JPH03504722A

JPH03504722A - Ｈｉｖ誘導細胞融合およびシンシチウム形成に対するペプチド阻害剤

Info

Publication number: JPH03504722A
Application number: JP50501189A
Authority: JP
Inventors: コンパンス，リチャード，ダヴリュー．; オーウェンズ，ランディー
Original assignee: University of Alabama UA
Current assignee: University of Alabama UA
Priority date: 1988-04-07
Filing date: 1989-04-06
Publication date: 1991-10-17
Also published as: DK241490D0; PT90229A; DK241490A; WO1989009785A1; EP0408663A4; EP0408663A1; AU3538689A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ＨＩＶ誘導細胞融合およびシンシチウム形成に対するペプチド阻害剤１、序論本発明はＨＩＶにより誘導された融合およびシンシチウム形成を阻害し、そしてそれによりＨＩＶの主要な細胞病理学的作用を阻害する新規ペプチドに関する。このペプチドはＨＩＶウィルスの膜貫通蛋白のアミン末端類似構造を育する。このような阻害ペプチドの効力をインビトロアッセイ系により測定する実施例により、本発明を説明する。２、発明の背景２．１．ウィルス糖蛋白および細胞融合哺乳類細胞へのエンベロープウィルスの侵入はウィルス糖蛋白により媒介される膜融合の過程により起こると考えられている。パラミクソウィルスおよび「Ｄ型」レトロウィルス群に属するものは、中性１）Ｈで融合を示すことが解っている（ＳｃｈｅｉｄとＣｈｏｐｐｉｎ、　１９７４゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５７：４７５−４９０．および１９７７、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８０：５４−６６；　Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ等、、　１９８１．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３８ニア７Ｏ−７７６）。パラミクソウィルスはその核カプシドを、ウィルス膜と形質膜との融合により、感染細胞の細胞質へ投入する。一方、オルトミクソウィルス、ラブドウィルス、アルファウィルスおよびある種のレトロウィルスは、内在化されエンドソーム区分の一部となる被覆小胞を介して細胞へ侵入することが解っている（Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｅおよびＨｅ１ｅｎｉｕｓ、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７７：３２７３−３２７７；　Ｗｈｉｔｅ等、、　　１９８０．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８７：２６４−２７３゜および１９８１．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８９：６７４−６７９；　Ｒｅｄｍｏｎｄ等、。１９８４、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３３：３９３−４０２；　Ｍａｅｄａおよび０ｈｎｉｓｈｉ。１９８０、　ＦＡＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１２２：２８３−２８７：　Ｈｕａｎｇ等、、　１９８１゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１０：２４３−２４７）。エンドサイト−シス小胞の酸性化に続き、特定のウィルス糖蛋白の融合活性が活性化され、ウィルス膜とエンドソーム小胞膜との間の融合を起こし、これにより細胞質への核カプシドの放出が起こるのである。エンドサイトおよびリソソームのｐＨを上昇させる物質、例えばクロロキンまたは塩化アンモニウムは、インフルエンザおよび他の酸活性エンベロープウィルスによる感染を阻止する（ＪｅｎｓｅｎおよびＬｕｉ、　１９６１．　Ｐｒｏｃ、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　１０７−４４７−４５１）。野生型ウィルスより高ｐｌで融合するインフルエンザウィルスの天然に存在する突然変異型は塩化アンモニウムに対してより耐性を有することが解かっている（Ｄｏｍｓ等、、　１９８６．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５７：６０３−６１３）。最近の研究では、ＨＩＶは受容体媒介エンドサイト−シスにより内在化されることが示唆されているが、その根拠としては、塩化アンモニウムの存在下で、ウィルス感染が９５％以上阻止されることが観察されていることがある（Ｍａｄｄｏｎ等、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４７：３３−３４８）一方、別のグループの研究によれば、）ｆｌＶは融合によりＣＤ４ −陽性Ｔ細胞へ侵入できることが示唆されている（Ｓｔｅｉｎ等、。１９８７、　Ｃｅ１ｌ　４９：　６５９−６６８）。ウィルス糖蛋白により誘発される膜融合の機構はインフルエンザウィルスのへマグルチニン（ＨＡ）糖蛋白およびセンダイウィルス（バラミクソウィルス）のＦ蛋白を用いた広く研究されている。インフルエンザへマグルチニンの融合活性は、受容体結合活性とは異なり、不活性の前駆体（ＨＡＧ）から２つのサブユニットへの蛋白分解的切断（宿主特異的酵素による）による活性化を必要とする（Ｌａｚａｒｏｗｉ　ｔｚおよびＣｈｏｐｐｏｎ、　１９７５゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６８Ｌ：４４４−４５４）　。センダイウィルスのＦ蛋白質（Ｆｏ）を活性化して２つのジスルフィド連結サブユニットＦ１．２を形成するためにも同様の切断を必要とする（ＳｃｈｉｄｅおよびＣｈｏｐｐｉｎ、　１９７４．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５７：４７５−４９０Ｈｕａｎｇ等、、　１９８１．　ＶｉｒｏｌｏｇＹ　１１０：２４３−２４７）。ＨＡｏまたはＦｏの切断により、ＨＡａおよびＦ１サブユニット上の疎水性アミノ末端が露出し、これが標的細胞膜の脂質二重層と相互作用し、融合を媒介すると考えられている（Ｇａｒｔｅｎ等、、　１９８１．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１５：３６１−３７４；　Ｒｊｃｈａｒｄｓｏｎ等、、　１９８０．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０５：２０５−２２２）。Ｆ０蛋白の分解により、円二色の変化および界面活性剤との結合性の増大により判定されるコンホーメーション変化が生じ、これは疎水性ドメインが露出したことを示している（Ｈｓｕ等１．　１９８１．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：３３５７−３３６３）。インフルエンザＨＡの３次元構造の研究により、中性ｐＨ状態では、ＨＡ分子は疎水性融合ペプチドと３量体を形成し、ここでこの疎水性の「融合ペプチド」は３量体のサブユニットの界面にしまい込まれていることが解った（Ｗｉ　１ｓｏｎ等、、　１９８１．　Ｎａｔｕｒｅ　２８９：３６６ −３７３）。酸性化されると、この疎水性の「融合ペプチド」が露出し、標的細胞膜へ挿入されて融合現象を媒介することが示唆されている（Ｄａｎｉｅｌｓ等、、　１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４０：４３１−４３９）。ＨＡ２の疎水性アミノ末端を変化させるためにインビトロ特定部位の突然変異誘発を、用いた最近の研究によれば、融合過程におけるこの領域の重要性が確認されている。Ｆ融合蛋白Ｊ内の２つのグリシン残基からグルタミン酸残基への変換により、融合が停止するか、またはｐＨ閾値が増大して融合の効率が低下する（Ｇｅｔｈｉｎｇ等、、　１９８６．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０２：１ｌ−２３）　、同様に、センダイＦ１糖蛋白のＮ末端での荷電残基の導入は融合活性を阻止することが判明している（Ｈｓｕ等、、　１９８１．　Ｊ。Ｂｉｏｌ、　Ｃｅｈｍ、　２５６：３５４７−３５５３）、インフルエンザＨＡ４またはセンダイＦ、のアミノ末端に相当するアミノ酸配列を有するオリゴペプチドは、それぞれのウィルスの感染力の強力な阻害物質であることが報告された（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等、、　１９８０．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０５：２０５−２２２；　ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＣｈｏｐｐｉｎ、　１９８３．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３１：５１８−５３２）。更に、パラミクソウィルスのＦｌのアミノ末端に相当するオリゴペプチドは細胞融合および溶血阻害することも示されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等、、　１９８０．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０５：２０５−２２２）。しかしながら、最近の文献（Ｈｕｌｌ等、、　１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５９　：３６８−３７２）は、ウィルス誘導融合に関し「融合ペプチド」仮説に代わる学説に信頼をおいている。Ｈｕｌｌ等は融合阻害性オリゴペプチドに対して抵抗性を存する麻疹ウィルス突然変異体を記載している。Ｆ糖蛋白の配列決定により、３つのアミノ酸の変化が明らかとなり、このうちの何れも疎水性ＮＨ２ −末端「融合ペプチド」領域内には位置していないことが明らかとなった。Ｈｕｌｌ等により報告された所見は、細胞膜内ではなく機能性Ｆ１．２コンホーメーシヨン内にＦ１アミノ末端が位置することにより、融合過程が媒介されていることを示唆している。２．２．　８ＩＶにより誘導されたシンシチウム形成ヒト免疫不全ウィルス（）ＩＩＶ）は後天性免疫不全症候群（エイズ）の原因物質であるが、これは恐らく標的細胞へのウィルスの侵入に関与しているエンベロープ糖蛋白を表面上に生産する。この糖蛋白はｌ　６０Ｋｄの前駆体として合成され、その後２つの蛋白質ｇｐ１２０およびｇｐ４１となされる。ｇｐ１２０部分は細胞ＣＤ４受容体分子に直接結合することが示されており、それゆえＣＤ４表面蛋白質を示す宿主細胞に対するＨＩＶの親和性をもたらすが、ｇｐ４１はウィルス膜にエンベロープ糖蛋白複合体を固定する作用を有する。ＨＩＶ感染の明らかな細胞病理学的特徴は多核シンシチウムの形成である（Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ等＋ｔ　１９８３．５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８−８７１：　Ｐｏｐｏｖｉｃ等、、　１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２４　：　４９７−５００；　Ｌｅｖｙ等、、　１９８４゜５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：８４０−８４２）、　　ＣＤ４抗原に対するモノクローナル抗体は融合を阻害することが解っており、このことは、ＣＤ４抗原への結合がシンシチウム形成に必要であることを示している（Ｌｉｆｓｏｎ等＋＋　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ２３２：１１２３−１１２７）。近年、ＨＩｖノエンベローブ糖蛋白遺伝子がワクシニアウィルスベクターにおいて発現されうることが示された（Ｈｕ等、、　１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ　３２０：５３７−５４０；　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等、、　１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ　３２０：５３５−５３７）。この種の組換え体はＨＩＶ感染培養物において見られるものと識別不可能なシンシチウム形成と細胞病理をもたらしくＬｉｆｓｏｎ等、、　１９８６．前記）、このことはＨＩＶｇｐ１２０／ｇｐ４１糖蛋白は、外来ウィルス「バックグラウンド」内に提示された場合には他のＨｒＶ蛋白の非存在下でシンシチウム形成を誘導しうろことを示している。しかしながら、このような融合の機構は解明されていない。今日まで、エイズの治癒法は存在しない。ＨＩＶかその病理学的作用を誘発する機構は充分には理解されていない。提案されている機構は、ＣＤ４−陽性細胞がウィルス複製により直接殺傷されるというものである（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、等、、　１９８４．　Ｉｎ″Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ’、　Ｇａ１ｌｏ、　Ｅｓ５ｅｘ　ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓ、　Ｅｄｓ、。Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。Ｎ、Ｙ、　ｐｐ、３６３−３７９）。集団内のウィルスの広がりを制御する試みとしてワクチン試験も現在実施中である。しかしながら、感染した患者内部の疾患の進行を制御する手段は、主にＡＺＴ（３’−アジド−２゛、３°−ジデオキシチミジン）のような抗ウィルス剤の使用に向けられており、この物質はウィルスポリメラーゼ活性を妨害することによりウィルス複製を阻止する。３、発明の要約ＨＩＶ誘導細胞融合を阻害できる新規ペプチド配列を記載する。本発明のペプチドはＨＩＶエンベロープの膜貫通蛋白のアミノ末端に位置する疎水性ドメイン内の領域を模倣している。このようなペプチドはＨＩＶ−１のｇｐ４１のアミノ末端およびＨＩＶ−２のｇｐ４０のアミノ末端を含むがこれらに限定されない旧■ の種々の株に見られるこの領域と相同であるアミノ酸配列を有する。これらペプチドは少なくとも２アミノ酸鎖長を有し、そしてインビボにおけるＨＩＶ感染の主要な細胞病理学的作用であるＨＩＶ誘導融合およびシンシチウム形成の阻害に使用できる。本発明のペプチドを実施例により説明するが、この実施例では、ＨＩＶのＢＨＩＯ株の糖蛋白を発現する組み換えウィルス、および、ＣＤ４標識抗原を構造的に発現する宿主細胞を用いたインビトロアッセイにより測定してオリゴペプチドＡＶＧおよびＡＶＧＩＧＡがＨＩＶ誘導シンシチウム形成を阻害した。３．１．定義本明細書で定義するペプチド配列は、以下に示すアミノ酸残基の１文字記号により表わされる。Ａ（アラニン）、Ｒ（アルギニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｃ（システィン）、Ｑ（グルタミン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｇ（グリシン）、Ｈ（ヒスチジン）、■（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｋ（リジン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニン）、Ｗ（）リブトファン）、Ｙ（チロシン）、■（バリン）。本明細書で用いる以下の用語は下記のとおりの意味旧■　＝ヒト免疫不全ウィルス（全変種）ｈ、　ｐ、　ｉ、　＝感染後時間ｍ、　ｏ、　ｉ、　＝感染の多重度ｐ、ｆ、　ｕ、　＝プラーク形成単位４、

【図面の簡単な説明】

第１図：エイズ患者抗血清を用いた場合の、組み換え型（ＶＶｅｎｖ）および野生型（ｗ、　ｔ、　）のワクシニアウィルス感染３Ｈ−ロイシン標識ＨｅＬａ　Ｔ４細胞におけるエンベロープ糖蛋白の、感染３．６および１０時間後における免疫沈降。第２図：感染１２時間後の″ＳＳ−メチオニン標識ＨｅＬａ　Ｔ４細胞のＳＤＳポリアクリルアミドゲル＝（ａ）患者抗血清との野生型（ｗ、　ｔ、　）免疫沈降；（ｂ）患者血清とのＶＶｅｎｖ免疫沈降；　（Ｃ）　Ｗ、　ｔ、細胞溶解物；　（ｄ）　ＶＶｅｎｖ細胞溶解物。第３図：感染７時間後の、ｌ　ｐ、　ｆ、　ｕ、　／細胞のＶＶｅｎｖで感染させたＨｅＬＡ　Ｔ４細胞＝（ａ）ペプチド無添加；（ｂ）８ｍＭペプチドＡＶＧ４ＧＡ　；　（ｃ）　８ｍＭペプチドＡＶＧＡＩＧ　；および（ｄ）　８ｍＭペプチドＡＶＧ。第４図：ペプチド阻害の定量。ＨｅＬＡ　Ｔ４細胞を種々の濃度の各ペプチドの存在下、ＶＶｅｎｖで０．１のｍ、　ｏ、　ｉ、で感染させ、感染２０時間後に、シンシチウムを定量した。第５図：　　ＨｅＬａ　Ｔ４細胞を１ｐ、ｆ、ｕ、／細胞で感染させ、ａＳＳ− メチオニン標識し、感染１０時間後にウサギ抗血清を用いて免疫沈降した。（ａ）野生型ワクシニア；（ｂ）ＶＶｅｎｖ、ペプチド無添加；　（ｃ）　ＶＶｅｎｖ、　８ｍＭペプチドＡＶＧＩＧＡ　；　（ｄ）　ｖｖｅｎｖ、　８ｍＭペプチドＡＶＧＡＩＧ　；　（ｄ）　ＶＶｅｎｖ。８ｍＭペプチドＡＶＧ。５、発明の記載ＨＩＶ誘導細胞融合および細胞変性性シンシチウム形成を阻害しつる新規ペプチド配列が開示される。本発明は、部分的には、ＨＩＶの膜貫通蛋白のアミノ末端の疎水性ドメインと実質的に相同であるペプチドが感染細胞のＨＩＶ誘導融合の効果的な阻害剤であるという発見に基づくものである。５．１．　　ＨＩＶ誘導融合のペプチド阻害剤本発明のペプチドはＨＩＶエンベロープ糖蛋白の膜貫通蛋白のアミノ末端に位置する約２１から４０のアミノ酸、例えばＨＩＶ−１（７）ｇｐ４１（７）最初ノ２１〜３０アミノ酸、また：′！ＨＩＶ−２のｇｐ４０の最初の２１〜３７アミノ酸、を包含する疎水性のドメイン内の領域に相当するアミノ酸配列を有する。ＨＩＶ−１の完全なゲノム配列はＨＩＶ−２の配列と同様以前に報告されている（旧Ｖ−１：　Ｗａｉｎ　Ｈｏｂｓｏｎ等、。１９８５、　　Ｃｅ１ｌ　４０：９−１７；　Ｒａｔｎｅｒら、、　　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７−２８４；　５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ、等、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：４８４−４９２；および５ｔａｒＣｉＣｈ等、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４５　：　６３７−６４８；　ＨＩＶ−２：　Ｇｕｙａｄｅｒ等、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２６：６６２−６６９）。本発明のペプチドは、かかる配列を含有するオリゴペプチド（例えば少なくとも２つのアミノ酸残基）。ポリペプチド（例えば、１０個より多いアミノ酸残基）または蛋白質（例えば分子量約１０Ｋｂまたは約１００アミノ酸残基鎖長のポリペプチド）を包含してなることができる。本発明のペプチドの例を以下の第工表〜第■表に示すが、これらにおいては、アミノ酸配列は各ペプチドのアミノ酸からカルボキシル末端へ読んだものである。第１表ＨＩＶ−１誘導融合を阻害するペプチドアミノ末端　　　　　　　　　カルボキシ末端ＺおよびＸはそれが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基（例えばカルボキシベンゾキシル、ダンシルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル）または交叉反応基（例えばアルキル化剤）を包含する。ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である。太字のアミノ酸は（存在する場合は）上記★で示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または任意の上記ペプチド配列内で、真上に示されるアミノ酸残基と置換できる。（本質以下余白）第■表ＨＩＶ−１誘導融合を阻害するペプチドアミノ末端　　　　　　　　　カルボキシ末端ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基（例えばカルボキシベンゾキシル、ダンシルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル）または交叉反応基（例えばアルキル化剤）を包含する。ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である。太字のアミノ酸は（存在する場合は）上記★で示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または任意の上記ペプチド配列内で、真上に示されるアミノ酸残基と置換できる。（本質以下余白）第■表ＨｒＶ−２誘導融合を阻害するペプチドアミノ末端　　　　　　　　　カルボキシ末端ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基（例えばカルボキシベンゾキシル、ダンシルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル）または交叉反応基（例えばアルキル化剤）を包含する。ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である。（本質以下余白）第■表ＨＩＶ−２誘導融合を阻害するペプチドアミノ末端　　　　　　　　　カルボキシ末端ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基（例えばカルボキシベンゾキシル、ダンシルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル）または交叉反応基（例えばアルキル化剤）を包含する。ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である。第７表ＨＩＶ誘導融合を阻害するペプチドアミノ末端　　　　　　　　　カルボキシ末端ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基（例えばカルボキシベンゾキシル、ダンシルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル）または交叉反応基（例えばアルキル化剤）を包含する。ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である。太字のアミノ酸は（存在する場合は）上記★て示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または任意の上記ペプチド配列内で、真上に示されるアミノ酸残基と置換できる。第■表ＨＩＶ誘導融合を阻害するペプチドアミノ末端　　　　　　　　　カルボキシ末端ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基（例えばカルボキシベンゾキシル、ダンシルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル）または交叉反応基（例えばアルキル化剤）を包含する。ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である。太字のアミノ酸は（存在する場合は）上記★で示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または任意の上記ペプチド配列内で、真上に示されるアミノ酸残基と置換できる。本発明のペプチドはＨｒＶ膜貫通蛋白のアミノ末端領域に似せて合成されるが、アミノ酸配列、立体配置、アミノ酸残基を連結する共有結合の種類、および／またはアミノ−またはカルボキシ末端残基への基の付加における種々の変形もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、本発明のペプチドは種々のＨＩＶ単離株内の株間の変化に適合するために変更された配列も包含し、またサイレント変化を生じて機能的には等価なペプチドを生成するような保存的変化も包含しうる。即ち第工表〜第■表に示されるペプチドは、変化かその用途において特定の利点を与えうる場合は、保存的または非保存的挿入、欠失および置換のような種々の変化により変化できる。本明細書では、保存的な置換は第１表〜第■表に示すペプチド配列内において１つまたはそれ以上のアミノ酸が、同じ極性および疎水性／親水性を有する他のアミノ酸により置換されることにより、サイレント変化が生じ、機能的に等価な分子が形成されるような置換を包含する。このような保存的変化には、以下のアミノ酸群内での置換を包含するがそれらに限定されない。即ち、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシン：およびメチオニン、ノルロイシン。ペプチドの立体配置はペプチドの阻害活性を増大させるために変化させることができる。例えば、ペプチドのアミノ末端でＬ異性体ではなくＤ異性体および／またはペプチドの最初の２アミノ酸の反対配置を用いることにより阻害作用を増大させることができる。立体配置におけるこのような変化は、蛋白分解からペプチドを保護することにより、または、その結合部位に対するペプチドの親和性に影響を与えることにより阻害活性を増強しうる。付加的なアミノ酸または他の化学基をペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端の何れかに付加してその活性を変化または増強できる。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシルまたはｔ−ブチルオキシカルボニルのような疎水性の基をアミノ末端に付加することによりペプチドの阻害活性を増大させうる。同様に、　を −ブトシキカルポニルのカルボキシ末端への付加も阻害活性を増大させうる。これと対照的に、カルボベンゾキシルまたはダンシルのような基をカルボキシ末端に付加させても効果は比較的小さいか、または、阻害活性を低下させる場合がある。あるいは、本発明のペプチドとその結合部位との間に共有結合を形成せしめる化学的に反応性の基を付加することにより誘導体形成させたペプチドを調製することもできる。このようなペプチドはその結合部位と共有結合を形成し、そして、その標的に不可逆的に結合しよう。例えば、ペプチドはクロロメチルケトンのようなアルキル化剤を用いて誘導形成しうる（Ｐｏｗｅｒｓ。１９８０、　　ｒＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌ、　Ｊａｋｏｂｙ　ａｎｄ　Ｗｉｋｅｋ編、　Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、、　Ｖｏｌ、４６：１９７−２０８）。かかる誘導体は実質的には、ヒスチジン、セリンおよびスルフヒドリル残基と反応でき、従って阻害ペプチドと標的細胞上のその結合部位との間の共有結合の形成を可能にするアルキル化剤である。本発明のペプチドは、画業上知られた何れかの方法で合成または調製しうる。短いペプチドは慣用の方法に従って固体支持体上または溶液中で合成しうる。市販の自動合成器も好都合に使用できる。例えばλ（ｅｒｒｉ−ｆｉｅｌｄ、　１９６９．　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｒｅ１ａｔ、　Ａｒｅａｓ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ。３２：２２１−２９６；　Ｔａｍ等、、　　１９８３．　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　ＳＯｃ、　　１０５：６４４２；　ＫｏｎｉｇおよびＧｅｉｇｅｒ、　１９７０．　Ｃｅｈｍ、　Ｂｅｒ、　１０３ニア８８−７８９および２０３４−２０４０を参照。あるいはまた、比較的長いペプチドは組み換えＤＮＡ法を用いて調製できる。従って、本発明のペプチドのヌクレオチドコード配列を画業上よく知られた方法によりクローン化し発現させることができる。例えばＭａｎｉａｔｉｓら、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。Ｃ３Ｈ，Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　１９８２参照。本発明の別の実施態様においては、アミノ酸残基か非ペプチド共有結合により相互に連結された上記配列を含存するペプチド類似体を合成することもできる。このような共有結合連結はアミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシル基並びにその他の存在しうる反応性の基（例えばイオウ）に関わる画業上長く知られた反応を用いて形成できる。本発明のこれらのペプチド類似体の合成に用いることのできる非ペプチド（または非アミド）連結は、少数例をあげればイミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジドおよびアゾ結合を包含するがこれらに限定されない。５．２．　ＨＩＶ誘導誘導シンクチウム形成リゴペプチド阻害剤の作用を示すインビトロアッセイペプチドの阻害活性は測定でき、そして、変更ペプチドの機能的等偏性および／または効果増大は本明細書のセクション６．２に記載したインビトロアッセイ系により容易に検査できる。従って、本発明の任意のペプチドの効力は、構造的にＣＤ４受容体分子を発現する細胞系およびＨＩＶｅｎｖ糖蛋白を発現する組み換えワクシニアウィルスを用いて、インビトロシンシチウム形成を阻害するその相対的能力により評価できる。これらの組み換えウィルスを真正ＨＩＶにより形成されたシン、　　シチウムとは形態学的に判別不可能であるシンシチウムの形成を誘導する。本発明のペプチドまたは変更ペプチドがこのアッセイ系でシンシチウム形成を阻害する能力は、真正のＨＩＶ誘導融合に対するこれらのペプチドの阻害活性の指標でなる。５．２．１．組み換えワクシニアウィルス旧■糖蛋白を発現する組み換えワクシニアウィルスを用いる本明細書に記載するアッセイ系は、本発明のペプチドの特性決定のため、およびＨＩＶ感染に対して有効でありうる抗ウィルス剤を選別するための幾つがの利点を提供する。特に、阻害性および／または抗ウイルス性化合物の薬効は、真正ＨＩＶにさらす危険を伴うことなく評価でき、これによりエイズに罹患する可能性を排除できる。更に、セクション６．２の実施例に記載される組み換えワクシニアウィルスをワクシニアの１８０株を用いて作製した。このワクシニア株は、組み換え体の作製に通常用いられてきたＷＲ株とは異なり、このウィルスに挿入された外来遺伝子の発現レベルの増大を示し、細胞変性作用が低下している。その結果としてこの組み換えワクシニアは標的被験細胞を感染させるのに使用でき、そして感染後より短い期間でＨＩＶエンベロープ糖蛋白の表面発現レベルを顕著に増大させる。更に、培養物における同調発現も可能である。最後に、　ｒＨＤワクシニア株の細胞変性作用が低下しているため、この組み換え体を取り扱いかつアッセイ系を操作せねばならぬ技術者に対する危険性を低下でき、そのことが本明細書中に記載するアッセイ系を、阻害性および／または抗ウイルス性化合物の評価、査定特性化および選別にとって極めて望ましいものとなしている。このワクシニアウィルスの性質ゆえ、ここに例示される組み換えウィルスはワクチンに有効に使用できるものとして有望である。５．３０発明の阻害ペプチドの使用本発明の阻害ペプチドはシンシチウムの形成を阻止し、それによりＨＩＶにさらされた患者内のＨＩＶ感染の進行を阻止するためにインビボで使用できる。適当な薬理学的担体中で製剤化された本発明のペプチドの有効量は、注射（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等）、上皮または皮膚粘膜内からの吸収（例えば口腔粘膜、直腸および膣の上皮内皮、鼻咽頭粘膜、腸粘膜等）などを包含するがこれらの限定されない任意の適切な経路で投与できる。ペプチドは、適当な薬理学的担体と混合、担体分子に結合および／または、リポソーム、マイクロカプセルおよび放出制御製剤に配合した後にインビボ投与できる。本発明のペプチドはまた、ＨＩＶの種々の株を同定するのに使用できる。例えば、本発明のペプチドはペプチドの配列特異性を共有する膜貫通蛋白を有するＨＩＶ株に対して阻害作用を及ぼす。対照的に、極めて多様な貫通配列を有するＨＩＶ株は阻止できない。それゆえ、知られた配列を有するペプチドをインビトロアッセイに用いて患者から単離したＨＩＶの特定の株が新しい変種であるかどうかを迅速に判定することができる。従って、下記セクション６．２に記載する実施例のＨｅＬａＴ４細胞系のような、構造的にＣＤ４受容体を発現する細胞系がインビトロの標的細胞として使用されよう。患者から単離したＨＩＶを用いて、ＨＩＶの特定の株に特異性な本発明のペプチドの存在下、インビトロで、ＣＤ４陽性細胞系を感染できる。ペプチドがウィルス誘導融合を阻止できない場合は、その）ＩＩＶ単離体が異なる株であることを示していよう。６、実施例：旧Ｖ−１エンベロープ糖蛋白誘導シンシチウム形成の選択的阻害ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖蛋白はウィルスの侵入にとっておよび細胞融合による多核巨大細胞の形成、即ち、ウィルス誘導主要細胞変性作用にとって必須要件である。下記のサブセクションでは、　（ａ）　ＨＩＶ誘導融合を阻害するオリゴペプチド、および（ｂ）融合阻害剤の可能性のあるものの作用を測定するために考案されたインビトロアッセイ系、を記載する。インビトロアッセイ系には、ＨＩＶのＢＨ−１０株のエンベロープ糖蛋白を発現する組み換えワクシニアウィルスを生成させそしてＣＤ４受容体分子を構造的に発現するＨｅＬａ細胞系（ＨｅＬａＴ４）を感染させるのに用いた。この系におけるシンシチウム誘導は感染４時間後に早くも観察されそして全単層が融合するまで継続した。）（ＩＶエンベロープ蛋白のｇｐ４１サブユニットのＮ末端は疎水性か高いことが観察され、そしてこれがウィルス誘導細胞融合に関与している可能性があると考えられた。ｇｐ４１のＮ末端領域に相同である幾っがのオリゴペプチドを合成し、それらがＨｅＬａＴ４細胞系のＨＩＶ−１誘導細胞融合を阻害する能力を測定した。ＢＨ−１０単離株のｇｐ４１のＮ末端とアミノ酸配列が同一であるヘキサペプチドはウィルス誘導細胞融合をほぼ完全に阻止することが判明した。これと対照的に、１アミノ酸挿入による相異を有するペプチドはＢＨ−１０単離株に対しほとんど何も阻害作用を示さながった。これらの結果は、ＨＩＶの融合ペプチドと相同のオリゴペプチドがウィルスにより誘導された病理を阻害することを示している。６．１．オリゴペプチド阻害剤種々のＨＩＶ株から得られたｇｐ４１のＮ−末端アミノ酸に対する種々の度合いの相同性を有する３種類のペプチドを合成した。第１のペプチド：Ａ１ａ＋−Ｖａｌ□−Ｇｌｙ２−ｆｌｅａ−Ｇｌｙｓ−Ａｌａ６（ＡＶＧ４ＧＡ）は８８１０株のｇｐ４１の最初の６アミノ酸と配列が等しい。第２のペプチド：Ａ］ａ＋−Ｖａ１２−Ｇｌｙ３−Ａｌａ４−１１ｅｓ−Ｇｌｙａ　（ＡＶＧＡＩＧ）はアミノ酸４，５および６の順序が僅かに異なっておりそしてｇｐ４１のＷＭＪ−１変種のＮ末端と相同である。最初の２つのペプチドのアミノ酸１，２および３が同一であるため、以下の配列を存するトリペプチドを合成した。Ａｌａ＋−Ｖａｌｚ−Ｇｌ’／ａ　（ＡＶＧ）６　、１．１．オリゴペプチドの合成Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａ型装置を用いて固相法によりペプチドを合成した。完成したペプチドを樹脂からはずして高速液体クロマトグラフィーにより精製した。６．２．ウィルス誘導シンシチウム形成のインビトロアッセイＨＩＶ誘導細胞融合に及ぼすセクション６．１で合成した各オリゴペプチドの作用を以下のサブセクションに記載の方法でアッセイした。一般的に、細胞融合は、ＣＤ４受容体分子を構造的に発現するＨｅＬａ細胞系（ＨｅＬａＴ４）を用いてアッセイした。ＨＩＶ（８８１０株）エンベロープ糖蛋白を発現する組み換えワクシニアウィルス（ＶＶ−ｅｎｖ−１）はＨｅＬａＴ４細胞系においてシンシチウム形成を誘導する。６．２．１．組み換えワクシニアウィルス下記実施例で使用される組み換えワクシニアウィルスの作製に用いる一般的操作を以下に要約する（ＳｍｉｔｈおよびＭｏ５ｓの１９８３．　　ｒＧｅｎｅＪ　２５：２１−２８参照）。ワクシニア組み換え体の作製を容易にするために、挿入ベクターと呼ばれる幾つかのプラスミドベクターを用いて、外来遺伝子をインビボで相同組み換えを介してワクシニアウィルスに挿入した（Ｍａｃｋｅｔｔ等、、　１９８４．　Ｊ、　Ｖｉｒ。１．４９：８５７−８６４；　Ｓｍ１ｔｈ等、、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０２：４９０−４９５およびＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０ニア１５５−７１５９）。ＤＮＡ複製の細菌起源および抗生物質耐性マーカーを有するのに加え、これらの挿入プラスミドは転写開始部位および上流ＤＮＡの２００〜３００塩基対を含む単離されたワクシニアウィルスプロモーターを含有しており、転写開始地点から下流に位置する幾つかの独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位も有している。プロモーターの両端および制限部位は、外来ＤＮＡをウィルスゲノムの相同の非必須領域への挿入を指示する非必須ワクシニアウィルスＤＮＡにより側面をはさまれている。切断および連結によりＨＩＶ　ＤＮＡを含有プラスミドを作製した後、これらのプラスミドをワクシニアウィルス感染細胞にトランスフェクションさせることによりウィルス組み換え体を生成させた。ワクシニアウィルスＴＫ遺伝子内へのかかる外来ＤＮＡの挿入により、ＴＫ−突然変異株が得られ、これはＢＵｄＲ存在下のＴＫ−宿主細胞上での増殖能力により同定できる。組み換え体は更に、外来遺伝子に特異的な標識ＤＮＡプローブを用いるプラークの選別、外来蛋白に特異的な抗血清およびＳ、　ａｕｒｅｕｓ由来の１２５１−標識プロチインＡまたは第２の抗体を用いる免疫学的分析、またはＥ、ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する挿入ベクターを用いた色選別により、野生型親ウィルスから識別できる。色原体基質５−ブロモ− ４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）とインキュベート後、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する組み換えプラークは青色を呈する。少なくとも２回のプラーク精製の後、組み換えウィルス保存株を種々の使用可能な種類の宿主細胞の何れかを用いて調製した。プラスミド挿入ベクターを用いて以下により詳細に記載する組み換えワクシニアウィルスを作製した。エンベロープ遺伝子をプラスミドｐＢＨ１０から取出して、ワクシニア組み換えプラスミドベクターｐｓｃ１１に挿入した。プラスミドｐＢＨ−１０（Ｒａｔｎｅｒ等、、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７−２８４）はプラスミドｐＳＰ６５の５ｓｔ１部位の未組み込みＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩゲノムのＤＮＡクローンを含有する。ｐＢＨｌＯを５ａｉｌおよびＸｈｏｌで消化し続いて３．１キロ塩基対断片のゲル単離により全エンベロープ遺伝子をサブクローニングした。この断片を５ａｌｌ消化プラスミドベクターｐＧｅｍ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）に連結した。ｅｎｖ遺伝子の方向は制限分析により判定した。Ｓａｃ　Ｉおよび５ａｌＩにより切断の後、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＳｌヌクレアーゼを用いた一方向消化を行なった。Ｔ４リガーゼを用いてプラスミドを再度環化し、これを用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換した。個々のコロニーから得たプラスミドをジデオキシ法で配列決定し、ｅｎｖ遺伝子の翻訳開始部位の上流に５６ヌクレオチドが残存することを判定した。全ｅｎｖ遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌでの切断、続いてＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片およびデオキシリポヌクレオシド３リン酸を用いるプラント末端の生成により得た。これらの断片をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するｐｓｃｌ　１のＳｍａ１部位に挿入した（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ　ｉ等、、　１９８５゜Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５：３０４３−３０４９）。ＨＢＩＯＩ細胞へのトランスフェクション、および、コロニープロットハイブリダイゼーションと制限酵素分析によるｅｎｖ遺伝子プローブを用いた選別の後、ｐＶｅｎｖ−１で示されるプラスミドを得た。ワクシニアウィルスに挿入するためには、ＴＫ−１４３細胞を、０．１　ｐ、ｆ、ｕ、／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でワクシニア（７）　ＩＨＤ株に感染させた。細胞を２　ｈ、　ｐ、　ｉ、　テ、５μｇｐＶｅｎｖ−１および１５μｇサケ精子ＤＮＡ／ｒＩＬＩＨｅｐｅｓ緩衝食塩水のリン酸カルシウム沈澱物でトランスフェクションした。ＴＫ−ワクシニアウィルスの保存株はＴＫ−１４３細胞中に調製した（ＳｍｉｔｈおよびＭｏ５ｓ、　１９８３．　Ｇｅｎｅ　２５：２ｌ−２８）。組み換え体を選択するには、ＴＫ−１４３細胞をＢＵｄＲ（２５μ／　ｍｌ　）の存在下、ＴＫ−ワクシニアウィルスの１００〜２００　ｐ、　ｆ、　ｕ、て感染させた。感染４８時間後に、３００μｇ／イの５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ）を含有する１％低融点アガロースを単層上に重層させた。４〜６時間で、青色のプラークを採取し、更に２回のプラーク精製により精製した。プラーク精製ウィルスをＣＶ−１細胞中で増殖させモしてＪｏｋｉｋの記載に従って精製した（１９６２゜Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　６１：２９０−３０１）。組み換えワクシニアウィルスは前記したようにして生成させた（ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｍｐａｎｓ、　　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４７：１０５３−１０５９）。ＨＩＶ−１ｅｎｖ蛋白の合成は、エイズ患者抗血清を用いる、組み換えワクシニアウィルス（ＶＶｅｎｖ−１）で感染させた細胞の溶解物の免疫沈降、およびそれに続くポリアクリルアミドゲル電気泳動により示された（第１図）。前駆体ｇｐ１６０に相当する強いバンド、および約１２０Ｋｄおよび４０Ｋｄｓで移動する２つの比較的弱いバンドが、組み換え体感染細胞では観察された。２９１２０分子は全細胞溶解物の主要バンドとして現われ、このことは蛋白分解的プロセシングが進行中であり、かつ組み換えワクシニアウィルスが極めて効率良くエンベロープ糖蛋白を発現することを示している（第２図）。使用した抗血清はｇｐ４１に対してより反応性が大きいように観察され、これは、ｇｐ１２０に対する反応性が小さく、ｇｐ１６０に対する反応性が大きいことを説明していよう。６　、２．２．構造的にＣＤ４受容体を発現する細胞系の感染組み換えワクシニアウィルスが細胞融合を誘導できるか否かを試験するためにＣＤ４受容体分子を構造的に発現するＨｅＬａ細胞系（Ｔ４）を得た（Ｍａｄｄｏｎら、１９８６゜Ｃｅ１ｌ　４７：３３３−３４８）。５−１０のｍ、ｏ、ｉ、で感染した場合、２〜４核を含有する融合の集中部分は４．　ｈ、　ｐ、　ｉ、もの早期に観察され、そして１２　ｈ、　ｐ、　ｉ、　までには細胞の全単層が融合した。間接表面免疫蛍光分析によれば、多核巨大細胞の表面上にエンベロープ糖蛋白の存在が認められた（第３図）。６．３１本発明のオリゴペプチドの阻害作用ＨＩＶ複製およびウィルス誘導細胞融合に及ぼすセクション６．１で合成した各オリゴペプチドの作用をセクション６．２に記載した系を用いてアッセイした。一定の範囲の濃度（０，５ｍＭ〜８ｍＭ）を各被験ペプチドに関して分析した。適切な適度のペプチドをＶＶｅｎｖ −Ｉ感染１時間後にＨｅＬａＴ４細胞に添加した。この分析の結果は以下に詳述するが、ペプチドＡＶＧＩＧＡおよびＡＶＧは旧Ｖ誘導シンシチウム形成の阻害に有効であることか示される。免疫沈降および免疫蛍光分析によれば、これらのペプチドの阻害作用は、蛋白合成、蛋白分解的プロセシングまたは蛋白輸送のレベルに存在するものではないことが示された。６．３．１．　ＨＩＶ誘導誘導シンクチウム形成リゴペプチドによる阻害セクション６．１で合成したペプチドが、ＨＩＶＯＢＨＩＯ株の糖蛋白を発現する組み換えワクシニアウィルスに感染させたＨｅＬａＴ４細胞におけるシンシチウム形成を阻害する能力に関して試験した。最大の阻害度はペプチドＡＶＧＩＧＡ（ＨＩＶの８８１０株の膜貫通蛋白から誘導）で観察され、一方、ＡＶＧＡＩＧ　（ＨＩＶ（７）　ＷＭＩ株の膜貫通蛋白カラ誘導）はより小さい阻害作用を示した。ペプチドＡＶＧはペプチドＡＶＧ　ＩＧＡおよびペプチドＡＶＧＡＩＧで観察された作用の中間の阻害作用を示した（第４図）。ペプチドＡＶＧ　ＩＧＡおよびＡＶＧのｌ５ｏ（シンシチウムが５０％阻害される濃度）はともに約０．７５ｍＭであり、そしてペプチドＡＶＧＡＩＧのＩｓｏは約２．５ｍＭであった。０．７５ｍＭでは、ペプチドＡＶＧＩＧＡの細胞融合阻害効果は、ペプチドＡＶＧＡＩＧより約２．５倍高かった。試験した最高濃度（８ｍＭ）では、ペプチドＡＶＧＩＧＡはペプチドＡＶＧＡＩＧおよびペプチドＡＶＧより僅かに効果が高かった。６　、３．２．オリゴペプチドは蛋白合成およびｇｐ１６０のプロセシングを阻害しないこれらのペプチドが蛋白合成およびプロセシングに阻害作用を及はすか否かを判定するため、ＶＶｅｎｖｌ感染ＨｅＬａ、Ｔ４細胞を、阻害濃度の各ペプチドの存在下、３Ｈ−ロイシンで放射性標識しそして免疫沈降を行なってポリアクリルアミドゲル電気泳動によりｅｎｖ糖蛋白合成を分析した（第５図）。ペプチドの存在下または非存在下でｅｎｖ遺伝子産物には差異は観察されず、このことはこれらのペプチドの阻害作用はｇｐ１６０の蛋白合成または蛋白分解的プロセシングのレベルでは存在しないことを示している。６　、３．３．オリゴペプチドは細胞表面への糖蛋白の輸送を阻止しないペプチドか細胞表面へのｅｎｖ糖蛋白の輸送を阻害するか否かを判定するため、ＨｅＬａＴ４細胞をｖｖｅｎｖｌに感染させそして間接表面免疫蛍光分析により表面発現について分析した（第３図）。高濃度の各ペプチドで処理した細胞の相対的蛍光強度はペプチドを添加しなかった細胞と同程度であり、このことはシンシチウム阻害が細胞表面への糖蛋白輸送の阻止によるものではないことを示している。７、微生物の寄託以下の組み換えウィルスをＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）に寄託し、以下のとおりの受託番号を受けた。組み換えウィルス　　受託番号ＶＶ−ｅｎｖ−Ｉ　　　　　ＡＴＣＣ２２０８本発明は細胞系およびウィルス、および例示したペプチドにより範囲を限定されるものではなく、これらの本発明の１つの態様を単に説明するためものである。事実、明細書中に記載したものに加えて、本発明の種々の変更が上記の説明および添付図面から当業者には明らであろう。かかる変更は請求の範囲に包含されるものである。（本質以下余白）ｏＣｏ　　　？　　　の　　ロ　　　　　（０（０ローＱ）　　　唖　　！　　　　　ｎ　　　〜／ｘ３７°十　ド　　ンメζ　ノラじ　　　　　　　　　（ｍＭ）国際調査報告１°゛″０°１ｌｅｌ＋ａｌ　１ｉｅ１°””′”’　ｔ＋ｒｒ／ｎｓ　８９１０１４２６＋ｍ−ｍ−ａｌＡｍｔａ＋−’＠、　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０１４２６Ｐ（Ｔ／ＵＳ　　８９１０Ａ４２６Ａｃｔａ：ｈ＊ｅｌ′＋ｔ　ｔｏ　ｆｏｒｉ　ＰＣＴＩ’ＩＳＡ／２１０．　ＶＩ。

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記式：【配列があります】〔式中、アミノ酸残基は一文字コードで表示され；ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基または交叉反応基を包含し；ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数であり；そして太字は、それが存在する場合は、上記★で示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または、各ペプチド配列内で、上に示される残基と置換できるアミノ酸を包含する〕からなる群から選択される式を含んでなるペプチド。
２．Ｚが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項１記載のペプチド。
３．Ｚがアルキル化剤を包含する請求項１記載のペプチド。
４．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項３記載のペプチド。
５．Ｘが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項１記載のペプチド。
６．Ｘがアルキル化剤を包含する請求項１記載のペプチド。
７．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項６記載のペプチド。
８．下記式：【配列があります】〔式中、アミノ酸残基は一文字コードで表示され；ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基または交叉反応基を包含し；ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数であり；そして太字は、それが存在する場合は、上記★で示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または各ペプチド配列内で、上に示した残基と置換できるアミノ酸を包含する〕からなる群から選択される式を含んでなるペプチド。
９．Ｚが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項８記載のペプチド。
１０．Ｚがアルキル化剤を包含する請求項８記載のペプチド。
１１．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項１０記載のペプチド。
１２．Ｘが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項８記載のペプチド。
１３．Ｘがアルキル化剤を包含する請求項８記載のペプチド。
１４．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項１３記載のペプチド。
１５．下記式：　【配列があります】〔式中、アミノ酸残基は一文字コードで表示されｌＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基または交叉反応基を包含し；そしてｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である〕からなる群から選択される式を含んでなるペプチド。
１６．Ｚが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項１５記載のペプチド。
１７．Ｚがアルキル化剤を包含する請求項１５記載のペプチド。
１８．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項１７記載のペプチド。
１９．Ｘが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項１５記載のペプチド。
２０．Ｘがアルキル化剤を包含する請求項１５記載のペプチド。
２１．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項２０記載のペプチド。
２２．下記式：　【配列があります】〔式中、アミノ酸残基は一文字コードで表示され；ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基または交叉反応基を包含し；そしてｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数である〕からなる群から選択される式を含んでなるペプチド。
２３．Ｚが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項２２記載のペプチド。
２４．Ｚがアルキル化剤を包含する請求項２２記載のペプチド。
２５．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項２４記載のペプチド。
２６．Ｘが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項２２記載のペプチド。
２７．Ｘがアルキル化剤を包含する請求項２２記載のペプチド。
２８．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項２７記載のペプチド。
２９．下記式：【配列があります】〔式中、アミノ酸残基は一文字コードで表示され；ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基１つまたはそれ以上、疎水性基または交叉反応基を包含し；ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数であり；そして、太字は、それが存在する場合は、上記★で示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または各ペプチド配列内で上に示した残基と置換できるアミノ酸を包含する〕からなる群から選択される式を含んでなるペプチド。
３０．Ｚが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項２９記載のペプチド。
３１．Ｚがアルキル化剤を包含する請求項２９記載のペプチド。
３２．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項３１記載のペプチド。
３３．Ｘが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項２９記載のペプチド。
３４．Ｘがアルキル化剤を包含する請求項２９記載のペプチド。
３５．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項３３記載のペプチド。
３６．下記式：【配列があります】〔式中、アミノ酸残基は一文字コードで表示され；ＺおよびＸは、それが存在する場合は、それぞれアミノ酸残基間つまたはそれ以上、疎水性基または交叉反応基を包含し；ｍおよびｎはそれぞれ少なくとも０の整数であり；そして、太字は、それが存在する場合は、上記★で示される位置でアミノ酸残基間に挿入されるか、または各ペプチド配列内で上に示した残基と置換できるアミノ酸を包含する〕からなる群から選択される式を含んでなるペプチド。
３７．Ｚが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項３６記載のペプチド。
３８．Ｚがアルキル化剤を包含する請求項３６記載のペプチド。
３９．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項３８記載のペプチド。
４０．Ｘが、カルボキシベンゾキシル、ダンシルおよびｔ−ブチルオキシカルボニルからなる群から選択される疎水性基を包含する請求項３６記載のペプチド。
４１．Ｘがアルキル化剤を包含する請求項３６記載のペプチド。
４２．アルキル化剤がクロロメチルケトンからなる請求項４１記載のペプチド。
４３．ヒト免疫不全ウイルスの膜貫通蛋白のアミノ末端の疎水性ドメインと実質的に相同であり、そして感染細胞のウイルス誘導融合を阻害するペプチド。
４４．ＨＩＶ−１のｇｐ４１のアミノ末端と実質的に相同である請求項４３記載のペプチド。
４５．ＨＩＶ−２のｇｐ４０のアミノ末端と実質的に相同である請求項４３記載のペプチド。