JP2003506410A - ウィルス感染性を阻止するペプチドおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト免疫不全症候群ウィルス（ＨＩＶ）感染を含むウィルス感染を阻害する、アミド型のペプチドの発見を開示する。ＨＩＶ感染等のウィルス感染の治療および予防のための薬剤での使用を含む、ペプチドの使用の方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染等のウィルス感染を阻止する
ペプチドの発見に関する。特に、ＨＩＶ感染等のウィルス感染の治療および予防
で使用するために、種々の小さなペプチドを含む医薬品が開示されている。

【０００２】 ［発明の背景］ 全てのウィルスは、コアを含有する核酸を包む、タンパク質からなる外殻から
構成される。ウィルスの核酸を直接包んでるタンパク質外殻は、カプシドと呼ば
れている。一方、カプシドと核酸との両方を有する完全なタンパク質−核酸複合
体はヌクレオカプシドと呼ばれる。アレナウィルス、ロタウィルス、オルビウィ
ルス、レトロウィルス（レンチウィルスを含む）、パビローマウィルス、アデノ
ウィルス、ヘルペスウィルス、パラミクソウイルス、ミクソウイルス、およびヘ
パドナウイルス(hepadnavirus)は全てそのような一般的な構造的特徴を示す（Vi
rology, Fields ed., third edition, Lippencott-Raven publishers, pp 1513,
1645,1778, 2047, 2113, 2221, and 2717 (1996)）。

【０００３】 カプシドは、多くのサブユニット（キャプソマー）から構成され、キャプソマ
ーはタンパク質のいくつかのホモまたはヘテロポリマーから形成される。ウィル
ス集合体内のキャプソマー間の非共有結合は、折り畳みタンパク質のドメインを
安定化させるものと同種である。２つのサブユニット間の界面は単一のドメイン
によく似ており、アミノ酸側鎖が互いに強く束ねられている。分析されたウィル
ス構造のほとんどに共通した特徴は、１個のキャプソマーからのポリペプチド鎖
は隣接するキャプソマードメインの下または上に伸ばすことができることである
。そのような伸ばしたポリペプチドの腕が他のポリペプチドの腕に絡まり、疎水
性相互作用、水素結合、および塩橋が生ずることによってカプシドが安定化する
ための補助となる。個々のキャプソマー間の接触は、またいくつかのウィルスに
とってはコアタンパク質との接触は、全体的なカプシド構造を決めるもので、ま
た多数の同一のキャプソマーがかかわっている場合、接触の繰り返しが生じ、結
果として得られる構造が対称性を持ったものとなる（Virology, Fields ed., th
ird edition, Lippencott-Raven publishers, p 62 (1996)）。

【０００４】 いくつかの単純なウィルスは、その解離した構成要素から自然発生的に形成さ
れ、一方他のウィルスでは集合の誘発にキャプソマーの酵素触媒修飾を必要とす
る。ウィルスの自己集合は、好ましい結合条件下でタンパク質サブユニット間の
相互作用の安定性によって促進される。より複雑なウィルスは、自己集合プロセ
スを行った複数の亜集合(subassemblies)からしばしば構築される（Virology, F
ields ed., third edition, Lippencott-Raven publishers, pp 6２, 70, 1646
and 1888 (1996)）。多くのウィルスのカプシドはタンパク質組成の点で異なる
が、一般的なウィルス構造のデザインは、タンパク質のいくつかのホモまたはヘ
テロポリマーから順々に構成される重合したキャプソマーによって特徴づけられ
るように進化してきた。

【０００５】 ＨＩＶは、ヒトに感染して後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレ
ンチウィルスに付けられた名称である。ヒト由来のレンチウィルス分離株は、血
清学的性質、および分子クローニングしたウィルスゲノムの配列分析に基づいて
２通りのタイプ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）のうちの一つに区分化される。
遺伝学的に識別可能なレンチウィルスは、ヒト以外のいくつかの霊長類種、例え
ばアフリカミドリザル、スーティーマンガベイ(sooty magabeys)、マンドリル、
チンパンジー、およびサイケ（syke）から得られている。集合的に、ヒト以外の
霊長類由来のレンチウィルス分離株をＳＩＶと呼ぶ。配列分析によって、いくつ
かのＳＩＶ株ならびにＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２株のゲノムが高度の相同性を
示すことが明らかにされている。さらに、電子顕微鏡によってＨＩＶおよびＳＩ
Ｖの超構造が、両方ともエンベロープ糖タンパク質スパイクを含む脂質二重層膜
によって囲まれた円錐形のヌクレオカプシドを持つ直径約１１０ｎｍのビリオン
を有する点で、類似していることが明らかにされている（Virology, Fields ed.
, third edition, Lippencott-Raven publishers, pp 1882-1883 (1996)）。

【０００６】 ＨＩＶは、少なくとも７つの遺伝子を含む複合レトロウィルスである。ｇａｇ
、ｐｏｌ、およびｅｎｖと呼ばれるウィルスの構造遺伝子は、それぞれウィルス
コアタンパク質、逆転写酵素、およびウィルスエンベロープのウィルス糖タンパ
ク質をコードする。残りのＨＩＶ遺伝子は、ウィルス複製に関与するアクセサリ
遺伝子(accessory gene)である。ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子は、ポリタンパク質
をコードするもので、すなわちそれらの遺伝子の各々から合成されたタンパク質
が翻訳後いくつかのより小さなタンパク質に切断されている。

【０００７】 ＨＩＶおよびＳＩＶのビリオンの全体的な形状が球形であるにもかかわらず、
ヌクレオカプシドは非対称的であって、長さが約１００ｎｍ、幅広の自由端部の
幅が約４０〜６０ｎｍ、および狭い端部の幅が約２０ｎｍである。各成熟ビリオ
ン内のヌクレオカプシドは、Ｇａｇ前駆体ポリペプチドからタンパク質分解を生
ずるようにプロセシングされたタンパク質によって封入されたウィルス一本鎖Ｒ
ＮＡゲノムの２分子から構成される。ウィルスによってコードされたプロテアー
ゼ（ＰＲ）によって行われるｇａｇ遺伝子ポリタンパク質Ｐｒ５５^gagの切断に
よって、複数の成熟カプシドタンパク質が生成される。それらのｇａｇ遺伝子産
物は、ヌクレオカプシドとビリオンエンベロープとの間に位置するものと考えら
れているマトリックスタンパク質（ｐ１７）、カプシド外殻を形成する主カプシ
ドタンパク質（ｐ２４）、およびウィルスＲＮＡゲノムに結合するヌクレオカプ
シドタンパク質（ｐ９）である。このような感染細胞でのタンパク質分解を生ず
るプロセシングは、ビリオン形態形成に関連している（Virology, Fields ed.,
third edition, Lippencott-Raven publishers, pp 1886-1887 (1996)）。

【０００８】 主カプシドタンパク質ｐ２４（ＣＡとも呼ぶ）は、約２４０個のアミノ酸を含
み、２４〜２７ｋＤの分子量を示す。タンパク質ｐ２４は自己結合することで二
量体、および十二量体ほどの大きさのオリゴマー複合体を形成する。ＨＩＶ−１
ｇａｇポリタンパク質における突然変異を用いた遺伝子研究によって、分子のＣ
末端側半分と多様なレトロウィルスのｐ２４タンパク質に保存されているアミノ
酸２０個に及ぶ主相同領域（ＭＨＲ）とを含むいくつかの機能的ドメインがｐ２
４タンパク質にあることがわかった。これらの突然変異は、前駆体ヌクレオカプ
シド集合に影響を及ぼすと思われる（Virology, Fields ed., third edition, L
ippencott-Raven publishers, pp 1888-1889 (1996)）。

【０００９】 ＡＩＤＳの病原体としてＨＩＶ−１が発見されてから、ウィルスが疾患を生じ
させるメカニズムを理解する上で、著しい進歩がなされてきた。多くの診断学的
検査が開発される一方で、ウィルスの非均一的な性質と適当な動物モデルを欠い
ていることが大きな原因となり、ＨＩＶワクチン治療の進歩は遅れている（Mart
in, Nature, 345:572-573 (1990)を参照）。

【００１０】 多くの薬学的作用物質がＡＩＤＳ治療の試みに使用されてきた。しかし、すべ
てを網羅していないかもしれないが、それらの薬物の多くは、治療薬としての有
用性を大きく制限する重大な副作用を生ずる。ＨＩＶ逆転写酵素は、ウィルス複
製における重要な役割を持つことから、薬物標的の一つである。いくつかのヌク
レオシド誘導体がＨＩＶ逆転写酵素を阻害することがわかっており、誘導体とし
てはアジドチミジン（ＡＺＴ、チドビジン）が挙げられる。ＡＺＴは、多くの患
者がその投与に耐えることができないほどの重大な副作用を引き起こす。ＨＩＶ
逆転写酵素を阻害する他のヌクレオシド類似体がＡＺＴよりも大きな副作用を引
き起こすことがわかっている。別の薬物標的は、ウィルスの分化に重要であるＨ
ＩＶプロテアーゼ（ＰＲ）である。ＰＲはアスパラギン酸プロテアーゼであり、
合成化合物によって阻害し得る（Richards, FEBS Lett., 253:214-216 (1989)）
。プロテアーゼ阻害剤は、逆転写酵素阻害剤よりも効果的にＨＩＶの増殖を阻害
するが、長期に及ぶ治療はリポジストロフィ、高脂血症、およびインシュリン耐
性等の代謝疾患と結びつく。

【００１１】 さらに、ＨＩＶはヌクレオシド／ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤および
プロテアーゼ阻害剤に対する耐性を素早く獲得する。この耐性は、また患者間で
も広がり得る。研究によれば、例えば、ＨＩＶに感染して間もない固体の１０人
に１人で、すでにＡＺＴに対する耐性を獲得していることが分かっており、それ
はおそらく感染時にＡＺＴに耐性を示すウィルスを持った人に感染させられるた
めである。

【００１２】 副作用がたとえあったとしても僅かである特異的かつ選択的な治療薬を得るこ
とがＨＩＶおよびＳＩＶを含むウィルス感染の治療および予防に有用である。

【００１３】 ［発明の概要］ 本発明は、ウィルス感染を阻害する小さなペプチド（２〜１０アミノ酸長）に
関する。完全なカプシド構造がビリオンの感染性にとって極めて重要である。二
量化、三量化、四量化、または重合に依存している感染性のためのカプシドタン
パク質巨大分子の集合を妨げる方法は、そのようなタンパク質間相互作用に影響
を及ぼす小さな分子を構築することである。カルボキシル末端の水酸基がアミド
基で置換された小さなペプチドがカプシドタンパク質相互作用に対するそのよう
な阻害効果を有することが発見された。したがって、本発明の態様はウィルスの
カプシド集合に対して作用する修飾小ペプチドに関する。

【００１４】 望ましい実施形態では、短ペプチドは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩ
Ｖのキャプソマー組織化およびカプシド集合に関与し、かつそれによって適当な
カプシド集合、ひいてはウイルス感染を阻害および／または防止するタンパク質
に結合する。小さなペプチド：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ＧＰＧ−ＮＨ₂ ）、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ＧＫＧ−ＮＨ₂）、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−ＮＨ₂（ＣＱＧ−ＮＨ₂）、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ＲＱＧ−ＮＨ₂ ）、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ＫＱＧ−ＮＨ₂）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−ＮＨ₂（ＡＬＧ−ＮＨ₂）、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ＧＶＧ−ＮＨ₂ ）、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ＶＧＧ−ＮＨ₂）、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−ＮＨ₂（ＡＳＧ−ＮＨ₂）、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ＳＬＧ−ＮＨ₂ ）、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂（ＳＰＴ−ＮＨ₂）が好ましい種類で
ある。これらの小さなペプチドおよびそれらの構造に類似したペプチド疑似体(p
eptidemimetic)（集合的に「ペプチド剤」と呼ぶ）は、単量体または多量体の形
態で使用される。本発明のペプチド剤は、ウィルスに感染した、ヒトを含む哺乳
動物における治療および予防上の用途に適している。

【００１５】 一実施形態において、ウィルスに感染した宿主細胞でのウィルス複製を阻害す
るための組成物は、式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意
のアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドを有効量含むもので、ペプチド
はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではなく、さらに前記組成物はウィルスのカ
プシド集合を阻害することでウィルス複製を阻害する。望ましくは、それらのペ
プチドのＸ₃は、グリシンである。また、上記した組成物は、式：Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ
−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有するペプチドからなる群から選択されるアミド型のペプチ
ドを含み得る。

【００１６】 別の関連した実施形態では、上記した組成物は、式：Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂ （式中、Ｘ₄およびＸ₅は任意のアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドで
あり、任意の１個または２個のアミノ酸が欠けている。この実施形態は、式：Ｘ ₁ Ｘ₂Ｘ₃を有するトリペプチドであってもよく、前記配列はウィルスのカプシド
タンパク質のアミノ酸配列に見いだされる。

【００１７】 いくつかの実施形態では、上記した組成物は支持体に結合しており、別の実施
形態では上記した組成物が薬学的に許容可能な担体を有する薬剤に組み込まれる
。例えば、アミド型のペプチドは式Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有するこ
とができ、かつ支持体に結合し得る。

【００１８】 さらに、アミド型のペプチドは、例えばＡｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、またはＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂の式を有し得る。こ
れらのペプチドも支持体に結合し得る。

【００１９】 宿主細胞でのＨＩＶ複製を阻害する方法も実施形態として挙げられる。例えば
、一つのアプローチは、式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は
任意のアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドを有効量、細胞に投与する
ことを含み、また前記ペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではないもの
である。したがって、上記ペプチドは、式： Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ ₂ 、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を
有するペプチドからなる群から選択し得る。上記の方法は、ヌクレオシド類似体
逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転
写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される抗ウイルス
治療薬を投与する過程をさらに含み得る。上記方法で使用するペプチドを支持体
に結合、または薬学的に許容可能な担体を含む薬剤中で投与し得る。

【００２０】 別の実施形態では、宿主細胞でのＨＩＶ複製を阻害するための組成物は、式：
Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸である）を有
するアミド型のペプチドを有効量含むもので、またペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではなく、前記組成物はカプシドの集合体を遮ることでＨＩＶ
複製を阻害する。望ましくは、この実施形態のペプチドにおいて、Ｘ₃はグリシ
ンである。好ましくは、この実施形態のペプチドは、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−ＮＨ₂、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨ₂、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
−ＮＨ₂を有するペプチドからなる群から選択される。また、上記したアミド型
のペプチドは、式：Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₄およびＸ₅はアミノ酸で
ある）を有することができ、また任意の１個または２個のアミノ酸が欠けている
。これらの組成物は、例えばＨＩＶのカプシドタンパク質のアミノ酸配列に見い
だされるトリペプチドＸ₁Ｘ₂Ｘ₃を有し得る。いくつかの実施形態では、これら
のペプチドは支持体に結合しており、別の実施形態ではこれらのペプチドが薬学
的に許容可能な担体を有する薬剤に組み込まれる。

【００２１】 別の方法では、宿主細胞でのウィルス複製を阻害するためのアプローチが提供
され、前記アプローチは式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は
任意のアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドを有効量、前記細胞に投与
することが含まれ、また前記ペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではな
い。この方法では、ペプチドは式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｒｇ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ ₂ 、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有するペプ
チドからなる群から選択し得る。この方法は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻
害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤
、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される抗ウイルス治療薬を投与
する過程をさらに含み得る。さらに本方法で使用するペプチドを支持体に結合、
または薬学的に許容可能な担体を含む薬剤中で投与し得る。

【００２２】 別の方法では、ウィルスカプシド集合を遮るためのアプローチが提供される。
このアプローチは、式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意
のアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドを有効量、細胞と接触させるこ
とを含み、また前記ペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではない。望ま
しくは、本方法で使用するペプチドは式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａ
ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有す
るペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この方法で使
用するペプチドにおいて、Ｘ₃はグリシンである。

【００２３】 他の実施形態では、方法は式：Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₄およびＸ₅ はアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドを用い、また任意の１個または
２個のアミノ酸が欠けている。さらに、方法は、ウィルスのタンパク質のアミノ
酸配列に見いだされるトリペプチドＸ₁Ｘ₂Ｘ₃の使用を含み得る。

【００２４】 多くの場合、本方法のペプチドは支持体に結合、または薬剤に組み込まれてい
る。

【００２５】 ペプチド剤の同定方法も提供する。一つの方法では、例えば、抗ウィルス薬剤
に組み込むのためのペプチド剤は、ウィルスが感染した複数の細胞に対して有効
量のペプチド剤（ここで、前記ペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂では
ない）を接触させ、不完全なカプシド形成についてウィルスを分析し、さらに不
完全なカプシド形成を誘導するペプチド剤を選択することによって同定される。
この方法は鏡検を用いてカプシド形成を分析するもので、ウィルスはＨＩＶ−１
、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶからなる群から選択し得る。さらに、同定されたペ
プチド剤は、トリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチド疑似体からなる群
から選択し得る。例えば、上記ペプチド剤は、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｎ
Ｈ₂、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
ＮＨ₂、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ ₂ を有するペプチドからなる群から選択し得る。好ましい実施形態では、上記方
法で使用されるペプチド剤は、ｐ２４のアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を
有する。

【００２６】 別の実施形態では、ウィルスタンパク質に結合するペプチド剤を同定するため
の方法を提供し、前記方法は、ウィルス・タンパク質を提供し、有効量のペプチ
ド剤（前記ペプチド剤はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではない）とウィルス
タンパク質とを接触させ、ウィルスタンパク質とペプチド剤とを含む複合体の形
成を検出することを含む。上記のように、この方法は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２
、およびＳＩＶからなる群から選択されるウィルス由来のウィルスタンパク質を
使用することを含む。さらに、いくつかの態様では、ペプチド剤は、トリペプチ
ド、オリゴペプチド、およびペプチド疑似体からなる群から選択される。望まし
くは、上記方法は、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ ₂ 、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有するペプチドからな
る群から選択されるペプチド剤を使用する。さらに、上記方法で同定されたペプ
チド剤が薬剤に組み込まれる、薬剤の製造方法を提供する。

【００２７】 薬剤を製造するための別のアプローチも提供され、前記アプローチは、式：Ｘ ₁ Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸である）を有し
、かつＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではないアミド型のペプチドを有効量、
細胞に投与し、細胞内でのウィルス複製阻害を検出し、薬剤の中にウィルス複製
阻害を引き起こすペプチドを組み込むことを含む。この方法では、式：Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ ₂ 、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドの使
用を含み得る。さらに、上記方法は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌ
クレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および
プロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される抗ウィルス化合物を薬剤の中に組
み込む過程を含み得る。さらに、上記方法は薬剤に担体を組み込む過程を含み得
る。

【００２８】 別の実施形態では、ウィルスに感染した宿主細胞でのウィルス複製を阻害する
組成物は、式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−Ｒ（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸で
ある）を有し、かつＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではないペプチドを有効量
含むもので、Ｒは前記ペプチドのカルボキシル末端に結合した修飾基であり、ま
たＲはアミド基、または類似の電荷および立体バルク（steric bulk）を有する
他の部分を含み、前記組成物はウィルスカプシド集合を遮ることでウィルス複製
を阻害する。この組成物は、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｒｇ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有するペプチ
ドからなる群から選択されるペプチドとし得る。望ましくは、それらの実施形態
において、Ｘ₃はグリシンである。

【００２９】 さらに、上記組成物は、式：Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−Ｒ（式中、
Ｘ₄、Ｘ₅、Ｘ₆、Ｘ₇、Ｘ₈、Ｘ₉、およびＸ₁₀は任意のアミノ酸である）を有する
ペプチドを含むことができ、任意の１、２、３、４、５、６、または７個のアミ
ノ酸が欠けており、またＲは前記ペプチドのカルボキシル末端に結合した修飾基
であり、さらにＲはアミド基、または類似の電荷および立体バルクを有する他の
部分を含む。

【００３０】 好ましくは、上記組成物は、ウィルスのカプシドタンパク質のアミノ酸配列に
見いだされるペプチドＸ₁Ｘ₂Ｘ₃を含む。

【００３１】 ［好ましい実施形態の詳細な説明］ 本発明者は、ウイルスカプシドタンパク質に対応した配列を有する修飾小ペプ
チドが適当なヌクレオカプシド形成を遮ることによってウィルス感染を抑制およ
び／または阻害することを発見した。そのようなペプチドは、ウィルス性疾患の
治療、特にＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者の治療に有用であり、またウィルス感染、特に
ＨＩＶ感染の危険性を有する患者に対する予防薬として有用であり、さらにウィ
ルスにさらされる危険性が顕著である医療機器の使用に有用である。

【００３２】 以下の開示では、本発明者は、培養液上清中に存在するカプシドタンパク質の
量または逆転写酵素活性をモニタするウィルス感染性アッセイによって測定し、
ウィルスタンパク質に対応する配列を有するアミド形状の小ペプチド、例えばＧ
ＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂
、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−Ｎ
Ｈ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂が、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ等のウィ
ルス複製を阻害することを実証する。さらに、本発明者は、それらの小ペプチド
がＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成の後の段階で、Ｖ３ループとは独立の
機構でウィルス感染を阻害するという証拠を提示する。

【００３３】 小ペプチドによって処理されたＨＩＶ粒子の電子顕微鏡写真は、新規な種類の
抗ウィルス剤がプロテアーゼ阻害剤とは異なる方法で適当なカプシド集合を遮る
ことを明らかにする。さらに、インビトロ(in vitro)結合アッセイによって、小
ペプチドがＨＩＶ−１の主カプシドタンパク質（ｐ２４）に結合することが明ら
かになる。アレナウィルス、ロタウィルス、オルビウィルス、レトロウィルス、
パピローマウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、パラミクソウイルス
、ミクソウイルス、およびヘパドナウイルス科のウイルス等の、いくつかのウイ
ルスカプシドタンパク質の配列が公知であることから、それらの配列に対応する
いくつかの小ペプチドは、ウィルス感染性アッセイまたは電子顕微鏡法、または
ここに記載したものの両方、または本開示が与えられた当業者にとって明らかで
あるようなそれらのアッセイの改変を用いることで、選択および迅速なスクリー
ングによりどのペプチドがウイルス感染を有効に阻害および／または予防するか
を同定することが可能である。

【００３４】 ウイルスカプシドタンパク質の配列に対応する小ペプチドおよびペプチド（「
ペプチド剤」と総称する）を含む生物工学的ツールおよび薬学的組成物を製造す
るためのいくつかのアプローチを以下に示す。好ましいペプチド剤は、ＧＰＧ−
ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬ
Ｇ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、
およびＳＰＴ−ＮＨ₂等のカルボキシル末端にアミド基を有するトリペプチドで
あるが、本発明者は、宿主細胞でのＨＩＶ複製を含むウィルス複製を阻害する、
式：Ｘ₁，Ｘ₂，Ｘ₃−ＮＨ₂または式：Ｘ₄，Ｘ₅、Ｘ₁，Ｘ₂，Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、
Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄およびＸ₅は任意のアミノ酸である）を有するアミド型の、
任意の１または２のアミノ酸を欠くことができるペプチドを含有する組成物およ
び方法も提供する。好ましい実施形態は、Ｘ₃としてグリシン残基を有する。い
くつかの実施形態では、ペプチド剤は単量体のかたちで提供され、他の実施形態
では、ペプチド剤は多量体のかたちで、または多量化されたかたちで提供される
。支持体結合ペプチド剤もまたいくつかの実施形態で使用される。ペプチド剤を
含む薬学的組成物は、ウィルス疾患、好ましくはＨＩＶ感染の治療および／また
は予防のために、治療薬または予防薬、またはその両方として、投与される。い
くつかの実施形態では、ペプチド剤を含む薬学的組成物はヌクレオシド類似体逆
転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写
酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤等の他の抗ウィルス治療薬と組み合わせ
て投与される。本発明は、小ペプチドが酸加水分解に対して耐性を有すること、
被験者に投与した場合にかなりの量の小ペプチドが効果的に血液、血漿、および
器官組織に送達されること、さらに被験者に対して小ペプチドを大量に投与して
も相対的に非毒性であることの証拠も提供する。

【００３５】 さらに、本発明者は、ウィルス複製を阻害または予防、またはウィルスカプシ
ド集合を妨害、またはそれら両方を行うペプチド剤を同定するためのいくつかの
方法を開示する。一つのアプローチでは、有効量のペプチド剤をウィルス感染細
胞と接触させ、ウィルス複製またはウィルス産物の存在についてかかる細胞を分
析する。さらに、電子顕微鏡を用いることで、カプシド集合を妨害するペプチド
剤の能力を容易に判断し得る。さらに、カプシドタンパク質（例えば、ｐ２４）
に結合するペプチド剤を同定し、それによってカプシド集合、さらにウィルス複
製を妨害する方法を開示する。したがって、カプシドタンパク質（例えば、ｐ２
４）をペプチド剤、例えば式：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任
意のアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドと接触させ、ペプチド剤が結
合したカプシドタンパク質（例えば、ｐ２４）を含む複合体を同定する。ウィル
スタンパク質（例えば、ｐ２４）およびペプチド剤を有する反応混合物や、ペプ
チド剤に結合したウィルスタンパク質（例えば、ｐ２４）を有する生体分子複合
体もまた本開示で教示される。

【００３６】 以下の表１に示すアミド型の小ペプチドを試験した。それらの小ペプチドの多
くを選択かつ合成した。なぜなら、それらは完全または部分的にＨＩＶおよび／
またはＳＩＶウィルスタンパク質に含まれる配列に一致するからである。表１の
小ペプチドを以下の実施例１に開示された方法にもとづいて合成した。しかし、
もちろん当業者に周知の任意の方法によっても合成されてもよい。

【００３７】

【表１】

【００３８】 実施例１ この実施例では、表記した小ペプチドを得るために使用されるアプローチを開
示する。自動ペプチド合成装置（Syro, Multisyntech, Tubingen, Germany）を
用いて、いくつかのトリペプチドを合成した。合成は、標準的なプロトコルにし
たがって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）保護アミノ酸（Mi
lligen, Bedford, Mass）を用いて実行した。全てのペプチドを凍結乾燥し、続
いて適当な濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。ペプチドの分析
は、ＰｅｐＳ−１５Ｃ１８カラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いる逆相
高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって行った。

【００３９】 多くの実施形態で、ペプチド（「修飾ペプチド」）のカルボキシル末端に結合
した修飾基を有するペプチドを用いた。いくつかの例では、ペプチドの末端カル
ボキシル基に通常存在するヒドロキシル残基をアミノ基で置換することによって
、修飾ペプチドを生成した。すなわち、ＣＯＯＨ末端の代わりに、ＣＯ−ＮＨ₂
を持つようにペプチドを合成した。例えば、好ましい小ペプチドとして、グリシ
ル−リシル−グリシンアミド（ＧＫＦ−ＮＨ₂）、シスチル−グルタミニル−グ
リシンアミド（ＧＱＧ−ＮＨ₂）、グリシル−プロリル−グリシンアミド（ＣＰ
Ｇ−ＮＨ₂）、アルギニル−グルタミニル−グリシンアミド（ＲＱＧ−ＮＨ₂）、
リシル−グルタミニル−グリシンアミド（ＫＱＧ−ＮＨ₂）、アラニル−ロイシ
ル−グリシンアミド（ＡＬＧ−ＮＨ₂）、グリシル−バリル−グリシンアミド（
ＧＶＧ−ＮＨ₂）、バリル−グリシル−グリシンアミド（ＶＧＧ−ＮＨ₂）、アラ
ニル−セリル−グリシンアミド（ＡＳＧ−ＮＨ₂）、セリル−ロイシル−グリシ
ンアミド（ＳＬＧ−ＮＨ₂）、およびセリル−プロリル−スレオニンアミド（Ｓ
ＰＴ−ＮＨ₂）が挙げられる。合成されたものに加えて、多くのトリペプチドも
また、Bachem Ag、Switzerlandから購入し、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、お
よびＧＰＧ−ＮＨ₂が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【００４０】 従来の抗ウィルス治療と組み合わせた小ペプチド治療の効果を評価する実験お
よび毒性実験において、ペプチドは以下のようにして得た。初期の実験に対して
は、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）４３０Ａペプチド合成
装置（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて固相ペプチド合成を行
った。各合成では、ｐ−メチルベンジルヒドリルアミン固相支持体樹脂（Peptid
e International, Louisville, KY）を用いて、酸加水分解によって固相支持体
からペプチドが劈開される時にカルボキシル末端アミドを得た。合成に使用する
全てのアミノ酸は、α−ＮＨ２基を保護するｔ−ブチルカルボニル基を含むもの
で、Novabiochem AG, Switzerlandから入手した。トリフルオロメタンスルホン
酸処理によって固相支持体樹脂から劈開した合成ペプチドから保護基を除去する
ことで、カルボキシル末端に水酸（−ＯＨ）基のかわりに、アミノ（−ＮＨ₂）
修飾基を有するペプチドが得られた。使用に先立って、逆相高性能液体クロマト
グラフィーによってペプチドの精製を行い、さらにアプライドバイオシステムズ
４３７Ａペプチドシーケンサ上で前記ペプチドの配列決定を行った。また、アミ
ド（ＣＯ−ＮＨ₂；ＧＰＧ−ＮＨ₂）またはカルボキシル（ＣＯＯＨ；ＧＰＧ−Ｏ
Ｈ）末端を有するトリペプチドＧＰＧをBachem AG, Switzerlandから購入した。

【００４１】 以下の開示では、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染を阻害する小ペ
プチドを同定するために使用したいくつかのアッセイについて説明する。

【００４２】 ＨＩＶおよびＳＩＶ感染性アッセイ 実施例１に基づいて合成したペプチドをいくつかのＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、
およびＳＩＶ感染性アッセイで用いた。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ
感染の効率を逆転写酵素活性、細胞上清中のｐ２４タンパク質の濃度、およびＨ
ＩＶ−１融合細胞形成の鏡検によってモニタした。

【００４３】 最初の実験では、いくつかのトリペプチドに対して、Ｈ９細胞におけるＨＩＶ
−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染を阻害する能力についてのスクリーニング
を行った。ひとたび阻害性のトリペプチドが同定されると、よりいっそう特異的
なアッセイを実施して選択されたトリペプチドの濃度変化と組み合わせ治療（例
えば、複数のトリペプチドを組み合わせて使用）との効果を判断した。

【００４４】 以下の実施例では、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染を阻害する能
力について、いくつかのトリペプチドをスクリーニングするために使用したアプ
ローチについて開示する。

【００４５】 実施例２ この実施例では、種々のトリペプチドのＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩ
Ｖ複製阻害能についての分析に使用した複数の方法について開示する。実験１お
よび２では、約２００，０００のＨ９細胞に対してＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、お
よびＳＩＶを２５ ＴＣＩＤ₅₀で感染させて、以下の合成トリペプチド、すなわ
ちＬＫＡ−ＮＨ₂、ＩＬＫ−ＮＨ₂、ＧＰＱ−ＮＨ₂、ＧＨＫ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−Ｎ
Ｈ₂、ＡＣＱ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＡＲＶ−ＮＨ₂、ＫＡＲ−ＮＨ₂、ＨＫＡ
−ＮＨ₂、ＧＡＴ−ＮＨ₂、ＫＡＬ−ＮＨ₂、およびＧＰＧ−ＮＨ₂の阻害効果につ
いて試験した。したがって、Ｈ９細胞を、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ胎
仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン
（１００ｕ／ｍｌ）（これらはすべてＧＩＢＣＯを通じて入手可能）とＳｉｇｍ
ａを通じて入手可能なポリブレン（Polybrene）（ｇ／ｍｌ）とを補充した１ｍ
ｌのＲＰＭＩ １６４０培地基中に、異なるペプチド（約１００μＭ）の存在ま
たは非存在下で再懸濁した。その後、ウィルスを２５ ＴＣＩＤ₅₀で２０〜３０
μｌの容量で加えた。細胞をウィルスとともに３７℃で１時間インキュベートし
、続いて１７０ｘｇ、７分でペレットにした。次に細胞を、室温において、ペプ
チドを含まないＲＰＭＩ培地中で３回洗浄し、上記のように１７０ｘｇ、７分で
ペレットにした。最後の洗浄の後、細胞を２４ウェルプレート（Costar corpora
tion）内の、ペプチドを含むＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、保湿５％ＣＯ₂中で３
７℃に保持した。

【００４６】 感染後４、７、１０、および１４日目に培地を交換する際に、培養液上清を回
収して分析した。ウィルスの複製をモニタするために、市販のレンチ（Lenti）
−逆転写酵素（ＲＴ）活性キット（Cavidi Tech, Uppsala, Sweden）を用いて上
清中のＲＴ活性をアッセイした。ＲＴの量は、標準物質の回帰線を用いて決定し
た。結果は、吸収値（ＯＤ）として表し、吸収値が高いことはタンパク質濃度が
高いこと、またウィルス感染がより大きいことを示している。融合細胞形成も鏡
検によってモニタした。表２および表３は実験１および２の細胞培養液上清の吸
収値をそれぞれ示す。

【００４７】 実験３（表４）では、約２００，０００のＨ９細胞に対してＨＩＶ−１、ＨＩ
Ｖ−２、およびＳＩＶを２５ ＴＣＩＤ₅₀で感染させて、異なる濃度のペプチド
ＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂およびこれらのペプチドの組み
合わせ（示した濃度は各トリペプチドの濃度に一致する）の阻害効果を試験した
。上記したように、Ｈ９細胞を、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ胎仔血清（
ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００
ｕ／ｍｌ）とポリブレン（ｇ／ｍｌ）とを補充した１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０
培地中に、濃度を変えた異なるペプチドの存在または非存在下で再懸濁した。そ
の後、ウィルスを２５ ＴＣＩＤ₅₀で２０〜３０μｌの容量で加えた。細胞を表
示ウィルスとともに３７℃で１時間インキュベートし、続いて１７０ｘｇ、７分
でペレットにした。次に細胞を、室温において、ペプチドを含まないＰＲＭＩ培
地中で３回洗浄し、上記のように１７０ｘｇ、７分でペレットにした。最後の洗
浄の後、細胞を、２４ウェルプレート（Costar corporation）内の、ペプチドを
含むＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、保湿５％ＣＯ₂中で３７℃に保持した。

【００４８】 感染後４、７、および１１日目に培地を交換する際に、培養液上清を回収した
。上記のように、レンチ−逆転写酵素（ＲＴ）活性キット（Cavidi Tech）を用
いて上清中のＲＴ活性を検出することで、各ウィルスの複製をモニタした。ＲＴ
の量は、標準物質の回帰直線を用いて決定した。結果は、吸収値（ＯＤ）として
表し、吸収値が高いことはタンパク質濃度が高いこと、またウィルス感染がより
大きいことを示している。表４は実験３の細胞培養液上清の吸収値を示す。

【００４９】 実験４（表５）では、約２００，０００のＨ９細胞に対してＨＩＶ−１を２５
ＴＣＩＤ₅₀で感染させて、異なる濃度のペプチドＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−Ｎ
Ｈ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂およびこれらのペプチドの組み合わせ（示した濃度は各トリ
ペプチドの全濃度に一致する）の阻害効果を試験した。上記したように、Ｈ９細
胞を、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１
００ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｕ／ｍｌ）とポリブレン（
ｇ／ｍｌ）とを補充した１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中に、濃度を変えた
異なるペプチドの存在または非存在下で再懸濁した。その後、ウィルスを２５Ｔ
ＣＩＤ₅₀で２０〜３０μｌの容量で加えた。細胞を表示ウィルスとともに３７℃
で１時間インキュベートし、続いて１７０ｘｇ、７分でペレットにした。次に細
胞を、室温において、ペプチドを含まないＰＲＭＩ培地中で３回洗浄し、上記の
ように１７０ｘｇ、７分でペレットにした。最後の洗浄の後、細胞を、２４ウェ
ルプレート（Costar corporation）内の、ペプチドを含むＲＰＭＩ培地中に再懸
濁し、湿気を持った５％ＣＯ₂中で３７℃に保持した。

【００５０】 感染後４、７、および１１日目に培地を交換する際に、培養液上清を回収した
。上記のように、レンチ−逆転写酵素（ＲＴ）活性キット（Cavidi Tech）を用
いて上清中のＲＴ活性を検出することで、各ウィルスの複製をモニタした。ＲＴ
の量は、標準物質の回帰線を用いて決定した。結果は、吸収値（ＯＤ）として表
し、吸収値が高いことはタンパク質濃度が高いこと、またウィルス感染がより大
きいことを示している。表５は実験４の細胞培養液上清の吸収値を示す。検出が
よりいっそう正確に判断されるように、１１日目で分析した上清を５倍希釈した
。

【００５１】 実験５（表６）では、約２００，０００のＨ９細胞に対してＨＩＶ−１を２５
ＴＣＩＤ₅₀で感染させて、異なる濃度のペプチドＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−Ｎ
Ｈ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂およびこれらのペプチドの組み合わせの阻害効果を試験した
。上記したように、Ｈ９細胞を、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ胎仔血清（
ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｕ／ｍ
ｌ）、およびポリブレン（ｇ／ｍｌ）とを補充した１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０
培地中に、濃度を変えた異なるペプチドの存在または非存在下で再懸濁した。そ
の後、ウィルスを２５ ＴＣＩＤ₅₀で２０〜３０μｌの容量で加えた。細胞を表
示ウィルスとともに３７℃で１時間インキュベートし、続いて１７０ｘｇ、７分
でペレットにした。次に細胞を、室温において、ペプチドを含まないＰＲＭＩ培
地中で３回洗浄し、上記のように１７０ｘｇ、７分でペレットにした。最後の洗
浄の後、細胞を、２４ウェルプレート（Costar corporation）内の、ペプチドを
含むＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、湿気を持った５％ＣＯ₂中で３７℃に保持した
。

【００５２】 感染後４、７、および１４日目に培地を交換する際に、培養液上清を回収した
。上清中のｐ２４の存在を検出することで各ウィルスの複製をモニタした。ＨＩ
Ｖｐ２４抗原は、市販のＨＩＶｐ２４抗原検出キット（Abbott）を用いて確定し
た。結果は、吸収値（ＯＤ）として表し、吸収値が高いことはタンパク質濃度が
高いこと、またウィルス感染がより大きいことを示している。いくつかの場合で
は、ｐ２４濃度をよりいっそう正確に検出するために、上清を連続希釈した。表
６は、実験５の細胞培養液上清の吸収値を示す。以下に詳細に説明するように、
トリペプチドＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂およびこれらのペ
プチドの組み合わせがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染を効果的に阻
害することがわかった。

【００５３】 実験６（表７および図１）では、約２００，０００のＨＵＴ７８細胞に対して
ＨＩＶ−１を２５ ＴＣＩＤ₅₀で感染させて、ＧＰＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、
ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ ₂ 、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂の阻害効果を試験した。ＨＵＴ細胞を
、上記した異なる小ペプチド（１００μＭ）の存在または非存在下で、１０％（
ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）
、ストレプトマイシン（１００ｕ／ｍｌ）、およびポリブレン（Sigma、２μｇ
／ｍｌ）とを補充した１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中に再懸濁した。その後
、ＨＩＶ−１ウィルスを２５ＴＣＩＤ₅₀で２０μｌの容量で加えた。細胞を、ウ
ィルスとともに３７℃で１時間インキュベートし、続いて１７０ｘｇ、７分でペ
レットにした。次に細胞を、室温において、ペプチドを含まないＰＲＭＩ培地中
で、上記のように１７０ｘｇ、７分の細胞沈降によって３回洗浄した。最後の洗
浄の後、細胞を、２４ウェルプレート（Costar corporation）内の、ペプチドを
含むＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、湿気を持った５％ＣＯ₂中で３７℃に保持した
。感染後４、７、および１１日目に培地を交換する際に、培養液上清を回収し、
ウィルスｐ２４産生をＨＩＶ−１ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（Abbott Laboratorie
s, North Chicago, USA）を用いてモニタした。以下で議論するように、小ペプ
チドＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−
ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂は効果的にＨＩＶ
−１感染を阻害することがわかった。

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【００５６】

【表４】

【００５７】

【表５】

【００５８】

【表６】

【００５９】

【表７】

【００６０】 小ペプチドによるＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染の阻害および／ま
たは防止

【００６１】 表１に列挙する小ペプチドのうちで、ＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ
−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、Ｖ
ＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂は、ＨＩＶ
−１感染を阻害および／または防止し、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、および
ＧＰＧ−ＮＨ₂はＨＩＶ−２およびＳＩＶ感染に対する阻害または防止も示した
。小ペプチドＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、
ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂に対して
は、ＨＩＶ−２またはＳＩＶ感染を防止または阻害する能力についての分析を行
わなかったが、小ペプチドＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、Ｒ
ＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂
、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂の対応する領域にある
カプシドタンパク質構造の顕著な相同性がＨＩＶ−２およびＳＩＶと共通である
という事実から、ＨＩＶ−２またはＳＩＶ感染、またはその両方の阻害または防
止が期待されるということが理解される。

【００６２】 実験１〜６（表２〜７および図１に示す）の結果は、カルボキシル末端のアミ
ノ酸としてグリシンを有するウイルスカプシドタンパク質配列に対応するアミド
型の小ペプチドＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂ 、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−Ｎ
Ｈ₂、およびＳＬＧ−ＮＨ₂がＨＩＶ感染を阻害または防止することが示している
。カルボキシル末端アラニン残基Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ（ＬＫＡ）およびＨｉ
ｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ（ＨＫＡ）またはカルボキシル末端グルタミン残基Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（ＧＰＱ）およびＡｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ（ＡＣＱ）を有するペ
プチドは、ＨＩＶ感染を防ぐことができなかった。しかし、アミノ末端グリシン
残基Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（ＧＰＱ）、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（ＧＨＫ）、
およびＧｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ＧＡＴ）を有するペプチドが感染およびＨＩＶ
−１融合細胞形成を防げなかったことから、アミノ末端にあるグリシンは抑制因
子ではない。さらに、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（ＧＰＱ）、Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｎ（ＡＣＱ）、およびＧｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ＧＡＴ）等の他の非荷電極性
側鎖、またはＡｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ（ＡＲＶ）、Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ（Ｈ
ＫＡ）、およびＬｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＫＡＬ）、ならびにＬｅｕ−Ｌｙｓ−
Ａｌａ（ＬＫＡ）等のカルボキシル末端の非極性側鎖を有するペプチドは、感染
を防ぐことができなかった。カルボキシル末端にあるグリシン残基がＨＩＶおよ
びＳＩＶ感染の阻害に関係していると思われるが、小ペプチドのカルボキシル末
端にある他のアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基もまたＨＩＶおよびＳＩＶ感
染を阻害し得る。例えば、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（ＳＰＴ）がＨＩＶ−１感染
を阻害または防止することが示された。

【００６３】 いくつかの実験では、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染に対する小
ペプチドの効果は濃度および時間に依存するようだった。５μＭおよび２０μＭ
ほどに低濃度のＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、およびＧＰＧ−ＮＨ₂およびそ
れらの組み合わせは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染を減少させる
効果が認められた。しかし、１００μＭ以上では、トリペプチドＧＫＧ−ＮＨ₂
、ＣＱＧ−ＮＨ₂、およびＧＰＧ−ＮＨ₂ならびにそれらの組み合わせはよりいっ
そう効率的にＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染を阻害した。表６に示
すように、３００μＭのＧＫＧ−ＮＨ₂およびＣＱＧ−ＮＨ₂は、細胞上清に含ま
れるｐ２４抗原の存在によって検出したところ約１００％までＨＩＶ−感染性を
減少させた。表６に示した減少率の計算は、ペプチド処理試料で検出されたｐ２
４抗原の量を対照群試料で検出されたｐ２４抗原の量で割り、この数に１００を
掛けて割合を出し、割られた割合を１００％から差し引くことで行った。例えば
、ＧＰＧ−ＮＨ₂によって表される減少率は以下の通りである。

【００６４】

【数１】５．６ｘ１０² ｘ１００ ＝ ３％、そして１００％−３％＝９７％ ２．０ｘ１０⁴

【００６５】 最初の５つの実験（表２〜６）では、トリペプチドＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−
ＮＨ₂、およびＧＰＧ−ＮＨ₂およびそれらの組み合わせが５μＭ以上の濃度でＨ
ＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染を阻害することが示された。

【００６６】 ６番目の実験（表７および図１）では、小ペプチドＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−
ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬ
Ｇ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂が１００μＭで効果的にＨＩＶ−１感染を阻害
および／または防止することが示された。表７に示すように、小ペプチドＲＱＧ
−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＬＧ−ＮＨ₂によって、上清
中のカプシドタンパク質ｐ２４の量によって測定されるように、ウィルスをほぼ
１００％減少させることができた。ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−Ｎ
Ｈ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂は１００μＭではＨＩＶ−１感染に対する阻害または
防止効果が少なかったが、より高い濃度でトリペプチドがよりいっそう高い効果
を示すと考えられる。表２〜７に示す実験１〜７のデータは、ウイルスカプシド
タンパク質の配列に対応する小ペプチドが幅広い濃度範囲で有効な抗ウィルス薬
剤であることを示している。

【００６７】 小ペプチドを媒介としたウィルス阻害をよりいっそう理解するために、ＤＮＡ
合成、ＲＮＡ合成、およびタンパク質発現に対するいくつかの研究を行った。そ
れらの実験を以下に説明する。

【００６８】 ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、およびタンパク質発現の後の段階での小ペプチド阻
害ウィルス感染性

【００６９】 プロウィルスＤＮＡおよびウィルスＲＮＡ合成を調べるために、小ペプチド存
在下で培養したＨＩＶ−１感染Ｈ−９細胞由来のＤＮＡおよびＲＮＡを、種々の
時点（０〜４８ｈ）で調製した。サザンブロット分析によって、ＨＩＶ−１ Ｄ
ＮＡがＧＰＧ−ＮＨ₂存在下で合成され、かつほぼ最初の２４時間ではプロウィ
ルスＤＮＡの量が小ペプチドの種々の濃度（０〜２，０００μＭ）とほぼ等しか
った。それらの結果は、ＧＰＧ−ＮＨ₂等の小ペプチドがＨＩＶ−１侵入および
ＤＮＡ合成に対して阻害効果を持たず、小ペプチドがＨＩＶ−１逆転写酵素活性
を阻害しないという知見と一致するということを証明している。

【００７０】 ノーザンブロット分析による分析では、感染後２４〜４８時間で３種類のＲＮ
Ａバンド（９．２、４．３、および２．０ｋｂ）が検出された。９．２ｋｂのＲ
ＮＡは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子に関してゲノムＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方
として機能する。４．３ｋｂの単一スプライスＲＮＡ(singly-spliced RNA)は、
少なくともｅｎｖ遺伝子を表し、また２ｋｂの多重スプライスＲＮＡは、調節遺
伝子をコードする。感染後４８時間まで、ＧＰＧ−ＮＨ₂は２０μＭでそれらの
ＲＮＡの発現に対して何ら阻害効果を示さなかった。２００μＭおよび２，００
０μＭで、感染後４８時間でＨＩＶ−１ＲＮＡの減少が認められ、それは第２の
複製サイクルの阻害を反映していると思われる。これらの結果によって、転写段
階ではＨＩＶ−１複製を小ペプチドが阻害しないこと、そしてまた小ペプチドは
転写産物のスプライシングに影響を及ぼさないことが明らかになった。

【００７１】 小ペプチド存在下でＨＩＶ−１が適当にタンパク質を発現するかどうかを判断
することを意図した実験では、タンパク質発現または修飾に対して著しい効果は
観察されなかった。しかし、一つの実験では、ポリアクリルアミドゲル上でｇｐ
１６０／ｇｐ１２０の異常な移動が認められた。ＧＰＧ−ＮＨ₂（２０μＭ以上
）存在下で、ｇｐ１６０および／またはｇｐ１２０は分子量がわずかに１２０，
０００Ｄａをわずかに下回る分子量を表すポリアクリルアミドゲル上の位置に電
気泳動することが観察された。この結果は、再現性がなく、またｇａｇタンパク
質ｐ１７またはｐ２４の移動における変化は観察されなかった。ＧＰＧ−ＮＨ₂
存在下でのウィルスタンパク質のグリコシレーション(glycosylation)を分析す
るための研究によれば、Ｎ−またはＯ−結合グリシレーションのいずれに対して
も影響がなかった。また、組み換えによって（ワクシニア・ウィルスで）産生さ
れたｇｐ１６０に対するグリコシレーションは、ＧＰＧ−ＮＨ₂によっては影響
されなかった。さらに、ＧＰＧ−ＮＨ₂は、ＨＩＶ−１特異的プロテアーゼ活性
に対して影響を及ぼさないことがわかった。

【００７２】 上記した実験では、小ペプチドがＨＩＶ複製サイクルの後期の段階でＨＩＶ感
染性と干渉することが示された。ＧＰＧ−ＮＨ₂は、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、
タンパク質合成、およびタンパク質グリコシレーションを妨害することができな
かった。以下の開示では、小ペプチド、例えばＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、
ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ ₂ 、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂が複
製サイクルの後段でウィルス感染を阻害するより多くの証拠が開示されており、
より広い意味で、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染等のウィルス感染を阻害する能力につ
いて他の小ペプチドまたはその誘導体をスクリーニングする別の技術を提供し得
る。したがって、ＨＩＶ−１感染細胞が小ペプチドの存在または非存在下でイン
キュベートされたいくつかの電子顕微鏡実験を以下で議論する。

【００７３】 ヌクレオカプシドの集合体に干渉する小ペプチド

【００７４】 小ペプチドＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、
ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ ₂ 、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂がＨＩＶ感染を阻害したことがひとた
び発見されると、小ペプチドと一緒にインキュベートしたＨＩＶ感染細胞をさら
に分析するために電子顕微鏡法が用いられた（図２、３、および４を参照）。図
４に示すように、電子顕微鏡による分析でＧＰＧ−ＮＨ₂との接触が適当なウィ
ルスヌクレオカプシド形成を妨害することがわかった。

【００７５】 このような一群の実験では、３７℃、１時間、３００ＴＣＩＤ₅₀でＨＩＶ−１
ＳＦ−２ウィルスをＨＵＴ７８細胞に感染させた。続いて、実施例２に示すよう
に、感染細胞に対して洗浄およびペレット化を３回行った。その後、１０％ＦＢ
Ｓ、抗体（１００Ｕ／ｍｌ）、およびポリブレン（３．２μｇ／ｍｌ）を添加し
たＲＰＭＩ培地に細胞を再懸濁した。次に、感染後３、５、または７日に１μＭ
または１０μＭの濃度で細胞培養中にＧＰＧ−ＮＨ₂を添加した。対照群の試料
に対しては、０．５μＭリトナビル（プロテアーゼ阻害剤）を投与した。

【００７６】 １４日目まで細胞を培養し、この時点で細胞を従来の手段によって２．５％グ
ルタルアルデヒドで固定した。固定細胞を次に１％ＯｓＯ₄で後固定し、さらに
脱水してエポキシ樹脂に包埋し、そしてブロックを重合させた。ヌクレオカプシ
ドの幅に合うように約６０〜８０ｎｍの厚さのウィルス感染細胞のエポキシ切片
を作った。１．０％酢酸ウラニルで染色したグリッド(grid)に切片を載せ、加速
電圧８０ｋＶでツアイス(Zeiss)ＣＥＭ９０９顕微鏡で分析した。画像品質を改
善するために顕微鏡に分光器を備え付け、また液体窒素冷却トラップを用いてビ
ームによる損傷を少なくした。対照およびＧＰＧ−ＮＨ₂でインキュベートした
細胞の切片を有するグリッドをいくつかの盲検試験で調べた。

【００７７】 未処理のＨＩＶウィルスの電子顕微鏡による鏡検によって、特徴的な円錐状の
ヌクレオカプシドと、前記ヌクレオカプシドの長さに延びた均一に染色されたＲ
ＮＡとが明らかになった（図２参照）。それとは対照的に、図３はウィルスプロ
テアーゼ阻害剤リトナビルの存在下で産生されたいくつかのＨＩＶ−１粒子を示
す電子顕微鏡写真が提示されている。リトナビル処理された感染細胞は、予想通
りに、認識可能なヌクレオシドを持たない奇形構造を示した（図３参照）。図４
は、ＧＰＧ−ＮＨ₂存在下で産生されたウィルス粒子を示す電子顕微鏡写真を提
示している。ＧＰＧ−ＮＨ₂で処理されたＨＩＶ−１粒子を持つ細胞は、リトナ
ビル処理粒子とは異なる識別可能なカプシド構造を持つＨＩＶ−１粒子を示した
。さらに特徴的なことは、いくつかのトリペプチド処理ウィルス粒子では、円錐
形状のカプシド構造が相対的に完全ではあるが、ＲＮＡはカプシドの外側または
前記カプシドの上面（幅広の端部）のいずれかでボール状の形態の中に蓄積され
た。さらに、いくつかのカプシドは正常なヌクレオカプシドに僅かに類似してい
る、または全く類似していない誤って生じた構造を持つことが観察され、また一
端でその構造の外側または前記構造の内側にあるように見えるＲＮＡが観察され
た。それらの研究から、小ペプチドがヌクレオカプシドの適当な形成に干渉し、
それによってこのようなカプシド発達の阻害がプロテアーゼ阻害剤リトナビルの
作用とは異なる段階で生ずることが明らかとなった。

【００７８】 アミド型のトリペプチド、例えばＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−Ｎ
Ｈ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ
−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂がカプシド集合
に干渉することについてのさらなる証拠は、標的生体分子としてのｐ２４による
結合アッセイを実施することによって明らかになった。ｐ２４結合アッセイの詳
細を以下に提供する。

【００７９】 主カプシドタンパク質（ｐ２４）に対する小ペプチドの結合

【００８０】 小ペプチドが成熟カプシドタンパク質（ＣＡ）またはｐ２４と相互作用する能
力を有し、それによってヌクレオカプシドに干渉するかどうかについて直接調べ
るために、実験を行った。この群の実験では、放射性標識ＧＰＧ−ＮＨ₂がｐ２
４に結合する能力を評価するｐ２４結合アッセイを実施した。

【００８１】 孔径が１０ｋＤ未満の透析膜（Slide-A-Lyzer, Pierce）を用いて透析をベー
スとする結合アッセイを行った。ＢＳＡ（Sigma）および組み換え体タンパク質
ｐ２４およびｇｐ１２０（ＡＩＤＳプログラム、ＮＣＩＢからの無償提供）の１
０μＭストックの５０μｌを別々の透析膜にインキュベートし、タンパク質を４
℃で２日間、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．４）、および２７．５Ｍの¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂（Amersham Ltd. UK）から
構成される５００ｍｌ溶液に対して透析した。続いて、透析したｐ２４、ｇｐ１
２０、およびＢＳＡから１０または５μｌを分取し、シンチレーション・バイア
ル内の３ｍｌリーディ・セーフ（ReadySafe）（Beckman）と混合した。次に、Ｃ ¹⁴ をシンチレーション計数によって検出した。

【００８２】 代表的な透析実験の結果を表８に示す。注目すべきことに、ＧＰＧ−ＮＨ₂に
よるｐ２４の結合が透析平衡状態で観察された。ｐ２４に結合した放射性ＧＰＧ
−ＮＨ₂の量は緩衝液中に存在する量よりも７．５倍多かった。それとは対照的
に、透析緩衝液に存在する量を上回る感知可能な量の放射性ＧＰＧ−ＮＨ₂はｇ
ｐ１２０またはＢＳＡのいずれとも結合しなかった。これらのことから、ＧＰＧ
−ＮＨ₂等の小ペプチドがｐ２４に結合するが、この相互作用が適当なヌクレオ
カプシド形成を妨害することが判明した。

【００８３】

【表８】

【００８４】 以下の開示では、ＡＺＴまたはリトナビルがＨＩＶまたはＳＩＶ感染を阻害す
る方法とは異なる機構で、小ペプチド、例えばＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、
ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ ₂ 、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂がＨ
ＩＶおよびＳＩＶ感染を阻害するさらなる証拠が提供される。

【００８５】 ＡＺＴまたはリトナビルに対して耐性を示すＨＩＶ−１株を阻害する小ペプチ
ド

【００８６】 ヌクレオシド類似体ＡＺＴまたはプロテアーゼ阻害剤リトナビルのいずれか一
方に対する耐性を持つＨＩＶ−１株を阻害する小ペプチドの能力。ＨＩＶ−１耐
性分離株を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）内で培養し、上清をウィルスストックとし
て回収した。ＴＣＩＤ₅₀（５０％組織培養感染量）の力価測定をＰＢＭＣで行い
、力価をリードおよびムエンチ（Read and Muench）の式に基づいて計算した。
３７℃、１時間での吸着によって２５ＴＣＩＤ₅₀のそれらのウィルス（ＨＩＶ−
１ ＳＦ１６２を対照群として使用）によって４００，０００ＰＢＭＣを感染さ
せた、その後３回洗浄した。細胞を、薬物を含まない培地、またはＧＰＧ−ＮＨ ₂ （１００μＭ）、ＡＺＴ（５μＭ）、またはリトナビル（０．１μＭ）のいず
れかを含む培地に再懸濁し、保湿ＣＯ₂、３７℃の条件下でインキュベートした
。４日毎に培地を変え、上清に含まれるＨＩＶ−１ｐ２４抗原タンパク質をＥＬ
ＩＳＡによってモニタした（表９）。

【００８７】 表９に示すように、ＧＰＧ−ＮＨ₂はＡＺＴまたはリトナビル耐性ＨＩＶ株の
いずれかに対して強力な抗ウィルス効果を有していた。この実験の結果は、上記
したデータを実証するものであり、小ペプチドがＡＺＴおよびリトナビルとは異
なる段階でＨＩＶ複製を阻害することを明らかにしている。さらに、Ｖａｈｌｎ
ｅ他の米国特許第５，６２７，０３５号（本明細書でその全体を引用する）に開
示されているように、ＨＩＶの「街上株(street strain)」の処置はＧＰＧ−Ｎ
Ｈ₂によって達成された。それらがＨＩＶウィルスタンパク質の配列からも誘導
されると考えるならば、ペプチド、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−Ｎ
Ｈ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ
−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂もまた、ＨＩＶの街上株と同様
に、ＡＺＴおよびリトナビル耐性ＨＩＶ感染の治療に有用である。

【００８８】

【表９】

【００８９】 上に示したデータをさらに支持するものとして、いくつかのＨＩＶ−１感染性
実験を、Ｖ３ループにＧＰＧ−共通配列が欠損しているＨＩＶ−１突然変異体に
対して実施した。以下に詳細に説明するこれらの実験によって、ＧＰＧ−ＮＨ₂
媒介ＨＩＶ−１感染がＶ３ループに依存しない様式で生じることを確立した。Ｈ
ＩＶ−１ｅｎｖ糖タンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループは、ループの先端に保存Ｇ
ＰＧ配列を含むもので、ウィルス複製に関与すると思われる。Ｖ３ループ相互作
用をかき乱すことでＧＰＧ−ＮＨ₂がＨＩＶ−１感染を阻害するかどうかを判断
するために、Ｖ３ループＨＩＶ−１突然変異体プロウイルスを構築した。ＧＰＧ
ドメインを欠損したこの突然変異体プロウィルスを、感染性アッセイにおいて細
胞に感染する能力について試験し、また免疫細胞化学および電子顕微鏡検査によ
って分析した。以下の実施例は突然変異体プロウィルスの構成、ＨＩＶ−１感染
性のアッセイ、免疫細胞化学および電子顕微鏡検査による突然変異体ウィルス粒
子の構造の決定、さらにＧＰＧ−ＮＨ₂が突然変異体ウィルス粒子による感染を
阻害することの発見について説明する。

【００９０】 実施例３ 感染性クローンｐＢＲｕ−２に基づいたＧＰＧ欠損プロウィルスは、分子生物
学上の従来の方法を用いて構築した。サブクローニング、突然変異誘発、および
プラスミドＤＮＡの増幅のために、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α株およ
びＮＭ５２２ｍｕｔＳ株を用いた。ｐｕｃ１８プラスミドをサブクローニングの
ベクターとして用い、また完全長のＨＩＶ−１／Ｂｒｕ（ＬＡＶ、ＬＡＩとも呼
ぶ）の複製コンピテントクローンを含むＨＩＶ−１プロウィルスクローンｐＢｒ
ｕ−２を突然変異体ウィルス生成のために用いた。

【００９１】 ｐＢＲｕ−２由来のｅｎｖ遺伝子をコードする２．７ｋｂＳａｌＩ−ｔｏ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントをｐｕｃ１８ベクタのＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位にサ
ブクローンニングした。ＧＰＧ欠失は、Ｕ．Ｓ．Ｅ．突然変異誘発キット（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）を用いた部位特異的突然変異誘発によって達成した。２つのオ
リゴヌクレオチドを必要とした。変異原性オリゴヌクレオチドは、５’リン酸化
ＣＧＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＴＴＴ ＧＴＴ ＡＣＡ
ＡＴＡ ＧＧ−３’（Scandinavian Gene Synthesis AB, Stockholm, Swedenか
ら入手）である。選択的オリゴヌクレオチドは、５’リン酸化 ＧＴＧ ＣＣＡ
ＣＣＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＡＴ−３’独自の制限部
位、すなわちｐｕｃ１８ベクターのＡｓｔＩＩを取り除くように設計された。し
たがって、野生型ＤＮＡは、対応するエンドヌクレアーゼＡａｔＩＩによって消
化することで、野生型および突然変異ＤＮＡの混合プールから選択的に排除され
た。突然変異誘発反応生成物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換してプラスミドＤＮＡを
増幅させた。突然変異体は、自動レーザ蛍光ＡＬＦ（登録商標）ＤＮＡシーケン
サー（Pharmacia）を用いてＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）シーケンシ
ングによって確認した。ＧＰＧをコードするオリゴヌクレオチドから切り出され
たＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＢＲｕ−２にクローニングして、プロ
ウィルスプラスミドを生成した。いくつかの細菌コロニーから得た突然変異体Ｄ
ＮＡをＱＩＡＧＥＮプラスミド・キットを用いて増幅および精製した。それらの
うちの２つ、すなわちｍｐ８およびｍｐ１０ＤＮＡを細胞に組み込んだ。

【００９２】 ＤＥＡＥデキストラン法（Palker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
1932-1936 (1988)）を用いて、野生型ＤＮＡおよび突然変異体ＤＮＡ（ｍｐ８お
よびｍｐ１０）をＨｅｌａ、ＨＵＴ₇₈、またはＭＴ−２細胞に組み込んだ。簡単
に言えば、トランスフェクション前２４時間に１０⁶細胞を調製した。次に、培
地を取り除き、事前に温めておいたリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で細胞を１回
洗浄し、さらにＴＢＳ−Ｄ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水−０．１％デキストラン）で１
回洗浄した。約０．５μｇのＤＮＡをＴＢＳ−Ｄ／ＤＥＡＥ−デキストランと混
合し、それを細胞に加えた後、３０分間、３７℃でインキュベートした。次に、
溶液を除去し、細胞をＴＢＳ−Ｄで１回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。
１０％血清および５μｇのクロロキン二リン酸塩を添加し、かつ事前に温めた培
地５ｍｌに細胞を混ぜ、３７℃で１時間インキュベートした後、血清を含まない
培地で３回洗浄した。最後に、細胞を１０ｍｌの培地で維持し、３７℃で４日間
インキュベートした。

【００９３】 ウィルス含有上清を回収し、０．４５μｇ孔径フィルタで濾過し、いっさいの
細胞を取り除き、分取して−７０℃でウィルスストックとして保存した。ウィル
スの力価測定は、ウィルスを連続希釈してＭＴ−２細胞に感染させることで行っ
た。ウィルス上清の５倍連続希釈のそれぞれから１００μｌを取り、それを２０
０，０００ＭＴ２細胞の接種材料とした。１６時間にわたる吸着の後に、細胞を
５回洗浄し、２４ウェルプレート（Costar Corporation）に入った１．５ｍｌ培
地に再懸濁した。感染後４、７、および１１日目に培地を取り替え、上清に含ま
れるｐ２４生成物を１４日目に試験した。５０％組織培養感染量（ＴＡＣＩＤ₅₀ ）終了点をリードおよびムエンチ（Read and Muench）の式に基づいて計算した
（Reed and Muench, Am. J. Hygiene 27: 493-497 (1938)）。

【００９４】 ＣＤ４＋Ｔ細胞株ＭＴ−２、Ｃ９１−ＰＬ、Ｃ８１６６、ＣＥＭ、ＨＵＴ₇₈、Ｈ
９、Ｊｕｒｋａｔ、およびＭｏｌｔ−３、単球様細胞株Ｕ９３７およびＴＨＰ−
１を、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ胎仔血清（GIBCO）、ペニシリン（１
００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したＲＰ
ＭＩ １６４０培地（GIBCO）中で増殖および維持した。Ｈｅｌａ細胞を、２％
ＦＢＳ、０．８％デキストロース、および抗生物質を添加したハンクス塩溶液を
含む培地１９９で増殖させた。

【００９５】 末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール−ヒパーク（Ficoll-Hypaque）密度勾
配遠心によって精製し、感染前に、フィトヘマグルチニン（KEBO Lab）で３日間
、上記の添加物が加えられたＲＰＭＩ １６４０培地中で刺激した。樹状細胞（
ＤＣ）を血液単球から生成し、Rormani et al., J. Exp. Med. 180:83-93 (1994
)に記載されたようにして、プラスチックに粘着させることで、単核分画から精
製した。簡単に言えば、血液単核球を上記のようにして精製し、接着は２時間に
わたってＲＰＭＩ培地中で組織培養フラスコ上で行い、次に接着しなかった細胞
をＰＢＳで洗い流した。接着細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ（２５Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ
−４（４．５Ｕ／ｍｌ）を含む培地中で７日間培養し、さらにウィルスを感染さ
せた。

【００９６】 感染は、細胞株ＭＴ−２、Ｃ９１−ＰＬ、Ｃ８１６６、ＣＥＭ、ＨＵＴ₇₈、Ｈ
９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ−３、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＰＢＭＣ、および樹
状細胞（ＤＣ）で行った。ＣＤ４＋細胞株に関しては、１００ＴＣＩＤ₅₀で１６
時間、野生型または突然変異体ウイルスと３７℃で２００，０００細胞をインキ
ュベートし、次に５回洗浄し、１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびポリブレン（Si
gma、２μｇ／ｍｌ）を添加した１．５ｍｌの新鮮ＲＰＭＩ媒体に再懸濁し、さ
らに湿気を持った５％ＣＯ₂、３７℃の条件下で２４ウェルプレートでインキュ
ベートした。ＰＢＭＣに関しては、５００，０００細胞を用い、プロロイキン（
Eurocetus、１５０Ｕ／ｍｌ）、ヒドロコーティゾン（Sigma、５μｇ／ｍｌ）、
およびポリブレン（Sigma、２μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ培地で培養した
。ＤＣに関しては、Grannelli-Piperno et al, J. Exp. Med. 184:2433-2438 (1
996)に記載されているように、８００，０００細胞をウィルスに対して１、１６
、および４８時間、それぞれさらし、その後にＰＢＳで３回洗浄し、さらに３７
℃、５分間、０．０５％トリプシンで穏やかに処理していっさいの表面結合ウィ
ルスを取り除く。対照群として、ＰＢＭＣを同様の方法でｍｐ８にさらした。細
胞を洗浄し、回収し、溶解させ、フェノール／クロロホルム抽出でＤＮＡを単離
し、続いて半定量的なＰＣＲ検出ＬＴＲシーケンスを実行した。１０倍の連続希
釈をＤＮＡに対して行い、すでに説明したような３つのプライマーが「入れ子」
となった構成を用いて、ＬＴＲ ＰＣＲを４０サイクル実行した（Hwang et al.
, Science 253: 71-74 (1991)）。ＤＣ−ＰＢＭＣ同時培養およびＤＣ−ＭＴ−
２同時培養実験に関しては、２５０，０００ＤＣを１６時間にわたってウィルス
にさらし、その後、ｐ２４が検出されなくなる（５ｐｇ／ｍｌ未満）まで５回洗
浄を行った。次に、細胞を０．０５％のトリプシンで穏やかに処理し、ＣＤ４上
のＨＩＶ−１結合エピトープを破壊し、いっさいの表面結合ウィルスを除去した
。洗浄後、細胞を２００，０００ＰＢＭＣ細胞または１００，０００ＭＴ−２細
胞が混合されたＲＰＭＩ培地に再懸濁した。

【００９７】 感染実験のために、感染後４、７、１１、１４、および１７日目に培地を変え
、ＨＩＶ−１ ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（Abbott Laboratories, North Chicago
, USA）を用いてｐ２４濃度によってウィルスの増殖を判断した。ｐ２４アッセ
イのＥＬＩＳＡ定量を用いて各ウィルス試料中のｐ２４濃度を定量したところ、
このアッセイはｐ２４の線形用量応答範囲が２０ｐｇから６４０ｐｇ／ｍｌを有
した。全てのウィルス試料を多重希釈によってアッセイし、ｐ２４の量を回帰直
線を用いて決定した。感染後１７日間培養した細胞からＤＮＡを単離し、Ｖ３領
域の直接シーケンシングをこれらのＤＮＡに対して行うことで突然変異を確認し
た。

【００９８】 すでにKowalski et al., Science 237:1351-1355 (1987)に記載されているよ
うなＡＰＡＡＰ（アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ免疫複合体
）サンドイッチ法によって、感染および未感染のＭＴ−２細胞に対する免疫細胞
化学も実行した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１５分間にわたってアセトン処理
することで細胞をスライド上に固定した。次に、細胞を、一連のマウス抗ＨＩＶ
−１ｐ２４一次抗体、ウサギ抗マウス免疫グロブリン二次抗体、およびマウスＡ
ＰＡＡＰモノクローン抗体（ＤＡＫＯ）に対して、それぞれ３７℃、３０分間、
加湿チャンバ内でインキュベートし、その後、ＰＢＳで５分間洗浄した。色素産
生基質を添加し、室温で２０分間にわたってインキュベートし、スライドをＨ₂
Ｏで洗浄し、グリセロールの中に置いて顕微鏡観察（倍率ｘ１００）を行った。
ウシ腸アルカリホスファターゼおよびウシ腸アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡ
Ｐ、希釈１：２０）に対するモノクローン抗体（Ｍａｂｓ）マウス抗ＨＩＶ−１
ｐ２４（ＤＡＫＯ、希釈１：２０）、ウサギ抗マウス免疫グロブリン（希釈１：
２５）、およびＭａｂのマウス免疫複合体を用いて免疫細胞化学アッセイを行っ
た。

【００９９】 さらに、電子顕微鏡検査を感染細胞に対して実施した。新鮮な感染細胞を７日
目に２．５％グルタルアルデヒドで固定し、１％ＯＳＯ４で後固定した。細胞を
脱水し、エポキシ樹脂に包埋し、さらに１％酢酸ウラニルで染色した。ウィルス
に感染した細胞のエポン（Epon）切片を６０〜８０ｎｍの厚さに作った。画像品
質を改善するために分光器を備え付けたツァイス（Zeiss）ＣＥＭ９０２を用い
て加速電圧８０ｋＶで、試料の分析を行った。また液体窒素冷却トラップを用い
てビームによる損傷を少なくした。

【０１００】 別の群の実験では、Ｖ３ループ阻害以外の機構によってＧＰＧ−ＮＨ₂がＨＩ
Ｖ−１感染を阻害するさらなる証拠が得られた。したがって、ＭＴ−２細胞にお
ける野生型およびＶ３−ループ欠失突然変異体（ＧＰＧドメイン）の感染性を阻
害するＧＰＧ−ＮＨ₂の能力が決定される。これらの実験では、ＧＰＧ−ＮＨ₂の
阻害効果を試験するために、２５ ＴＣＩＤ₅₀でＨＩＶ−１_Bru野生型およびＧ
ＰＧ欠失突然変異体ｍｐ８およびｍｐ１０を約２００，０００ＭＴ−２細胞に感
染させた。濃度が２０μＭおよび１００μＭのＧＰＧ−ＮＨ₂存在下または非存
在下で１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）、ペ
ニシリン（１００μ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μ／ｍｌ）、および
ポリブレン（シグマ２μｇ／ｍｌ）とを添加した１ｍｌのＲＰＭＴ １６４０培
地にＭＴ−２細胞を再懸濁した。その後、ウイルスを２５ ＴＣＩＤ₅₀で２０〜
３０μｌ量で添加した。細胞を３７℃で１６時間にわたってウィルスとともにイ
ンキュベートし、その後、１７０ｘｇで７分間遠心することで緩やかにペレット
化させた。次に、室温で、上記のように１７０ｘｇ、７分間の細胞遠心沈降によ
って、ペプチド無しのＲＰＭＩ培地で細胞を３回洗浄した。最後の洗浄を行った
後、２４ウェルプレート（Costar corporation）内のＲＰＭＩ培地に細胞を再懸
濁し、加湿５％ＣＯ₂中、３７℃に保った。培地を感染後４、６、１１、および
１４日目に交換する時に、培養液上清を回収した。ウィルスの複製をモニタする
ために、７日目および１４日目の上清に含まれるＨＩＶ−１ ｐ２４抗原タンパ
ク質をｐ２４の線形用量応答範囲が２０ｐｇから６４０ｐｇ／ｍｌであるＥＬＩ
ＳＡキット（Abbott Laboratories）によってアッセイし、ｐ２４量を回帰直線
によって決定し得る。

【０１０１】 この実施例で記載した実験から得られた結果は、以下に詳細に説明するが、Ｇ
ＰＧ−ＮＨ₂がＶ３ループに依存しない方法でＨＩＶ−１感染を阻害することを
証明する。

【０１０２】 Ｖ３ループに依存しない方法での小ペプチドによるＨＩＶ−１感染の阻害

【０１０３】 Ｖ３ループでのＧＰＧ欠失がウィルスの産生に影響を及ぼすかどうかを判断す
るために、プロウィルスプラスミドＤＮＡ（野生型および突然変異体の両方）を
ＣＤ４陰性細胞株Ｈｅｒａ、ならびに、ＣＤ４陽性細胞株ＭＴ−２およびＨＵＴ ₇₈ にトランスフェクトした。培養液上清を毎日採取し、ウィルス産生をｐ２４濃
度測定によってモニタした。６日間の時間枠内で、類似の増殖パターンが野生型
ウィルス（ＷＴ）とＨｅｌａトランスフェクションからの突然変異体とで観察さ
れた。ｐ２４濃度は４日目まで増加し続け、その後プラトーに達した。したがっ
て、突然変異体および野生型のプロウィルスＤＮＡはそれらの細胞で等しく十分
に発現した。類似の結果は、ＨＵＴ₇₈トランスフェクタントから得られ、またこ
れらのトランスフェクトされたＨＵＴ₇₈細胞にシンシチウム（syncytia）が観察
された。しかし、ＭＴ−２トランスフェクションによるｐ２４産生のパターンは
、ＨｅｌａおよびＨＵＴ７８細胞で観察されるものと著しく異なっていた。ｐ２
４産生レベルは、４日をすぎても増加し続けたが、突然変異体ウィルス／プロウ
ィルスＤＮＡによってトランスフェクトされた細胞のｐ２４産生は野生型ウィル
ス・プロウィルスＤＮＡによってトランスフェクトされたものよりも低かった。
トランスフェクション後６日目で、野生型が１，３８０ｎｇ／ｍｌのｐ２４を産
生したが、ｍｐ８およびｍｐ１０のｐ２４産生はそれぞれ１５．８ｎｇ／ｍｌお
よび１３．７ｎｇ／ｍｌであった。これらの結果は、ＧＰＧ欠失突然変異体の子
孫ウィルスが産生され、非トランスフェクションＣＤ４＋ＭＴ−２細胞に感染す
ることができたにもかかわらず、あきらかに野生株の子孫よりも効率的ではない
ことを示している。これらのトランスフェクトされた細胞由来のＤＮＡの塩基配
列を決定し、ＧＰＧ欠失をｍｐ８およびｍｐ１０の子孫の双方について確認した
。

【０１０４】 次に、感染を確立することが可能なウィルス粒子を生成する突然変異体分子ク
ローンの能力について、さらに分析を行った。Ｈｅｌａ細胞およびＭＴ−２細胞
をプロウィルスＤＮＡによってトランスフェクトし、前記トランスフェクション
後４日目に培養液上清を回収し、濾過し、ｐ２４レベルについてアッセイを行い
、分取量を−７０℃で凍らせてウィルスストックとした。ウィルスの力価測定（
ＴＣＩＤ₅₀）をＭＴ−２細胞で行った。ｐ２４が等量含まれるように調製したＭ
Ｔ−２トランスフェクタントからの上清は、野生型ウィルスでは８３，３００Ｔ
ＣＩＤ₅₀／ｍｌ産生し、一方突然変異体ｍｐ８およびｍｐ１０はそれぞれ１６，
７００ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌおよび２５，０００ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ産生し、野生型で
得られたものよりも約５倍少なかった。Ｈｅｌａトランスファクタント上清の低
ｐ２４産生にしたがって、前記上清が生ずる力価もまた非常に低く、野生型およ
び突然変異体でそれぞれ７０ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌおよび１０ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌであ
った。したがって、突然変異体ウィルスが感染性を依然として持っていても、Ｖ
３におけるＧＰＧモチーフの欠失によってそれらの細胞でのウィルス病原性が減
少するかもしれない。このことは、ＭＴ−２細胞の感染によってさらに試験され
、子孫ウィルスの産生についてモニタされた。ＨｅｌａおよびＭＴ−２トランス
フェクションの両方からのウィルス・ストックを次に使用して、ＭＴ−２細胞に
感染させた（ＭＴ−２トランスフェクタント上清から１００ＴＣＩＤ₅₀野生型ま
たは突然変異体ウィルス、またはＨｅｌａトランスフェクタントストックから５
ＴＣＩＤ₅₀のウィルス）。細胞をウィルスとともに１６時間インキュベートし、
続いて洗浄した。その後、細胞を再懸濁し、３７℃でインキュベートした。ウィ
ルス複製をｐ２４レベルの測定および細胞変性効果によってモニタした。ＭＴ−
２トランスフェクタント由来のウィルス、野生型（ＷＴ）、同様に、突然変異体
ウィルス（ｍｐ８およびｍｐ１０）によって、すべてがｐ２４産生によってウィ
ルス複製を示した。野生型は感染後１１日目でｐ２４のピーク濃度が２，１５０
ｎｇ／ｍｌに達し、一方突然変異体は約４日遅れてピーク濃度を表し、感染後１
４日目でｍｐ８およびｍｐ１０はそれぞれ１，５８０ｎｇ／ｍｌおよび１，７６
０ｎｇ／ｍｌのｐ２４ピーク値を示した。Ｈｅｌａトランスフェクタント由来の
ウィルスによるＭＴ−２細胞の感染（５ＴＣＩＤ₅₀で）もまた、ＭＴ−２細胞産
生ウィルスで得られたものと類似の増殖反応速度でＷＴおよび突然変異体の両方
でｐ２４産生が生じた。ＤＮＡを全ての感染細胞から単離し、Ｖ３シーケンシン
グによって突然変異体を確認したところ、突然変異体ウィルスの増殖が野生型配
列の逆転または獲得によるものではないことが示された。

【０１０５】 シンシチウム形成（syncytium formation）もまた、ＷＴおよび突然変異体の
両方が感染したＭＴ−２細胞で観察された。細胞培養を感染後７日目で固定し、
ＡＰＡＡＰサンドイッチ法を用いる免疫細胞化学で使用した。感染細胞を免疫染
色して赤色に染めた。シンシチウムはＷＴおよび突然変異体ウィルス感染ＭＴ−
２細胞の両方で観察されたが、ＷＴ（感染後４日目に誘導）は突然変異体（感染
後６日目に誘導）よりも早くシンシチウムを誘導した。電子顕微鏡検法（ＥＭ）
は、突然変異体ウィルス感染ＭＴ−２細胞がＨＩＶ−１粒子を産生することをさ
らに明らかにした。特徴的な円錐形状のコアを有するＨＩＶ−１粒子が見られた
。これらのデータによって、ＧＰＧ欠失突然変異体がＭＴ−２細胞において感染
性を残していることが確認された。

【０１０６】 Ｖ３ループ相互作用とは異なる機構によるウィルス感染をＧＰＧ−ＮＨ２が阻
害する決定的な証拠は、ＭＴ−２細胞での野生型およびＶ３ループ欠失突然変異
体（ＧＰＧドメイン）の感染性を阻害するＧＰＧ−ＮＨ₂の能力を評価する実験
を実行した時に得られた。感染後７日目および１４日で、野生型および突然変異
体ウィルス感染の著しい減少が見られた。表１０を参照されたい。２０μＭおよ
び１００μＭで、ＧＰＧ−ＮＨ₂が野生型感染およびＧＰＧ欠失構成体ｍｐ８お
よびｍｐ１０によって媒介された感染を効果的に減少させた。実際、野生型、ｍ
ｐ８、およびｍｐ１０について、感染後７日目および１００μＭのＧＰＧ−ＮＨ
２で、ウィルス感染性が等しく完全に減少することが観測された。これらの結果
は、ＧＰＧ−ＮＨ₂がＶ３ループのＧＰＧドメインとの相互作用とは別の機構に
よってＨＩＶ−１感染を阻害していることを示している。

【０１０７】

【表１０】

【０１０８】 ここに示したデータは、修飾カルボキシル末端を持つ小ペプチドがウィルス感
染（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ感染）を阻害し、ｐ２４に
結合し、そして適当なカプシド集合を妨害することを示している。上記した多く
のアッセイは、任意の小ペプチド、修飾小ペプチド、オリゴペプチド、またはペ
プチド疑似体の能力を同定して、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染を防止または阻害する
ことに使用可能である。同様の技術を、他のウィルス感染の防止または阻害に対
して任意の小ペプチド、修飾小ペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド疑似
体の能力を同定するために使用することもできる。

【０１０９】 いくつかのウイルスカプシドタンパク質の配列が公知であることから、異なる
ウイルスカプシドの適当な集合を防ぐアミド型の小ペプチドのデザイン、製造、
および同定は簡単である。例えば、いくつかのウイルスカプシドタンパク質は、
主相同領域（ＭＨＲ）と呼ばれる、長さが２０アミノ酸の相同領域を有しており
、これは多くの腫瘍ウィルスおよびレンチウィルスのカルボキシル末端ドメイン
内に存在する（図５参照）。図５は、ＨＩＶ−１のカルボキシル末端ドメイン（
１４６〜２３１残基）を示し、この配列を、他のウィルス（そのうちのいくつか
は、鳥、マウス、およびサルに感染する）のカプシドタンパク質配列と比較して
いる。注目すべきことは、それらのウイルスカプシドタンパク質の配列と顕著な
相同性が見いだされることである。発明者らは、ＨＩＶ−１におけるカプシドの
二量体化およびウィルス集合にとってカルボキシル末端ドメインが必要であるこ
とを観察した（Gamble et al., Science 278: 849 (1997)、本明細書で全体的に
引用する）。この開示で説明したアッセイにおいて抗ウィルス活性を示した小ペ
プチドがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩＶのカルボキシル末端ドメインの
領域と完全または部分的に一致する一方で、ウィルスのＮ−末端ドメインの領域
がカプシド集合にとって重要であり、またウイルスカプシドタンパク質のＮ末端
領域のアミノ酸と完全または部分的に一致する小ペプチドのデザインおよび合成
は本発明の好ましい実施形態である。しかし、ＭＨＲ領域およびウイルスカプシ
ドタンパク質のカルボキシル末端ドメイン内のアミノ酸配列に完全または部分的
に一致する小ペプチドの使用は、本発明の好ましい実施形態である。

【０１１０】 本発明は、３種類の異なるウィルスのカプシドタンパク質配列に完全または部
分的に一致するアミド型のいくつかの新規の小ペプチドが、これらのウイルスに
よる感染を効果的に阻害および／または防止することを示した。ここで用いた戦
略は、他のウィルスのカプシドタンパク質配列に完全または部分的に一致するア
ミド型の別の小ペプチドの産生に用いることができる。図５に開示した配列の領
域に対応する小ペプチド、オリゴペプチド、および／またはペプチド疑似体をデ
ザインおよび製造することで、当業者に容易に理解されるように、例えば、ＨＩ
Ｖ、ＳＩＶ、ＲＳＶ、ＨＴＬＶ−１、ＭＭＴＶ、ＭＰＭＶ、およびＭＭＬＶ感染
を阻害する新規の分子を、上記したスクリーニング方法またはそれらのアッセイ
の変形例を用いることで素早く同定し得る。さらに、他のウイルスカプシドタン
パク質の多くの配列、例えばアレナウィルス、ロタウィルス、オルビウィルス、
レトロウィルス、パピローマウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、パ
ラミクソウイルス、ミクソウイルス、およびヘパドナウイルス科のウイルス等が
知られている。それらの配列に完全または部分的に一致するいくつかの小ペプチ
ド、オリゴペプチド、および／またはペプチド疑似体を、ここで説明したウィル
ス感染性アッセイおよび／または電子顕微鏡検査法を用いて、または本発明の開
示によって当業者が容易に想到できるそれらのアッセイの変形例によって、ウィ
ルス感染を効果的に阻害および／または防止するものを同定するために、選択ま
たは素早くスクリーニングし得る。

【０１１１】 好ましい実施形態は、カプシド集合を妨害し、ウィルス感染を阻害するために
使われる修飾カルボキシ末端を有する小ペプチド（アミノ酸１個以上、かつアミ
ノ酸１０個以下の長さ）を含む。好ましくは、ＨＩＶまたはＳＩＶカプシドで見
いだされる配列を有するジペプチド、トリペプチド、およびオリゴペプチド、さ
らに対応のペプチド疑似体を用いる。例えば、本発明のオリゴペプチドは、４個
のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個、または
９個または１０個のアミノ酸を有するものであってもよく、本発明のペプチド疑
似体は４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸に類似した構造を有す
るものであってもよい。これらのオリゴペプチドは、望ましくはトリペプチドＧ
ＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂
、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−Ｎ
Ｈ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂で見いだされる完全または部分的配列も含む。ジペプ
チド、トリペプチド、およびオリゴペプチドに類似したペプチド疑似体も、好ま
しくは、ＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱ
Ｇ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、
ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂で見いだされる配列に一致する。好ましく
は、小ペプチドは、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）よりもむしろカルボキシ末端（
ＣＯ−ＮＨ₂）に修飾基（例えば、アミド基）を有する。他の修飾基をカルボキ
シル末端に有する小ペプチドも使用し得るが、望ましくは、結合修飾基はアミド
基と同一電荷を持ち、かつ立体的に同じ振る舞いをする（カルボキシル末端に異
なる置換基を有するペプチドを比較するアッセイに関するＶａｈｌｎｅ他の米国
特許第５，６２７，０３５号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、小ペ
プチドの組み込みの改善、またはエキソプロテアーゼ消化の防止、またはその両
方のために、アセチルまたはメチル基を小ペプチドのいずれかの末端に付加する
ことが望ましい。

【０１１２】 以下の開示では、ジペプチド、トリペプチド、アミノ酸が１０個以下のオリゴ
ペプチド、およびトリペプチド、ならびにアミノ酸が１０個以下のオリゴペプチ
ドに類似したペプチド疑似体（総称して「ペプチド剤」と呼ぶ）を含む生物工学
的ツールおよび薬学的組成物を作成するために、いくつかのアプローチが提供さ
れる。ここで注目すべき点は、「ペプチド剤」という用語には、ジペプチド、ト
リペプチド、およびアミノ酸が１０個以下のオリゴペプチドが含まれるというこ
とである。「ペプチド剤」は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、また
は１０個のアミノ酸からなるペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、また
は１０個のアミノ酸からなるペプチドに類似したペプチド疑似体である。さらに
、「ペプチド剤」は、以下に説明するように、多量体または多量体化薬剤として
提供される２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸からなる
ペプチド、あるいは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸
からなるペプチドに類似したペプチド疑似体である。

【０１１３】 予防薬または治療薬として望まれる生物工学的ツールあるいはコンポーネント
は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ等のウィルスに対して十分な親和性
または阻害が得られる形態または方法で、ペプチド剤を提供する。天然の単量体
ペプチド剤（例えば、各々がたった一つの結合エピトープを持つペプチド剤の個
々のユニットとして現れる）が、ｐ２４等のキャプソマータンパク質に結合し、
かつ／またはカプシド集合に干渉し、かつ／またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ま
たはＳＩＶ感染等のウィルス感染を防ぐのに十分である一方で、合成リガンドま
たは多重結合リガンド（例えば、いくつかの結合エピトープを持つペプチド剤の
複数のユニットとして現れる）は、ｐ２４等のキャプソマータンパク質に結合し
、かつ／またはカプシド集合に干渉し、かつ／またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、
またはＳＩＶ感染等のウィルス感染を防ぐ能力が著しく高い場合がある。ここで
注目すべき点は、「多重結合的（multimeric）」という用語は複数のユニットか
らなるリガンドが存在することを意味し、例えばトリペプチド、オリゴペプチド
、またはペプトド疑似体のいくつかの個々の分子であり、単一の個々のユニット
として結合した複数のリガンドの存在、例えば一列に結合したいくつかのトリペ
プチド、オリゴペプチド、またはペプチド疑似体分子等を意味する「多量体化（
multimerized）」という用語は区別されることである。

【０１１４】 多重結合支持体および多量体リガンドの調製

【０１１５】 ｐ２４等のキャプソマータンパク質への結合、および／またはカプシド集合へ
の干渉、および／またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩＶ感染等の阻害を
行う多重結合剤（合成または天然）は、トリペプチド、オリゴペプチド、または
ペプチド疑似体を高分子支持体に結合させて得られ得る。ここで用いられる「支
持体」という用語は、ペプチド剤を結合、固定、または安定化する担体、樹脂、
または任意の高分子構造を含む。固相支持体として、反応トレイのウェルの壁部
、試験管、ポリスチレン・ビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテ
ックス粒子等の微粒子、ヒツジ（または他の動物）赤血球細胞、人工細胞等が挙
げられるが、これらに限定されない。また、支持体という用語には、前記用語が
薬剤の調製のためのものであると理解されることから、担体も含まれる。

【０１１６】 高分子支持体は、疎水性非共有相互作用によってペプチド剤の一部分と相互作
用する疎水性の表面を有するものであってもよい。支持体の疎水性面は、プラス
チック等のポリマー、または疎水基が結合しているポリスチレン、ポリエチレン
、またはポリビニル等の他の任意のポリマーであってもよい。あるいは、ペプチ
ド剤は、タンパク質およびオリゴ／ポリサッカリド（例えば、セルロース、澱粉
、グリコーゲン、キトサン、アミノ化セファロース）を含む担体に共有結合した
ものであり得る。これらの後の実施形態では、共有結合を作るように担体上の反
応基との結合にペプチド剤上の反応基、例えば水酸基またはアミノ基を使用して
もよい。支持体は、ペプチド剤と相互作用する帯電した表面を有するものであっ
てもよい。また、支持体はペプチド剤を結合させるように、化学的に活性化され
る他の反応基を有するものであってもよい。例えば、臭化シアン活性化マトリッ
クス、エポキシ活性化マトリックス、チオおよびチオプロピルゲル、ニトロフェ
ニルクロロホルメート、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドクロロホルメート
リンケージ、およびオキシランアクリル支持体が当業者にとって一般的である。

【０１１７】 支持体は、ペプチド剤が、水酸基、カルボキシ基、またはアミノ基、および担
体上の反応基を介して共有結合する、酸化珪素材料（例えば、シリカゲル、ゼオ
ライト、珪藻土、またはアミノ化ガラス）等の無機担体を含むものであってもよ
い。さらに、いくつかの実施形態では、リポソームまたは脂質二重層（天然また
は合成）が支持体として考慮され、ペプチド剤はリポソームエンジニアリングの
技術によって膜表面に結合されるか、または前記膜に取り込まれる。一つのアプ
ローチによれば、リポソーム多重結合支持体は、二重層の表面に露出したペプチ
ド剤と、ペプチド剤を脂質二重層につなぎとめる第２のドメインとを有する。ア
ンカー(anchor)は、周知の膜貫通ドメインに類似した疎水性のアミノ酸残基から
構成されるものであってもよく、あるいは従来の技術によって第１のドメインに
結合するセラミドを含むものであってもよい。

【０１１８】 体内（例えば、予防または治療の用途で）で使用するための支持体または担体
は、生理学的に非毒性であることが望まれ、好ましくは免疫的に非反応性である
。体内での使用のために考えられる担体として、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ，
Ｌ−アラニン、リポソーム、およびクロモソルブ（Chromosorb）（商標）（John
s-Manville Products, Denver Co.）が挙げられる。リガンド共役クロモソルブ
（商標）（Synsorb-Pk）は、溶血性尿毒性症候群の予防のためにヒトで試験され
、副作用がないことが報告されている（Armstrong et al. J. Infectious Disea
ses, １７１:１０４２-１０４５ (１９９５)）。いくつかの実施形態のために、
本発明の発明者は、被験者の体内にペプチド剤が結合する能力を有する「むき出
しの（naked）」担体（すなわち、結合ペプチド剤が欠けている）の投与を検討
する。このアプローチによって、むき出しの担体がペプチド剤とは別に投与され
、ひとたび両方が被験者の体内に入ると、担体とペプチド剤とが集合して多重結
合複合体となる「プロドラッグタイプ(prodrug-type)」の治療が想定される。

【０１１９】 適当な長さのλリンカー等のリンカーをペプチド剤と支持体との間に挿入する
ことで、ペプチド剤の融通性をより大きくし、それによって支持体によって生ず
る可能性のある任意の立体障害を克服することも考えられる。ｐ２４等のキャプ
ソマータンパク質に最適に結合し、かつ／またはカプシド集合に干渉し、かつ／
またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩＶ感染等のウィルス感染を阻害する
ことを可能とする適当な長さのリンカーは、本開示で詳細に述べられたアッセイ
においてリンカーを変えることでペプチド剤をスクリーニングすることによって
、決定し得る。

【０１２０】 複数の種類のペプチド剤を含む複合支持体もまた、一つの実施形態である。「
複合支持体」とは、ｐ２４等のキャプソマータンパク質に結合し、かつ／または
カプシド集合に干渉し、かつ／またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩＶ感
染等のウィルス感染を阻害する２つまたはそれ以上の異なるペプチド剤に結合ま
たは前記ペプチド剤を固定するために使用される担体、樹脂、または任意の高分
子構造であってもよい。いくつの実施形態では、リポソームまたは脂質二重層（
天然または合成）が複合支持体の構築に使用することが考えられ、ペプチド剤は
リポソーム・エンジニアリングの技術によって膜表面または前記膜に取り込まれ
る。

【０１２１】 上記のように、適当な長さのλリンカー等のリンカーをペプチド剤と支持体と
の間に挿入することで、分子内の融通性をより大きくし、それによって任意の立
体障害を克服することも考えられる。ｐ２４等のキャプソマータンパク質に結合
し、かつ／またはカプシド集合に干渉し、かつ／またはＨＩＶまたはＳＩＶ感染
等のウィルス感染を阻害することを可能とする適当な長さのリンカーは、本開示
で詳細に述べられたアッセイにおいてリンカーを変えることでペプチド剤をスク
リーニングすることによって、決定し得る。

【０１２２】 本発明の別の実施形態では、「多量体化−多重結合支持体」および「多量体化
−複合支持体」をそれぞれ生成するように、上記した多重結合および複合支持体
が多量体化リガンドに結合したものであってもよい。多量体化リガンドは、例え
ば、従来の分子生物学上の技術を用いて２つまたはそれ以上のペプチド剤を一列
に並べて結合させることによって得ることができる。リガンドの多量体化の形態
は、ｐ２４等のキャプソマータンパク質に結合し、かつ／またはカプシド集合に
干渉し、かつ／またはＨＩＶまたはＳＩＶ感染等のウィルス感染を阻害する能力
がより良くなった薬剤を得ることが可能となるため、多くの用途で有利であり得
る。さらに、リンカーまたはスペーサ、例えばフレキシブルλリンカーを、多量
体化薬剤を構築する個々のドメイン間に取り込むことは、有利な実施形態である
。適当な長さのλリンカーを、例えばタンパク質結合ドメイン間に挿入すること
は、分子内の融通性をより大きくし、それによって立体障害の克服を可能とする
。同様に、リンカーを多量体化リガンドと支持体との間に挿入することで、融通
性をより大きくし、支持体によって表される立体障害の制限を可能とする。ｐ２
４への最適な結合、かつ／またはカプシド集合への干渉、かつ／またはＨＩＶま
たはＳＩＶ感染の阻害を可能とするリンカーの適当な長さの決定は、本開示で詳
細に述べられたアッセイにおいてリンカーを変えることでリガンドをスクリーニ
ングすることによって、決定し得る。

【０１２３】 好ましい実施形態では、上記した支持体の様々な種類は、トリペプチドＧＰＧ
−ＮＨ₂、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、Ａ
ＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂
、およびＳＰＴ−ＮＨ₂を用いることで生成される。集合的に「支持体結合薬」
と呼ばれる多重結合支持体、複合支持体、多量体化−多重結合支持体、または多
量体化−複合支持体もまた、好ましくは、トリペプチドＧＰＧ−ＮＨ₂、ＧＫＧ
−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、Ｇ
ＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ₂、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−
ＮＨ₂を用いて構成される。

【０１２４】 以下の説明では、治療および／または予防用途を持つ本発明のいくつかの実施
形態が記載されている。

【０１２５】 治療および予防上の用途

【０１２６】 ここに記載した単量および多重結合のペプチド剤は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染
等のウィルス感染を避けるための予防対策として、またはすでにＨＩＶまたはＳ
ＩＶ等のウィルスに感染した被験者を治療するための治療薬として、被験者の治
療に適している。だれもが予防薬としてペプチドによる処置を受けることができ
るが、もっとも適当な被験者は、ウィルス感染の危険にさらされている人たちで
ある。そのような被験者として、同性愛者、売春者、静脈麻薬常習者、血友病患
者、ウィルス感染した母親から生まれた子供、および患者または生物学的試料に
触れた医療従事者が挙げられるが、これらに限定されない。

【０１２７】 本発明の薬学的に活性な化合物は、患者、例えばヒトを含む哺乳動物に対して
投与するための医薬品を生産するために、ガレノス式製剤調製法(galenic pharm
acy)の従来の方法にもとづいて加工し得る。ペプチド剤は、修飾して、または修
飾することなしに、薬学的産物に取り込むことができる。さらに、いくつかの経
路によって小ペプチドをコードする核酸配列またはペプチド剤を運ぶ医薬品また
は治療薬の製造は、実施形態である。例えば、限定するためのものではないが、
カプシド集合を妨害することでウィルスの複製を阻害する小ペプチドをコードす
る配列を持つＤＮＡ、ＲＮＡ、およびウィルスベクターを考えることができる。
所望のペプチド剤をコードする核酸は、単独で、またはペプチド剤と組み合わせ
て投与し得る。

【０１２８】 ここに記載した化合物は、従来の賦形剤、すなわちペプチド剤とは有害な反応
を起こさない非経口投与、経腸（例えば、内服）または局所投与に適した 薬学的に許容される有機または無機の担体物質と混和して用いることができる。
薬学的に許容される適当な担体として、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム
、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトー
ス、アミロースあるいはスターチ等の炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、滑
石、ケイ酸、粘着性のパラフィン、芳香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリ
セリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、
ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。製薬的配合物
は滅菌することができ、もし必要ならば、活性化合物と有害な反応を起こさない
助剤、例えば潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼ
す塩、緩衝液、着色剤、風味剤、および／または芳香性の物質等を混合し得る。
また、ビタミン等、他の所望の活性剤と共に、それらを組み合わせることもでき
る。

【０１２９】 いくつかの実施形態では、ペプチド剤を含む治療薬は、良好なウィルス応答を
達成するように、ＨＩＶ感染等、ウイルス感染を治療する他の治療薬と組み合わ
せて投与される。現時点では、ヒトへのＨＩＶ−１感染に対する抗ウィルス治療
で臨床的に使われる薬物には４種類ある。それらは、（ｉ）ジドビジン、ラミブ
ジン、スタブジン、ジダノシン、アバカビル、およびザルシタビン等のヌクレオ
シド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、（ｉｉ）アデトビルおよびピバキシ
ル等のヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、（ｉｉｉ）エファビレンツ、ネビ
ラピン、およびデラビルジン等の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ
）、および（ｉｖ）インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、
およびアンプレナビル等のプロテアーゼ阻害剤である。ペプチド剤の投与と関連
させて、２、３、または４つの異なる種類の薬物を同時に投与することで、ＨＩ
Ｖが耐性を発達させる可能性が低くなる。なぜなら、異なる種類の薬物およびペ
プチド剤を克服する多重突然変異体が同一のウィルス粒子に生ずる可能性は少な
いからである。

【０１３０】 したがって、当業者に周知の投与量および方法によって、ペプチド剤をヌクレ
オシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌク
レオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて与えるこ
とが本発明の好ましい実施形態である。ペプチド剤と、ヌクレオシド類似体逆転
写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵
素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤とを含む医薬品もまた、本発明の実施形態
である。

【０１３１】 ＧＰＧ−ＮＨ₂と従来の抗ウィルス薬との組み合わせによるＨＩＶ感染の治療
の有効性に関する研究は、以下に提供する実施形態に見いだすことができる。

【０１３２】 実施例４ この実施例では、アミド型の小ペプチドとＡＺＴとの複数の異なる組み合わせ
を試験し、２種類の化合物が補完し合ってＨＩＶ−１複製を阻害するかどうかを
判断することが示されている（図６参照）。したがって、異なる濃度のＧＰＧ−
ＮＨ₂、ＡＺＴ、またはリトナビル（Ｒｉｔｏ^TM）およびそれらの化合物の組み
合わせの存在または非存在下で、２００，０００ＨＵＴ₇₈細胞を２５ ＴＣＩＤ ₅₀ でＨＩＶ−１ ＳＦ−２ウィルスを感染させた。図６に示す数字は阻害化合物
のマイクロモル濃度を表している。細胞は、種々の阻害剤存在下、３７℃、１時
間にわたってウィルスとともにインキュベートし、続いて３回洗浄した。次に、
細胞を、抗ウイルス薬、および／またはペプチドを含有する、１０％（ｖ／ｖ）
加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ ＧＩＢＣＯ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍ
ｌ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびポリブレン（Ｓｉｇｍａ
、２μｇ／ｍｌ）とを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中に再懸濁し、２４ウェ
ルプレート（Costar corporation）において、湿った状態で５％ＣＯ₂にて、３
７℃で培養した。培養液上清を４日毎に回収し、感染後１４日目までに培地を変
えた。ウィルスの複製をモニタするために、上清に含まれるＨＩＶ−１ｐ２４抗
原タンパク質を市販のキット（Abbott）を用いてアッセイした。

【０１３３】 ＧＰＧ−ＮＨ₂は、ＡＺＴ存在下でＨＩＶ−１の複製阻害を相乗的に高めた。
一方、小ペプチドはプロテアーゼ阻害剤であるリトナビルの効果に対して、付加
的な抗ウィルス効果のみを示した。それにもかかわらず、これらの実験は、ヌク
レオシド類似体およびプロチアーゼ阻害剤がウイルスの複製を妨害する方法とは
別の機構によってその小ペプチドがＨＩＶ−１を阻害するという上記のデータを
立証する。さらに、これらの実験は、小ペプチドおよびＡＺＴおよび／またはリ
トナビルを含むＨＩＶ−１感染に対する新規な治療プロトコルが有効であること
を示す。

【０１３４】 以下の開示では、投与量および投与の方法を提供する。

【０１３５】 投与量および投与の方法 特定のペプチド剤製剤の有効量および投与方法は、当業者に周知の他の因子と
同様に、個々の患者および疾患の段階に応じて変動する。そのような化合物の治
療上の有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手
順、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的効果がある投与量）およびＬＤ５０
（集団の５０％が致死する投与量）によって判断し得る。治療的効果に対する毒
性の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比で表すことができる
。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物
実験から得られたデータを用いて、ヒトでの使用のための投与量範囲の定式化が
行われる。そのような化合物の投与量は、好ましくは毒性がほとんどないＥＤ５
０を有する循環濃度の範囲内である。投与量は、用いた投与形態、患者の感受性
、および投与の経路に応じてこの範囲で変化する。

【０１３６】 個々の医師が治療の対象である患者を観察して正確な投与量を選択する。投与
量および投与は、活性部分が十分な量提供されるように、または所望の効果を保
つようにして、調製される。考慮すべき他の因子として、患者の病状の重症度、
年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反
応感度、および治療に対するトレランス／応答が挙げられる。短時間作用の薬学
的組成物は、日々投与されるが、長時間作用の薬学的組成物は、２、３日から４
日毎、一週間毎、または二週間に１回の頻度で投与される。特定の製剤の半減期
およびクリアランス率に応じて、本発明の薬学的組成物は、１日に１回、２回、
３回、４回、５回、６回、７回、８回、１０回、またはそれ以上の回数で投与さ
れる。

【０１３７】 通常の投与量は、投与の経路に応じて、約１〜１００，０００μｇの範囲で変
動し、全投与量は最大で約１０グラムである。所望の投与量として、２５０μｇ
、５００μｇ、１ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５
０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５
０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５
０ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、１．１ｇ、１．２ｇ、１．３ｇ、１．４ｇ、１．５
ｇ、１．６ｇ、１．７ｇ、１．８ｇ、１．９ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ
、７ｇ、８ｇ、９ｇ、および１０ｇが含まれる。さらに、ペプチド剤の濃度は、
局所形態で薬剤を投与する実施形態ではかなり高くし得る。ペプチド剤のモル濃
度は、いくつかの実施形態で使用し得る。局所投与および／または塗布用医療器
具のための所望の濃度は、１００μＭ〜８００ｍＭの範囲である。それらの実施
形態に用いる好ましい濃度は、５００μＭ〜５００ｍＭの範囲である。例えば、
局所塗布および／または塗布用医療器具のための好ましい濃度としては、５００
μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、６５０μＭ、７００μＭ、７５０μＭ、８００
μＭ、８５０μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍ
Ｍ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ
、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４
０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２０
０ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４２
５ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭ、および５００ｍＭが挙げられる。特定の投与
量および送達方法に関するガイダンスは文献（例えば、米国特許第４，６５７，
７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５，２１２号を参照）お
よび以下に記載されている。

【０１３８】 特に、本明細書で記載したペプチド剤の投与量は、ｐ２４等のキャプソマータ
ンパク質の結合、および／またはカプシド集合に対する干渉、および／またはＨ
ＩＶおよびＳＩＶ感染等のウィルス感染の阻害を含む所望の効果を達成するため
に十分なペプチド剤を提供する量である。したがって、ペプチド剤の投与量は、
好ましくは組織または血液濃度、またはその両方が約０．１μＭ〜５００ｍＭと
なる量である。所望の投与量は、組織または血液濃度、またはその両方が約１〜
８００μＭとなる量である。好ましくは、投与量は組織または血液濃度が、約１
０μＭ〜約５００μＭを上回るようにする量である。好ましくは、投与量は、例
えば、組織または血液濃度、またはその両方が１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、
２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６
０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５
μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１４５
μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００
μＭ、２２０μＭ、２４０μＭ、２５０μＭ、２６０μＭ、２８０μＭ、３００
μＭ、３２０μＭ、３４０μＭ、３６０μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０
μＭ、４４０μＭ、４６０μＭ、４８０μＭ、および５００μＭとなるのに必要
な小ペプチドの量である。組織濃度が８００μＭを上回るようにする投与量は好
ましくはないが、本発明のいくつかの実施形態では使用し得る。ペプチドを一定
量注射することで、血液レベルによって測定されるような組織内での安定した濃
度を保つこともできる。

【０１３９】 ペプチドの毒性が低いことにより、危害なく組織濃度をよりいっそう高く保つ
ことができる。ＨＩＶ−１の小ペプチド耐性株（例えば、ＧＰＧ−ＮＨ₂耐性株
）を選択する試みは、これまでのところ成功していない。ＨＩＶ−１株ＨＴＬＶ
−ＩＩＩＢは、連続希釈（限界希釈）したＧＰＧ−ＮＨ₂の存在下で６ヶ月より
長く、インビトロで耐性の分化のあからさまな兆候を示すことなく継代培養され
た。

【０１４０】 ペプチド剤の投与経路は、限定されるものではないが、局所、経皮、非経口、
経腸、経気管支、および経歯槽である。局所投与は、局所的に塗布されたペプチ
ド含有のクリーム、ゲル、リンス等を介して達成される。経皮投与は、ペプチド
剤が皮膚を透過して血流に入ることを可能とさせるクリーム、リンス、ゲル等の
塗布によって達成される。投与の非経口の経路は、限定されるものではないが、
電気的または直接注射、例えば中心静脈内、静脈内、筋肉内、腹腔内あるいは皮
下への電気的または直接注射が含まれる。経腸投与は、限定されるものではない
が、食物摂取、および直腸が含まれる。経気管支および経歯槽は、限定されるも
のではないが、経口または鼻腔のいずれかを介した吸入が含まれる。

【０１４１】 局所投与に適当なペプチド剤含有化合物の組成物は、限定されるものではない
が、生理学的に許容されるインプラント、軟膏、クリーム、リンス、およびゲル
が含まれる。ペプチドが少なくとも最小限の可溶性となっている任意の液体、ゲ
ル、または固形の薬学的に許容される塩が本発明での局所的使用にとって適して
いる。局所投与の組成物は、ＨＩＶの伝播を防ぐために性交の間、特に有用であ
る。そのような使用に適した組成物は、限定されるものではないが、膣、肛門の
坐薬、クリーム、および膣洗浄器である。

【０１４２】 経皮投与に適したペプチド剤の組成物は、限定されるものではないが、皮膚に
対して直接塗布、または経皮装置（「経皮貼布」）等の保護担体に取り込んで適
用される薬学的に許容される懸濁液、オイル、クリーム、および軟膏である。適
当なクリーム、軟膏等の例は、医師のデスクレファレンスに見いだすことができ
、また当業者に公知である。適当な経皮装置の例として、例えば、Chinen他の米
国特許第４,８１８,５４０号（１９８９年４月４日発行、本明細書で引用する）
に記載されている。

【０１４３】 非経口投与に適したペプチド剤の組成物は、限定されるものではないが、薬学
的に許容される滅菌した等張液である。そのような溶液としては、限定されるも
のではないが、中心静脈へ注射するための生理食塩水およびリン酸生理食塩水、
ペプチド剤の静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射である。

【０１４４】 経気管支および経歯槽投与に適当なペプチドの組成物は、限定されるものでは
ないが、吸入のための種々のタイプのエアロゾルが含まれる。例えば、ペンタミ
ジンはエアロゾルを介して経鼻腔投与の形でＡＩＤＳ患者に投与され、ニューモ
システィスカリニ(pneumocystis carinii)肺炎によって生ずる肺炎を防ぐ。ペプ
チドの経気管支および経歯槽に適した装置もまた実施形態である。そのような装
置は、限定されるものではないが、アトマイザーと気化器が挙げられる。現在利
用可能なアトマイザーおよび気化器の多くのタイプはペプチド剤の送達に容易に
適用し得る。

【０１４５】 経腸投与に適したペプチド剤の組成物は、限定されるものではないが、薬学的
に許容される粉末、錠剤、食物摂取用液体および直腸投与用の坐薬が含まれる。
ＨＩＶ感染症の最も一般的な経路および使いやすさにより、胃腸経由の投与、特
に経口が本発明の最も好ましい実施形態でありトリペプチド（ＧＰＧ−ＮＨ₂）
を有する５００ミリグラムのカプセルを調製したところ、４℃で貯蔵した場合に
少なくとも１２ヶ月間安定であることがわかった。他のウィルス−宿主系で示さ
れているように、小ペプチドの特異的抗ウィルス活性は、経口投与後に血漿中で
検出し得る（Miller et al., Appl. Microbiol., 16:1489 (1968)）。なぜなら
、小ペプチドは明らかに患者の消化器系での分解から免れるため、それらは経口
投与にとって理想的である）。

【０１４６】 ペプチド剤は、ＨＩＶ感染の予防が重要であるような状況下での使用にも適し
ている。例えば、医療従事者は、分泌物または体液にＨＩＶウィルスを含むＨＩ
Ｖ陽性と思われる患者と常に接している。さらに、ペプチド剤は、ＨＩＶの伝播
を防ぐために性交中に使用するための抗ウィルス組成物に処方し得る。そのよう
な組成物は当業者に知られており、本明細書でその全体を引用するModak他のＰ
ＣＴ公報第ＷＯ９０／０４３９０号（１９９０年３月３日）として発行された国
際特許出願にも記載されている。

【０１４７】 本発明の態様は、手袋、シーツ、作業面等の医療用器具をＨＩＶ伝播から保護
するコーティングも含む。代替的に、ペプチド剤は高分子医療装置に含浸させる
ことができる。特に好ましくは、医療用手袋およびコンドームのコーティングで
ある。医療装置での使用に適したコーティングは、ペプチドを含む粉末によって
、またはペプチド剤が懸濁されている高分子コーティングによって提供される。
コーティングまたは装置用の適当な高分子材料は、生理学的に許容され、またそ
れを介して治療上有効な量のペプチド剤が拡散し得るものである。適当なポリマ
ーとして、限定されるものではないが、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポ
リアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ
テトラフルオロエチレン、ポリビニルクロリド、アセチルセルロース、シリコー
ンエラストマー、コラーゲン、シルク等が挙げられる。そのようなコーティング
は、例えばFox他に対して１９８６年９月１６日に発行された米国特許第４，６
１２，３３７号に記載されており、その全体を本明細書で引用する。

【０１４８】 以下の開示では、小ペプチドに対するいくつかの毒性学的研究が提供され、他
のペプチド剤の毒性についての試験に対するアプローチが開示される。

【０１４９】 小ペプチドの毒性学的研究 ＧＰＧ−ＮＨ₂に対するいくつかの毒性学的研究が実施されてきており、それ
らのアッセイをより多くのペプチド（例えば、ＧＫＧ−ＮＨ₂、ＣＱＧ−ＮＨ₂、
ＲＱＧ−ＮＨ₂、ＫＱＧ−ＮＨ₂、ＡＬＧ−ＮＨ₂、ＧＶＧ−ＮＨ₂、ＶＧＧ−ＮＨ ₂ 、ＡＳＧ−ＮＨ₂、ＳＬＧ−ＮＨ₂、およびＳＰＴ−ＮＨ₂）を用いて再現できる
（Vahlne他の米国特許第５,６２７,０３５号を参照）。培養リンパ球に対するＧ
ＰＧ−ＮＨ₂の効果を以下の例で提供する。

【０１５０】 実施例５ この実施例では、培養リンパ球に対する小ペプチドの効果に取り組んだいくつ
かの毒性学的研究を提示する。一般に、２ｍＭまでの濃度で試験したＨＩＶ−１
のウィルス阻害アッセイで使用したペプチドは、その形態学的外観、トリパンブ
ルー染色、および細胞増殖によって判断されるように、使用した細胞に対してい
かなる毒性的効果をも示さなかった。ＧＰＧ−ＮＨ₂の毒性については、（ｉ）
プラーク減少アッセイ、および（ｉｉ）ＨＳＶ−１の産生阻害アッセイによって
さらに試験した。ＧＰＧ−ＮＨ₂は、１ｍＭまでの濃度でＨＳＶ−１複製を減少
することはなかったが、その毒性が欠如していることが確認されただけではなく
、小ペプチドが選択的にＨＩＶ−関連のウィルスを阻害することが確認された。
この知見は、ＧＰＧ−ＮＨ₂がインフルエンザまたはポリオウィルスのいずれも
阻害しなかったという観察によって強く確信した。

【０１５１】 次に、正常なヒト・リンパ単球様細胞（ＰＢＭＣ）に対する毒性について調べ
た。２ｍＭほどの高濃度の投与量で、かつ４日間にわたってさらした場合、培養
した単核白血球およびリンパ球の生存に対して、検出できるほどの影響をＧＰＧ
−ＮＨ₂が与えることはなかった。ヒト単核細胞のインビトロ増殖応答に対する
ＧＰＧ−ＮＨ₂の効果も試験した。Ｔ細胞に対して直接的な抗増殖特性があった
としてもＧＰＧ−ＮＨ₂の影響はほんのわずかであり、２０μＭの用量でアクセ
サリ細胞（例えば、単核白血球および樹状細胞）の機能に影響を及ぼすようなこ
とはなかった。

【０１５２】 種々の細胞株のインビトロ５０％細胞毒性濃度（ＣＣ₅₀）についても評価した
。したがって、Ｔ細胞株ＨＵＴ₇₈、Ｈ９、ＣＥＭ−ＳＳ、ＭＴ−２、および（非
）誘導ＡＣＨ−２、同様にマクロファージ誘導細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｔａｔ Ｉ
ＩＩ、ＴＨＰ−１、および（非）誘導Ｕ−１細胞の培地に対して、異なる濃度の
ＧＰＧ−ＮＨ₂、最大で４０ｍＭのＧＰＧ−ＮＨ₂を添加した。３日間インキュベ
ーションした後、細胞の数を数えた。トリパンブルー色素排除試験およびＨＵＴ ₇₈ 、ＭＴ−２、およびＪｕｒｋａｔ−ｔａｔ ＩＩＩの細胞計数によって、４０
ｍＭのＧＰＧ−ＮＨ₂存在下での３日間の培養で細胞増殖の約４０％阻害が見ら
れた。Ｈ９、ＣＥＳＳ−ＳＳ、およびＴＨＰ−１はこのＧＰＧ−ＮＨ₂の濃度で
は細胞数の減少が２０％未満であった。したがって、インビトロでのＣＣ₅₀／Ｉ
Ｃ₅₀の比は、＞１０⁴であった。上記の毒性試験によって、高濃度でも小ペプチ
ドのリンパ球に対する毒性が低いことがわかった。

【０１５３】 齧歯類に対する大量の小ペプチドの効果もまた分析し、それらの実験を次の実
施例に示す。

【０１５４】 実施例６ この実施例では、大量に齧歯類に投与された小ペプチドに対するいくつかのイ
ンビボ(in vivo)毒性研究の結果を示す。最初の実験では、多めの単一投与量か
らなる小ペプチドをマウスに与え、毒性効果を分析した。体重１ｋｇあたり最大
で１ｇの濃度でアダルトマウスの尾部静脈にＧＰＧ−ＮＨ₂を静脈内注射したが
、これらの動物には明らかな毒性効果はなかった。第２の実験では、小ペプチド
の投与量をいくつかの異なる量にしてほぼ３週間にわたりマウスに与えた。マウ
ス群（１群あたり５匹のマウス）に対して、齢６日からＧＰＧ−ＮＨ₂の腹腔内
注射（それぞれ０．０１、０．１、および１ｇ／ｋｇ体重／日）を開始した。注
射を１８日間にわたって毎日行った。対照群と比較すると、マウスに対するＧＰ
Ｇ−ＮＨ₂の顕著な影響は認められなかった。同様の実験では、ＧＰＧ−ＮＨ₂の
４週間毒性研究をデンマークのスキャントックス（Scantox）Ａ／Ｓで行った。
ＧＰＧ−ＮＨ₂をラットに対して、最大１ｇ／ｋｇ体重／日で２８日間経口投与
した。動物に対する毒性の兆候は認められなかった。このようなインビボ毒性実
験によって、ここに記載した小ペプチドが哺乳動物に対して毒性が低く、投与量
が多くても安全に提供できることがわかった。

【０１５５】 さらなる研究では、ヒト血液および血漿での小ペプチドの安定性を分析した。
以下の実施例では、そのような実験を説明する。

【０１５６】 実施例７ この実施例では、ヒト血液および血漿内での小ペプチドの安定性について評価
するために実施した幾つかの研究を説明する。したがって、ヒト血液は新鮮なも
のを採取してＥＤＴＡで処理した。血清は、２，５００ｒｐｍで２０分間の遠心
を行うことで分離した。ＧＰＧ−ＮＨ₂を１０ｍＭまたは５０ｍＭの濃度で血液
または血漿に添加し、その後に３７℃で、１、２、および４時間にわたって、そ
れぞれインキュベートした。対照群として、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ウシ
胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプト
マイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびポリブレン（Ｓｉｇｍａ、２μｇ／ｍｌ）
が加えられているＲＰＭＩ １６４０培地に対してＧＰＧ−ＮＨ₂を添加し、同
様にしてインキュベートを行った。３７℃で２０分間のインキュベートを行った
後、ＧＰＧ−ＮＨ₂含有血液を２，５００ｒｐｍで２０分間遠心し、血漿を単離
した。いくつかの血漿試料を５ｍＭの濃度のＣａＣｌ₂で、３７℃、１０分間処
理し、続いて、３０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心し、この上清をＣａＣｌ₂
処理血漿と呼ぶ。そして、すべてのＧＰＧ−ＮＨ₂含有血漿試料をＲＰＭＩ培地
で希釈して、最終濃度が２０μＭまたは１００μＭのＧＰＧ−ＮＨ₂（５００倍
希釈）が得られ、それをＨＩＶ−１複製アッセイで使用した。

【０１５７】 複製アッセイをＨＵＴ₇₈細胞で行い、またＨＩＶ−１ＳＦ−２ウィルスを使用し
た。すなわち、約２００，０００細胞を希釈ＧＰＧアミド含有培地、血漿、また
は血液からの血漿に再懸濁した。ＧＰＧ−ＮＨ₂含有培地、血漿、または血液か
らの血漿を細胞とともに、３７℃で１時間、２時間、または４時間にわたってイ
ンキュベートした。その後、ＳＦ−２ウィルスを２５ＴＣＩＤ₅₀で添加した。１
時間の吸着後、細胞をＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、その後適当なＧＰＧアミド含
有プラズマに再懸濁して湿った状態で５％のＣＯ₂にて、３７℃でインキュベー
トした。培養液上清を４日毎に回収し、感染後１４日まで培養液を交換した。ウ
ィルスの複製をモニタするために、上清に含まれるＨＩＶ−１ ｐ２４抗原タン
パク質を市販のキット（Abbott）を用いてアッセイした。ＨＩＶ−１ ｐ２４ア
ッセイは、感染後７日目および１４日目の上清に対して実施した。ＧＰＧ−ＮＨ ₂ 添加培地、血漿、または血液からの血漿によってＨＩＶ−１を阻害する能力に
ついては顕著な差は認められなかった。

【０１５８】 ヒト血漿中でのＧＰＧ−ＮＨ₂の安定性もまた、薄層クロマトグラフィ（ＴＬ
Ｃ）によって化学的に評価した（図７参照）。この実験では、¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−Ｎ
Ｈ₂をヒト血漿とともに３７℃、３０分、２時間、または８時間にわたってイン
キュベートし、続いてタンパク質をＴＬＣによって分離し、クロマトグラフをオ
ートラジオグラフィフイルムに露出することで視覚化した。図７に示すように（
レーン：Ｈｐ０、Ｈｐ０．５、Ｈｐ２、およびＨｐ８）、小ペプチドのわずかな
移動度の変化が観察された。小ペプチドの移動度は、３７℃でヒト血漿で３０分
間インキュベートした後、若干増加したが、８時間まで移動度がさらに変化する
ことはなかった。ＴＬＣスポットの質量分析計による分析（エレクトロスプレイ
分析(electrospray analysis)）によって、全てのスポットを確認したところ、
移動度が増加したスポットが含まれ、それはＧＰＧ−ＮＨ₂であった。上記の実
験では、本明細書に記載した小ペプチドがヒト血液および血漿で安定しおり、抗
ウィルス特性を保持し、さらに血漿プロテアーゼによっては分解しない。

【０１５９】 以下の開示では、小ペプチドの吸着、分配、および代謝に関するいくつかの研
究が提供されている。

【０１６０】 小ペプチドの吸着、分配、および代謝 小ペプチドを含有する薬剤の経口投与が求められることから、小ペプチドの酸
安定性を、種々の時間で、５０ｍＭＫＣｌおよび０．１ＭＨＶｌからなる溶液に ¹⁴ Ｃ標識ＧＰＧ−ＮＨ₂をインキュベートすることによって評価した。酸加水分
解後、放射標識トリペプチドを薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）で分析し、ＨＰ
ＴＬＣプレートを２５％メタノール：２５％イソプロパノール：１５％ブタノー
ル：３５％（０．１Ｎ ＨＯＡｃおよび０．１Ｎ ＮａＯＡｃ）によって現像し
た。図８からわかるように、２４時間に至るトリペプチドのインキュべーション
は移動度に影響を及ぼさず、そのためＧＰＧ−ＮＨ₂の分子構造にも影響を及ば
さなかった。このことから胃で見いだされる酸性条件と類似の酸性条件で小ペプ
チドが生き残ることがわかった。

【０１６１】 さらに、培地から細胞への小ペプチドのインビトロでの取り込みを一連の実験
で調べた。したがって、ＨＵＴ₇₈、Ｊｕｒｋａｔ−ｔａｔ ＩＩＩ、およびＭＴ
−２細胞を¹⁴Ｃ標識ＧＰＧ−ＮＨ₂１６５ｎＣｉ（０．７μＭのＧＰＧ−ＮＨ₂と
等しい）とともにインキュベートした。小ペプチドの取り込みが観察され、ＧＰ
Ｇ−ＮＨ₂の８％（Ｊｕｒｋａｔ−ｔａｔ ＩＩＩ）と２０％（ＨＵＴ₇₈細胞）
との間が細胞に組み込まれた。この結果は、いくつかの細胞種への小ペプチドの
組み込みが有効であることを示している。

【０１６２】 さらに、小ペプチドのインビトロでの取り込みについてラットで分析した。ラ
ットに¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂を供給し、その後、種々の時間点で、血液、尿、お
よび組織資料を前記動物から採取した。給餌後８時間に採取したラットの尿試料
と、給餌後、３０分、２時間、および８時間で採取したラット血漿とをＴＣＬプ
レート上で、図７に示すように分離させた（したがって、尿８、ｒｐ０．５、ｒ
ｐ２、およびｒｐ８とした）。全ての組織は剖検の後、任意のアッセイを実行す
るまで−２０℃に保存した。１０〜３０ミリグラムの組織試料を分析した各器官
の異なる３カ所の位置から採取し、器官組織を次に４５℃で４〜８時間、２５０
μｌの組織溶解剤（OptiSolv, LKB-Wallac）に溶解した。３ｍｌの０．０５ＭＨ
Ｃｌ酸性シンチレーションカクテル（Luma Gel, Lumac/3M）を添加する前に、均
質化した組織溶液に５０μｌの３０％Ｈ₂Ｏ₂と１００μｌのイソプロパノールを
添加することによって脱色した。放射能は、ベータシンチレーションカウンタ（
LKB-Wallac 1218 Rack Beta）によって決定した。血漿中のフリー／未結合ＧＰ
Ｇ−ＮＨ２を血漿１容とエタノール２容を用いた沈殿によって回収し、その後１
時間にわたって−７０℃でインキュべーションし、２０，０００ｘｇで１５分間
、４℃遠心した。１０μｌの混合物をサンプリングして組織試料として分析する
前に、血液細胞試料をＰＢＳで希釈（ＰＢＳ１容に対して血液細胞２容の比率で
）した。定量化に先立って、５ないし２０μｌの血漿および尿の試料を直接３ｍ
ｌのReadySafe（Beckman）流体と混合した。最大取り込みを計算するための基礎
と分布とを与える結果を表１０および表１１に示す。値はｎＣｉで表す。

【０１６３】

【表１１】

【０１６４】

【表１２】

【０１６５】 最大取り込みの計算は、以下のようにして決定した。全給餌は８００μＣｉ／
ｋｇラット体重（動物あたり合計１６０μＣｉ）。ＧＰＧ−ＮＨ₂ およびその代
謝産物が等しく体内に分配されると仮定すると、組織中に存在するＧＰＧ−ＮＨ ₂ は、動物全数によって、調べた動物の全数を割り、さらに体重と係数０．９と
を掛けることで得られる異なる組織からの平均カウント／ｇである。血液の容積
が平均体重の約１０％であると概算されることから、血液の容積を省略するため
に、この係数が導き出される。例えば（動物１〜５のデータから）、もし５匹の
ラットの体重合計が２０７ｇで、種々の組織から検出された放射性活性が（３５
+４６６+４９５+３６６+３３１)または１，６９３ ｎＣｉであり、血液から検出
された放射性活性は（９３＋１３０）または２２３ｎＣｉであり、さらに尿で検
出された放射性活性は４，０１５ｎＣｉであり、小ペプチドの最大取り込みは、
以下のように計算し得る。

【０１６６】 組織： （３５＋４６６＋４９５＋３６６＋３３１）／５^*２０７^*０．９＝６３
，２４０ ｎＣｉ 流体： 血液 （９３＋１３０）^*２０７^*０．１＝４，６４２ ｎＣｉ 尿： ４，０１５ ｎＣｉ 合計： （６３．２４＋４．６４２＋４．０１５）／８００^*０．２０７＝０．
４３４２、ｏｒ ４３％ 最大取り込み

【０１６７】 保持／固定化ＧＰＧ−ＮＨ₂と試料組織内のその代謝産物との相対的分布は、
肝臓で最大であり、続いて、腎臓、脾臓、胸腺、脳の順に続くことが観察された
。尿での放射能は３時間と８時間との間で倍となることが観察された。ＴＬＣプ
レートからの尿の放射性スポットの質量分析のデータ（エレクトロスプレイ質量
分析法）は、尿中の放射能の僅かな部分のみが完全なＧＰＧ−ＮＨ₂であること
を示した（図７参照）。上記のインビトロでの研究から得られた結果によれば、
著しい量の小ペプチドが効果的に血液、血漿、およびいくつかの異なる組織に運
ばれることがわかった。

【０１６８】 さらに、図９および図１０に示すように、顕著な量の小ペプチドが長時間にわ
たって血漿分画に残っている。図９では、血液細胞と、結合した血漿タンパク質
との間の放射能の分布、同様に非タンパク質結合（フリー）血漿放射能が示され
ている。血漿分画からの放射能の除去は図１０に示され経路リペプチドＧＰＧ−
ＮＨ₂は半減期が８６．５分である。タンパク質結合放射能を、９９．５％エタ
ノールを２容加えることによる沈殿の後にアッセイした。取り込みおよび分布デ
ータと上記ＴＬＣデータとから、血漿から回収した完全なＧＰＧ−ＮＨ₂の最小
取り込みを計算し、ラットの給餌後１時間以内に、少なくとも１％の供給ＧＰＧ
−ＮＨ₂が血漿中に遊離ＧＰＧ−ＮＨ₂として回収される。

【０１６９】 小ペプチドを与えられた動物の血漿中の生物学的活性ＧＰＧ−ＮＨ₂を評価す
るために、血漿試料を最終給餌１日後、４週毒性研究のラットから得た血液から
調製した。血漿試料をＲＰＭＩ培地で１／５希釈し、上記したように、ＨＩＶ−
１のＳＦ１６２株によって感染したＰＢＭＣを投与した。つぎに、市販の検出ア
ッセイ（Abbott）を用いることで上清中のｐ２４の量を検出することによって、
感染後７日目、１１日目、および１４日目にウィルス感染性をモニタした。表１
２に示すように、小ペプチドで処理したラットから得た血清はウィルス感染性を
阻害する能力を保持した。いくつかの例では、１０μＭほど少量のＧＰＧ−ＮＨ ₂ を投与することで、十分な濃度の小ペプチドが血漿に与えられ、それによって
ＨＩＶ−１複製の阻害が可能となった。減少率は表６に示すように計算した。こ
れらの実験結果から、動物の体内でＨＩＶ複製を阻害するのに有効な濃度で本明
細書で説明した小ペプチドが保持される。

【０１７０】

【表１３】

【０１７１】 全血清から得たタンパク質もまたカラムクロマトグラフィで分析して分取し、
粗タンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（１０％）電気
泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）で分離した。ラット血漿試料を１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）および５０ｍＭＫｃｌからなる緩衝液中でサイズ排除（セフ
ァロースＧ−５０、Pharmacia）クロマトグラフィ（０．４ｘ６ｃｍ）によって
部分精製した。溶出液を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）緩衝液でＮａ
Ｃｌの濃度勾配を段階的に高めたることで、アニオン交換クロマトグラフィで分
離した（セファロース、ＣＬ−６Ｂ ＤＥＡＥ、０．４ｘ６ｃｍ）。溶出液は、
放射能（Ready Safe, Beckman; LKB1218, Sweden）にもとづいてモニタおよびプ
ールした。強シグナルのタンパク質分画を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、エ
ドマンＮ末端アミノ酸シーケンシング（Applied Byosystems Procise Sequencer
, USA）にかける前に、続いてＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド、BioRad
）膜上にブロッティングした。

【０１７２】 図１１に示すように、動物に給餌後６０分にタンパク質に共有結合したと思わ
れる僅かな放射能が観察された。Ｂ−１〜Ｂ−４と記されたタンパク質をシーケ
ンシングし、α−１抗トリプシン（Ｂ１）、ペンタキシン（Ｂ−２）、Ｃ−反応
性タンパク質（Ｂ−３）とし、さらにＢ−４は同定することができなかった。こ
れらのタンパク質はすべて肝臓で合成されたものである。一つの解釈は、加水分
解されたＧＰＧ−ＮＨ₂が肝臓のタンパク質合成で再利用されたということであ
る。これらの実験から、小ペプチドが体内で代謝され、同定された結合タンパク
質（Ｂ−１、Ｂ−２、およびＢ−３）が全て肝臓で合成されることから、小ペプ
チドの加水分解および再利用は肝臓で起こることが明らかになった。

【０１７３】 特定の実施形態および実施例を参照して本発明を記述したが、本発明の精神か
ら逸脱することなく種々の変形例が可能であることを理解すべきである。したが
って、本発明は併記の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＨＵＴ７８細胞で行ったＨＩＶ感染性についての研究から得られた結
果を示すグラフである。

【図２】 図２は、未処理のＨＩＶ粒子の複数の電子顕微鏡写真である。

【図３】 図３は、プロテアーゼ阻害剤リトナビエを接触させたＨＩＶ粒子の複数の電子
顕微鏡写真である。

【図４】 図４は、ＧＰＧ−ＮＨ₂と接触させたＨＩＶ粒子の複数の電子顕微鏡写真であ る。

【図５】 図５は、ＨＩＶ−１のｐ２４タンパク質（１４６〜２３１残基）のカルボキシ
ル末端に対応するタンパク質配列と、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ラウス肉腫ウィルス
（ＲＳＶ），ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）、マウス乳癌ウイ
ルス（ＭＭＴＶ）、マーソン−ファイザー・サル・ウィルス（Mason-Pfizer mon
key virus、ＭＰＭＶ）、およびモロニー・マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）
のタンパク質配列との整合を示す図である。棒線は、主相同領域（ＭＨＲ）を示
す。

【図６】 図６は、ＧＰＧ−ＮＨ２、リトナビル（Ｒｉｔｏ）、ＡＺＴ、またはそれらの
薬剤の組み合わせの存在下または非存在下で培養したＨＩＶ感染細胞の上清に検
出されたｐ２４（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。

【図７】 図７は、¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂を経口投与した後に採取したラットの尿および
ラットの血漿（ｒｐ）、ならびに¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂とともにインキュベート
したヒト血漿（Ｈｐ）から得られた非タンパク質結合放射性標識化合物が分離さ
れた薄層クロマトグラフィ支持体を示す図であって、採取時間が付されており、
またＲ１〜Ｒ１３は同定された放射性化合物の位置を示す役割を持つ。

【図８】 図８は、０．１ＮのＨＣｌおよび５０ｍＭのＫＣｌによって処理され、かつ２
４時間にわたって採取された¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂が分離された薄層クロマトグ
ラフィ支持体を示す図であって、数字は酸暴露時間を示し、またＲは同定された ¹⁴ Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂の位置を示す役割を持つ。

【図９】 図９は、ラット血液中での¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂とその代謝産物との分配を示
すグラフである。

【図１０】 図１０は、¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂を経口投与したラットの血漿分画からの放射
能の排除を示すグラフである。

【図１１】 図１１は、１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で分離したラット血漿粗タンパク質およ
び分画化ラット血漿タンパク質を示す図であって、８−ｆ３は¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−Ｎ
Ｈ₂の投与８時間後の試料から採取した第３の分画を指し、８−ｆ１は¹⁴Ｃ−Ｇ
ＰＧ−ＮＨ₂の投与８時間後の試料から採取した第１の分画を指し、４−ｆ３は^{1 4} Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂の投与４時間後の試料から採取した第３の分画を指し、４−
ｆ１は¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂の投与４時間後の試料から採取した第１の分画を指
し、８ｈ、４ｈ、２ｈ、および１ｈは¹⁴Ｃ−ＧＰＧ−ＮＨ₂の投与後に試料を採
取した時間を指し、さらにＢ１〜Ｂ４は同定されたタンパク質の位置を示す役割
を持つ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/569 Ｇ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BA20 CB21 DA36 FB03 4B063 QA05 QA06 QQ10 QQ79 QR77 QR79 QR80 QS31 QX01 QX10 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA08 BA15 BA23 CA62 DC50 NA01 NA14 ZB332 ZC552 4H045 AA10 AA20 AA30 BA12 BA13 BA14 BA15 BA42 BA60 EA29 FA20 FA51

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウィルスに感染した宿主細胞でのウィルス複製を阻害するた
   めの組成物であって、式Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意
   のアミノ酸である）を有するアミド型のペプチドを有効量含み、前記ペプチドは
   Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではなく、さらに前記組成物はウィルスのカプ
   シド集合を阻害することでウィルス複製を阻害する組成物。
2. 【請求項２】 前記ペプチドは、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａ
   ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
   −ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
   Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有す
   るペプチドからなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 Ｘ₃はグリシンである請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記アミド型のペプチドは、式Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式
   中、Ｘ₄およびＸ₅は任意のアミノ酸）を有し、任意の１個または２個のアミノ酸
   が欠けている請求項１に記載の組成物。
5. 【請求項５】 前記トリペプチドＸ₁Ｘ₂Ｘ₃は前記ウィルスのカプシドタン
   パク質のアミノ酸配列中に見いだされる、請求項１に記載の組成物。
6. 【請求項６】 前記ペプチドは支持体に結合している請求項１に記載の組成
   物。
7. 【請求項７】 前記ペプチドは薬学的に許容可能な担体を有する薬剤に組み
   込まれている請求項１に記載の組成物。
8. 【請求項８】 式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有するアミド型のペ
   プチド。
9. 【請求項９】 支持体に結合した請求項８に記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 式：Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有するアミド型の
    ペプチド。
11. 【請求項１１】 支持体に結合した請求項１０に記載のペプチド。
12. 【請求項１２】 式：Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有するアミド型の
    ペプチド。
13. 【請求項１３】 支持体に結合した請求項１２に記載のペプチド。
14. 【請求項１４】 式：Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有するアミド型の
    ペプチド。
15. 【請求項１５】 支持体に結合した請求項１４に記載のペプチド。
16. 【請求項１６】 式：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有するアミド型の
    ペプチド。
17. 【請求項１７】 支持体に結合した請求項１６に記載のペプチド。
18. 【請求項１８】 式：Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を有するアミド型の
    ペプチド。
19. 【請求項１９】 支持体に結合した請求項１８に記載のペプチド。
20. 【請求項２０】 宿主細胞でのＨＩＶ複製を阻害する方法であって、式Ｘ₁
    Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸である）を有する
    アミド型のペプチドを有効量、前記細胞に投与することを含み、前記ペプチドは
    Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではない方法。
21. 【請求項２１】 前記ペプチドは、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
    Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇ
    ｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌ
    ｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
    、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有
    するペプチドからなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似
    体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻
    害剤からなる群から選択される抗ウイルス治療薬を投与する過程をさらに含む請
    求項２０に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記ペプチドは支持体に結合している請求項２０に記載の
    方法。
24. 【請求項２４】 前記ペプチドは薬学的に許容可能な担体を含む薬剤中で投
    与される、請求項２０に記載の方法。
25. 【請求項２５】 宿主細胞でのＨＩＶ複製を阻害するための組成物であって
    、式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸である
    ）を有するアミド型のペプチドを有効量含み、前記ペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
    −Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではなく、前記組成物はカプシドの集合体を遮ることでＨＩＶ
    複製を阻害する組成物。
26. 【請求項２６】 前記ペプチドは、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
    Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇ
    ｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌ
    ｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
    、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有
    するペプチドからなる群から選択される請求項２５に記載の組成物。
27. 【請求項２７】 Ｘ₃はグリシンである請求項２５に記載の組成物。
28. 【請求項２８】 前記アミド型のペプチドは、式Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（
    式中、Ｘ₄およびＸ₅は任意のアミノ酸である）を有し、任意の１個または２個の
    アミノ酸が欠けている請求項２５に記載の組成物。
29. 【請求項２９】 前記トリペプチドＸ₁Ｘ₂Ｘ₃はＨＩＶのカプシドタンパク
    質のアミノ酸配列に見いだされる請求項２５に記載の組成物。
30. 【請求項３０】 前記ペプチドは支持体に結合している請求項２５に記載の
    組成物。
31. 【請求項３１】 前記ペプチドは薬学的に許容可能な担体を有する薬剤に組
    込まれている請求項２５に記載の組成物。
32. 【請求項３２】 宿主細胞でのウィルス複製を阻害するための方法であって
    、式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸である
    ）を有するアミド型のペプチドを有効量、前記細胞に投与することを含み、前記
    ペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではない方法。
33. 【請求項３３】 前記ペプチドは、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
    Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇ
    ｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌ
    ｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
    、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有
    するペプチドからなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似
    体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻
    害剤からなる群から選択される抗ウイルス治療薬を投与する過程をさらに含む請
    求項３２に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記ペプチドは支持体に結合している請求項３２記載の方
    法。
36. 【請求項３６】 前記ペプチドは薬学的に許容可能な担体を含む薬剤中で投
    与される、請求項３２に記載の方法。
37. 【請求項３７】 ウィルスカプシド集合を遮るための方法であって、 式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸である
    ）を有するアミド型のペプチドを有効量、細胞と接触させることを含み、前記ペ
    プチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではない方法。
38. 【請求項３８】 前記ペプチドは式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａ
    ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇｌ
    ｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
    −ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
    Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有す
    るペプチドからなる群から選択される請求項３７に記載の方法。
39. 【請求項３９】 Ｘ₃はグリシンである請求項３７に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記アミド型のペプチドは、式Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（
    式中、Ｘ₄およびＸ₅は任意のアミノ酸である）を有し、任意の１個または２個の
    アミノ酸が欠けている請求項３７に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記トリペプチドＸ₁Ｘ₂Ｘ₃は前記ウィルスのタンパク質
    のアミノ酸配列に見いだされる請求項３７に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記ペプチドは支持体に結合している請求項３７に記載の
    組成物。
43. 【請求項４３】 抗ウィルス薬剤へ組み込むためのペプチド剤を同定するた
    めの方法であって、 ウィルスが感染した複数の細胞に対して、ペプチドがＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
    −ＮＨ₂ではない有効量のペプチド剤を接触させ、 不完全なカプシド形成について前記ウィルスを分析し、 不完全なカプシド形成を誘導するペプチド剤を選択すること、 を含む方法。
44. 【請求項４４】 前記カプシド形成の分析は顕微鏡を用いる、請求項４３に
    記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記ウィルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ
    からなる群から選択される請求項４３に記載の方法。
46. 【請求項４６】 前記ペプチド剤は、トリペプチド、オリゴペプチド、およ
    びペプチド疑似体からなる群から選択される請求項４３に記載の方法。
47. 【請求項４７】 前記ペプチド剤は、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
    、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−
    Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
    ｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ ₂ 、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を
    有するペプチドからなる群から選択される請求項４３に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記ペプチド剤は、ｐ２４のアミノ酸配列と一致するアミ
    ノ酸配列を有する請求項４３に記載の方法。
49. 【請求項４９】 ウィルスタンパク質に結合するペプチド剤を同定するため
    の方法であって、 ウィルスタンパク質を提供し、 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではない有効量のペプチド剤と前記ウィルス
    タンパク質とを接触させ、 前記ウィルスタンパク質と前記ペプチド剤とを含む複合体の形成を検出するこ
    と、 を含む方法。
50. 【請求項５０】 前記ウィルスタンパク質は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、お
    よびＳＩＶからなる群から選択されるウイルス由来である請求項４９に記載の方
    法。
51. 【請求項５１】 前記ペプチド剤は、トリペプチド、オリゴペプチド、およ
    びペプチド疑似体からなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
52. 【請求項５２】 前記ペプチド剤は、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
    、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−
    Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
    ｌｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ ₂ 、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を
    有するペプチドからなる群から選択される請求項に記載５０に記載の方法。
53. 【請求項５３】 請求項４９で同定されたペプチド剤を薬剤に組み込むこと
    を含む薬剤の製造方法。
54. 【請求項５４】 薬剤を製造するための方法であって、 式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−ＮＨ₂（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミノ酸である
    ）を有し、かつＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではない、有効量のアミド型の
    ペプチドを細胞に投与し、 前記細胞内でのウィルス複製阻害を検出し、そして 前記薬剤の中に前記ウィルス複製阻害を引き起こすペプチドを組み込むこと、
    を含む方法。
55. 【請求項５５】 前記ペプチドは、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
    Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇ
    ｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌ
    ｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
    、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有
    するペプチドからなる群から選択される請求項５４に記載の方法。
56. 【請求項５６】 ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似
    体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻
    害剤からなる群から選択される抗ウィルス化合物を前記薬剤の中に組み込む過程
    をさらに含む請求項５４に記載の方法。
57. 【請求項５７】 薬剤に担体を組み込む過程をさらに含む請求項５４に記載
    の方法。
58. 【請求項５８】 ウィルスに感染した宿主細胞でのウィルス複製を阻害する
    組成物であって、式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃−Ｒ（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は任意のアミ
    ノ酸である）を有し、かつＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ではないペプチドを
    有効量含み、Ｒは前記ペプチドのカルボキシル末端に結合した修飾基であり、ま
    たＲはアミド基、または類似の電荷および立体バルクを有する他の部分を含み、
    前記組成物はウィルスカプシド集合を遮ることでウィルス複製を阻害する組成物
    。
59. 【請求項５９】 前記ペプチドは、式：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、
    Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｌｙｓ−Ｇ
    ｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌ
    ｙ−ＮＨ₂、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂
    、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂、およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂を有
    するペプチドからなる群から選択される請求項５８に記載の組成物。
60. 【請求項６０】 Ｘ₃はグリシンである請求項５８に記載の組成物。
61. 【請求項６１】 前記ペプチドは、式：Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃
    −Ｒ（式中、Ｘ₄、Ｘ₅、Ｘ₆、Ｘ₇、Ｘ₈、Ｘ₉、およびＸ₁₀は任意のアミノ酸であ
    る）を有し、任意の１、２、４、５、６、または７個のアミノ酸が欠けており、
    Ｒは前記ペプチドのカルボキシル末端に結合した修飾基であり、さらにＲはアミ
    ド基、または類似の電荷および立体バルクを有する他の部分を含む請求項５８に
    記載の組成物。
62. 【請求項６２】 前記ペプチドＸ₁Ｘ₂Ｘ₃は、前記ウィルスのカプシドタン
    パク質のアミノ酸配列に見いだされる請求項５８に記載の組成物。