ Мд8О4, 1 мМ ΌΤΤ, 2 мМ АТР, 15 мМ буфера фосфата калия, рН 7,8) и 200 мкл раствора субстрата (200 мМ люциферина, 25 мМ глицилглицина). В конце измеряли люминесценцию с использованием люминометра Ьита! ЙВ9507 (Веййо1б) на 20 образцов.
В этих примерах (фиг. 1 и 2) и [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А (белые столбцы), и С§А (черные столбцы) приводили к антивирусной активности, зависимой от дозы, в силу чего оказалось, что [Э-МеА1а]3[Е1Уа1]4-С§А снова превосходит С§А, таким образом, подтверждая данные, полученные с субгеномными репликонами. Требовалась в 10 раз большая концентрация С§А, чтобы привести к тому же самому ингибирующему эффекту репликации, что и циклоспорин согласно изобретению.
Высокое сродство циклоспорина согласно изобретению по отношению к циклофилину.
В вышеупомянутых наблюдениях \Уа1а51и и др. (2003) и Ыадака^а и др. (2003), анти-НСУ эффект был связан со связывающей способностью циклоспоринов по отношению к циклофилинам. Чтобы определить более мощный ингибитор РР1а§е активности циклофилина, например циклофилина А, и, следовательно, репликации НСУ, для циклофилинов измеряли влияние С§А, [Ме11е]4-С§А и [О-МеА1а]-[Е1Уа1]4С§А на активность РР1а§е.
В анализах использовался коммерчески доступный рекомбинантный циклофилин человека (8щта). Активность РР!а§е циклофилинов определяли с использованием спектрофотометрического анализа,
- 6 012650 включающего химотрипсин, согласно багаа-Есйуета и др. (ВВК.С, 191 (1993), 70-75). Этот способ основывается на высокой трансселективности химотрипсина для пептидов типа Н-сукцинил-а1а-а1а-ргорйе-п-нитроанилид. Расщепление пептидов высвобождало фрагмент паранитроанилина, который может быть обнаружен и количественно определен при 390 нм. Гидролиз цис-формы ограничивался скоростью цис-транс-изомеризации, осуществляемой с помощью циклофилина А. Пептид выдерживали в 25 нМ растворе БЮ в 2,2,2-трифторэтаноле при 470 мМ, чтобы увеличить популяцию цис-конформера пептидов. Анализ выполняли на спектрофотометре с расщепленным пучком и температуру водяной бани устанавливали на 5°С. Циклофилин (общая концентрация фермента 7500 пмоль/мг; 81дта) растворяли до концентрации 20 нМ в буфере (35 мМ НЕРЕ8 и 0,26 мг/мл химотрипсина (удельная активность 50 единиц/мг), рН 7,8 с помощью КОН) и инкубировали в течение 6 мин при комнатной температуре, а затем в течение 54 мин на водяной бане. СТА. [Ме11е]4-С§А или [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А добавляли соответственно к этим инкубациям, используя диапазон концентраций 2-50 нМ. Затем в кювету с образцом добавляли 3,5 мл инкубированного циклофилина. Кювета сравнения содержала пробу смеси, в которой реакция уже завершилась, для компенсации луча сравнения. Пептид добавляли при концентрации 25 мкМ для инициирования реакции, и изменение поглощения контролировали в 10 точках данных в секунду. Для контроля скорости определяли также для параллельной реакции, в которой отсутствовал циклофилин. Эти холостые скорости гидролиза пептида (т.е. в отсутствие циклофилина) вычитали из скоростей в присутствии циклофилина А.
Начальные скорости реакции, полученные из анализов РР1а§е следовых количеств веществ в течение времени, анализировали с помощью регрессионного анализа первого порядка, используя преобразование первого порядка, по изменению поглощения при 390 нм. Общую концентрацию фермента (Е1), константу диссоциации ингибитора (К1) и константу скорость-определяющей реакции рассчитывали с помощью программного обеспечения Е|§8у8 (2003, Вюкой) путем аппроксимации данных, полученных из регрессионного анализа в уравнении тесного связывания мультипротеина ингибитора.
Уравнение тесного связывания мультипротеина ингибитора имело следующую формулу:
ν = к * Р-к * (-Ь-вцг! (Ь*Ь- 4* с))/2 где Ь определяют как Ь=-(Е1*Р+1+К1) и с определяется как с=Е1*Р*1.
Е1, К1 и к рассчитывали на компьютере один раз для данного набора данных, затем строили графическое представление данных, и линия соответствовала точкам, предполагающим тесное связывание ингибитора с единственным белком, определяемое следующими уравнениями:
где В=Е1*Р+1+К1 и
С=Е1*Р*1.
Таблица 4 Е, К1 и значения к циклофилина А для С§А, [Ме11е]4-С§А и [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А, определенные из анализов активности РРТаке.
Соединение Е( (пмоль/мг) К, (нМ) К(3-1)
СзА 7500 9,79 ±1,37 0,17 ± 0,0069
[Ме11е]4-СзА 7500 2,11 ±0,32 0,17 ± 0,0068
{О-МеА1а]3-[ЕП/а!]4-СзА 7500 0,34 ±0,12 0,16 ±0,0074
Самое низкое значение К1 циклофилина А, наблюдаемое для циклоспорина согласно изобретению, подтверждало большую потенциальную возможность антивирусной активности, специфичности и индекса селективности (как упомянуто выше) по сравнению с СТА и [Ме11е]4-С§А. Как ни странно, неиммуносупрессивный [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А показал почти в 6 раз более высокое сродство по отношению к циклофилину по этому примеру по сравнению с другим неиммуносупрессивным циклоспорином [Ме11е]4-С§А.
Вышеописанный эксперимент показал, что [Э-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А является более эффективным ингибитором репликации НСУ, чем любой другой испытанный циклоспорин. Эта повышенная антиНСУ активность соотносится с повышенной циклофилинсвязывающей активностью [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4С§А.
Клиренс репликона НСУ и ребаунд эффект (эффект отмены).
Рецидив инфекции НСУ представляет собой главную проблему болезни, особенно при проведении потенциально эффективного лечения, например при применении циклоспорина и/или интерферона. Для того чтобы изучить, отражена ли более высокая анти-НСУ активность циклоспорина согласно изобретению по сравнению с СТА в отношении способности соединения более эффективно лечить клетки, производящие репликон НСУ от них, проводили анализ клетки ίη νίίτο, основанный на присутствии селективного препарата 0418, для рекомбинантного продуцированного репликона.
В анализах использовали клетки Ний-9-13, клетки гепатоаденомы человека (Ний-7) (йойтапп еί а1., 8с1епсе 285 (5424), (1999), 110-113) Клетки выращивали в стандартной полной среде ЭМЕМ без воздействия 0418. Клетки культивировали в присутствии СТА или |О-МеА1а|3-|Е1Уа1|4-СзА (оба при концен
- 7 012650 трации 0,5 или 1 мкг/мл) или оставляли необработанными в течение 7 последовательных проходов. Выполняли контрольный анализ для того, чтобы гарантировать, что отсутствие селективного воздействия 0418 не повлияет на содержание репликона НСУ в течение нескольких проходов. Чтобы подтвердить, что клетки Ний-9-13, которые уже обрабатывали в течение 7 дней с помощью [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А, действительно очистились от их репликона, селекцию проб 0418 (1000 мкг/мл) повторно начинали в течение еще 2 проходов. Только те клетки, которые все еще несли репликон НСУ, были способны размножаться в этих условиях, а клетки без репликона погибали в присутствии 0418 в течение фазы отмены.
Реакцию ВТ-РСВ выполняли на экстрактах вирусного РНК образцов, отобранных в различных точках прохода. Прямыми и обратными используемыми правмерами являлись 5'СС00СТАССТ0СССАТТС-3' и 5'-ССА0АТСАТССТ0АТС0АСАА0-3' соответственно. Флуорогенной пробой являлось соединение 5'-АСАТС0САТС0А0С0А0САС0ТАС-3'. В качестве внутренней контрольной пробы использовалась плазмида, содержащая часть генной последовательности неомицин фосфотрансферазы. Результаты анализировали и выражали как количество репликона РНК (нанограмм) в 1000 клеток и использовали для построения графика.
Результаты этих экспериментов (фиг. 3) показали превосходящий антивирусный эффект [ΌМеА1а]3-[Е1Уа1]4-С§А по сравнению с СкА в этом стандартном клеточном анализе ίη νίίτο. Циклоспорин согласно изобретению неожиданно показал вируцидный эффект, а не только вирустатический эффект как другой иммуносупрессивный СкА. Действительно, когда обработанные с помощью [Ц-МеА1а]3|Е1Уа1|4-С.'5А клетки Ний-9-13 (кружки и квадратики на фиг. 3) снова культивировали в присутствии 0418 (фаза отмены), культуры погибали в отличие от клеток, обработанных с помощью СТА (ромбики и треугольники). Обе культуры, обработанные с помощью СТА для 7 последовательных проходов, были способны размножаться в присутствии 0418. Это подтвердило, что [Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А способен вылечивать клетки Ний-9-13 от их репликона НСУ.
Комбинация лекарств.
Интерферон (ΙΕΝ) является частью общеупотребительной терапии инфекции НСУ. Эффект комбинации [Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А / ΙΕΝ-α 2а оценивали, используя метод Рпсйатб и 8Ыртап (ΛηΙίνίπι1 Век, 1990, 14, 181-205). Вкратце, теоретический аддитивный эффект рассчитывается исходя из кривых дозаответ индивидуальных соединений по уравнению формулы
Ζ = X + Υ (1 - X) где X представляет собой ингибирование, оказанное одним только [Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А, а
Υ представляет один ΙΕΝ-α 2а;
Ζ представляет собой эффект, произведенный комбинацией [Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А с ΙΕΝ-α 2а.
Теоретическую совокупную поверхность вычитают из фактической экспериментальной поверхности, приводя к горизонтальной поверхности, которая соответствует нулевой плоскости; когда комбинация аддитивна, поверхность, которая находится выше нулевой плоскости, указывает на синергический эффект комбинации, а поверхность ниже нулевой плоскости указывает на антагонизм. Антивирусный анализ выполняли, по существу, как описано выше для клеток Ний 5-2 за исключением того, что соединения добавляли в шахматном порядке. Для каждого соединения использовали три репликационных планшета, чтобы измерить кривую доза-ответ для каждого индивидуального соединения. Данные, полученные от всех трех планшетов, использовали для расчета теоретической совокупной поверхности. Исследования комбинации для каждой пары соединений также производили трижды. Данные анализировали на дисперсность с помощью теста АNΟУА.
Незначительная синергическая активность была отмечена при самых высоких используемых концентрациях ΙΕΝ-α 2а, но в целом объединенную анти-НСУ активность [Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А с ΙΕΝ-α 2а можно рассматривать как аддитивную (фиг. 4).
Результаты с [Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А могут быть просуммированы следующим образом.
[Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А имеет более высокую анти-НСУ активность и является менее цитотоксичным, чем СТА. как показано в субгеномной системе репликона НСУ.
Это было подтверждено в клеточной культуре гепатоаденомы, инфицированной полноразмерным инфекционным химерным геном из штаммов НСУ 16 и ШН1.
[Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А способен лечить клетки от их НСУ репликона более эффективно, чем СкА. Эти эффекты связаны с более выраженным сродством к связыванию циклофилина.
Анти-НСУ активность комбинации |^-МеА1а|3-|ЕιУа1|''ι-СΤА/IΕN-α 2а аддитивна.
[Ц-МеА1а]3-^Уа1]4-С8А может применяться для лечения пациентов, инфицированных НСУ. Активное соединение может вводиться любым обычно используемым способом. Оно может вводиться парентерально, например, в форме инъецируемых растворов или суспензий, или в форме инъецируемых осаждаемых составов. Предпочтительно оно будет применяться перорально в форме растворов или суспензий для питья, таблеток или капсул. Фармацевтические композиции для перорального введения, включающие циклоспорин согласно изобретению, описаны в примерах. Примеры показывают, что такие фармацевтические композиции в характерном случае включают циклоспорин согласно изобретению и
- 8 012650 одно или более фармацевтически приемлемых веществ-носителей. Как правило, эти композиции являются концентрированными и перед введением должны быть объединены с соответствующим разбавителем, например водой. Фармацевтические композиции для парентерального введения в характерном случае также включают один или более наполнителей. Необязательные наполнители включают изотонический агент, буфер или другой рН-регулирующий агент и консервант. Эти наполнители могут быть добавлены для сохранения композиции и для достижения предпочтительных диапазонов рН (приблизительно 6,57,5) и осмотических свойств (приблизительно 300 мосм/Ь).
Дополнительные примеры композиций циклоспорина для орального применения могут быть найдены в патентах США № 5525590 и № 5639724 и заявке на патент США № 2003/0104992. Требуемая дозировка циклоспорина согласно изобретению для перорального применения от ежедневного до трех раз в неделю может составлять приблизительно от 1 до приблизительно 100 мг/кг, предпочтительно приблизительно от 1 до приблизительно 20 мг/кг. Для внутривенного введения соответствующая дозировка может быть приблизительно от 1 до приблизительно 50 мг/кг, предпочтительно приблизительно от 1 до приблизительно 25 мг/кг. Под эффективным количеством циклоспорина согласно изобретению понимают такое количество, которое при неоднократном введении пациенту, нуждающемуся в лечении инфекции НСУ, в ходе терапевтического режима приводит к объективному клиническому ответу, такому как статистически существенное уменьшение титра НСУ сыворотки или существенное уменьшение активности АТТ сыворотки у пациента.
Была выполнена начальная фаза 1 клинических испытаний, чтобы определить безопасность оральных доз |О-МсА1а|3’-|Е1Уа1|4-С'5А при приеме внутрь и определить фармакокинетический профиль и безопасный профиль лекарственного вещества. Испытания показали, что дозы от 50 до 1600 мг в микроэмульсии в воде хорошо переносятся. Наблюдались умеренные и непродолжительные побочные эффекты, включая тошноту, рвоту, боль в животе, умеренные головные боли. Эти побочные эффекты не были связаны с дозой.
Клиницистом должны быть учтены многочисленные факторы при определении пробных доз для проверки эффективности фармацевтической композиции, включающей циклоспорин по настоящему изобретению, в отношении инфекции НСУ. Первичными среди них являются токсичность и период полувыведения выбранного циклоспорина согласно изобретению. Дополнительные факторы включают вес пациента, возраст пациента, общее состояние пациента (включая существенные системные или серьезные заболевания, включая декомпенсированное заболевание печени, тяжелое заболевание костного мозга, существовавшее ранее, и другие вирусные инфекции), стадию инфекции НСУ (острую против хронической), на что указывают, например, уровни аланиновой аминотрансферазы (АТТ) сыворотки, специфический генотип НСУ, предыдущая терапия инфекции НСУ, прием пациентом других лекарств и т.п. Курс лечения обычно требует повторного введения фармацевтической композиции по изобретению. Как правило, адекватная доза препарата обычно применяется (вводится) 3-7 раз в неделю, и продолжительность лечения может быть приблизительно от 4 недель до 6 месяцев, предпочтительно приблизительно от 4 недель до приблизительно 12 месяцев. Лечение может сопровождаться определениями НСУ в сыворотке и измерением уровней АТТ сыворотки. Конечной точкой лечения является вирологический ответ, т.е. отсутствие НСУ в конце курса лечения, спустя несколько месяцев после начала лечения или спустя несколько месяцев после завершения лечения НСУ в сыворотке может быть измерен на уровне РНК такими способами как количественная КТ-РСК. или Нозерн-блоттинг, или на уровне белкаиммунологическим ферментным анализом или усовершенствованным хемилюминесцентным иммуноанализом вирусных белков.
Конечная точка может также включать определение уровня АТТ сыворотки в нормальном диапазоне.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может включать один или более других компонентов, активных в отношении инфекции НСУ, в дополнение к циклоспорину по настоящему изобретению, как, например, другое антивирусное лекарственное вещество, например рибавирин, или интерферон-альфа циклоспорин по изобретению и такой другой активный компонент могут вводиться вместе как часть одной и той же фармацевтической композиции или могут вводиться по отдельности как часть соответствующей схемы приема, разработанной для получения преимуществ комбинированного лечения. Соответствующая схема приема, количество каждой вводимой дозы и конкретные интервалы между приемами каждого активного агента будут зависеть от конкретной комбинации используемых активных агентов, состояния пациента, которого лечат, и других факторов, обсуждаемых в предыдущем разделе. Такие дополнительные активные компоненты в общем случае будут вводиться в количествах, меньших или равных тем, в которых они являются эффективными как отдельные терапевтические средства. Одобренные Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (ΡΌΑ) дозировки для таких активных средств, которые уже получили одобрение ΡΌΑ для применения на людях, опубликованы и доступны специалистам в данной области.
Все патенты, заявки на патенты и публикации, которые цитируются в настоящей работе, рассматриваются как включенные в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.
Изобретение далее детально описано посредством следующих примеров. Примеры представлены для целей иллюстрации специалисту в данной области техники и не предназначены для ограничения
- 9 012650 объема изобретения, как оно описано в формуле изобретения. Таким образом, изобретение не должно рассматриваться как ограниченное представленными примерами, но должно рассматриваться как охватывающее любое и все изменения, которые являются очевидными на основании представленного здесь описания.
Пример 1. Синтез [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-СкА.
(Переведено из докторской диссертации 1еап Егапсок Ошсйои, озаглавленной Эе поцуеаих апа1одиек бе Сус1окрогт А сотте адеп! апИ-ШУ-Г' («Новые аналоги циклоспорина в качестве агентов против ВИЧ-1»), ЕасиИе бек 8с1епсек, Ишуегайу о! Ьаикаппе, СН-1015 Ьаикаппе, Швейцария (2001)).
Синтез Н-МеБеи-Уа1-МеБеи-А1а-О-Л1а-МеБеи-МеЕеи-МеУа1-МеВ1п1(ОЛс)-АЬи-8аг-ОМе.
4-Диметиламинопиридин (ОМАР) (41,5 ммоль; 5,8 г) добавляли к раствору циклоспорина (СкА) (8,3 ммоль; 10 г) в 100 мл уксусного ангидрида. Раствор перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь затем разбавляли 600 мл этилацетата и промывали дважды водой и четыре раза насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над безводным №128О+ фильтровали и растворитель испаряли при пониженном давлении. Полученный желтый остаток хроматографировали на силикагеле (элюент: дихлорметан/метанол 98:2) и перекристаллизовали из эфира. Выделяли 9,5 г МеВт! (ОАс)-СкА в виде белого порошка с выходом 92%.
Тетрафторборат триметилоксония (22,5 ммоль, 3,3 г) добавляли к раствору МеВт!(ОАс)-Ск (7,5 ммоль; 9,4 г) в 60 мл дихлорметана. После 16 ч выдерживания при комнатной температуре добавляли 35 мл 0,26 М раствора метилата натрия в метаноле. Через 1 ч добавляли 35 мл метанола и 35 мл 2 н. раствора серной кислоты и реакционную смесь перемешивали в течение еще 15 мин, нейтрализовали до рН 6,0 с помощью насыщенного раствора КНСО3 (28 мл) и экстрагировали дважды этилацетатом. Органическую фазу промывали 2 раза насыщенным раствором ИаС1, сушили над безводным Иа28О4 и фильтровали. Затем растворитель испаряли под уменьшенным давлением. Остаток хроматографировали на силикагеле (элюент: этилацетат/метанол 5:1). Получали 7,3 г Н-МеЕеи-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеиМеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-8аг-ОМе (выход: 76%).
НРЬС ΐτ=268,23 мин (98%).
Е8/М8: т/ζ: 1277,5 [М+Н+], 639,2 [М+2Н+].
Синтез Н-Уа1-МеЕеи-А1а-П-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-8аг-ОМе.
4-Диметиламинопиридин (ОМАР) (2,3 ммоль; 334 мг) и фенилизотиоцианат (6,9 ммоль; 0,75 мл) добавляли к раствору Н-МеЕеи-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-8аг-ОМе (4,6 ммоль; 7 г) в 48 мл тетрагидрофуране. Через 2 ч растворитель испаряли и неочищенный продукт хроматографировали на силикагеле (элюенты: метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ)/этилацетат 9:1 (1); МТВЕ/метанол 9:1 (2)). Получали 5,8 г Рй-ХН-С(8)-МеЕеи-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1МеВт1(ОАс)-АЬи-8аг-ОМе (выход 90%).
13,8 мл трифторуксусной кислоты добавляли к раствору последнего соединения (4 ммоль; 5,6 г) в 290 мл дихлорметана. После 1 ч реакции смесь нейтрализовывали, используя КНСО3, и разбавляли 500 мл дихлорметана. Органическую фазу промывали 2 раза насыщенным раствором ИаС1, сушили над безводным №ь8О4 и фильтровали. Затем испаряли растворитель при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (элюенты: МТВЕ/этилацетат 9:1 (1); МТВЕ/метанол 3:1 (2)). Получали 2,8 г Н-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-8аг-ОМе (выход 61%).
НРЬС !г=25,80 мин (99%).
Е8/М8: т/ζ: 1050,5 [М+Н+], 547,7 [М+2Н+].
Синтез Вос-П-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеЕеи-А1а-П-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-ХМеСН2-СН2-ОН.
Фторо-И,Х,Х'-тетраметилформамидиний гексафторофосфат (ТРЕН) (0,96 ммоль; 0,25 г) добавляли в инертной атмосфере к раствору Н-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-8агОМе (0,87 ммоль; 1,00 г), диизопропилэтиламин (2,78 ммоль; 0,48 мл) и Вос-П-МеА1а-Е1Уа1-ОН (0,96 ммоль; 0,32 г) в 15 мл дихлорметана. Через 15 мин дихлорметан испаряли и остаток извлекали этилацетатом. Органическую фазу промывали последовательно насыщенным раствором ИаНСО3, 10%-ным раствором лимонной кислоты и насыщенным раствором ИаС1, а затем сушили над безводным №128О4 и концентрировали. Хроматография на силикагеле (в смеси этилацет/метанол 98:2) давала 1,14 г (90%) Вос-О-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-8аг-ОМе.
Последний продукт (0,64 ммоль; 0,93 г) растворяли в 45 мл безводного метанола и небольшими порциями с интервалом в 15 мин в течение 3 ч 30 мин добавляли боргидрид натрия (25,5 ммоль; 0,96 г). Через 4 ч реакционную смесь охлаждали до 0°С, гидролизовали добавлением 10%-ной лимонной кислоты и концентрировали. Остаток извлекали этилацетатом. Органическую фазу промывали 10%-ным раствором лимонной кислоты и насыщенным раствором ИаС1, а затем сушили над безводным Иа28О4 и концентрировали. После хроматографии на силикагеле (в смеси этилацетат/метанол 95:5) получали 0,63 г (81%) Вос-О-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-ХМе-СН2-СН2ОН.
Е8/М8: т/ζ: 1434,9 [М+Н+], 717,9 [М+2Н+].
- 10 012650
Синтез Н-О-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеЬеи-А1а-О-А1а-МеЬеи-МеЬеи-МеУа1-МеВт1-АЬи-ОН.
Метансульфокислоту (3,18 ммоль; 2,060 мл) добавляли к раствору Вос-О-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеБ-еиА1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1(ОАс)-АЬи-ХМе-СН2-СН2-ОН (0,425 ммоль; 610 мг) в 42,5 мл метанола и смесь нагревали 50°С и выдерживали при этой температуре. Ход реакции контролировали с помощью НРЬС и масс-спектрометрии. Через 80 ч смесь охлаждали до 0°С и гидролизовали добавлением 1М раствора ЫаНСО3. Метанол удаляли и остаток извлекали этилацетатом. Органическую фазу промывали 1М раствором ЫаНСО3 и затем насыщенным раствором ЫаС1, сушили над безводным Ыа28О4 и концентрировали. Продукт (557 мг), Н-О-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеЕеи-А1а-П-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1МеВт1(ОАс)-АЬи-О-СН2-СН2-ПНМе, использовали в следующей стадии без очистки.
Продукт (0,42 ммоль; 557 мг) растворяли в 20 мл метаноле и объединяли в инертной атмосфере с раствором метилата натрия (1,26 ммоль) в 1,26 мл метаноле. Через 18 ч при комнатной температуре реакционную смесь охлаждали до 0°С и добавляли по каплям гидроксид натрия (4,2 ммоль; 168 мг) в 5 мл воды. Через 21 ч при комнатной температуре реакционную смесь снова охлаждали до 0°С и нейтрализовали 1 М раствором КН8О4. Метанол удаляли, а остаток растворяли в этилацетате. Органическую фазу промывали полунасыщенным раствором ЫаС1, сушили над безводным Ыа28О4 и концентрировали. Продукт (335 мг; 64%), Н-О-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеЕеи-А1а-О-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1-МеВт1-АЬи-ОН, использовали в следующей стадии без очистки.
НРЬС 1г=26,27 мин (86%).
Е8/М8: т/ζ: 1235,5 [М+Н+], 618,2 [М+2Н+].
Синтез [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А.
В инертной атмосфере раствор Н-О-МеА1а-Е1Уа1-Уа1-МеЕеи-А1а-П-А1а-МеЕеи-МеЕеи-МеУа1МеВт1-АЬи-ОН (0,162 ммоль; 200 мг) и симм.-коллидина (1,78 ммоль; 0,24 мл) в 50 мл дихлорметана добавляли по каплям к раствору (7-азабензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфоний гексафторфосфата (РуАОР, 0,486 ммоль; 254 мг) в 3,2 л дихлорметана. Через 72 ч реакционную смесь гидролизовали добавлением 10%-го раствора Ыа2СО3. Дихлорметан испаряли и остаток извлекали этилацетатом. Органическую фазу промывали последовательно 0,1 н. раствором НС1 и насыщенным раствором №1С1. сушили над безводным Ыа28О4 и концентрировали. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с образованием 110 мг (59%) [П-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С§А.
НРЬС 4=30,54 мин (100%).
Е8/М8: т/ζ: 1217,6 [М+Н+], 609,3 [М+2Н+].
Пример 2. Композиции циклоспорина согласно изобретению для перорального применения.
Количества выражены в массовых процентах.
Пример А:
Циклоспорин по изобретению 10 <31усо(иго17535,95
М1д1усо181218
СгеторЬог РН4035,95
Альфа-токоферол0,1
Пример Б:
Циклоспорин по изобретению 10
Тетрагликоль2
Сар1ех 8002
1М1кко1 НСО-4085,9
Бутилгидрокситолуол (ВНТ)0,1
Пример В:
Пример Г:
Циклоспорин по изобретению10
ШусоГиго! 7539,95
М|д1усо181214
СгеторЬог РН4036
Бутилгидроксианизол (ВНА) 0,05-0,1
Циклоспорин по изобретению 10
Тетрагликоль
Муп1о1
СгеторНог КН40
Альфа-токоферол
74,9
0,1
- 11 012650
Пример Д:
Циклоспорин по изобретению 10
Этанол9
Пропиленгликоль8
СгеторКог РН4041
Глицерин монолинолеат32
Индивидуальные компоненты композиций А-Г и способы получения этих композиций описаны в заявке на патент Великобритании № 2222770.

Claims (6)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения инфекции вируса гепатита С (НСУ) или для предотвращения рецидива НСУ у пациента.
  2. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство дополнительно содержит, по меньшей мере, второй компонент, который является активным в отношении инфекции НСУ.
  3. 3. Фармацевтическая композиция для лечения инфекции НСУ или для предотвращения рецидива НСУ, включающая в качестве активных компонентов эффективное количество [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А и эффективное количество второго компонента, который является активным в отношении инфекции НСУ.
  4. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что она дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, разбавитель.
  5. 5. Способ лечения инфекции НСУ или предотвращения рецидива НСУ у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества [О-МеА1а]3-[Е1Уа1]4-С8А.
  6. 6. Способ по п.5, включающий дополнительное введение второго компонента, который является активным в отношении инфекции НСУ.
    Концентрация (мкг/мл)
EA200700725A 2004-10-01 2005-10-03 ПРИМЕНЕНИЕ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТА С И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИН EA012650B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IB2004003205 2004-10-01
PCT/IB2005/002940 WO2006038088A1 (en) 2004-10-01 2005-10-03 Use of [d-meala]3-[etval]4-cyclosporin for the treatment of hepatitis c infection and pharmaceutical composition comprising said [d-meala]3-[etval]4-cyclosporin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200700725A1 EA200700725A1 (ru) 2007-10-26
EA012650B1 true EA012650B1 (ru) 2009-12-30

Family

ID=34959441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200700725A EA012650B1 (ru) 2004-10-01 2005-10-03 ПРИМЕНЕНИЕ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТА С И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИН

Country Status (30)

Country Link
US (3) US7439227B2 (ru)
EP (1) EP1793844B1 (ru)
JP (1) JP4892486B2 (ru)
KR (1) KR101191833B1 (ru)
CN (1) CN101056648B (ru)
AT (1) ATE490778T1 (ru)
AU (1) AU2005290984B2 (ru)
BR (1) BRPI0515494A (ru)
CA (1) CA2580448C (ru)
CY (1) CY1114594T1 (ru)
DE (1) DE602005025232D1 (ru)
DK (1) DK1793844T3 (ru)
EA (1) EA012650B1 (ru)
ES (1) ES2357587T3 (ru)
GE (1) GEP20104960B (ru)
HK (1) HK1104236A1 (ru)
HR (1) HRP20110169T1 (ru)
IL (1) IL182362A0 (ru)
MA (1) MA28950B1 (ru)
MX (1) MX2007003387A (ru)
NZ (1) NZ554412A (ru)
PL (1) PL1793844T3 (ru)
PT (1) PT1793844E (ru)
RS (1) RS51614B (ru)
SG (1) SG139750A1 (ru)
SI (1) SI1793844T1 (ru)
TN (1) TNSN07084A1 (ru)
UA (1) UA88484C2 (ru)
WO (1) WO2006038088A1 (ru)
ZA (1) ZA200702610B (ru)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0320638D0 (en) 2003-09-03 2003-10-01 Novartis Ag Organic compounds
CA2573207C (en) 2004-07-14 2013-04-16 Novartis Ag Use of a combination of cyclosporin and pegylated interferons for treating hepatitis c (hcv)
US7196161B2 (en) 2004-10-01 2007-03-27 Scynexis Inc. 3-ether and 3-thioether substituted cyclosporin derivatives for the treatment and prevention of hepatitis C infection
DE602005010607D1 (de) 2004-11-22 2008-12-04 Astellas Pharma Inc Zyklosporinanalog
NZ555143A (en) 2004-12-23 2009-12-24 Novartis Ag Compositions for HCV treatment
KR20070089954A (ko) * 2004-12-23 2007-09-04 노파르티스 아게 플라비비리대 치료용 화합물
AU2006259348B2 (en) * 2005-06-17 2010-07-22 Novartis Ag Use of sanglifehrin in HCV
NZ567262A (en) 2005-09-30 2011-12-22 Scynexis Inc Cyclosporin derivatives and their use for the treatment and prevention of hepatitis C infection
US8329658B2 (en) 2005-09-30 2012-12-11 Scynexis, Inc. Arylalkyl and heteroarylalkyl derivatives of cyclosporine A for the treatment and prevention of viral infection
US7872097B2 (en) 2005-10-26 2011-01-18 Astellas Pharma Inc. Cyclic peptide compounds
RU2448976C2 (ru) 2006-04-11 2012-04-27 Новартис Аг Ингибиторы hcv/вич и их применение
CA2652662C (en) 2006-05-19 2015-11-03 Scynexis, Inc. Methods for the treatment and prevention of ocular disorders
WO2008043797A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-17 Novartis Ag Use of modified cyclosporins
WO2008069917A2 (en) 2006-11-20 2008-06-12 Scynexis, Inc. Novel cyclic peptides
MX2009011512A (es) 2007-05-02 2009-11-12 Astellas Pharma Inc Nuevos compuestos peptidos ciclicos.
WO2009042892A1 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Oregon Health & Science University Cyclic undecapeptides and derivatives as multiple sclerosis therapies
WO2009098533A1 (en) * 2008-02-08 2009-08-13 Debiopharm Sa Non -immunosuppressive cyclosporin for the treatment of muscular dystrophy
US20090306033A1 (en) * 2008-06-06 2009-12-10 Keqiang Li Novel cyclic peptides
WO2010002428A2 (en) 2008-06-06 2010-01-07 Scynexis, Inc. Novel macrocyclic peptides
BRPI0920502A2 (pt) * 2008-11-06 2015-12-22 Debio Rech Pharma Sa compostos cicloundecadepsipeptídeos e seu uso como medicamento
JP5780969B2 (ja) 2008-12-31 2015-09-16 サイネクシス，インコーポレーテッド シクロスポリンａの誘導体
WO2010088573A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis c infection
US8481483B2 (en) 2009-02-19 2013-07-09 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues
US8512690B2 (en) 2009-04-10 2013-08-20 Novartis Ag Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors
US20110182850A1 (en) 2009-04-10 2011-07-28 Trixi Brandl Organic compounds and their uses
US8685917B2 (en) 2009-07-09 2014-04-01 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues
US8349312B2 (en) 2009-07-09 2013-01-08 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Proline substituted cyclosporin analogues
US8367053B2 (en) 2009-07-09 2013-02-05 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Cyclosporin analogues
US20110117055A1 (en) 2009-11-19 2011-05-19 Macdonald James E Methods of Treating Hepatitis C Virus with Oxoacetamide Compounds
CN102869367A (zh) 2009-12-09 2013-01-09 西尼克斯公司 新颖的环肽
US8623814B2 (en) 2010-02-23 2014-01-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Antiviral agents
WO2011141891A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Use of cycloundecadepsipeptide compounds
US9217015B2 (en) 2010-07-16 2015-12-22 S&T Global Inc. Cyclosporin derivatives for the treatment and prevention of a viral infection
US9573978B2 (en) 2010-08-12 2017-02-21 S&T Global, Inc. Cyclosporin derivatives for the treatment and prevention of a viral infection
AU2011311706B2 (en) 2010-10-05 2015-11-12 Debiopharm S.A. New treatments of Hepatitis C virus infection
EA201390532A1 (ru) 2010-10-08 2013-09-30 Новартис Аг Композиции сульфамидых ингибиторов ns3, содержащие витамин е
JP6110791B2 (ja) * 2010-11-30 2017-04-05 ノバルティス アーゲー Ｃ型肝炎ウイルス感染症の新規治療
US9890198B2 (en) 2010-12-03 2018-02-13 S&T Global Inc. Cyclosporin derivatives and uses thereof
JO3337B1 (ar) * 2010-12-13 2019-03-13 Debiopharm Sa تركيبات صيدلية تشمل أليسبوريفير
JP2014509628A (ja) 2011-03-31 2014-04-21 ノバルティス アーゲー Ｃ型肝炎ウイルス感染症を治療するためのアリスポリビル
PL2694087T3 (pl) * 2011-04-01 2015-06-30 Novartis Ag Leczenie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B samego lub w połączeniu z zakażeniem wirusem zapalenia wątroby typu delta i towarzyszącymi chorobami wątroby
SG193908A1 (en) * 2011-04-13 2013-11-29 Novartis Ag Treatment of hepatitis c virus infection with alisporivir
EP2760461A1 (en) 2011-09-27 2014-08-06 Novartis AG Alisporivr for treatment of hepatis c virus infection
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
AR088463A1 (es) 2011-10-21 2014-06-11 Abbvie Inc Metodos para el tratamiento de hcv
ES2527544T1 (es) 2011-10-21 2015-01-26 Abbvie Inc. Tratamiento mono (PSI-7977) o de combinación con AAD para su uso en el tratamiento del VHC
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
CN104284671A (zh) 2012-05-07 2015-01-14 诺华股份有限公司 使用阿拉泊韦的药代动力学调节
AR090964A1 (es) * 2012-05-09 2014-12-17 Novartis Ag Proceso para la elaboracion de undecapeptidos ciclicos
WO2014085623A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Novel [n-me-4-hydroxyleucine]-9-cyclosporin analogues
US20140205566A1 (en) 2012-11-30 2014-07-24 Novartis Ag Cyclic nucleuoside derivatives and uses thereof
WO2015008223A1 (en) 2013-07-17 2015-01-22 Novartis Ag Treatment of hepatitis c virus infection with alisporivir and ribavirin
JP2016538317A (ja) 2013-08-26 2016-12-08 エナンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｃ型肝炎を防止または治療するための新規シクロスポリン類似体
WO2015136455A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Novartis Ag New treatments of hepatitis c virus infection
WO2016073480A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Novel cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis c infection
WO2017189978A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Emory University Alkyne containing nucleotide and nucleoside therapeutic compositions and uses related thereto
US11807664B2 (en) 2017-05-12 2023-11-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing cyclic organic compound

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998028328A1 (fr) * 1996-12-24 1998-07-02 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Derive de cyclosporine, sa preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent
WO1998028329A1 (fr) * 1996-12-24 1998-07-02 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Derives de cyclosporine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
WO2000001715A1 (fr) * 1998-07-01 2000-01-13 Debiopharm S.A. Nouvelle cyclosporine ayant un profil d'activite ameliore
WO2005021028A1 (en) * 2003-09-03 2005-03-10 Novartis Ag Use of modified cyclosporins for the treatment of hcv disorders

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9811854D0 (en) * 1998-06-02 1998-07-29 Ciba Geigy Ag Organic compounds

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998028328A1 (fr) * 1996-12-24 1998-07-02 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Derive de cyclosporine, sa preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent
WO1998028329A1 (fr) * 1996-12-24 1998-07-02 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Derives de cyclosporine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
WO2000001715A1 (fr) * 1998-07-01 2000-01-13 Debiopharm S.A. Nouvelle cyclosporine ayant un profil d'activite ameliore
WO2005021028A1 (en) * 2003-09-03 2005-03-10 Novartis Ag Use of modified cyclosporins for the treatment of hcv disorders

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANSSON M.J. ET AL.: "The nonimmunosuppressive cyclosporin analogs NIM811 and UNIL025 display nanomolar potencies on permeability transition in brain-derived mitochondria", JOURNAL OF BIOENERGETICS AND BIOMEMBRANES, PLENUM PUBLISHING, NEW YORK, NY, US, vol. 36, no. 4, August 2004 (2004-08), pages 407-413, XP002330699, ISSN: 0145-479X, the whole document *
HUBLER F. ET AL.: "Synthetic routes to NEtXaa<4>-cyclosporin A derivatives as potential anti-HIV I drugs", TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 41, no. 37, September 2000 (2000-09), pages 7193-7196, XP004210230, ISSN: 0040-4039, the whole document *
INOUE K. ET AL.: "Interferon Combined With Cyclosporine Treatment as an Effective Countermeasure Against Hepatitis C Virus Recurrence in Liver Transplant Patients With End-Stage Hepatitis C Virus Related Disease", TRANSPLANTATION PROCEEDINGS, ORLANDO, FL, US, vol. 37, no. 2, March 2005 (2005-03), pages 1233-1234, XP004860087, ISSN: 0041-1345, the whole document *
NAKAGAWA M. ET AL.: "Specific inhibition of hepatitis C virus replication by cyclosporin A", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, vol. 313, no. 1, 2 January 2004 (2004-01-02), pages 42-47, XP004479114, ISSN: 0006-291X, abstract, page 46, column 1, line 18-line 22, page 46, column 1, line 49 - page 47, column 2, paragraph 2 *
WATASHI KOICHI ET AL.: "Cyclosporin A suppresses replication of hepatitis C virus genome in cultured hepatocytes". HEPATOLOGY, vol. 38, no. 5, November 2003 (2003-11), pages 1282-1288, XP009047548, ISSN: 0270-9139, the whole document *
XIA WEI-LIANG ET AL.: "Inhibitory effect of cyclosporine A on hepatitis B virus replication in vitro and its possible mechanisms". HEPATOBILIARY & PANCREATIC DISEASES INTERNATIONAL: HBPD INT. FEB 2005, vol. 4, no. 1, February 2005 (2005-02), pages 18-22, XP002361357, ISSN: 1499-3872, the whole document, page 20, right-hand column, paragraph 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2580448C (en) 2012-09-18
KR101191833B1 (ko) 2012-10-16
WO2006038088A1 (en) 2006-04-13
EA200700725A1 (ru) 2007-10-26
US20060252675A1 (en) 2006-11-09
US20090081164A1 (en) 2009-03-26
EP1793844A1 (en) 2007-06-13
CA2580448A1 (en) 2006-04-13
HK1104236A1 (en) 2008-01-11
NZ554412A (en) 2011-01-28
SI1793844T1 (sl) 2011-05-31
JP2008514690A (ja) 2008-05-08
ATE490778T1 (de) 2010-12-15
KR20070073761A (ko) 2007-07-10
MX2007003387A (es) 2007-05-23
CN101056648A (zh) 2007-10-17
CY1114594T1 (el) 2016-10-05
GEP20104960B (en) 2010-04-26
DE602005025232D1 (de) 2011-01-20
ZA200702610B (en) 2008-08-27
JP4892486B2 (ja) 2012-03-07
USRE43371E1 (en) 2012-05-08
AU2005290984A1 (en) 2006-04-13
US7439227B2 (en) 2008-10-21
DK1793844T3 (da) 2011-03-21
CN101056648B (zh) 2012-08-15
SG139750A1 (en) 2008-02-29
PL1793844T3 (pl) 2011-05-31
AU2005290984B2 (en) 2010-09-09
UA88484C2 (ru) 2009-10-26
ES2357587T3 (es) 2011-04-27
TNSN07084A1 (en) 2008-06-02
RS51614B (en) 2011-08-31
EP1793844B1 (en) 2010-12-08
BRPI0515494A (pt) 2008-07-29
US7772184B2 (en) 2010-08-10
PT1793844E (pt) 2011-03-10
IL182362A0 (en) 2007-07-24
HRP20110169T1 (hr) 2011-04-30
MA28950B1 (fr) 2007-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012650B1 (ru) ПРИМЕНЕНИЕ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТА С И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ [D-MeAla]-[EtVal]-ЦИКЛОСПОРИН
KR101755058B1 (ko) 특정 ｈｃｖ ｎｓ５ａ 억제제 및 ｈｃｖ ｎｓ３ 프로테아제 억제제의 조합물
KR101846596B1 (ko) Ｃ형 간염 바이러스 억제제의 조합
Robins et al. HIV protease inhibitors: their anti-HIV activity and potential role in treatment
CA2889717A1 (en) Pyrimidine nucleotides and their monophosphate prodrugs for treatment of viral infections and cancer
EA016457B1 (ru) Аналог тиофена для лечения вирусной инфекции гепатита с
TW201216979A (en) Macrocyclic proline derived HCV serine protease inhibitors
JP2013521279A (ja) Ｈｃｖ複製の阻害剤としての医薬併用剤
KR20080033481A (ko) 세린 프로테아제의 억제제
US20110117055A1 (en) Methods of Treating Hepatitis C Virus with Oxoacetamide Compounds
MX2011006239A (es) Analogos ciclicos de peptido de 4-amino-4-oxobutanoilo, inhibidores de replica viral.
JP2020203947A (ja) Ｎｓ５ａ、ｎｓ５ｂまたはｎｓ３阻害剤を使用する、ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するための方法
JP5894935B2 (ja) サングリフェリン系化合物
CN114224896A (zh) 病毒感染症的预防和早期治疗用组合物
US20110064694A1 (en) Anti-hepatitis c activity of meso-tetrakis-porphyrin analogues
EA022408B1 (ru) Производные санглиферина и способы их получения
EA027810B1 (ru) Гетероциклические карбоксамиды для лечения вирусных заболеваний
JP3517238B2 (ja) レトロウイルス感染の阻害
WO2022076742A1 (en) Methods and compositions for treating viral infections
US20080139463A1 (en) Use Of [D-Meala]3-[Etval]4-Cyclosporin For The Treatment Of Hepatitis C Infection And Pharmaceutical Composition Comprising Said [D-Meala]3-[Etval]4-Cyclosporin
Hansson et al. Bioengineering and semisynthesis of an optimized cyclophilin inhibitor for treatment of chronic viral infection
CN112194694A (zh) 尿苷酸双苯丙酸酯基氨基磷酸酯化合物、其药物组合物及其制备方法和应用
NZ617102B2 (en) Substituted aliphanes, cyclophanes, heteraphanes, heterophanes and hetero-heteraphanes useful for treating hcv infections
NZ617102A (en) Substituted aliphanes, cyclophanes, heteraphanes, heterophanes and hetero-heteraphanes useful for treating hcv infections
WO2013062882A1 (en) Scd inhibitors for the treatment of hcv

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU