PT1793844E - Utilização de [d-meala]3-[etval]4-csa para o tratamento de infecção causada pelo vírus da hepatite c - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DE [D-MEALA] 3-[ETVAL] 4-CSA PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÃO CAUSADA PELO VÍRUS DA HEPATITE C A presente invenção refere-se à utilização de [D-MeAla]3-[EtVal]4-Csa para o tratamento de infecção causada pelo vírus da hepatite C (HCV) e a uma composição farmacêutica que compreende a referida [D-MeAla]3- [EtVal] 4-Csa, possivelmente em combinação com Ribavirina ou um interferão alfa. A presente invenção está definida nas reivindicações. 0 HCV foi clonado e caracterizado há cerca de 15 anos por Choo e seus colaboradores (ver Science 244 (1989), 359-362). 0 HCV pertence à família Flaviviridae e compreende um capsídeo nuclear encapsulado e um genoma de RNA de fita simples de polaridade positiva (ver Bartenschlager et al., Antiviral Res. 60, (2003), 91-102). O HCV é transmitido, basicamente através do sangue, produtos de sangue e transmissão vertical durante a gravidez. A introdução de testes diagnósticos para selecção de produtos de sangue reduziu, de forma significativa, a taxa de nova infecção.

Até hoje, o HCV permanece um grave problema médico. Existem actualmente cerca de 170 milhões de pessoas infectadas com o HCV. O curso inicial da infecção é tipicamente brando. No entanto, o sistema imune é muitas vezes incapaz de eliminar o vírus e as pessoas com infecções persistentes estão em alto risco de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (ver Poynard et al., Lancet 349, (1997), 825-832). 1 Não há vacina disponível e as opções terapêuticas são muito limitadas (ver Manns et al., Indian J. Gastroenterol. 20 (Suppl. 1), (2001), C47-51; Tan et al., Nat. Rev. Drug Discov. 1 , (2002), 867-881). A terapêutica actual é baseada numa combinação de interferão alfa e ribavirina. Esta terapêutica produz uma resposta antivirai sustentada em 85-90% dos doentes infectados com os genótipos 2 e 3, mas, infelizmente, apenas em cerca de 45% dos doentes infectados com o genótipo 1 prevalente. Além disso, os efeitos secundários são significativos e incluem mialgia, artralgia, dor de cabeça, febre, depressão grave, leucopenia e anemia hemolítica.

Evidentemente, terapêuticas adicionais, com uma maior actividade antiviral e um melhor perfil de segurança, são necessárias para o tratamento da infecção por HCV, particularmente, por exemplo, no caso de prevenção da recorrência do HCV. A fim de estabelecer o perfil de segurança, critérios tais como baixa citotoxicidade e efeito citostático e alto índice de selectividade são particularmente relevantes para o tratamento clínico da infecção por HCV.

Uma nova abordagem para o tratamento da infecção por HCV utilizando ciclosporinas foi descrito recentemente, por observações clínicas (ver Teraoka et al., Transplant Proc, 1988, 20 (3 suppl 3), 868-876, e Inoue et al. J Gastroenterol, 2003, 38, 567- 572). Recentemente, demonstrou-se que a Ciclosporina A (CsA) inibiu a replicação intracelular in vitro de um replicão subgenómico de HCV a concentrações de fármaco clinicamente possíveis (ver Watashi et al., Hepatology 38, 2003, 1282-1288, e Nakagawa et al., BBRC 313, 2004, 42-47). Ambos os grupo sugeriram que o efeito anti-HCV da CsA são estava associado com a actividade imunossupressora com base nas observações feitas com a utilização respectivamente de um macrólido 2 imunossupressor, isto é, o composto conhecido sob o nome FK 506 e um derivado não imunossupressor de ciclosporina A, isto é, o composto conhecido sob o nome NIM 811 ou [Melle] 4-CsA. Nakagawa et al. consideram que, a expansão das aplicações de CsA pode causar problemas substanciais devido às suas propriedades imunossupressoras bem conhecidas e sugerem que uma solução para superar este problemas seria considerar a utilização de análogos não imunossupressores de ciclosporina.

Durante os últimos 15 anos, uma série de estudos químicos medicinais foram realizados com o objectivo de identificar tais análogos não imunossupressores de ciclosporina e o composto NIM 811 é um dos compostos mais representativos com tal propriedade. 0 NIM 811, juntamente com 9 outros derivados de ciclosporina A, foram relatados por Ko et al. no Pedido de Patente EP 0 484 281 por suas propriedades não imunossupressoras e foram considerados como sendo potencialmente úteis no tratamento de infecção por HIV e na prevenção da SIDA. A concepção desses derivados envolveu a modificação de aminoácidos nas posições 4 e/ou 5 de Ciclosporina A.

Por meio da modificação dos aminoácidos nas posições 2 e/ou 6 da Ciclosporina A, Sigal et al. sintetizaram um total de 61 análogos de ciclosporina e observaram que, tais modificações químicas induzem uma redução na actividade imunossupressora (ver Sigal et al., J. Exp. Med., 173, 1991 , 619-628).

Outras tentativas para modificar o aminoácido na posição 3 da Ciclosporina A, a fim de obter compostos não imunossupressores foram descritas, particularmente por Barrièrre et al., nos documentos WO 98/28328, WO 98/28329 e WP 98/28330. 3

Wenger et al. conceberam uma série de compostos que diferem da Ciclosporina A na posição 3, os quais contêm um aminoácido N-metilado, não volumoso hidrofóbico ou neutro diferente de uma glicina e na posição 4 que contêm um aminoácido N-metilado ou N-etilado hidrofóbico ou neutro diferente de uma leucina e declararam que aqueles compostos têm uma alta potência em inibir a replicação do HIV-1 e essencialmente carecem de actividade imunossupressora (ver o Pedido de Patente Internacional WO 00/01715 e Tetrahedron Lett. 41, (2000), 7193-6). O objectivo da presente invenção é proporcionar o clínico com uma nova terapêutica para o tratamento de infecção por HCV, particularmente, por exemplo, no caso de prevenção da recorrência de HCV. Esta terapêutica deve oferecer uma melhor actividade antiviral e um melhor perfil de segurança, em comparação com as terapêuticas já aprovadas ou as recentemente propostas.

Os presentes inventores constataram, surpreendentemente, que a administração a um doente infectado com HCV de um composto muito especifico, ou seja [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, atende os requisitos acima mencionados. Eles observaram que, para além da sua propriedade não imunossupressora, a [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA possui uma afinidade significativamente maior por ciclofilinas, cuja afinidade aumentada está correlacionada com uma elevada eficácia da inibição da replicação do HCV.

Em concordância, um dos objectivos da presente invenção refere-se à utilização de [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA para a preparação de um produto medicinal destinado ao tratamento da infecção por HCV num doente ou para a prevenção da recorrência de HCV. 4 A [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA foi relatada por Wenger et al. no documento WO 00/01715 e foi atribuído ao mesmo o número de Registo 254435-95-5. Trata-se de um undecapéptido cíclico descrito pela seguinte fórmula: -MeBmt-aAbu-D-MeAia-EtVal-Va!-MeLeu-A!a-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-12 3 45 678 9 10 11 em que MeBmt é N-metil-(4R)-4-but-2E-en-l-il-4-metil-(L)treonina, aAbu é ácido L-a-aminobutírico, D-MeAla é N-metil-D-alinina, EtVal é N-etil-L-valina, Vai é L-valina, MeLeu é N-metil-L-leucina, Ala é L-alanina, (D)Ala é D-alanina, e MeVal é N-metil-L-valina. A numeração convencional das posições de aminoácidos geralmente utilizadas na referência de Ciclosporina A está indicada abaixo da fórmula. Consegue-se isto por meio da utilização de nomes compostos que compreendem uma primeira parte que indica a identidade dos resíduos que são diferentes daqueles na ciclosporina A que proporcionam a sua posição, e uma segunda parte rotulada "CsA" que indica que todos os outros resíduos são idênticos àqueles na Ciclosporina A. Por exemplo, [Melle]4-CsA é uma ciclosporina que é idêntica à ciclosporina A, excepto que MeLeu na posição 4 é substituído por Melle (N-metil-L-isoleucina) . A presente invenção será explicada, adicionalmente, com as seguintes experiências e com os desenhos nos quais: a Figura 1 representa um histograma de resposta à dosagem medida por ensaio luciferase em células Huh-7-Lunet infectadas; a Figura 2 representa um histograma de resposta à dosagem medida por ensaio luciferase em células Huh-7,5 infectadas; a Figura 3 representa curvas de resposta de depuração das células Huh-9-13 infectadas; 5 a Figura 4 ilustra uma representação em 3D da resposta à dosagem com combinação IFN / [D-MeAla]3- [EtVal] 4-CsA.

As utilizações médicas actuais da Ciclosporina A referem-se à capacidade desse composto de suprimir a resposta imune mediada por células pela prevenção da reprodução e libertação de vários factores de crescimento de célula T autócrinos, incluindo interleucina 2 (IL-2) de células T activadas (ver Borel (1989)

Transplant. Proceed. 21, 810-815; Kronke et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81, 5214-5218; Faulds et al. (1993) Drugs 45, 953-1040) . Mediante entrada nas células a Ciclosporina A liga-se às ciclofilinas com alta afinidade (ver Handschumacher et al. (1984) Science 226, 544-547) . Como entre diferentes funções biológicas, as mesmas têm actividade peptidil-prolil cis-trans isomerase (PPlase) que pode ser media in vitro (ver Fischer et al. (1989) Nature 337, 476- 478; Takahashi et al. (1989) Nature 337, 473-475). Uma interaeção para o efeito imunossupressor da cicloposrina A é critica entre o complexo ciclofilina-ciclosporina A e fosfatase 2B serina/treonina dependente de cálcio e calmodulina (calcineurina) (ver Hauske (1993) DN&P 6, 705-711, Friedman et al. (1991) Cell 66, 799-806; Liu et al. (1991) Cell 66, 807-815). A formação desse complexo ternário resulta numa inibição da actividade fostatase da calcineurina (ver Jain et al. (1993) Nature 365, 352-355; Rao et al. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 707-747; Crabtree (1999) Cell 96, 611-614). A calcineurina promove a desfosforilação selectiva de NF-AT que a seguir transloca-se para o núcleo onde se associa com a proteína 1 activadora e transactiva os genes alvo, incluindo o gene IL-2.

Acredita-se que, devido aos aminoácidos nas posições 3 e 4, a [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA tem uma capacidade dramaticamente reduzida em interagir com a calcineurina tal como demonstrado por ensaios transcripcionais e imunológicos, bem como uma afinidade 6 significativamente maior por ciclofilinas tal como indicado por ensaios de inibição da actividade peptidil-prolil cis-trans isomerase.

A actividade peptidil-prolil cis-trans isomerase (PPlase) das ciclofilinas foi determinada pela utilização de um procedimento adaptado de Kodron et al., (ver Biochemistry 30, 6127-6134 (1991); J. Am. Chem. Soc. 114, 2670-2675 (1992)). Ala-Ala-Pro-Phe-para nitro-anilina N-succinilada (Suc-AAPF-pNA, Bachem, Bubendorf, Suiça) foi utilizada como substrato. O ensaio foi baseado na clivagem preferencial de quimotripsina da isoforma trans da ligação Phe-pNa no tetrapéptido Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. Esta clivagem libera a unidade para-nitroanilina que pode ser detectada e quantificada em 390 nm (£ = 11.814 M^citf1) . Schutkowski et al. (1995) Biochemistry 34, 13016-13026. A isomerização cis-trans é catalisada por ciclofilina (PPlase, EC5.2.1.8). Após misturar CsA ou outra cicloposrina (concentrações finais de 10“9 - 2 x 10~5 M preparadas de soluções-mãe concentradas 1000 vezes em etanol) com 0,1 pg de ciclofilina (Sigma) num volume total de 1,5 mL de Hepes 40 mM, pH 7,9 e incubação durante 50 minutos em gelo, a mistura de reacção foi transferida para uma cuba que foi mantida a 10 °C num espectrofotómetro Varian (Varian). Subsequente à adição de 3, 75 mg de quimotripsina (70 pL de uma solução de quimotripsina em HC1 10 mM), a reacção foi iniciada pela adição de 10 pL de uma solução 3,2 mM de Suc-AAPF-pNA em LiCl/trifluoroetanol 0,5 Μ. A reacção foi monitorizada durante 3 minutos e uma taxa constante foi determinada a partir dos dados obtidos. Como controlo, uma constante de taxa inicial foi também determinada para uma reacção paralela que não continha ciclofilina. Curvas de concentração-resposta foram estabelecidas para a ciclosporina A e outras ciclosporinas e valores lC5o (50% de concentração inibidora) de diferentes ciclosporinas foram expressos em relação aos da ciclosporina A 7 (1.0) . Um valor inferior a 1 significa que o composto tem uma maior afinidade à ciclofilina do que a CsA.

Um ensaio repórter dependente de NF-AT foi utilizado inicialmente para estimar as actividades imunossupressoras das ciclosporinas. Baumann et ai. (1992) Transplant. Proc. 24, 43-48. Células Jurkat T estavelmente transfectadas com um construtor repórter que contém um gene bacteriano β-galactosidase sob o controlo de um promotor de um gene IL-2 foram obtidas da G. Zenke, Novartis Pharma AG, Basileia, Suíça. As células foram desenvolvidas em meio RPM11640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 100 u/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 50 μΜ e 100 u/mL de hidromicina B. As células foram estimuladas pela adição de forbol-12-miristato-13-acetato 2,4 mM e 75 pg/mL de fito-hemaglutinina na presença ou ausência de ciclosporina A ou outra ciclosporina (concentrações finais de 10~9 - 2 x 10“5 M preparadas de soluções-mãe concentradas 1000 vezes em etanol). Em seguida à incubação por 20 horas a 37 °C, as células foram colhidas e lisadas em Na2HP04 50 mM (pH 9,0), KC110 mM, MgS04 1 mM, 1% Triton X-100, 4-metilumbeliferil-P-D-galactosida 0,5 mM (Sigma, Buchs, Suíça). A reacção de β- galactosidase foi deixada prosseguir durante 1 horas no escuro à temperatura ambiente. 4-metil-umbeliferona fluorescente foi ensaiada fluorometricamente na solução sobrenadante (excitação: 355 nm; emissão: 460 nm). Foram estabelecidas curvas de

concentração-resposta para a ciclosporina A e outras ciclosporinas e valores IC50 (50% de concentração inibidora) de diferentes ciclosporinas foram expressos em relação aos da ciclosporina A (1.0) . Um valor superior a 1 significa que o composto é menos imunossupressor do que a CsA.

Os resultados do exemplo estão apresentados na Tabela 1 adiante. 8

Tabela 1: Ligação de ciclofilina (PPlase) e actividades imunossupressoras (IL-2) da CsA e outras ciclosporinas.

Composto PPlase IL-2 CsA 1,0 O i—1 [D-MeAla]3- [EtVal] 4-CsA 0,3 7161 [Melle]4-CsA LO O 2250

Os dados apresentados na Tabela 1 revelaram que algumas substituições na posição 4 (isto é, Vai, Ile) reduziram dramaticamente a actividade imunossupressora (medida como a inibição da expressão de IL-2) bem como a actividade de ligação da ciclofilina visivelmente intensificada (medida como a inibição da actividade PPlase da ciclofilina). A substituição na posição 3 resultou num aumento mais substancial na actividade de ligação da ciclofilina (em 2 vezes ou mais; cf [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA. Teve uma maior actividade de ligação a ciclofilina e uma menor actividade imunossupressora residual do que a [Melle]4-CsA, o melhor composto de referência disponível na literatura. A [Melle]4-CsA é também conhecida como NIM811.

Actividade não imunossupressora de [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA

Numa análise de confirmação, foram estimadas as actividades imunossupressoras de CsA, [Melle] 4-CsA e [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA por meio da utilização da reacção de linfócito mista. Nesse ensaio, as ciclosporinas foram dissolvidas em etanol (10 mg/mL). PBMCs CD4+ recém-isoladas de dois dadores saudáveis foram misturadas subsequentes à inactivação por irradiação de uma das populações (células estimuladoras; S). Depois de cinco dias de co-cultura na presença ou ausência de uma ciclosporina (1 pg/mL), a resposta 9 proliferativa da população celular não inactivada (células responsivas; R) foi determinada por incorporação de [3H] timidina. 0 ensaio foi realizado reciprocamente com as duas populações de células, cada uma sendo inactivada e estimulada por sua vez. A estimulação (%) das células responsivas foi calculada pela fórmula:

Estimulação percentual = 100 x (amostra com ciclosporina - básico) / (amostra sem ciclosporina - básico) A amostra refere-se a uma mistura de células estimuladoras e responsivas. Básico representa um controlo no qual apenas células estimuladoras são misturadas. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. Os mesmos foram interpretados para significar que tanto a [Melle]4-CsA como a [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA são essencialmente destituídas de actividade imunossupressora.

Tabela 2. Resposta proliferativa de PBMCs CD4+ na presença/ausência de ciclosporinas

Co-cultura Composto N 0, 0 estimulação (relativa) Desvio padrão RI x S2 Nenhum 8 100 30 RI x S2 CsA 4 29 3 RI x S2 [Melle]4-CsA 4 84 13 RI x S2 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 4 75 11 R2 x SI Nenhum 8 100 9 R2 x SI CsA 4 9 2 R2 x SI [Melle]4-CsA 4 75 9 R2 x SI [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 4 65 7 SI x S2 Nenhum 4 0 0,6 10 RI x S2 referem-se a uma co-cultura de células responsivas do dador 1 e células estimuladoras do dador 2. N é o número de medições.

Alta_actividade_anti-HCV_e_baixo_efeito

citotóxico/citostático de [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA

Tal como mencionado anteriormente, a infecção com o vírus da hepatite C (HCV) é um problema sério de saúde porque os doentes persistentemente infectados estão num alto risco de desenvolver doenças crónicas do fígado incluindo cirrose e carcinoma hepatocelular. A terapêutica disponível actual é inadequada para uma grande fracção desta última população, bem como está associada com efeitos secundários significativos. Até recentemente, o desenvolvimento de terapêuticas mais eficazes foi impedido pela ausência de um modelo apropriado in vitro de replicação de HCV que permite a selecção de compostos potencialmente activos antes da avaliação em testes clínicos humanos. Este obstáculo foi superado pelo desenvolvimento de minigenomas (replicões) de HCV geneticamente modificados que se auto-amplificam em células cultivadas de hepatoma em altos níveis (Lohmann et al., Science 285, (1999), 110-113). Este sistema de replicão de HCV tornou-se rapidamente a ferramenta padrão para o estudo da replicação, patogénese e persistência de HCV (Bartenschlager et al. Antiviral Res. 60, (2003), 91-102). O genoma do HCV consiste num RNA de fita simples que contém um único quadro de leitura aberto para uma poliproteína de cerca de 3000 aminoácidos. A tradução dessa poliproteína é iniciada num sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) localizado na extremidade 5' do RNA. A poliproteína do HCV é clivada em pelo menos dez proteínas. Elas incluem proteína de capsídeo C, proteínas do envelope EI e E2, possível proteína p7 viroporina, proteínas NS2 e NS3 não estruturais que têm actividades serina proteinase bem como APTase/helicase, NS4A, proteína NS4B, 11 NS5A e NS5B RNA polimerase dependente de RNA indutoras de trama membranosa. 0 primeiro replicão de sucesso era um RNA bicistrónico contendo numa direcção 5' a 3' um IRES HCV, uma sequência de codificação para uma neomicina fosfotransferase, um IRES de um virus de encefalocardite e sequências de codificação para proteínas HCVC NH3 a NS5. Subsequente à introdução em células Huh-7 e selecção utilizando G418 (geneticina), este replicão pode demonstrar replicar autonomamente em altos níveis (1.000-5.000 cópias/células) (Lohmann et al, 1999). A caracterização do sistema revelou que a eficiência de replicação é dependente da permissividade da célula hospedeira e, mais importante, da selecção das mutações adaptadas a cultura celular nas sequências de codificação-proteína de HCV. Constatou-se que a replicação é sensível ao interferão alfa, proporcionando evidência para a relevância do sistema para selecção de fármacos que têm eficácia in vivo. Foram também construídos replicões variantes nos quais a sequência de codificação-neomicina fosfotransferase foi substituída, por exemplo, por uma sequência de codificação-luciferase ou por sequências que codificam para uma proteína de fusão luciferase-ubiquitina-neomicina fosfotransferase. A replicação dos últimos replicões variantes pode ser testada pelo ensaio luciferase conveniente, ao passo que a replicação do primeiro replicão requer determinações de número de cópia do RNA.

Watashi et al. (2003) demonstraram por meio de Northern blot e RT-PCR (reacção em cadeia de transcriptase polimerase reversa) quantitativo que a acumulação de RNA de HCV foi inibida por CsA, mas não pelo macrólido imunossupressor FK506 e o derivado de CsA não imunossupressor PSC 833 em células MH-14 que contêm replicão de HCV. Seus ensaios que envolveram exposições de 7 dias de células aos agentes activos revelaram que o título de RNA de HCV ficou reduzido em cerca de 200 vezes na presença de 1 pg/mL de ciclosporina A. Constataram também que a ciclosporina [Melle]4-CsA 12 não imunossupressora também inibiu a replicação do HCV. Os resultados indicam que a [Melle]4-CsA era quase tão eficaz quanto a CsA na redução do título de RNA de HCV. A fim de determinar se a ciclosporina da presente invenção possui actividade anti-HCV e, caso possua tal actividade, como essa actividade se compara com as actividades de CsA e [Melle]4-CsA, foram realizadas experiências que compararam os efeitos inibidores de CsA, [Melle] 4-CsA e [D-MeAla]3- [EtVal] 4~CsA em sistemas de replicão de HCV.

Os ensaios utilizaram células Huh 5-2 que continham um RNA bicistrónico que codifica um proteína de fusão liciferase-ubiquitina-neomicina fosfotransferase de pirilampo e as proteínas NS3-5 de HCV. As sequências virais originaram-se de um vírus HCV do genótipo lb. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM (Life Technologies), 1 x aminoácidos não essenciais (Life Technologies), 100 μ/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina e 250 pg/mL de G418 (Geneticin Life Technologies) a 37 °C e 5% CO2. Para os ensaios de replicação antiviral as células foram semeadas a uma densidade 7000 células/poço em View Plates™ (Packard) de 96 poços no mesmo meio, excepto para G418. Após uma incubação de 24 horas, o meio foi removido, foram adicionadas diluições em série dos compostos de teste em meio e as células foram incubadas por mais 72 horas.

Os efeitos antivirais foram estimados, por ensaio luciferase ou por RT-CPR quantitativo. Para realizar ensaios luciferase o meio foi removido e as células forma lavadas com PBS. Em seguida à lise em 50 pL de tampão Glo-lysis (Promega) por 15 minutos, 50 pL de Reagente de Ensaio Stead-Glo Luciferase (Promega) foram adicionados aos lisados celulares. A actividade luciferase foi medida 13 utilizando um luminómetro, e o sinal de cada teste foi expresso como uma percentagem do sinal medido em poços de cultura não expostos a um composto de teste. A densidade celular e os efeitos citostáticos foram avaliados em culturas paralelas em placas de 96 poços comuns (Beckton-Dickinson) utilizando o ensaio MTT (CellTiter 96R AQueoUs Non-

Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega). Nesse ensaio, 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxi-fenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS) é bio-reduzido a um formazan que é quantificado em 498 nm num leitor de placa. A produção de formazan está directamente correlacionada com o número de células vivas. A análise RT-PCR quantificou a região de neomicina de replicões utilizando um detector de sequência ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Os iniciadores dianteiros e reversos utilizados foram 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' e 5'-CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3', respectivamente. A sonda fluorogénica foi 5'-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-31. Como controlo interno, foi utilizado um plasmideo contendo parte da sequência genética de neomicina fosfotransferase.

Os resultados dessas experiências permitiram o cálculo de EC50 para as diferentes ciclosporinas, que é a concentração eficaz necessária para inibir a replicação de replicão de HCV em 50% e de CC5o que é a concentração necessária que inibe a proliferação de células que crescem de foram exponencial em 50% e um indice de selectividade SI que é a relação entre CC50 e EC50. A Tabela 3 apresenta os valores obtidos de células Huh 5-2 utilizando ensaios de actividade luciferase para estimar a eficácia de replicação e ensaios MTT para calibração dos ensaios luciferase e para estimar dos efeitos citostáticos dos compostos. De acordo 14 com as observações acima discutidas por Watashi et al. (2003), a CsA e a [Melle]4-CsA tinham actividades anti-HCV (replicação) similares.

Surpreendentemente, a [D-MeAla]3- [EtVal] 4~CsA era consideravelmente mais potente do que a CsA e a [Melle] 4-CsA. Observou-se também a concentração citostática de 50% (CC50) para a [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA foi significativamente mais alta do que os valores determinados para CsA e [Melle]4-CsA. Consequentemente, um índice de selectividade consideravelmente maia alto foi constatado para a [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA em comparação com as duas outras ciclosporinas. Experiências análogas nas quais os valores EC5o foram derivados de determinações de títulos de RNA utilizando RT-PCR quantitativo obtiveram conclusões similares. Valores SI de 45*, 73 e 625* foram obtidos para CsA, [Melle] 4-CsA e [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, respectivamente. Os asteriscos indicam que foi apresentado o menor de dois valores determinados independentemente.

Tabela 3: Valores de EC5o, CC50 e SI determinados a partir de ensaios luciferase da replicação de RNA HCV e ensaios MTT de citotoxicidade em células Huh 5-2 compreendendo um minireplicão de HCV que contém luciferase

Composto EC50 (pg/mL) +/- Desvio Padrão CC50 (pg/mL) +/- Desvio Padrão índice de selectividade CSA 0,28 +/- 0,13 11,6 +/- 5,6 41 [D-MeAla]3- [EtVal] 4-CsA 0 0 1 + 00 0 0 >27 >900 [Melle]4-CsA 0,22 14 64 15

Actividade Antiviral de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA medida em células alvo infectadas com HCV recombinante A actividade anti-HCV de [D-MeAla]3- [EtVal] 4-CsA em comparação com a CsA foi ainda determinada em sistemas de cultura que se aproximam da situação in vivo. 0 método utilizou células de hepatoma que tinham sido infectadas com um construtor de HCV quimérico de comprimento total infeccioso ou o mesmo virus que foi modificado para portar um gene receptor de luciferase. Depois do tratamento das células infectadas com a ciclosporina da invenção ou CsA, a actividade luciferase foi medida como estando directamente correlacionada com a inibição da replicação virai.

Virus HCV infecciosos de genoma quimérico de comprimento total entre estirpes de HCV J6 e JFH1 (Jcl) foram utilizadas para inocular as células de hepatoma dos ensaios. 0 construtor do virus Jcl também foi modificado para obter-se um genoma bicistrónico que porta um gene repórter luciferase [Jcl-Luc). Vinte e quatro e noventa e seis horas depois da transfecção dos transcritos de RNA dos genomas por electroporação de células Huh-7,5, o sobrenadante da cultura de células foi colhido. Os sobrenadantes foram filtrados (0,45 μΜ) e a dose de infecção de cultura celular 50 (CCID50) por mL foi determinada pelos ensaios de diluição limitantes de acordo com Lindenbach et al. (Science, 309, (2005), 623-626). A CCID50 foi de 1,3 x 105 para Jcl e 4,2 x 103 para Jcl-Luc.

Os ensaios utilizaram células Huh-7-Lunet ou células Huh-7,5 Lohmann et al., Science 285(5424), (1999), 110-113). As células foram cultivadas em Meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM; Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado por calor (FCS) (Integro), 1 x aminoácidos não essenciais (Gibco), 100 IU/mL de penicilina (Gibco), 100 pg/mL de estreptomicina (Gibco) ou 25 pg/mL de higromicina (Gibco) para células Huh-mono a 37 °C e 5% de 16 C02. Para os ensaios antivirais (replicação), células Huh-7-Lunet e Huh-7,5 foram semeadas a uma densidade de 2 x 104 ou 4 x 104 por poço de uma placa de 12 poços. Vinte e quatro horas mais tarde o meio foi substituído por 0,5 mL do concentrado de vírus Jcl-Luc (placas de 12 poços) ou 0,25 mL do concentrado de vírus Jcl (placa de 12 poços). Quatro horas mais tarde, o inoculo virai foi substituído por meio contendo concentrações diferentes de CsA ou [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA, e foram ainda incubado por mais 72 horas. A inibição da replicação virai foi estimada por meio de ensaio luciferase. Para realizar o ensaio luciferase, as células foram colhidas, lavadas com PBS e lisadas em tampão de lise luciferase (1% Triton X-100, glicilglicina 25 mM, MgS04 15 mM, EDTA 4 mM e DTT 1 mM) . A actividade luciferase de pirilampo foi medida de acordo com Krieger et al. (J Virol, 75(10), (2001), 4614-4624). Em resumo, após um ciclo de congelação/descongelação, as células foram ressuspensas e 100 pL de lisado celular foi misturado com 360 pL de tampão de ensaio (glicilglicina 25 mM, MgS0415 mM, DTT 1 mM, ATP 2 mM, tampão de fosfato de potássio 15 mM, pH 7,8) e 200 pL de solução de substrato (luciferina 200 mM, glicilglicina 25 mM). Finalmente, a luminescência foi medida pela utilização de um luminómetro Lumat (Berthold) para 20 amostras.

Nesses exemplos, (Figs. 1 e 2) tanto a [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA (barras brancas) como a CsA (barras pretas) resultaram numa actividade antiviral dose-dependente, pelo que a [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA provou novamente, superioridade sobre a CsA, deste modo corroborando os dados obtidos com os replicões subgenómicos. Uma concentração 10 vezes maior de CsA foi necessária para resultar no mesmo efeito de inibição de replicação da ciclosporina da invenção. 17

Alta afinidade da ciclosporina da invenção por ciclofilina

Nas observações discutidas acima por Watashi et al. (2003) e Nagakawa et al. (2003), o efeito anti-HCV foi relacionado com a capacidade de ligação das ciclosporinas às ciclofilinas. Os efeitos sobre a actividade PPlase de CsA, [Melle]4-CsA e [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA foram medidos para as ciclofilinas a fim de determinar o inibidor mais potente da actividade PPlase de ciclofilina, por exemplo, a ciclofilina A e, consequentemente, da replicação de HCV.

Foi utilizada ciclofilina A recombinante humana comercial (Sigma) nos ensaios. A actividade PPlase das ciclofilinas foi determinada utilizando um ensaio espectrofotométrico acoplado a quimotripsina de acordo com Gracia-Echeverria et al. (BBRC, 191 (1993), 70-75). Este método é baseado na alta selectividade trans das quimotripsinas por péptidos do tipo N-succinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida. A clivagem dos péptidos libertou a unidade para-nitroanilina que pôde ser detectada e quantificada em 390 nm. A hidrólise da forma cis foi limitada pela taxa de isomerização cis-trans realizada pela ciclofilina A. 0 péptido foi composto numa solução de LiCl 25 nM em 2,2,2-trifluoretanol a 470 nM para intensificar a população de péptidos da configuração cis. O ensaio foi realizado no espectrofotómetro de feixe dividido e o banho de água foi ajustado em 5 °C. Ciclofilina A (7500 pmol/mg de concentração total da enzima; Sigma) foi dissolvida a 20 nM num tampão (HEPES 35 mM e 0,26 mg/mL de quimotripsina (actividade especifica de 50 unidades/mg), pH 7,8 com KOH) e foi incubada por 6 minutos à temperatura ambiente, seguido por 54 minutos num banho de água. A CsA, [Melle]4-CsA ou [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA foram adicionadas como apropriado nessas incubações utilizando uma gama de concentração de 2-50 nM. Em seguida, 3,5 mL da ciclofilina incubada foram adicionados na cuvete de amostra. A cuvete de referência continha uma reacção que chegou ao término para 18 equilibrar o feixe de referência. 0 péptido foi adicionado a 25 μΜ para iniciar a reacção e a alteração na absorbância foi monitorizada em 10 pontos de dados por segundo. Como controlo, também foram determinadas as taxas para uma reacção em paralelo sem ciclofilina. Estas taxas em branco da hidrólise de péptido (isto é, na ausência de ciclofilina) foram subtraídas das taxas na presença de ciclofilina A.

As taxas iniciais obtidas dos ensaios PPlase foram analisadas por análise de regressão de primeira ordem, por meio da utilização de transformação de primeira ordem dos traços do decurso de tempo da alteração na absorbância a 390 nm. A concentração enzimática total (Et) , a constante de dissociação inibidora (Ki) e a constante de taxa para a reacção limitante de taxa foi calculada com o software FigSyS (2003, Blosoft), ajustando-se os dados obtidos da análise de regressão na equação de multiproteina do inibidor de ligação estreita. A equação de multiproteina do inibidor de ligação estreita tinha a seguinte fórmula: V = K*Et*P-k*(-b-sqrt(b*b-4*c))/2 onde b é definido como b = -(Et*P+|+Ki) e c é c = Et*P* | .

Assim que Et, Kj e k foram calculados pelo computador para um dado conjunto de dados, uma representação gráfica dos dados foi realizada e a linha ajustada aos pontos presumindo a ligação estreita do inibidor a uma única proteína definida pelas seguintes equações: V = K*Et*P-K(B-sqrt(B*-B4*C))/2 19 onde B = Et*P+|+Ki e C = Et*P* I .

Tabela 4: Valores Et, Ki e k de ciclofilina A para CsA, [Melle]4-CsA e [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA determinados a partir dos ensaios de actividade de PPlase.

Composto Et(pmol/mg) Ki (nM) k (s-1) CsA 7500 9,79 ± 1,37 0,17 ± 0,0059 Melle]4-CsA 7500 2,11 ± 0,32 0,17 ± 0,0068 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 7500 0,34 ± 0,12 0,16 ± 0,0074 0 valor mais baixo Ki de ciclofilina A observado para a ciclosporina da invenção corroborou o alto potencial de actividade virai, o índice de especificidade e selectividade (tal como mencionado acima) em comparação com CsA e [Melle]4-CsA. Surpreendentemente, a [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA não imunossupressora demonstrou uma afinidade quase 6 vezes maior para a ciclofilina dos exemplos em comparação com a outra ciclosporina não imunossupressora [Melle]4-CsA.

As experiências acima citadas evidenciaram que a [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA era um inibidor mais eficaz da replicação do HCV do que qualquer outra ciclosporina testada. Esta actividade anti-HCV aumentada correlacionou-se com a maior actividade de ligação da ciclofilina de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA.

Depuração e rebote do replicão do HCV A recorrência da infecção por HCV é um problema primordial da doença, mesmo com a utilização de tratamento potencialmente eficaz, por exemplo, ciclosporina e/ou interferão. Para estudar se a actividade anti-HCV mais potente da ciclosporina da invenção em comparação com a CsA reflecte-se na capacidade do composto de curar 20 de forma mais eficaz as células que produzem do replicão de HCV daquelas, foi realizado um ensaio celular in vitro com base na presença do fármaco selectivo G418 para replicão produzido de forma recombinante.

Os ensaios utilizaram células Huh-9-13, células de hepatoma humano (Huh-7) (Lohmann et al., Science 285 (5424), (1999), 110-113). As células foram desenvolvidas no meio DMEM completo comum, sem pressão G418. As células forma cultivadas na presença de CsA ou de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA (ambas a 0,5 ou 1 pg/mL) ou foram deixadas sem tratamento por 7 passagens consecutivas. O controlo foi realizado para garantia de que a ausência da pressão selectiva G418 não influenciaria o teor do replicão de HCV durante várias passagens. A fim de confirmar que as células Huh-9-13 que tinham sido tratadas por 7 dias com [D-MeAla]3- [EtVal] 4~CsA foram, de facto, depuradas do seu replicão, a selecção de G418 (1000 pg/mL) foi reiniciada por 2 outras passagens. Apenas aquelas células que ainda portavam o replicão de HCV foram capazes de proliferar em tais condições e as células sem o replicão morreram na presença de G418 durante a fase de rebote.

Foi realizada PCR-RT nos extractos do RNA virai das amostras retiradas em pontos de passagem diferentes. Os iniciadores dianteiro e reverso utilizados foram 51-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' e 5'-CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3', respectivamente. A sonda fluorogénica foi 5'-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-3'. Como controlo interno, foi utilizado um plasmideo contendo parte da sequência genética neomicina fosfotransferase. Os resultados foram analisados e expressos como uma quantidade do RNA replicão (ng) por 1000 células e utilizados no desenho de um gráfico. 21

Os resultados dessas experiências (Figura 3) mostrou o efeito antiviral superior de [D-MeAla]3- [EtVal] 4-CsA em comparação com CsA nesse ensaio de célula in vitro padrão. Surpreendentemente, a ciclosporina da invenção demonstrou um efeito virucida e não apenas um efeito virustático como a outra CsA imunossupressora. De facto, quando as células Huh-9-13 tratadas com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA (círculos e quadrados na Figura 3) foram novamente cultivadas na presença de G418 (fase de rebote), as culturas morreram em comparação com as células tratadas com CsA (losangos e triângulos). Ambas as culturas que tinham sido tratadas com CsA por 7 passagens consecutivas foram capazes de proliferar na presença de G418. Isto confirmou que a [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA foi capaz de curar células Huh-9-13 do seu replicão de HCV.

Combinação de Fármacos 0 interferão (IFN) é parte de uma terapêutica actual de infecção por HCV. 0 efeito da combinação de [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA / INF-a 2a foi avaliado utilizando o método de Priochard e Shipman (Antiviral Res. 1990, 14, 181-205). Em resumo, o efeito aditivo teórico é calculado a partir das curvas dose-resposta de compostos individuais pela equação de fórmula: Z = X + Y(l-X), onde X representa a inibição produzida apenas por [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA e Y representa apenas INF-α 2a. Z representa o efeito produzido pela combinação de [D-MeAla]3- [EtVal] 4-CsA com INF-α 2a. A superfície aditiva teórica é subtraída da superfície horizontal real, resultando numa superfície horizontal que iguala o plano zero quando a combinação é aditiva, uma superfície que fica acima do plano zero indica um efeito sinérgico da combinação e uma superfície abaixo do plano zero indica antagonismo. O ensaio 22 antiviral foi realizado, essencialmente como descrito acima para as células Huh 5-2 excepto que os compostos foram adicionados em formato de tabuleiro de damas. Para cada composto três réplicas de placa foram utilizadas para medir a curva dose-resposta de cada composto individual. Os dados obtidos de todas as três placas foram utilizados no cálculo da superfície aditiva teórica. Estudos de combinação para cada par de compostos foram feitos também em triplicata. Os dados foram analisados quanto à variância por meio do teste ANOVA.

Uma ligeira actividade sinérgica foi observada na maior concentração de INF-α 2a utilizada, porém, de um modo geral, a actividade anti-HCV combinada de [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA com INF-a 2a pode ser considerada como aditiva (Fig. 4).

As resumidas constatações como a seguir: com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA podem ser A [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA possui uma actividade anti-HCV mais potente e é menos citotóxica do que a CsA, como demonstrado num sistema de replicão subgenómico do HCV. Isto foi confirmado numa cultura de célula de hepatoma infectada com um genoma quimérico infeccioso de comprimento total entre estirpes de HCV J6 e JFH1. A [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA é capaz de curar as células do seu replicão de HCV mais eficazmente do que a CsA.

Esses efeitos estão relacionados com uma afinidade mais pronunciadas de ligação à ciclofilina. A actividade anti-HCV da combinação [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA / INF-α 2a é aditiva. 23 A [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA pode ser utilizada para tratar doentes infectados com o HCV. 0 composto activo pode ser administrado por qualquer via convencional. Pode ser administrado parentericamente, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injectáveis ou na forma de formulações de depósito injectável. Preferencialmente, será administrado por via oral na forma de soluções ou suspensões para beber, comprimidos ou cápsulas. Composições farmacêuticas para administração oral que compreendem uma ciclosporina da invenção estão descritas nos Exemplos. Tal como é demonstrado pelos exemplos, estas composições farmacêuticas tipicamente compreendem uma ciclosporina da invenção e uma ou mais substâncias veiculo farmaceuticamente aceitáveis. Tipicamente, estas composições são concentradas e necessitam ser combinadas com um diluente apropriado, por exemplo, água, antes da administração. As composições farmacêuticas para administração parentérica tipicamente também incluem um ou mais excipientes. Os excipientes opcionais incluem um agente isotónico, um tampão ou outro agente de controlo do pH, e um conservante. Estes excipientes podem ser adicionados para manutenção da composição e para aquisição das gamas de pH preferidas (cerca de 6,5-7,5) e osmolaridade (cerca de 300 mosm/L).

Exemplos adicionais de formulações de ciclosporina para administração oral podem ser encontrados nas Patentes U.S. Nos. 5,525,590 e 5,639,724 e Pedido de Patente U.S. 2003/0104992. Pela via oral, a dosagem indicada de uma ciclosporina da invenção para administração semanal diária a três vezes por semana pode ser de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, preferencialmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Pela via intravenosa, a dosagem correspondente indicada pode ser de cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, preferencialmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg. Uma quantidade eficaz da ciclosporina da invenção entende-se como uma quantidade que, quando administrada repetidamente no curso de 24 um regime terapêutico a um doente em necessidade do tratamento de infecção por HCV resulta numa resposta clinica objectiva, tal como uma redução estatisticamente significativa no titulo do HCV no soro ou uma redução significativa da actividade da ALT no soro de um doente.

Estudos clínicos de fase I iniciais foram levados a cabo para avaliar a segurança das doses orais de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA e para determinar o perfil farmacocinético e o perfil de segurança da substância do fármaco. Os estudos demonstraram que doses de 50 a 1600 mg numa micro-emulsão em água foram bem toleradas. Efeitos secundários brandos e de pouca duração foram observados incluindo náusea, vómito, dor abdominal, dores de cabeça brandas. Estes efeitos secundários não eram relacionados à dose.

Inúmeros factores serão levados em consideração por um clínico aquando da determinação das doses de ensaio para testar a eficácia de uma composição farmacêutica que compreende a ciclosporina da presente invenção contra infecção por HCV. Primordial entre estes estão a toxicidade e a semi-vida da ciclosporina seleccionada da invenção. Factores adicionais incluem a altura do doente, a idade do doente, o estado geral do doente (incluindo doenças sistémicas significativas ou principais incluindo doença descompensada do fígado, comprometimento da medula espinal pré-existente grave e outras infecções virais), o estágio da infecção por HCV (agudo versus crónico) como indicado, por exemplo, por níveis de alanina aminotransferase (ALT) no soro, do genótipo particular do HCV, terapêutica prévia de infecção por HCV, a presença de outros fármacos no doente, e outros. Um curso de tratamento necessitará administração repetida de uma composição farmacêutica da invenção. Tipicamente, uma dose de fármaco adequada será administrada 3-7 vezes por semana e a duração do tratamento pode ser de cerca de 4 semanas a 6 meses, preferencialmente de 25 cerca de 4 semanas a cerca de 12 meses. 0 tratamento pode ser seguido por determinações de HCV no soro e medição dos níveis de ALT no soro. 0 ponto final do tratamento é uma resposta virológica, isto é, a ausência de HCV no final de um curso de tratamento, vários meses após o término do tratamento. 0 HCV no soro pode ser medido ao nível do RNA por métodos tais como PCR-RT quantitativo ou Northern blots ou ao nível de proteína por imunoensaio enzimático ou imunoensaio de quimiluminescência intensificado de proteínas virais. 0 ponto final também pode incluir uma determinação de um nível de ALT no soro na gama normal.

Uma composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um ou mais de outros ingredientes activos contra infecção por HCV para além da ciclosporina da presente invenção, tal como por exemplo, outra substância de fármaco antiviral, por exemplo ribavirina ou um interferão alfa. A ciclosporina da invenção e este outro ingrediente activo podem ser administrados juntos, como parte da mesma composição farmacêutica ou podem ser administrados em separado, como parte de um regime de dose apropriado destinado a obter os benefícios da terapêutica de combinação. 0 regime de dose adequado, a quantidade de cada dose administrada e os intervalos específicos entre as doses de cada agente activo dependerão da combinação específica dos agentes activos utilizados, do estado do doente a ser tratado e outros factores discutidos no parágrafo anterior. Tais ingredientes activos adicionais serão, em geral, administrados em quantidades menores ou iguais àquelas para as quais são eficazes como agentes terapêuticos únicos. As dosagens aprovadas pelo FDA para estes agentes activos que receberam a aprovação do FDA para administração a serem humanos, estão publicamente disponíveis. 26 A invenção é ainda elaborada pelos exemplos a seguir. Os exemplos são proporcionados com a finalidade de ilustração para um especialista na técnica e não pretendem ser limitativos do âmbito da invenção, tal como descrita nas reivindicações. Desse modo, a invenção não deve ser interpretada como sendo limitada aos exemplos proporcionados, mas deve ser interpretada de modo a abranger quaisquer e todas as variações que se tornam evidentes como resultado do ensinamento aqui dado.

EXEMPLO 1: Síntese de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA (Traduzido de uma tese de PhD por Jean François Guichou, intitulada "De nouveaux analogues de Cyclosporin A comme agent anti-VIH-1", Falculte des Sciences, University of Lausanne, CH-1015 Lausanne, Suíça (2001)). Síntese de H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe: 4-Dimetilaminopiridina (DMAP) (41,5 mmoles; 5,8 g) foi adicionada a uma solução de ciclosporina A (CsA) (8,3 mmoles; 10 g) em 100 mL de anidrido acético. A solução foi agitada por 18 horas à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi a seguir diluída com 600 mL de acetato de etilo, e lavada duas vezes com água e quatro vezes com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A fase orgânica foi seca sobre Na2S04, filtrada e o solvente foi evaporado a pressão reduzida. O resíduo amarelo obtido foi submetido a cromatografia em gel de sílica (eluente: 98:2 diclorometano/metanol) e recristalizado em éter. 9,5 g de MeBmt (OAc)-CsA, foi recuperado na forma de um pó branco, o que representa um rendimento de 92%. 27

Tetrafluoroborato de trimetiloxónio (22,5 mmoles; 3,3 g) foi adicionado a uma solução de MeBmt(OAc)-Cs (7,5 mmoles; 9,4 g) em 60 mL de diclorometano. Depois de 16 horas à temperatura ambiente, 35 mL de metanolato de sódio 0,26 M em metanol foram adicionados. Depois de 1 hora, 35 mL de metanol e 35 mL de ácido sulfúrico 2 N foram adicionados, e a mistura de reacção foi agitada por mais 15 minutos, neutralizada ao pH 6,0 com KHCO3 saturado (28 mL) e extraída duas vezes com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada 2 vezes com NaCl saturado, seca sobre Na2S04 anidro e filtrada. Subsequentemente, 0 solvente foi evaporado a pressão reduzida. O resíduo foi submetido a cromatografia em gel de sílica (eluente: 5:1 acetato de etilo/metanol). Foram obtidos 7,3 g de H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (rendimento: 76%). HPLC tr=268,23 mn (98%) ES/MS: m/z: 1277, 5 [M+H+] , 639,2 [M+2H+] Síntese de H-Val-MeLeU-Ala-D-Ala-MeLeU-MeLeU-MeVal-

MeBmt(OAc)-AbU-Sar-OMe: DMAP (2,3 mmoles; 334 mg) e isotiocianato de fenilo (6,9 mmoles; 0,75 mL) foram adicionados a uma solução de H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (4,6 mmoles; 7 g) em 48 mL de tetra-hidrofurano. Depois de 2 horas, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi submetido a cromatografia em gel de sílica (eluentes: 9:1 éter metil terc-butílico (MTBE)/acetato de etilo (1); 9:1 MTBE/metanol (2)). Foram obtidos 5,8 g de Ph-NH-C(S)-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (90% de rendimento).

Adicionou-se 13,8 mL de ácido trifuoroacético a uma solução do último composto (4 mmoles; 5,6 g) em 290 mL de diclorometano. Depois de 1 hora de reacção, a mistura foi neutralizada utilizando 28 KHCO3 e diluída com 500 mL de diclorometano. A fase orgânica foi lavada 2 vezes com NaCl saturado, seca sobre Na2S04 anidro e filtrada. Subsequentemente, o solvente foi evaporado a pressão reduzida. O resíduo foi submetido a cromatografia em gel de sílica (eluentes: 9:1 MTBE/acetato de etilo (1); 3:1 MTBE/metanol (2)).

Foram obtidos 2,8 g de H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (61% de rendimento). HPLC tr=25,80 mn (99%) ES/MS: m/z: 1050,5 [M+H+] , 547, 7 [M+2H+] Síntese de Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBrTIt(OAc)-AbU-NMe-CH2-CH2-OH:

Adicionou-se Ν,Ν,Ν'-tetrametilformamidínio hexafluorofosfato de flúor (TFFH) (0,96 mmoles; 0,25 g) sob uma atmosfera inerte, foi adicionado a uma solução de H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (0,87 mmoles; 1,00 g), DIPEA (2,78 mmoles; 0,48 mL) e Boc-D-MeAla-EtVal-OH (0,96 mmoles; 0,32 g) em 15 mL de diclorometano. Depois de 15 minutos, o diclorometano foi evaporado e o resíduo retirado em acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada sucessivamente com uma solução saturada de NaHC03, uma solução a 10% de ácido acético e uma solução saturada de NaCl e foi depois seca sobre Na2S04 e concentrada. A cromatograf ia em gel de sílica (em 98:2 acetato de etilo/ metanol) rende 1,14 g (90%) de Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe. O último produto (0,64 mmoles; 0,93 g) foi retirado em 45 mL de metanol anidro e boro-hidreto de sódio (25,5 mmoles; 0,96 g) foi adicionado em pequenas porções a intervalos de 15 minutos durante um período de 3 horas e 30 minutos. Em 4 horas, a mistura de reacção foi resfriada até 0 °C, hidrolisada pela adição de ácido cítrico a 10% e concentrada. 0 resíduo foi retirado em acetato de 29 etilo. A fase orgânica foi lavada com uma solução a 10% de ácido cítrico e uma solução saturada de NaCl, e foi então seca sobre Na2S04 e concentrada. Depois de cromatografia em gel de sílica (em 95:5 acetato de etilo/metanol) foram obtidos 0,63 g (81%) de Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH. ES/MS: m/z: 1434, 9 [M+H+], 717,9 [M+2H+] Síntese de H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH: Ácido metanossulfónico (3,18 mmoles; 2,060 mL) foi adicionado a uma solução de Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-AbU-NMe-CH2-CH2-OH (0,425 mmoles; 610 mg) em 42,5 mL de metanol, e a mistura foi aquecida e mantida a 50 °C. O progresso da reacção foi monitorizado por HPLC e espectrometria de massa. Depois de 80 horas, a mistura foi resfriada até 0 °C, e hidrolisada pela adição de NaHC03 1 Μ. O metanol foi eliminado e o resíduo foi retirado em acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com NaHC03 1 M e depois uma solução saturada de NaCl, seca sobre Na2S04 anidro e concentrada. O produto (557 mg), H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-Mel_eu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-0-CH2-CH2-NHMe, foi utilizado na próxima etapa sem purificação. 0 produto (0,42 mmoles; 557 mg) foi dissolvido em 20 mL de metanol e combinado sob uma atmosfera inerte com uma solução de metanolato de sódio (1,26 mmoles) em 1,26 mL metanol. Depois de 18 horas à temperatura ambiente, a mistura de reacção foi resfriada até 0 °C e hidróxido de sódio (4,2 mmoles; 168 mg) em 5 mL de água foi adicionado gota a gota. Depois de 21 horas à temperatura ambiente, a mistura de reacção foi de novo resfriada até 0 °C e neutralizada com KHS04 1 Μ. O metanol foi eliminado e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com uma 30 solução semi-saturada de NaCl, seca sobre Na2S04 anidro e concentrada. 0 produto (335 mg; 64%), H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH, foi utilizado na próxima etapa sem purificação. HPLC tr=26,27 mn (86%) ES/MS: m/z: 1235,5 [M+H+] , 618,2 [M+2H+] Síntese de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA:

Sob uma atmosfera inerte, uma solução de H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH (0,162 mmoles; 200 mg) e sym.colidina (1,78 mmoles; 0,24 mL) em 50 mL de diclorometano foi adicionada gota a gota a uma solução de hexafluoro-fosfato de (7-azabenzotriazol-l-iloxi)tripirrolidinofosfónio (PyAOP, 0,486 mmoles; 254 mg) em 3,2 litros de diclorometano. 72 horas mais tarde, a mistura de reacção foi hidrolisada pela adição de uma solução a 10% Na2C03. O diclorometano foi evaporado e o resíduo retirado em acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada sucessivamente com uma solução de HC1 0,1 N e uma solução saturada de NaCl, seca sobre Na2S04 anidro e concentrada. O produto bruto foi purificado em gel de sílica, com um rendimento de 110 mg (59%) de [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA. HPLC tr=30,54 mn (100%) ES/MS: m/z: 1217,6 [M+H+], 609,3 [M+2H+] EXAMPLE 2: Formulações orais de ciclosporinas da invenção.

As quantidades são expressas como % em p/p. 31

Exemplo A

Ciclosporina da invenção 10 Glicofurol 75 35,95 Miglicol 812 18 Cremophor RH40 35,95 Alfa-Tocoferol 0,1 Exemplo B: Ciclosporina da invenção 10 Tetraglicol 2 Captex 800 2 Nikkol HCO-40 85,9 Hidroxitolueno de butilo (BHT) 0,1 Exemplo C: Ciclosporina da invenção 10 Glicofurol 75 39,95 Miglicol 812 14 Cremophor RH40 36 Butil hidroxianisol (BHA) 0,05-0,1 Exemplo D: Ciclosporina da invenção 10 Tetraglicol 10 Miritol 5 Cremophor RH40 74,9 Alfa-Tocoferol 0,1 Exemplo E: Ciclosporina da invenção 10 Etanol 9 Propileno Glicol 8 Cremophor RH40 41 32 32

Monolinoleato de Glicerol

Para os componentes individuais das formulação A-D e para os métodos de preparação, ver o Pedido de Patente Britânico N° 2,222,770.

Lisboa, 2 de Março de 2011. 33

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA para a preparação de um produto medicinal destinado ao tratamento de infecção por HCV ou a prevenção da recorrência de HCV.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação e, caracterizado pelo facto da referida [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA, sendo um primeiro ingrediente, ser co-administrada ou administrada separadamente com pelo menos um segundo ingrediente que é uma substância de fármaco antiviral activa contra HCV seleccionada do grupo que consiste em ribavirina e um interferão alfa.
3. 3. Composição farmacêutica que compreende a [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA como primeiro ingrediente e pelo menos uma substância de fármaco antiviral activa contra HCV como um segundo ingrediente, caracterizada pelo facto do referido segundo ingrediente ser seleccionado do grupo que consiste em ribavirina e um interferão alfa.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 que compreende ainda um veiculo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um diluente.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4 para utilização no tratamento de infecção por HCV ou a prevenção da recorrência de HCV.
6. 6. [D-MeAla]3-[EtVal] 4-CsA para utilização no tratamento de infecção por HCV ou a prevenção da recorrência de HCV. Lisboa, 2 de Março de 2011. 1