KR101191833B1

KR101191833B1 - 씨형 간염 감염의 치료용［디-멜라］3-［에트발］4-시클로스포린의 이용 및 상기［디-멜라］3-［에트발］4-시클로스포린으로 구성되는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101191833B1
Application number: KR1020077007285A
Authority: KR
Inventors: 삐에뜨로 스칼화로; 장 모리스 두몽; 그레고리 보그니오; 롤랑이브 모베르나이
Original assignee: 데비오팜 에스 에이
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2005-10-03
Publication date: 2012-10-16
Also published as: NZ554412A; MA28950B1; US7439227B2; HK1104236A1; PL1793844T3; TNSN07084A1; JP2008514690A; EA012650B1; USRE43371E1; EP1793844B1; SI1793844T1; MX2007003387A; UA88484C2; EP1793844A1; ZA200702610B; GEP20104960B; CN101056648A; EA200700725A1; DE602005025232D1; IL182362A0

Abstract

본 발명은 단일 활성 제제로서 또는 또 다른 활성 제제와의 조합에 따라, 증가된 시클로필린 결합 활동성 및 필수 결여 면역 억제 활동성을 갖는 시클로스포린의 HCV 감염의 치료의 이용에 관한 것이다.

시클로스포린, 시클로필린, HCV 감염 치료

Description

씨형 간염 감염의 치료용［디-멜라］3-［에트발］4-시클로스포린의 이용 및 상기［디-멜라］3-［에트발］4-시클로스포린으로 구성되는 약학 조성물{USE OF [D-MEALA]3-[ETVAL]4-CYCLOSPORIN FOR THE TREATMENT OF HEPATISIS C INFECTION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAID [D-MEALA]3-[ETVAL]4-CYCLOSPORIN}

본 발명은 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염의 치료를 위한 시클로스포린의 이용에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 상기 시클로스포린으로 구성되는 약학 조성물에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(HCV)는 추(Choo) 및 그의 동료(사이언스 244 참조 (1989), 359-362)들에 의하여 약 15년 전에 복제되었다. HCV는 플라비바이러스과(Flaviviridaee)에 속하며, 엔벨로프 뉴클레오캡시드 및 양극의 단일 스트랜드 RNA 게놈(Bartenschlager et al., Antiviral Res.60,(2003),91~102를 참조)로 구성된다. HCV는 임신 중에 혈액, 혈액 제품 및 수직 전염에 의하여 전염된다. 혈액 제품을 스크린하기 위한 진단 테스트의 도입에 의하여 새로운 감염율을 대폭 감소시켰다.

아직도, HCV는 심각한 의료 문제로 남아 있다. 현재 약 1억 7천만명의 HCV 감염 환자들이 있다. 감염의 최초 경로에 있어서 일반적으로 그 정도가 심하지 않다. 그러나, 면역 체계가 종종 상기 바이러스를 제거할 수 없을 뿐 아니라, 장시간의 잠복기를 갖는 바이러스에 감염된 사람들은 간경변 및 간세포암에 대한 높은 위험에 노출되어 있다(Poynard et al., Lancet 349, (1997), 825-832를 참조).

현재 사용 가능한 백신이 없으며, 치료를 위한 선택이 대단히 제한적이다(Manns et al., Indian J. Gastroenterol. 20 (Suppl. 1), (2001), C47-51; Tan et al., Nat. Rev. Drug Discov. 1, (2002), 867-881을 참조).

현재 치료는 인터페론 알파와 리바비린을 조합시켜 실시되고 있다. 상기 치료방법은 유전자형 2 및 3으로 감염된 환자의 85~90%에서 항바이러스 반응을 보이지만, 불행하게도 일반적인 유전자형 1에 감염된 환자의 단지 약 45%에서 그러한 반응을 보인다. 부작용이 심각하며, 근육통, 관절통, 열, 심각한 기능저하, 백혈구감소증, 용혈성 빈혈증 등이다.

보다 높은 항바이러스 활동성과 보다 우수한 안전 프로파일을 갖는 추가적인 치료방법들이 HCV 감염 치료를 위하여 필요하며, 특히 예를 들면 HCV 재발 방지를 위하여 그러한 것들이 더욱 필요하다. 안전한 프로파일을 만들기 위하여, 낮은 항체 의존 세포매개 세포독성과 세포증식억제 효과 및 높은 선택성 지수와 같은 기준이 HCV 감염의 클리닉 치료를 위하여 특히 필요하다.

시클로스포린을 이용한 HCV 감염의 치료를 위한 새로운 방법은 최근에 클리닉 관찰에 의하여 기술되었다(Teraoka et al., Transplant Proc., 1988, 20(3 suppl 3), 868-876 및 Inoue et al. J Gastroenterol, 2003, 38, 567-572). 최근의 방법에 의하면, 시클로스포린 A(CsA)은 클리닉적으로 사용 가능한 투약 농도로 HCV 서브-게놈 레플리콘의 생체외 세포 내 복제를 억제한다 (Watashi et al., Hepatology 38, 2003, 1282-1288 및 Nakagawa et al., BBRC 313, 2004, 42-47을 참조). 상기 두 그룹에 따르면, CsA의 항 HCV 효과는 FK 506 및 비면역 억제 시클로스포린 A 유도체의 이름으로 알려진 화합물과 같은 면역 억제 마크로라이드(macrolide)를 이용하여 만들어진 관측에 따라 면역 억제 활동성과 관련이 없다는 것을 제안하였다. 나카가와 등에 따르면, CsA의 확대 적용은 잘 알려진 면역 억제 특성으로 인하여 많은 문제를 야기하며, 이와 같은 문제를 극복하기 위한 한 방법은 비면역 억제 시클로스포린 아날로그를 사용하는 것을 고려하는 것이다.

지난 15년 동안, 수많은 의료 화학 연구들은 그러한 비면역 억제 시클로스포린 아날로그를 확인하기 위하여 수행되었으며, 화합물 NIM 811은 상기와 같은 특성을 갖는 가장 대표적인 화합물들 중 한 개이다.

9개의 다른 시클로스포린 A 유도체와 함께 NIM 811은 그들의 비면역 억제 특성에 대하여 특허 출원 EP 0 4840281에서 Ko et al.에 의하여 공개되었으며, HIV 감염의 치료 및 AIDS 예방에 상당히 유용한 것으로 고려된다. 그와 같은 유도체의 디자인(design)은 시클로스포린 A의 4-및/또는 5-포지션에서 아미노산의 변형을 포함한다.

시갈 등(Sigal et al.)은 시클로스포린 A의 2-및/또는 6-포지션에서 아미노산을 변형시켜, 전체 61개의 시클로스포린 아날로그를 합성하였으며, 그러한 화학 적 변형이 면역 억제 활동성을 감소시킨다는 것을 관찰하였다(Sigal et al., J. Exp. Med., 173, 1991, 619-628을 참조).

비면역 억제 화합물을 만들기 위하여 시클로스포린 A의 3-포지션에서 아미노산을 변형하기 위한 시도는 WO 98/28328, WO 98/28329 및 WO 98/28330에서 Barriere 등에 의하여 공개되었다.

웬거(Wenger)등은 위치 3에서 글리신과 비교하여 N-메틸레이트, 부피가 크지않는 소수성 또는 중성 아미노산을 포함하며, 위치 4에서 류신(leucine)과 비교하여 N-메틸레이트 또는 N-에틸레이트 소수성 또는 중성 아미노산을 포함하는 시클로스포린 A로부터 다른 일련의 화합물을 만들었으며, 그들에 따르면 그러한 화합물들은 HIV-1 복제를 억제하기 위한 높은 약효를 가지고 있으며, 면역 억제 활동성을 필수적으로 결여한다고 보고하였다(국제특허출원번호 WO 00/01715 및 Tetrahedron Lett., 41(2000), 7193-6을 참조).

본 발명의 목적은 HCV 감염의 치료를 위한 새로운 치료방법을 이용한 임상을 제공하는 것이며, 보다 구체적으로는 HCV 재발의 방지를 위한 것이다. 상기의 방법은 기존 제안된 치료 방법 또는 새롭게 제안된 방법들과 비교하여 보다 높은 항바이러스 활동성 및 보다 우수한 안전 프로파일을 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 발명자들은 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA와 같은 대단히 구체적인 화합물의 HCV로 감염된 환자에게 투약한 결과 상기의 조건들을 만족하는 놀라운 사실을 발견하였다. 또한 상기 발명자들은 그 비면역 억제 특성에 추가하여, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA가 시클로필린에 대하여 현저하게 증가된 친화성을 갖는다는 사실을 발견하였으며, 상기 증가된 친화성은 HCV 복제의 억제에 대한 증가된 효능과 서로 관련되어 있다.

따라서, 본 발명의 요지 중 하나는 환자에 있어서 HCV 감염의 치료를 위하여 의료 제품의 제조를 위한 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 사용에 관한 것이다.

[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 WO 00/01715에서 Wenger 등에 의하여 보고되었으며, CAS 등록 번호 254435-95-5를 갖는다. 그것은 다음 공식에 의하여 설명되는 환식 데카펩타이드이다.

상기의 공식에서 MeBmt는 N-메틸 -(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4-메틸 -(L)트레오닌이며, αAbu는 L-α-아미노부티릭 산이며, D-MeAla는 N-메틸 -D-알라닌이며, EtVal은 N-ethyl-L-발린이며, Val은 L-발린(valine)이며, MeLeu는 N-메틸 -L-류신이며, Ala는 L-알라닌이며, (D)Ala는 D-알라닌이며, 그리고 MeVal은 N-메틸 -L-발린(valine)이다. 시클로스포린의 참조용으로 사용된 아미노산 포지션의 기존 번호는 아래 공식에 나타나 있다. 상기의 구성은 시클로스포린 A에서의 그것들과는 서로 다른 잔기 확인을 표시하며 그리고 그들의 포지션을 제공하는 제1 부분과, 모든 다른 잔기들이 시클로스포린 A의 그것들과 동일한 것을 표시하는 "CsA"로 표시된 제2 부분으로 구성되는 조성물 이름을 사용하여 구현된다. 예를 들면, [Melle]⁴-CsA는 포지션 4에서 MeLeu가 Melle(N-메틸 -이소류신)에 의하여 교체되는 것을 제외하고, 시클로스포린 A와 동일한 시클로스포린이다.

본 발명을 하기의 실험과 그리고 도면들을 참조하여 설명하면 다음과 같다.

도 1은 감염된 Huh-7-Lunet 세포에서 루시페라아제 분석(assay)으로 측정된 도즈(dose) 반응 히스토그램을 도시한다.

도 2는 감염된 Huh-7.5 세포에서 루시페라아제 분석에 의하여 측정된 도즈 반응 히스토그램을 도시한다.

도 3은 감염된 Huh-9-13 세포의 클리어런스 반응 곡선을 도시한다.

도 4는 IFN/[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA 조합에 따른 도즈 반응을 입체적으로 표시하는 것이다.

시클로스포린 A의 현재 의료용 사용은 활성 T 세포(Borel (1989) 이식, Proceed. 21, 810-815; Kronke et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5214-5218; Faulds et al. (1993) Drugs 45, 953-1040)부터의 인터루킨 2(IL-2)을 포함하여, 여러개의 T-세포 성장 인자의 생산 및 방출을 예방하여 세포 중개 면역 반응을 억제하기 위한 본 화합물의 능력에 관련된 것이다. 이와 같은 세포들로의 침입 즉시, 시클로스포린 A는 높은 친화력으로 시클로필린에 결합한다(Handschumacher et al. (1984) 사이언스 226, 544-547). 서로 다른 생물학적 기 능으로서, 그들은 체외에서 측정될 수 있는 펩티딜-프로필시스-트랜스 이소메라제(PPlase) 활동성을 갖는다(Fisher et al. (1989) 네이쳐 337, 476-478; Takahashi et al (1989) 네이쳐 337, 473-475). 시클로스포린 A의 면역 억제 효과에 대한 임계 상태는 시클로필린-시클로스포린 A 컴플렉스 및 칼슘 - 및 칼모둘린-종속 세린/트레오닌 포스파타아제 2B(칼시뉴린) 사이의 상호작용이다(Hauske (1993) DN&P 6, 705-711, Friedman et al (1991) 셀 66, 799-806; Liu et al (1991) 셀 66, 807-815). 이와 같은 삼성분복합체(ternary complex)의 형성에 따라 칼시뉴린의 포스파타아제를 억제하는 결과를 가져온다(Jain et al (1993) 네이쳐 365, 352-355; Rao et al (1997) (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 707-747; Crabtree (1999) 셀 96, 611-614). 칼시뉴린은 활성체(activator) 단백질 1과 연결되는 그리고 IL-2 유전자를 포함한 목표 유전자를 트랜스-엑티베이트시키는 핵으로 위치 이전되는 NF-AT의 선택적 탈인산화(dephosphorylation)를 증진시킨다.

그리고, 3- 및 4-위치에서의 아미노산에 의하여, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA 는 트랜스스크립 유전정보 및 면역학적 분석에 도시된 칼시뉴린과 상호 작용에 대하여 현저하게 감소된 능력을 가질 뿐만 아니라 펩티딜-프로필 시스-트랜스 아이소메라제의 억제 분석으로 얻어진 시클로필린에 대하여 현저히 증가된 친화성을 가진다.

시클로필린의 펩티딜-프로필 시스-트랜스 아이소메라제(PPlase)는 Kofron등으로부터 적용된 순서에 따라 결정된다(Biochemistry 30, 6127-6134(1991); J. Am. Chem. Soc. 114, 2670-2675(1992)를 참조). N-succinylated Ala-Ala-Pro-Phe-para nitro-aniline(Suc-AAPF-pNA, Bachem, Bubendrof, 스위스)가 기질(substrate)로 사용된다. 상기 분석은 테트라펩타이드 Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 내의 Phe-pNA의 트랜스 아이소폼의 우선 키모트립신 난할(preferential chymotrypsin cleavage)에 따라 수행되었다. 상기의 난할(cleavage)이 검출되어 390nm(ε=11,814M^-1cm^-1)로 정량화될 수 있는 파라-니트로아닐린의 일 부분을 자유롭게 한다. Schutkowski등(1995) Biochemistry 34, 13016-13026. 시스-트랜스 이성질화는 시클로필린에 의하여 촉매 반응된다(PPlase, EC 5.2.1.8). CsA 또는 시클로스포린(에탄올 내에 100배 농축 스톡(stpck) 용액으로부터 만들어진 10^-9-2x10^-5 M 최종 농축)을 40mM Hepes, pH 7.9의 1.5ml의 전체 부피로 얼음 위에서 50분간 인큐베이션을 한 0.1μg 시클로필린(시그마)와 혼합한 이후에, 반응 혼합물은 Varian spectrophotometer(Varian) 내에서 10℃로 보존된 큐벳(cuvette)으로 이송된다. 3.75mg의 치모트립신(10mM HCl 내의 chymotrypsin 용액 70μl)를 추가하고, 0.5M 트리플루오로에탄올에서 Suc-AAPF-pNA의 3.2mM 용액의 10μl을 추가하여 반응을 시작하였다. 상기 반응은 3분 동안 모니터링 되었으며, 최초의 속도 상수(initial rate constant)는 그 결과 얻어진 데이터로부터 결정되었다. 제어하는 방법으로서, 최초의 속도 상수는 시클로필린을 갖지 않는 병렬 반응에 대하여 결정하였다. 농도 반응 곡선이 시클로스포린 A 및 다른 시클로스포린에 대하여 얻어졌으며, 다른 시클로스포린의 IC₅₀(50% 억제 농도) 값은 시클로스포린 A(1.0)의 그것에 대응하여 표현된다. 1보다 작은 값은 화합물이 CsA보다 높은 시클로필린 친화성을 갖는다는 것을 뜻한다.

시클로스포린의 면역억제 활동성을 처음 예측하기 위하여 NF-AT-종속 리퍼터 분석이 사용되었다. IL-2 유전자의 조촉매(promoter)의 제어에 따라 박테리아 β-galactosidase(갈락토시다제) 유전자를 포함하는 리포터 구성체(construct)로 안전하게 전환된 Jurkat T-세포는 (Baumann 등(1992) Transplant Proc. 24, 43-48) 스위스 바젤의 노바티스 제약회사의 G. Zenke로부터 얻어졌다. 세포들은 10%의 열 비활성 송아지 태아 혈청, 100μ/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 2mM 글루타민, 50μM 2-머캡토에탄올 및 100μ/ml 하이그로마이 신 B로 보충된 RPMI 1640 매개체 내에서 배양되었다. 세포들은 시클로스포린 A 또는 또 다른 시클로스포린(에탄올 내에서 1000배 농축된 스톡 용액으로부터 만들어진 10^-9-2x10^-5 M 최종 농축)을 제공한 상태 또는 제공하지 않은 상태에서 2.4μM phorbol(포르볼)-12-myristate(마이리스테이트)-13-아세테이트 및 75μg/ml 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)을 추가시켜 자극 반응시켰다. 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션 처리한 이후에, 세포들을 모아서 50mM Na₂HPO4(pH9.0), 10mM KCl, 1mM MgSO4, 1% Triton(트리톤) X -100, 0.5mM 4-methylumbelliferyl(메틸럼벨리페릴)-β-D-galactoside(갈락토사이드)(Sigma, Buchs, 스위스) 내에서 세포 용해(lysed)되었다. 여기서, β-갈락토시다아제(galactosidase) 반응은 1시간 동안 실온에서 어두운 곳에서 처리되었다. 풀루오르센트(Fluorescent) 4-메틸-umbelliferone(엄벨리페론)는 상등액 용액(여기(excitation): 355nm; 에미션: 460nm) 내에서 플루오르메티컬하게 분석되었다. 농도 반응 곡선은 시클로스포린 A 및 다른 시클로스포린에 대하여 만들어졌으며, 다른 시클로스포린의 IC₅₀ 값들은 시클로스포린 A(1.0)의 그것에 대응하여 계산되었다. 1보다 높은 값은 화합물이 CsA 보다 덜 면역 억제적이라는 것을 뜻한다.

예시적인 결과들이 아래의 표 1에 제공되어 있다.

표 1: 시클로필린 결합(PPlase) 및 CsA 및 다른 시클로스포린의 면역 억제(IL-2) 활동성

표 1의 데이터에 따르면, 포지션 4(예를 들면, Val, lle)에서 어떤 치환에 의하여 면역 억제 활동성(IL-2 표현의 억제로서 측정)을 극적으로 감소시켰을 뿐 아니라, 시클로필린 결합 활동성(시클로필린의 PPlase 활동성에 대한 억제성 측정)을 측정가능하게 개선하였다. 포지션 3에서의 치환에 의하여, 시클로필린 결합 활동성(2배 또는 그 이상; cf[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA)을 현저하게 증가시켰다. 리터리쳐(literature)로부터 사용가능한 최고의 기준 화합물인 [Melle]⁴-CsA보다 보다 높은 시클로필린 결합 활동성 및 보다 낮은 잔여물 면역 억제 활동성을 나타내었다. 여기서, [Melle]⁴-CsA는 NIM811로써 알려져 있다.

[D- MeAla ] ³ -[ EtVal ] ⁴ - CsA 의 비면역 억제 활동성

확인 분석에서, CsA, [Melle]⁴-CsA 및 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 면역 억제 활동성은 혼합된 임파구(lymphocyte) 반응을 이용하여 추정되었다. 이와 같은 분석에서, 시클로스포린은 에탄올(10ml/ml) 내에서 용해되었다. 두 개의 건강한 공여체로부터 신선하게 분리된 CD4⁺ PBMCs는 혼합되어, 개체군(자극기 세포; S) 중 한 개의 개체군의 방사선 요법(irradiation)에 의하여 비활성화된다. 시클로스포린(1μg/ml)이 제공된 상태 또는 제공되지 않은 상태에서 5일 동안 공동 배양한 이후에, 비활성 세포 개체군(응답기 세포; R)의 증식성(proliferative) 반응은 [³H]-티미딘 포함에 의하여 결정된다.

분석이 2개의 세포 개체군을 이용하여 반복적으로 수행되었다. 각각의 세포 개체군은 교대로 비활성화되고 그리고 자극 처리되었다. 응답기 세포의 자극 처리(%)는 다음의 공식에 의하여 계산되었다.

백분율 자극 = 100x(시클로스포린의 샘플-백그라운드)/(시클로스포린 없는 샘플-백그라운드)

샘플들은 자극기 및 응답기 세포의 혼합물이다. 백그라운드는 자극기 세포들만이 혼합되는 제어를 뜻한다. 그 결과들이 표 2에 도시되어 있다. [Melle]⁴-CsA 및 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 기본적으로 면역 억제 활동성을 결여하고 있다.

표 2: 시클로스포린이 제공된 상태/제공되지 않은 상태에서 CD4⁺ PBMCs의 증식성 반응

R1 x S2는 공여체 1로부터의 응답기 세포 및 공여체 2로부터의 자극기 세포의 공동 배양을 뜻한다. N은 특정 횟수를 뜻한다.

[D- MeAla ] ³ -[ EtVal ] ⁴ - CsA 의 높은 항- HCV 활동성 및 낮은 cytotoxicity/cytostatic 효과

상기에 설명한 바와 같이, C형 간염 바이러스(HCV) 감염은 지속적으로 감염된 환자들이 간경변(cirrhosis) 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)을 포함하여 만성적인 간 질환에 대하여 높은 위험에 처하기 때문에 심각한 건강 상에 문제가 된다. 현재 사용 가능한 치료는 후자 개체군의 많은 부분에 적용이 안 되며, 그리고 현저한 부작용을 낳는다. 최근 까지만 해도, 보다 효과적인 치료법의 개발은 인간에 대한 임상 실험을 평가하기 이전에 잠재 활성 화합물의 스크린을 가능하게 하는 HCV 복제의 적절한 생체외 모델이 존재하지 않는 관계로 지연되고 있다. 상기와 같은 장애는 배양된 간종양 세포 내에서 높은 수치로 자체 증식하는 유전적으로 변형된 HCV 미니게놈(복제)의 개발로 극복 가능하다(Lohmann 등.사이언스 285, (1999), 110-113). 이와 같은 HCV 복제 시스템은 빠른 시간 내에 HCV 복제, 발병학 및 지속성을 연구하기 위한 표준 도구가 되었다(Bartenschlager 등. Antiviral Res. 60, (2003), 91-102). HCV 게놈은 약 3000개의 아미노산의 폴리프로테인을 위한 단일 오픈 리딩 프레임(single open reading frame)을 포함하는 단일 표준 RNA로 구성된다. 이와 같은 폴리프로테인의 전이는 RNA의 5' 끝단에 위치하는 내부 리보솜 엔트리 사이트(IRES)에서 시작한다. HCV 폴리프로테인은 최소한 10개의 단백질 내로 분리된다. 그들은 캡시드 단백질 C, 엔벨로프 단백질 E1 및 E2, 가능성 바이로포린(viroporin) 단백질 p7, 세린 단백질 뿐만 아니라 ATPase/helicase 활동성을 하는 비구조 단백질 NS2 및 NS3, NS4A, 막 웹 유도 단백질 NS4B, NS5A 및 RNA-종속 RNA 폴리메라아제 NS5B을 포함한다.

첫번째 성공적인 복제는 5' 내지 3'의 방향으로 HCV IRES와, 네오마이신(neomycin) 포스포트랜스페라아제(phosphotransferase)용 코딩 시퀀스, 엔세파로카디티스(encephalocarditis) 바이러스로부터의 IRES 및 HCV 단백질 NS3 내지 NS5의 코딩 시퀀스를 포함하는 바이시스트로닉(bicistronic) RNA이다. Huh-7 세포에 사용 및 G418(geneticin)을 이용한 선택을 한 결과, 상기 복제는 높은 수치로 자동 으로 복제되는 것을 보여주었다(1000-5000 카피/세포)(Lohmann 등, 1999). 시스템의 특성에 따라, 복제의 효용은 호스트 세포의 투과성, 보다 중요하게는 HCV 단백질-코딩 시퀀스에서 세포 배양 작용 돌연변이의 선택에 따라 결정된다. 이와 같은 복제는 인터페론 알파에 민감한 것으로 알려졌으며, 생체내 효용을 갖는 약을 스크리닝하기 위한 시스템의 관련성에 대한 증거를 제공한다. 다양한 복제가 구현되었으며, 그러한 복제에 있어서 네오마이신 포스포트랜스페라아제(phosphotransferase) 코딩 시퀀스는 루시페라아제-유비퀴틴(ubiquitin)-네오마이신 포스포트랜스페라아제 퓨전 단백질에 대하여, 예를 들면 루시페라아제 코딩 시퀀스 또는 시퀀스 코딩에 의하여 교환된다. 후자의 다양한 레플리콘의 복제는 편리한 루시페라아제 분석에 의하여 분석되며, 반면에 전자의 레플리콘의 복제는 RNA 카피 수의 결정을 필요로 한다.

와타시(Watashi)씨 등(2003)은 HCV RNA 축적이 CsA에 의하여 억제되었지만, MH-14 세포들을 포함하는 HCV 레플리콘 내에서 면역 억제 매크로라이드(macrolide) FK506 및 비면역억제 CsA 유도체 PSC833에 의하여 억제되지 않는다는 사실을 노던 볼트(Nthern bolt) 및 정량(quantitative) RT-PCR(reverse transcriptase chain reaction)에 의하여 공개되었다. 그들 분석에 따르면, 세포를 활성 제제에 7일간 노출한 결과, HCV RNA 적정 농도가 1μg/ml 시클로스포린을 제공한 상태에서 약 200배 감소하였다. 또한, 비면역 억제 시클로스포린 [Melle]⁴-CsA는 HCV 복제를 억제하였다. 그 결과, [Melle]⁴-CsA는 HCV RNA 적정 농도를 감소시키는데 있어서 CsA 만큼 거의 동일하게 효과적이라는 사실을 알았다.

본 발명의 시클로스포린은 항 HCV 활동성 효과를 갖는지, 그리고 이러한 활동성이 어떻게 CsA 및 [Melle]⁴-CsA의 활동성과 비교되는지를 알기 위하여, HCV 레플리콘 시스템 내에서의 CsA, [Melle]⁴-CsA 및 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴--CsA의 억제 효과를 비교하였다.

분석을 위하여, 반딧불이 루시페라아제-유비퀴틴(ubiquitin)-네오마이신 포스포트랜스페라아제 퓨전 단백질 및 HCV 단백질 NS3-5를 인코딩하는 바이시스트로닉(bicistronic) RNA을 포함하는 Huh 5-2 세포를 사용하였다. 바이러스 시퀀스는 유전자형 1b의 HCV 바이러스로부터 만들어진다. 세포들은 10%의 열 비활성 송아지 태아 혈청, 2mM 글루타민(라이프 테크노로지), 1 x 비필수아미노산(라이프 테크노로지), 100μ/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 및 250μg/ml G418(Geneticin, 라이프 테크노로지)가 포함된 RPMI 1640 매개체(Gibco) 내에서 37℃ 및 5% CO₂로 배양되었다. 항 바이러스성(복제) 분석을 위하여, G418을 제외하고 동일한 매개체 내에서 96-우물(well) 뷰 플레이트 TM(Packard) 내에 7000 세포/우물의 밀도로 파종하였다. 24시간 동안의 인큐베이션 이후에, 매개체가 제거되었으며, 매개체 내의 시험 화합물의 시리얼 희석이 이루어졌으며, 세포들은 추가로 72시간 동안 인큐베이션되었다.

항바이러스성 효과는 루시페라아제 분석 또는 정량 RT-PCR 둘 중 한 방법으로 얻어졌다. 루시페라아제 분석을 수행하기 위하여, 매개체가 제거되고, 세포들은 PBS로 세척되었다. 15분 동안 Glo-lysis(글로-라이시스) 버퍼(Promega) 내에서 세포를 용해 시킨 이후에, 스테드-글로(stead-Glo) 루시페라아제 분석 시약(reagent)(Promega) 50ml가 용해물에 추가되었다. 루시페라아제 활동성은 루미노미터를 이용하여 측정되었으며, 각 시험으로부터의 신호는 시험 화합물에 노출되지 않은 배양 우물 내에서 측정된 신호의 백분율로 표현되었다.

세포 밀도 및 성장 억제 효과는 MTT 분석을 이용하여 정규 96-우물 플레이트(Beckton-Dickinson) 내에서 병렬 배양으로 특정되었다(CellTiter 96^RAQ_ueous 비방사능 세포 분열 분석, Promega). 상기 분석에서, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-5-(3-카복시메톡시-페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸리움(MTS)가 플레이트 리더 내에서 498nm으로 정량화되는 포마즌으로 생물학적으로 감소된다. 포마즌 제품은 라이프 세포의 수와 직접적으로 연관되어 있다.

RT-PCR 분석에 의하여, ABI PRISM 7700 시퀀스 디텍터를 이용하여 레플리콘의 네오마이신 영역이 정량화된다(Applied Biosystems, Foster City, CA). 사용된 전방 방향 또는 역방향 프리머들은 각각 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' 및 5'-CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3'이다. 플루오르유전자 탐침은 5'-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-3'이다. 내부 제어의 방법으로, 네오마이신 포스포트랜스페라아제 유전자 시퀀스의 일부를 포함하는 플라스미드가 사용되었다.

이러한 실험의 결과에 의하여 50%까지 HCV 레플리콘 복제를 억제하는데 필요한 유효 농도에 해당하는 서로 다른 시클로스포린을 위한 EC₅₀의 계산을 가능하게 하였으며, 지수적으로 성장하는 세포 분열을 50%까지 억제하는데 필요한 농도인 CC₅₀의 계산을 가능하게 하였으며, 그리고 CC₅₀과 EC₅₀ 사이의 비율에 해당하는 선택 수치 SI의 계산을 가능하게 한다.

표 3은 복제 효용을 계산하기 위하여 루시페라아제 활동성 분석을 사용하여 그리고 루시페라아제 분석의 계산과 화합물의 성장 억제 계산을 위하여 MTT 분석을 이용하여 Huh 5-2 세포로부터 얻어진 값들이다. Watashi 등(2003)에 의한 상기 관측에 따라, CsA 및 [Melle]⁴-CsA는 유사한 항-HCV(복제) 활동성을 갖는다.

놀랍게도, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA가 CsA 및 [Melle]⁴-CsA 보다 상당히 더 약효가 있는 것으로 나타났다. [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA에 대한 50% 성장 억제 농도 (CC50)은 CsA 및 [Melle]⁴-CsA에 대하여 결정된 값들보다 현저히 높은 것을 알수 있다. 결과적으로, 두 개의 다른 시클로스포린과 비교하여 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA에 대하여 상당히 높은 선택성 지수가 발견되었다. EC₅₀ 값들이 정량 RT-PCR을 이용하여 RNA 티터(titers)의 결정으로부터 유도되는 아날로그 시험 결과는 유사한 결론을 보였다. 45^*, 73 및 625^*의 SI 값들은 CsA, [Melle]⁴-CsA 및 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA에 대하여 각각 얻어진다. 여기서, 기호 *은 독립적으로 각각 결정되는 2개의 값들 중 아래값들이 제공되는 것을 표시한다.

표 3: EC₅₀, CC₅₀ 및 SI값들은 HCV RNA 복제의 루시페라아제 분석 및 HCV 미니레플리콘을 포함하는 루시페라아제로 구성되는 Huh 5-2 세포에서 세포독성의 MTT 분석으로부터 결정되는 값이다.

유전자 재조합 HCV 을 갖는 감염 목표 세포에서 측정된 [D- MeAla ] ³ -[ EtVal ] ⁴ -CsA의 항바이러스성 활동성

CsA와 비교하여 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 항-HCV 활동성은 생체내 상황과 유사한 배양 시스템에서 추가로 결정된다. 상기 방법은 전염성 전장(full length) 키메릭(chimeric) HCV 구성체 또는 루시페라아제 수용체 유전자를 이송할 수 있도록 변형된 동일한 바이러스에 감염된 간종양 세포를 사용하였다. 감염된 세포들을 본 발명의 시클로스포린 또는 CsA를 이용하여 치료한 이후에, 루시페라아제 활동성은 바이러스성 복제의 억제에 직접적으로 서로 관련되어 있는 것이 관측되었다.

HCV 스트레인 J6 및 JFH1(Jc1) 사이의 전장 키메릭 게놈의 감염성 HCV 바이러스를 이용하여, 분석용 간종양 세포를 접종하였다. Jc1 바이러스의 구성체가 변형되어, 루시페라아제 리포터 유전자(Jc1-Luc)를 이송하는 바이시스트로닉(bicistronic) 게놈을 얻었다. Huh-7.5 세포에 의하여 게놈의 RNA 트랜스크 립(transcript) 유전정보 트렌스펙션 24시간 및 96시간 이후에, 상등액을 여과시키고(0.45μM), 린텐바하(Lindenbach) 등에 공개된 방법에 따라, ml당 세포 배양 감염 도즈 50(CCID50)를 제한 희석 분석법에 의하여 결정하였다. (사이언스, 309, (2005), 623-626). CCID50은 Jc1에 대하여 1.3 x 105였으며, 그리고 Jc1-Luc에 대하여 4.2 x 103였다.

Huh-7-Lunet 또는 Huh-7.5 세포 둘 중 한 개가 분석을 위하여 사용되었다(Lohmannn et al. 사이언스 285(5424), 110-113). 세포들은 10%의 열 비활성 fetal bovine 혈청(FCS)(Integro), 1 x 비필수아미노산(Gibco), 100IU/ml 페니실린(Gibco), 휴모노 세포를 위한 100μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)(Gibco) 또는 25μg/ml 하이그로마이신(hygromycin)(Gibco)을 포함하는 Dulbecco's 변형 Eagle's 매개체(DMEM; Gibco) 내에서 37℃의 온도와 5% CO2 조건에서 배양되었다.

항바이러스성(복제) 분석을 위하여, Huh-7-Lunet 및 Huh-7.5 세포가 12-우물 플레이트의 우물당 2x104 또는 4x104의 밀도로 파종되었다. 24시간 뒤에, 매개체는 Jc1-Luc 바이러스 스톡(12-우물 플레이트)의 0.5ml 또는 Jc1 바이러스 스톡(12-우물 플레이트)의 0.25ml에 의하여 교환되었다. 4시간 후에, 바이러스 접종원은 서로 다른 농도의 CsA 또는 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA를 포함하는 매개체로 교환되었으며, 그리고 추가로 72시간 동안 인큐베이션 처리되었다.

바이러스성 복제의 억제는 루시페라아제 분석 방법에 의하여 관찰되었다. 루시페라아제 분석을 수행하기 위하여, 세포들이 수확되었으며, PBS를 이용하여 세척하고, 루시페라아제 세포 용해 버퍼 내에서 세포 용해되었다(1% Triton X-100, 25mM. glycylglycine, 15mM MgSO4, 4mM EGTA 및 1mM DTT). Krieger et al의 방법에 따라, 반딧불이 루시페라아제 활동성이 관찰되었다. 한번의 냉동 및 해동 사이클이 끝난 이후에, 세포들이 부유 처리되었으며, 100μl의 세포 lysate는 360μl 분석 버퍼(25mM glycylglycine, 15mM MgSO4, 1mM DTT, 2mM ATP, 15mM 칼륨 인산염 버퍼, pH 7.8)와 200μl 기판 용액(200mM 루시페린, 25mM glycylglycine)과 서로 혼합되었다. 최종적으로, 20 샘플에 대하여 발광을 Lumat LB9507 루미노미터(Berthold)를 이용하여 측정하였다.

상기의 보기(도 1 및 도 2)들에 있어서, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA(백색 바) 및 CsA(흑색 바)는 도즈-종속 항바이러스성 활동성을 하였으며, 이에 따라 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 CsA와 비교하여 우수함을 증명하였으며, 서브게놈 레플리콘으로 얻어진 데이터를 확증하게 된다.

100배 높은 농도의 CsA가 필요하며, 본 발명의 시클로스포린과 동일한 복제 억제 효과를 얻는다.

시클로필린에 대한 본 발명의 시클로스포린의 높은 친화성

Watashi et al(2003) 및 Nagakawa et al(2003)에 의한 상기 관찰에 의하면, 항-HCV 효과는 시클로필린에 대한 시클로스포린의 결합 능력에 관한 것이다. CsA, [Melle]⁴-CsA 및 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 PPlase 활동성에 대한 효과가 시클로필린에 대하여 측정되어, 시클로필린 A와 같은 시클로필린 및 HCV 복제의 PPlase 활동성의 보다 우수한 약효능을 갖는 억제제를 결정하였다.

현재 유통되고 있는 유전자 재조합 시클로필린 A(Sigma)가 분석에 사용되었다. 시클로필린의 PPlase 활동성은 Garcia-Echverra 등에 의한 키모트립신(chymotrypsin)-결합 스펙트로모토메트릭(spectrophotometric) 분석을 이용하여 결정되었다(BBRC, 191, (1993), 70-75). 상기의 방법은 유형 N-succunyl-ala-pro-phe-p-nitroanilide의 펩타이드를 위한 키모트립신(chymotrypsin)의 높은 트랜스 선택성에 따라 실시된다. 펩타이드 난할은 390nm에서 검출 및 정량화될 수 있는 파라-니트로아닐린의 일 부분을 자유롭게 만들었다. 시스 폼의 가수분해는 시클로필린 A에 의하여 수행된 시스-트랜스 이성질화(isomerisation)의 속도에 의하여 제한된다. 펩타이드는 시스 콘포머(cis conformer) 펩타이드 개체군을 개선시키기 위하여 470mM으로 2,2,2-트리플로우로 에탄올에서 25 nM LiCl의 용액 내에 형성된다. 분석은 스플릿 빔 스펙트로포토메터(spectrophotometer)에서 수행되며, 물 욕조는 5℃로 설정된다. 시클로필 A(7500 pmol/mg 총 효소 농도; Sigma)는 버퍼 내에서 20nM에서 용해되며(35mM HEPES 및 0.26mg/ml 키모트립신 (활동성 50 유니트/mg), KOH를 갖는 pH 7.8) 및 실온에서 6분간 인큐베이션되었으며, 물 욕조에서 54분간 처리되었다. CsA, [Melle]⁴-CsA 또는 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 2-50nM의 농도 범위로 상기 인큐베이션에 적절하게 투입되었다. 3.5ml의 인큐베이션 시클로필린이 샘플 퀴벳에 추가되었다. 기준 퀴벳은 기준 빔의 밸런싱이 완료시키는 반응을 실시하게 된다. 반응을 개시하기 위하여 펩타이드가 25μM으로 추가되었다. 흡광도(absorbance)에서의 변화는 초당 10 데이터 포인트로 모니터링되었다. 제어의 방 법으로, 시클로필린을 결여하는 병렬 반응을 위한 속도들이 결정되었다. 펩타이드 가수분해의 블랭크 속도(예를 들면 시클로필린이 존재하지 않는 상태)는 시클로필린 A가 존재하는 상태에서의 속도로부터 감산하였다. PPlase 분석으로부터 얻어지는 최초 속도는 390nm에서의 흡수성(absorbance)에서 변화의 시간 경과의 궤적에서 제1차수 변환을 이용하여 제1차수 회귀 분석 방법으로 분석되었다. 속도 제한 반응을 위한 총 효소 농도(E_t), 반응 억제제 해리 상수(K_i) 및 속도 상수는 회귀 분석으로부터 얻어진 데이터를 견고한(tight) 결합 억제다중단백질 방정식에 대입하여 소프트웨어 FigSyS(2003, Biosoft)를 사용하여 계산된다.

견고한 결합 반응 억제제 다중단백질 방정식은 다음의 공식을 갖는다.

v=k^*E_t ^*P-k^*(-b-sqrt(b^*b-4^*c))/2

상기 식에서 b=-(E_t ^*P+I+K_i)이며, 그리고 c는 Et^*P^*I이다.

일단, Et, K_i 및 k가 주어진 세트 데이터에 대하여 컴퓨터에 의하여 계산되면, 상기 데이터는 그래픽으로 그려지며, 다음의 공식에 의하여 정의되는 단일 단백질로의 견고한 반응 억제제의 결합을 가정하면, 선들은 그 포인트들에 고정된다.

v=K^*E_t ^*P-K(B-sqrt(B^*B-4^*C))/2

상기의 식에서, B=E_t ^*P+I+K 및 C=E_t ^*P^*I이다.

표 4: PPlase 활동성 분석으로부터 결정되는 CsA, [Melle]⁴-CsA 및 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA에 대한 시클로필린 A의 E_t, K_i 및 k값

본 발명의 시클로스포린에 대하여 관찰된 시클로필린 A의 가장 낮은 값 K_i는 CsA 및 [Melle]⁴-CsA와 비교하여 높은 효능의 항바이러스성 활동성, 특이성 및 선택성 수치(상기에 설명)를 얻었다. 놀랍게도, 비면역 억제 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 다른 비면역 억제 시클로스포린 [Melle]⁴-CsA와 비교하여 보기의 시클로필린에 대하여 거의 6배의 높은 친화성을 보여주었다.

상기 실험 결과에 따라, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 테스트가 실시된 다른 시클로스포린 보다 보다 효과적인 반응 억제제였다. 이러한 사실에 따라, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 증가된 시클로필린 결합 활동성과 관련된 항-HCV 활동성을 증가시켰다.

HCV 레플리콘 클리어런스 및 리바운드

HCV 감염의 재발은 시클로스포린 및/또는 인터페론과 같은 가능성 있는 효율 적인 치료의 이용으로 질병의 중요한 문제점이다. CsA와 비교하여 본 발명의 시클로스포린의 보다 우수한 약효를 갖는 항-HCV 활동성이 HCV 레플리콘을 생산하는 보다 효율적인 치료 세포에 화합물로서의 그 능력이 반영되는지 않는지를 연구하기 위하여, 유전자 재조합으로 생산된 레플리콘에 대하여 선택성 약(selective drug) G418이 제공된 상태에서 수행되었다.

분석은 Huh-9-13 세포, 인간 간종양 세포(Huh-7)를 이용하여 실시되었다(Lohmann et al, 사이언스 285(5424), 110-113). 상기 세포들은 G418 압력이 없는 상태에서 일반적인 완전 매개체 DMEM 내에서 성장되었다. 세포들은 CsA 또는 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA를 제공한 상태에서 배양되었으며(두 경우, 0.5 또는 1μg/ml) 또는 7 연속 통과 동안 처리되지 않은 상태로 두었다. 제어 수행 결과, G418 선택성 압력의 존재에 의하여 여러개의 통과가 진행되는 동안 HCV 레플리콘 내용물이 영향을 받지 않았다. [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA를 이용하여 7일 동안 처리한 Huh-9-13 세포들이 그들의 레플리콘으로부터 실제적으로 클리어되는 것을 확인하기 위하여, G418 선택(1000μg/ml)은 2번의 추가 통과를 위하여 재시작되었다. HCV 레플리콘을 수용하고 있는 그러한 세포들은 상기와 같은 조건 하에서 번식하였으며, 레플리콘이 없는 세포들은 리바운드 단계 동안에 G418를 제공한 상태에서 죽었다.

RT-PCR은 서로 다른 통과 포인트에서 취해진 샘플들의 바이러스성 RNA의 추출물에 대하여 수행되었다. 사용된 전방 방향 및 역 방향의 프리머들은 각각 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' 및 5'-CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3'이다. 플루오르유전자 탐 침은 5'-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-3'이다. 내부 제어의 방법으로, 네오마이신 포스포트랜스페라아제 유전자 시퀀스의 일부를 포함하는 플라스미드가 사용되었다. 그결과들이 분석되었으며, 1000 세포당 레플리콘 RNA(ng)의 수량으로 표현되었으며, 초안 그래프를 그리는데 이용되었다.

이러한 실험(도 3)들의 결과는 이와 같은 표준 생체내 세포 분석에서 CsA와 비교하여 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 우수한 항바이러스성 효과를 보여주었다. 놀랍게도, 본 발명에 의한 시클로스포린은 살균 효과 뿐 아니라 다른 면역 억제 CsA로써 항바이러스 효과를 보여주었다. 실제적으로, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA 처리된 Huh-9-13 세포(도 3의 원형 및 사각형)은 G418(리바운드 단계)가 제공된 상태에서 다시 배양되었으며, CsA 처리된 세포(다이몬드형 및 삼각형)와 비교하여 배양이 죽었다. 7 연속 통과 동안에 CsA로 처리된 상기 두가지 배양은 G418을 제공한 상태에서 번식할 수 있었다. 상기와 같은 결과로, [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 그들의 HCV 레플리콘으로부터 Huh-9-13 세포들을 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.

약 조합

인터페론(INF)는 현재 HCV 감염의 치료 방법 중 한 방법이다. [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA/IFN-α 2a 조합의 효과는 Prichard 및 Shipman의 방법을 이용하여 평가하였다(Antiviral Res. 1990, 14, 181-205). 이론적인 부가 효과는 다음 방정식에 의한 개별 화합물의 도즈-반응 곡선으로부터 계산된다.

Z=X+Y(1-X)

상기 식에서, X는 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA에 의한 억제를 뜻하며, Y는 IFN-α 2a를 뜻한다. 그리고, Z는 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA와 IFN-α 2a와의 조합을 뜻한다. 이론적인 부가 표면은 실제적인 실험 표면으로부터 공제되어, 조합 내용이 부가적일때 제로 평면과 동일한 수평 표면이 되며, 그리고 제로 평면 상부에 존재하는 표면은 조합에 따른 시너지 상승 효과를 표시하며, 상기 제로 평면 아래의 표면은 길항 작용을 뜻한다. 항바이러스 분석은 화합물이 체크 보드 형식으로 추가되는 것을 제외하고 Huh 5-2 세포에 대하여 설명된 상기 방법에 따라 수행된다. 각각의 화합물에 대하여, 3개의 복제 플레이트를 사용하여, 각각의 개별 화합물의 도즈 반응 곡선을 측정하였다. 3개의 플레이트로부터 얻어진 데이터는 이론적인 부가 표면을 계산하기 위하여 사용되었다. 각각의 화합물 쌍에 대한 조합에 대한 연구는 3번 실시하였다. 모든 데이터는 ANOVA 테스트의 방법으로 가변 조건 수에 대하여 분석되었다.

조금의 시너지 활동성이 IFN-α 2a의 가장 높은 농도에서 관찰되었지만, 전체적인 D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA와 IFN-α 2a의 조합 항-HCV 활동성이 추가로 발견되었다 (도 4).

[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA를 이용한 결과는 다음과 같이 요약된다.

- [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 HCV 서브게놈 레플리콘 시스템에 도시된 바와 같이, Z보다 우수한 약 효능 항-HCV 활동성을 가지며, CsA와 비교하여 세포독성을 적게 가졌다.

- 이와 같은 것은 HCV 스트레인 J6 및 JFH1 사이에서 전장(full length) 감염성 키메릭 게놈으로 감염된 간종양 세포 배양에서 확인되었다.

- [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 CsA와 비교하여 더 효과적으로 그들 HCV 레플리콘으로부터 세포들을 치료할 수 있다.

- 상기와 같은 효과들은 보다 우수한 시클로필린 결합 친화성에 관련되어 있다.

- 조합 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA/IFN-α 2a의 항-HCV 활동성은 부가적이다.

[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA가 HCV에 감염된 환자를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

활성 화합물은 일반적인 방법으로 투여될 수 있다. 상기 활성 화합물은 주사 가능 용액 또는 부유액의 형태 또는 주사가능한 침전 제제 형태로 비경구 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 마시는 형태의 용액 또는 부유액, 타블렛 또는 캡슐 형태로 경구 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 시클로스포린으로 구성되는 경구 투여에 대한 약학 조성물은 예제들에 설명되어 있다. 상기 예제들에 설명된 바와 같이, 그러한 약학 조성물은 본 발명에 의한 하나의 시클로스포린을 포함하며, 한 개 또는 그 이상의 약학적으로 수용 가능한 운반체 물질을 갖는다. 이러한 조성물들은 농도 처리되며, 투여되기 이전에 물과 같은 소정의 희석제와 혼합될 필요가 있다. 비경구 투여를 위한 약학 조성물은 한 개 또는 그 이상의 첨가제를 갖는다. 선택적 첨가제는 등장제(isotonic agent), 버퍼 또는 다른 Ph 조절 제제, 보존제를 포함한다. 이러한 첨가제들은 조성물의 유지를 위하여 첨가될 수 있으며, 그리고 바람직한 Ph 농도(약 6.5~7.5) 및 오스몰 농도(약 300mosm/L)를 얻기 위하여 첨가될 수 있다.

경구 투여를 위한 시클로스포린 제제의 추가적인 예시들은 미국 특허 번호 5,525,590 및 5,639,724 및 미국 특허 출원 번호 2003/0104992에 공개되어 있다. 경구 경로에 대하여, 트라이스(trice) 주간 투여를 위한 본 발명에 의한 상기 시클로스포린의 표시 복용량은 약 1mg/kg에서 약 100mg/kg이며, 바람직하게는 약 1mg/kg에서 약 20mg/kg이다. 정맥내 경로에 대하여, 표시된 해당 복용량은 약 1mg/kg에서 약 50mg/kg이며, 바람직하게는 약 1mg/kg에서 약 25mg/kg이다. 본 발명에 의한 효과적인 상기 시클로스포린의 양은 HCV 감염에 대한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 섭생을 하는 동안에 반복적으로 투여했을때, 혈청 HCV 티터(titer)에 있어서 통계적으로 현저한 감소 또는 환자에 있어서 혈청 ALT 활동성의 현저한 감소와 같은 목적물에 대한 임상 반응이 나타나는 양에 해당한다.

최초 단계 I 임상 연구는 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 경구 투약의 안전성을 평가하기 위하여 그리고 약 물질의 약동학 프로파일 및 안전 프로파일을 결정하기 위하여 수행되었다. 연구 결과, 물에 포함된 마이크로-에멀션에서 50 내지 1600의 도즈는 잘 융화되는 것으로 나타났다. 현기증, 구토, 복통, 미약한 두통과 같은 미 약하고 짧은 시간의 부작용이 관찰되었다. 이러한 부작용은 도즈(dose)와 관련성이 없었다.

HCV 감염에 대한 본 발명의 상기 시클로스포린으로 구성되는 약학 조성물의 효능을 검사하기 위하여 시험 도즈를 결정할때 수많은 인자들이 임상의에 의하여 고려되었다. 이러한 요인들 중에서 주된 요인은 독성과 본 발명에 의한 선택된 시클로스포린의 반감된 수명이다. 추가적인 인자들은 환자의 신체 크기, 환자의 나이, 환자의 전체적인 조건(보상작용 상실 간 질환, 심각한 선재(preexisting) 골수 컨프로마이즈(conpromise) 및 다른 바이러스성 감염을 포함한 주요 질환), 혈청 알라니 아미노트랜스페라아제(ALT) 수치와 같은 HCV 감염 단계(급성 대 만성), HCV 감염의 조기 치료, 환자에 있어서 다른 약 존재 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 치료과정에 있어서, 본 발명에 의한 약학 조성물의 반복적인 투약을 필요로 한다. 적절한 약의 도즈는 주간 당 3-7회가 적당하다. 치료 기간은 약 4주에서 6개월이며, 바람직하게는 약 4주에서 약 12개월이다. 치료 이후에는, 혈청 내의 HCV의 결정과 혈청 ALT 수치의 측정이 필요하다. 치료의 엔드 포인트는 바이러스학적(virological) 반응이며, 예를 들면 치료 단계의 마지막 단계에서, 또는 치료 개시 이후 수개월 또는 치료 완료 이후 수개월의 시점에 HCV가 존재하지 않는 반응이다. 혈청 내의 HCV는 정량 RT-PCR 또는 노던 볼트와 같은 방법으로 RNA 수치로 또는 효소 면역 분석의 단백질 수치 또는 바이러스성 단백질의 개선된 화학발광(chemiluminescence) 면역 분석으로 측정될 수 있다. 엔드 포인트는 정상적인 범위 내에서 혈청 ALT 수치의 결정을 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 약학 조성물은 리바비린 또는 인터페론 알파와 같은 또 다른 항바이러스성 약 물질과 같은 본 발명에 의한 상기 시클로스포린에 추가하여, HCV 감염에 대한 한 개 또는 그 이상의 다른 성분 활성제를 포함한다. 본 발명에 의한 상기 시클로스포린과 그러한 다른 활성 성분은 동일한 약학 조성물의 일 부분으로써 함께 투약될 수 있으며, 조합 치료의 장점을 얻기 위하여 적당한 도즈 섭생의 부분으로써 별도로 투약될 수도 있다. 소정의 도즈 섭생(복용식이요법), 투약된 각 도즈의 양, 각 활성제제의 도즈 사이의 구체적인 간격은 사용된 활성제제의 조합, 치료 중인 환자의 조건, 앞부분에 설명된 다른 인자들에 따라 결정된다. 상기와 같은 추가 활성 성분은 단일 치료 제제로써 효과가 있는 양보다 적게 또는 이와 동일한 양으로 투약된다. 인간에 대한 투약으로 FDA 승인을 획득한 상기와 같은 활성 제제에 대한 FDA 승인 복용량은 공개되어 있다.

모든 특허, 특허 출원 및 인용된 공개 내용은 그들 전체 내용에 참조용으로 포함되어 있음을 밝힌다.

본 발명은 다음의 예시에 의하여 추가로 부연하면 다음과 같다. 예시들은 당업자에게 예시적인 목적으로 제공되었으며, 청구항에 설명된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 제공된 예시들에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 본 발명의 공개의 결과에 따라 이루어지는 일부 또는 전체 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

예시 1: [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 합성

(Ph. D. thesis by Jean Francois Guichou entitled "De nouveaux analogues de Cyclosporin A comme agent anti-VIH-1", Faculte des Sciences, University of Lausanne, CH-1015 Lausanne, Switzerland (2001)로부터 인용되었다.)

H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe의 합성:

4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(41.5m몰; 5.8g)이 100ml 아세틱 무수물 내에서 시클로스포린 A(CsA) (8.3m몰; 10g)의 용액에 추가되었다. 상기 용액은 실온에서 18시간 동안 저었다. 반응 혼합물은 600ml 에틸 아세테이트로 희석되었으며, 물을 이용하여 2번 세척하였으며, 중탄산염 나트륨의 포화 수용액으로 4번 세척하였다. 유기 페이즈는 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과되고, 용제는 감압 상태에서 증발되었다. 얻어진 황색의 잔류물은 실리카 겔(용리액(eluent): 98:2 디클로로메탄/메탄올)에서 크로마토그래피 처리되고, 흰색 가루인 MeBmt(OAc)-CsA의 8.5g으로 결정화 및 복구되었으며, 92%의 수율을 얻었다.

트리메틸옥소니움 테트라프플루오르보레이트(22.5m몰; 3.3g)는 60ml 디클로로메탄 내에서 MeBmt(OAc)-CS(7.5m몰; 9.4g)의 용액에 추가되었다. 실온에서 16시간 이후에, 메탄올 내의 0.26M 나트륨 메탄올레이트(methanolate)의 35ml가 추가되었다. 1시간 이후에, 메탄올 35ml 및 2 N 슬포릭 산 35ml이 첨가되었다. 반응 혼합물을 또 다시 15분 동안 저었으며, 포화 KHCO₃(28ml)을 이용하여 pH 6.0으로 중화되고, 에틸 아세테이트로 2번 추출되었다. 유기 페이즈는 포화 NaCl을 이용하여 2번 세척하였으며, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과시켰다. 결과적으로, 용제는 감압된 상태에서 증발되었다. 잔여물은 실리카 겔(용리액: 5:1 에틸아세테이트/메탄올) 상에서 크로마토그래피 처리되었다.

H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe의 7.3g이 얻어졌다 (수율: 76%).

HPLC tr = 268.23mn(98%)

ES/MS : m/z: 1277.5[M+H⁺], 639.2[M+2H⁺]

H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe의 합성:

DMAP(2.3m몰; 334mg) 및 페닐이소티오시안산염(phenylisothiocyanate)(6.9m몰; 0.75ml)을 48ml 테트라하이드로퓨란 내에서 H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe(4.6m몰; 7g)의 용액에 추가하였다. 2시간 이후에, 용제는 증발 처리되었다. 가공되지 않은 제품을 실리카 겔(용리액: 9:1 tert-부틸 메틸 에테르(MTBE)/에킬아세테이트(1); 9:1 MTBE/메탄올(2)). Ph-NH-C(S)-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe의 5.8g이 얻어졌다(90%의 수율).

13.8ml 트리플루오르아세틱산이 290ml 디클로로메탄 내에서 후자의 화합물(4m몰; 5.6g)의 용액에 추가되었다. 1시간의 반응 이후에, 혼합물은 KHCO₃를 이용하여 중성화 처리되었으며, 500ml의 디클로로메탄을 이용하여 희석 처리되었다. 유기 페이즈는 포화 NaCl을 이용하여 2회 세척하였으며, 무수물 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 처리되었다. 결과적으로, 용재는 감압 상태에서 증발 처리되었다. 잔여물은 실리카 겔(eluants: 9:1 MTBE/에틸아세테이트(1); 3:1 MTBE/메탄올(2)) 상에서 크로마토그래피 처리되었다. H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe의 2.8g이 얻어졌다(61%의 수율).

HPLCtr = 25.80mn(99%)

ES/MS : m/z: 1050.5[M+H⁺], 547.7[M+2H⁺]

Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-NMe-CH₂-CH₂-OH의 합성:

플루오르-N,N,N'-테트라메티로름아미디니움 헥사플루오르포스페이트(TFFH)(0.96m몰; 0.25g)이 불활성 분위기 하에서 15ml 디클로메탄 내에서 H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe(0.8m몰; 1.00g), DIPEA(2.78m몰; 0.48ml) 및 Boc-D-MeAla-EtVal-OH(0.96m몰; 0.32g)로 구성되는 용액에 첨가되었다. 15분 뒤에, 디클로메탄은 증발되고, 잔여물은 에틸아세테이트 내에서 취해졌다. 유기 페이즈는 포화 NaHCO₃ 용액, 10%의 구연산 용액 및 포화 NaCl 용액으로 연속으로 세척되었으며, 무수물 Na₂SO₄로 건조시켜 농도처리되었다. 실리카 겔(98:2 에틸아세테이트/메탄올 내에서) 상에서 크토마토그래피 결과 1.14g(90%)의 Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe 수율을 얻었다.

후자의 제품(0.64m몰; 0.93g)이 45ml 무수물 메탄올 내에서 얻어졌으며, 나트륨 보로하이드라이드(borohydride)(25.5m몰; 0.96g)이 3시간 30분 동안 15분의 간격으로 작은 부분으로 첨가되었다. 4시간째, 반응 혼합은 0℃로 냉각되었으며, 10%의 구연산을 첨가하여 무수화 처리되고, 농도 처리되었다. 잔여물은 에틸아세테이트 내에서 얻어졌다. 유기 페이즈는 10%의 구연산 용액과 포화 NaCl 용액으로 세척되었으며, 무수물 Na₂SO₄로 건조되고, 그리고 농도 처리되었다. 실리카 겔(95:5 에틸아세테이트/메탄올 내에서) 상에서 크토마토그래피 결과, 0.63g(81%)의 Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH₂-CH₂-OH를 얻었다.

ES/MS : m/z: 1434.9[M+H⁺], 717.9[M+2H⁺]

H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt-Abu-OH의 합성:

메탄술폰산(3.18m몰; 2.060ml)이 42.5ml 메탄올 내에서 Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH₂-CH₂-OH(0.425m몰; 610mg)의 용액에 첨가되었으며, 혼합물은 가열되고 50℃에서 유지되었다. 반응의 진행 상태는 HPLC 및 질량 스펙트로메트리를 이용하여 모니터링하였다. 80시간 이후에, 혼합물은 0℃로 냉각되었으며, 1M NaHCO₃의 첨가로 무수물화 처리되었다. 메탄올이 제거되고, 잔여물은 에틸아세테이트 내에서 추출되었다. 유기 페이즈는 1M NaHCO₃로 세척 시키고 그리고 NaCl 용액으로 세척시킨 이후에, 무수물 Na₂SO₄로 건조시키고 농도처리되었다. 제품 H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu- Meleu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-O-CH₂-CH₂-NHME가 정화처리 없이 다음 공정에 사용되었다.

제품(0.42m몰; 557mg)은 1.26ml 메탄올 내에서 나트륨 메탄올레이트(methanolate)(1.26m몰)을 이용하여 20ml 메탄올 내에 용해되었으며, 불활성 대기 상태에서 혼합되었다. 실온에서 18시간 이후에, 반응 혼합물은 0℃로 냉각되었으며, 5ml의 물속의 나트륨 하이드로사이드(4.2m몰; 168mg)를 떨어지는 방향으로 추가하였다. 실온에서 21시간 이후에, 반응 혼합물은 0℃로 다시 냉각되고, 1M KHSO₄를 이용하여 중화처리되었다. 메탄올이 제거되고, 잔여물은 에틸아세테이트 내에서 용해되었다. 유기 페이즈는 반 정도 포화된 NaCl 용액으로 세척되었으며, 무수물 Na₂SO₄로 건조되고, 농도 처리되었다. 제품(335mg; 64%) H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt-Abu-OH이 정화처리 없이 다음 공정에 사용되었다.

HPLCtr = 26.27mn(86%)

ES/MS : m/z: 1235.5[M+H⁺], 618.2[M+2H⁺]

[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA의 합성:

불활성 대기 조건 하에서, 50ml 디클로메탄 내에서 H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-Meleu-MeVal-MeBmt-Abu-OH(0.162m몰; 200mg)의 용액 및 sym.collidine(1.78m몰; 0.24ml)가 3.2 리터 디클로메탄 내에서 (7-아자벤조트리아 졸-1-일록시)트리피롤리디노포스포니움 헥사풀루오르포스페이트(PyAOP, 0.486m몰; 254mg)의 용액에 떨어지는 방향으로 추가되었다. 72시간 이후에, 반응 혼합물은 10%의 Na₂CO₃ 용액을 추가하여 가수분해 시켰다. 디클로메탄이 증발되고, 잔여물이 에틸아세테이트 내에서 취해졌다. 유기 페이즈는 0.1 N HCl 용액과 NaCl 포화 용액으로 연속하여 세척하였으며, 무수물 Na₂SO₄로 건조시키고, 농도 처리되었다. 가공하지 않은 제품이 실리카 겔 상에서 정화처리되었다. 110mg(59%)의 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA이 얻어졌다.

HPLC tr = 30.54mn(100%)

ES/MS : m/z: 1217.6[M+H⁺], 609.3[M+2H⁺]

예시 2: 본 발명의 시클로스포린의 구강 제제

양은 % w/w로 표시되었다.

예시 A:

본 발명의 시클로스포린 10

클리코푸롤 75 35.95

미글리콜 812 18

크레모포르 RH40 35.95

알파-토코페롤 0.1

예시 B:

본 발명의 시클로스포린 10

테트라글리콜 2

캡텍스 800 2

니콜 HCO-40 85.9

부틸하이드록시톨루엔(BHT) 0.1

예시 C:

본 발명의 시클로스포린 10

글리콜포롤 75 39.95

미글리콜 812 14

코레모포르 RH40 36

부틸하이드록시아니솔(BHA) 0.05-0.1

예시 D:

본 발명의 시클로스포린 10

테트라글리콜 10

마이리톨 5

크레모포르 RH40 74.9

알파-토코페롤 0.1

예시 E:

본 발명의 시클로스포린 10

에탄올 9

프로필렌 글리콜 8

크로모포르 RH40 41

글리세롤 모놀리놀레이트 32

제제 A-D의 개별 구성요소 및 제조 방법에 대한 것은 영국 특허 출원 번호 2,222,770을 참조.

본 발명은 HCV 감염의 치료를 위한 새로운 치료방법을 제공하고 HCV의 재발을 방지하며, 기존의 치료 방법들에 의해 높은 항바이러스 활동성 및 보다 우수한 안전 프로파일을 제공하는 것이 가능하다.

Claims

[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA를 포함하고 있는 HCV 감염 환자의 치료를 목적으로 한 의약품.
제 1항에 있어서,

상기 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA은 상기 환자에 있어서 HCV 감염의 조합 치료의 장점을 얻기 위하여 소정의 복용식이요법(dose regimen)의 일 부분으로서 HCV 감염에 대하여 활성 상태인 인터페론을 공동으로 투약하거나 또는 개별적으로 투약하는 것을 특징으로 하는 HCV 감염 환자의 치료를 목적으로 한 의약품.
[D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA 및 인터페론을 포함하여 구성되는 HCV 감염 환자의 치료를 위한 약학 조성물.
제 3항에 있어서,

상기 약학 조성물은 약학적으로 수용가능한 전달체 및 경우에 따라 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 HCV 감염 환자의 치료를 위한 약학 조성물.
삭제
제 3항 또는 제4항에 있어서,

상기 [D-MeAla]³-[EtVal]⁴-CsA는 조합 치료 유효 양의 장점을 얻기 위하여 소정의 복용식이요법의 한 부분으로서 그리고 HCV 감염에 대하여 활성 상태인 인터페론을 함께 투약하거나 또는 별도로 분리하여 투약하게 되는 것을 특징으로 하는 HCV 감염 환자의 치료를 위한 약학 조성물.